禽網狀內皮組織增殖症病毒亞單位疫苗及其生產方法

2023-12-08 22:37:46

專利名稱：禽網狀內皮組織增殖症病毒亞單位疫苗及其生產方法
技術領域：
本發明所涉及的是一種禽用網狀內皮組織增殖症病毒亞單位疫苗的生產方法，屬於獸用生物製品的生產領域。
背景技術：
禽網狀內皮組織增殖症(Reticuloendoetheliosis，RE)是由反轉錄病毒科的禽網狀內皮組織增殖症病毒(Reticuloendoetheliosis virus，REV)引起的雞、鴨、火雞和其他禽類的一組綜合症，包括致死性網狀細胞瘤、矮小綜合症以及淋巴組織和其他組織的慢性腫瘤(Jackson C A W，et al.Proventriculitis，″Nakanuke″and reticuloendoheliosis inchickens following vaccination with herpesvirus of turkeys.J Vet，1977，53457-458；崔治中，等.禽白血病及禽網狀內皮增生病感染情況的調查.中國畜禽傳染病，1987，(1)37-38)。REV感染後禽生長遲緩，淘汰率和死亡率升高；引起感染雞的免疫抑制，幹擾其它禽病疫苗的免疫效果，導致免疫失敗。REV已經成為繼馬立克氏病病毒(MDV)、禽白血病病毒(ALV)之後又一重要的禽腫瘤病毒(Jackson C A W，et al.Proventriculitis，″Nakanuke″andreticuloendoheliosis in chickens following vaccination with herpesvirus of turkeys.J Vet，1977，53457-458；Witter R L.Reticuloendotheliosis.InCalnek B W，et al.ed.Disease of Poultry，10thed.USA(Ames)Iowa State University Press，1997，467-484.)。它不但可以引起雛雞嚴重的免疫抑制，還嚴重影響雛雞的正常發育。如果用被REV汙染的雞胚製備弱毒疫苗，更會汙染疫苗。目前，REV在我國的流行越來越嚴重，在某些雞場中對REV陽性抗體的檢出率可能高達21.4％～71.0％，其中出現免疫抑制狀態的雞群對REV抗體陽性率要比正常雞群高的多(崔治中，等.禽白血病及禽網狀內皮增生病感染情況的調查.中國畜禽傳染病，1987，(1)37-38；崔治中，等.禽網狀內皮組織增生病病毒感染和雞群的免疫抑制.中國獸藥雜誌，2000，34(1)1-3.)。近年來，國內大量的流行病學調查及病例報告表明，REV感染及其在我國雞群中造成的危害已相當普遍。REV可在年輕雞群中引起免疫抑制和生長滯緩(特別是與其它病毒共感染時)，也可引起腫瘤，很多專家已認為近幾年我國雞群中顯著增加的腫瘤發病率均與REV感染相關。2001年，金文杰等[9]從傳染性法氏囊病的病料中檢測到REV的感染率為22.7％；2003年，姜世金等(姜世金，等中.傳染性腺胃炎發病雞中MDV REV CAV共感染的檢測.中國獸醫雜誌，2004，40(4)10-12.)曾用斑點雜交方法對我國800餘份發生禽腫瘤的樣品進行檢測，其中REV的陽性率高達80％以上；2004年，張志等(張志，等.從J亞群白血病腫瘤中檢測出禽網狀內皮組織增生症病毒.中國獸醫學報，2004，24(1)10-13.)從馬立克氏病病毒感染的病例中檢測到REV的共感染率至少為36.8％。顯然，REV的感染應引起人們的重視。
REV可以在雞胚和雞胚成纖維細胞上複製，但複製量較低，用其做成疫苗免疫雞後，很難誘發抗體。因此迄今為止，國內外還沒有可以用來有效防治REV的疫苗。更沒有商品化用於預防REV的疫苗，這一嚴峻現實對於抗REV疫苗提出了新需求。
env基因編碼兩種糖蛋白gp90和gp20(Tsai W P，et al.Site directed cytotoxic antibodyagainst the C-terminal segment of the surface glycoprotein gp90 of avain reticuloendotheliosisvirus.Virology，1988，166608-611；Tsai W P，et al.，Biosynthesis and chemical and immunologicalcharacterization of avain reticuloendotheliosis virus env gege-encoded proteins.Virology，1986，155567-583.)。其中gp90蛋白是REV病毒的免疫原性蛋白，具有受體結合功能，能夠激發感染宿主產生中和抗體，是囊膜糖蛋白的表面蛋白；gp20為穿膜蛋白。本發明人試圖通過杆狀病毒雙向表達載體構建REV的env基因真核表達載體，以作為進一步研究抗REV基因工程疫苗的基礎。
本發明的目的本發明的目的是通過杆狀病毒雙向表達載體構建REV的env基因真核表達載體，以製備抗REV基因工程亞單位疫苗。
本發明的詳細描述本發明的發明要點是利用Bac-to-Bac Baculovirus Expression Systems，構建了能表達禽網狀內皮組織增殖症病毒(REV)囊膜糖蛋白基因(env)的重組杆狀病毒，用重組杆狀病毒感染Sf9細胞，經培養，收集細胞，經超聲波裂解，製成油乳苗。
1表達REV env基因的重組杆狀病毒的構建用Invitrogen公司的Bac-to-Bac Baculovirus Expression Systems(CAT.NO.10359-016)杆狀病毒表達載體試劑盒構建重組杆狀病毒。[Bac to bac杆狀病毒表達系統購自Invitrogen公司，主要由轉移供體載體pFastBacTMDUAL、大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、E.coliDH10BacTM菌株和CellFECTIN轉染試劑構成。pFastBacTMDUAL為雙向真核表達載體，含有兩個強啟動子，分別為Polh啟動子和p10啟動子，能同時高效表達兩段外源基因。E.coli DH10BacTM菌株中含有天然杆狀病毒全基因組質粒及表達轉座酶的輔助質粒(Helper plasmid)。]
詳細的操作程序按廠家的說明書進行，現簡述如下1.1引物設計和env基因的PCR擴增根據SNV株REV的前病毒基因組DNA測得的全基因序列(GenBank DQ003591)設計一對引物。上遊引物5』-CAGGAATTCAAGAATGGACTGTCTCACC-3』；下遊引物5』-AGAGTCGACCAAGCATGGGTACAGAAG-3』。其中，上遊引物含有EcoRI酶切位點，下遊引物含有SalI酶切位點。引物合成後，以SNV株REV的前病毒基因組DNA為模板，PCR擴增包含整個env基因的片段，大小約1.87kb。
1.2含REV env基因的重組供體質粒的構建取上文env基因的PCR產物和試劑盒提供的供體質粒pFastBacTMDUAL分別經EcoRI和SalI雙酶切，電泳，回收帶有EcoRI和SalI粘性末端的env基因和線性化的轉移供體質粒。然後將兩者以1∶3的摩爾比在T4 DNA連接酶的作用下，16℃連接過夜，使目的基因整合到供體載體pFastBacTMDUAL上的Polh啟動子下遊。取10μL連接產物轉化E.coli DH5α感受態細胞，以轉化菌製備含有REV env基因的重組供體質粒DNA。
1.3含REV env基因重組杆狀病毒全基因組質粒的構建將重組供體質粒DNA約200ng轉化大腸桿菌DH10BacTM感受態細胞。在同時含卡那黴素、慶大黴素、四環素和指示劑TPTG和x-gal的LB瓊脂平板上，37℃避光培養24～48h，挑選白色菌落，連續傳代3次，性狀穩定的白色菌落即為含有REV env基因的重組杆狀病毒全基因組質粒轉化的重組菌落。然後按操作手冊從該重組菌提取含有REV env基因的重組杆狀病毒全基因組質粒DNA，以此質粒DNA為模板進行PCR擴增驗證。EcoRI單酶切此PCR產物，作進一步驗證。
1.3.1含REV env基因的重組供體質粒的酶切鑑定經初步篩選的重組供體質粒經EcoRI和SalI酶切後，電泳結果呈現兩條特異帶，其中一條為env基因，大小約1.8kb；另一條為載體，大小約為5.1kb。均與預期值一致，該重組供體質粒定名為pFastBac-REV env。
1.3.2含REV env基因重組杆狀病毒全基因組質粒DNA的驗證將上述重組轉移供體質粒pFastBac-REVenv轉化大腸桿菌DH10BacTM感受態細胞，在抗生素及指示劑的篩選下，選取白色菌落，經3次傳代後，所得的菌落全部為白色菌落。選取其中一菌落大量擴增，提取質粒DNA作為模板，以PUC/M13引物，PCR擴增出一條約4.4kb的特異條帶，EcoRI單酶切成兩條特異帶，分別為1.8kb和2.6kb，與試驗設計預期的大小相符。從而驗證所篩選的菌落為含有REV env基因的重組表達載體質粒轉化的陽性菌落，該重組質粒定名為rBACMID-REVenv。
2表達REV env重組杆狀病毒的檢測用含有REV env基因的重組杆狀病毒全基因組質粒rBACMID-REVenv的DNA轉染Sf9細胞(SF9細胞Life Technologies，Cat.No.11496-015；SF9細胞培養液Grace′s Insect Cell Culture Medium，Supplemented(1X)，liquid，Life Technologies，C at.No.11590-056，應用前添加10％胎牛血清)，在轉染後3d，一些細胞開始出現細胞病變，貼壁的細胞開始懸浮起來，細胞形態變大，折光性增強，表明已有病毒形成。
3含REV env基因的重組杆狀病毒全基因組質粒NDA轉染Sf9細胞將Sf9細胞用無血清、無抗生素的Sf-900SFM培養液(Life Technology，Cat.No10902)洗滌2次，然後加入上述培養基將細胞吹打起來，離心，棄上清，加入培養基將細胞重懸，取2mL含有9×105個細胞的無血清、無抗生素的培養基置於35mm的一次性平皿中，27℃靜置1h。取A、B兩個1.5mL的離心管，A管中加入5μL含REV env基因的重組杆狀病毒全基因組的質粒DNA溶液(0.2μg/μL)和100μL無血清、無抗生素的培養基；B管中加入6μLCellFECTIN轉染試劑和100μL無血清、無抗生素的培養基。將兩管合併於C管中，混勻，室溫作用35min後，加入800μL無血清、無抗生素的培養基輕輕混勻。將平皿中的上清吸乾，用C管中的混合物覆蓋細胞，27℃培養5h。吸乾平皿中的轉染混合物，加入2mL無血清、無抗生素的培養基，繼續培養，3d後收集、保存含有轉染細胞產生的重組杆狀病毒上清液，並繼續培養轉染的Sf9細胞。
4重組杆狀病毒感染細胞中REV env基因表達的檢測重組杆狀病毒感染細胞中REV env基因表達的檢測採用間接免疫螢光抗體檢測。其方法是收集構建的重組杆狀病毒轉染了3d和7d的Sf9細胞。離心後，將濃縮的細胞約2×105個塗布於載玻片上，待自然乾燥後，丙酮固定10min，自然乾燥，在載玻片上滴加抗REV的鼠源單克隆抗體11B118和11B154(Cui Z Z，Lee L F，Silva R F.Monoclonal antibodies againstavian reticuloendotheliosis virusIdentification of strain-specific and strain-commonepitopes.J Imnunol，1986，1364237-4242.)的混合液作為第一抗體(簡稱一抗)，37℃作用45min，用PBS漂洗3次，甩幹殘留的PBS；加入FITC標記的羊抗鼠IgG(Sigma公司)第二抗體(簡稱二抗)，37℃作用45min，用PBS漂洗3次，甩幹殘留的PBS，滴加50％的甘油，螢光顯微鏡下觀察，出現特異性綠色螢光的判定為陽性。
重組REV env基因的表達的檢測結果在轉染後3d和7d分別取Sf9細胞用REV的單克隆抗體做IFA檢測REV env的表達，轉染後3d有5％～10％的細胞呈IFA陽性，轉染7d後IFA檢測的陽性細胞比例可達95％以上，表明已發生病毒向未感染細胞的傳染(見附圖1)。取轉染了3d的含有重組杆狀病毒的上清，以MOI為0.1的量接種處於對數生長期的Sf9細胞，經IFA檢測也同樣為陽性。說明已形成了能表達REV env的重組杆狀病毒(該重組杆狀病毒命名為REVenv-rAcNPV，2005年7月20日送藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC 1417)。
5表達REV env重組杆狀病毒的檢測用含有REV env基因的重組杆狀病毒全基因組質粒rBACMID-REVenv的DNA轉染Sf9細胞，在轉染後3d，一些細胞開始出現細胞病變，貼壁的細胞開始懸浮起來，細胞形態變大，折光性增強，表明已有病毒形成。
5.1 SDS-PAGE凝膠電泳H和Western blot檢測取轉染72h後收集、保存的含有重組杆狀病毒的上清接種Sf9細胞，培養72h後收集感染重組杆狀病毒的細胞約5×106個，加入1.5mL的離心管中，2000r/min離心5min，棄上清，用PBS洗滌2次，棄上清，加入細胞裂解液100μL，冰浴30min，加入2×上樣緩衝液100μL煮沸3min，離心5min，取上清用於加樣。用同樣的方法處理用天然杆狀病毒感染的Sf9細胞作為陰性對照。按常規的方法製備凝膠，加樣，電泳。按文獻(Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T.分子克隆實驗指南.金冬雁，黎孟楓，等譯.第二版.北京科學出版社，1996.)介紹的方法進行Western blot試驗，檢測sf9細胞中env基因的表達。本試驗所選用的一抗為抗REV的鼠源單克隆抗體11B118和11B154(Cui Z Z，LeeL F，Silva R F.Monoclonal antibodies against avian reticuloendotheliosis virusIdentificationof strain-specific and strain-common epitopes.J Imnunol，1986，1364237-4242.)兩種單克隆抗體(簡稱單抗)的混合液。
5.2 SDS-PAGE和Westernblot檢測結果用轉染3d的重組杆狀病毒上清感染新鮮的Sf9細胞，培養72h後收集細胞。此細胞經SDS-PAGE電泳後再用Western blot進一步分析(圖2)，發現重組杆狀病毒所表達的蛋白(泳道1)可以與REV特異性單抗11B118和11B154兩種單抗混合液反應，天然杆狀病毒中的蛋白(泳道2)則不與兩種單抗反應，表明REV env基因得到了表達，而且被剪切成兩種蛋白，大小分別約為45kD和62kD。
6 env基因重組表達產物——亞單位疫苗的製備用以上重組杆狀病毒(毒株名，REVenv-rAcNPV，2005年7月20日送藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC 1417。)以MOI值(multiplicity ofinfection，感染倍數，即加入的病毒單位數/細胞數)為2～3的量感染處於對數生長期的Sf9細胞(SF9細胞培養液Grace′s Insect Cell Culture Medium，Supplemented(1X)，liquid，LifeTechnologies，Cat.No.11590-056，應用前添加10％胎牛血清)，棄去培養液，接入病毒後加入無血清和無抗生素的細胞維持液37℃培養4～5d，細胞膨脹變大，並有部分感染細胞懸浮於上清中後，以3000r/min離心30min收集細胞，經超聲波(用上海新芝生物技術研究所和寧波新芝科器研究所生產的JY92型超聲波細胞粉碎機，在功率為400W下工作20次，每次20秒，間歇50秒)裂解，按水相∶油相＝1∶3的比例依照常規油乳劑苗的製備法製成油乳苗，相當於每毫升油乳苗中含有400萬感染的Sf9細胞。
7亞單位疫苗在SPF雞的免疫反應及抗體水平的檢測以0.5mL/只的劑量用肌肉注射的途徑免疫45日齡的無特異性病原(SPF)雞，15天後重複免疫一次。SPF雞在帶過濾空氣裝置的隔離罩內飼養，飼料及飲用水均高壓滅菌，維生素及飼料添加劑亦經過無菌檢測。在免疫後16d、34d、45d採集的血清用ELISA標準試劑盒(Reticuloendothelisosis Virus Antibody Test Kit，購於IDEXX公司)進行檢測。ELISA試驗檢測結果的S/P值＞0.5判為陽性。
檢測結果如下SPF雞免疫接種試驗表明(表1)，用感染的Sf9細胞裂解產物胸部第2次肌肉注射免疫後16d，4隻雞中(編號為1～4)有3隻雞血清對REV抗體檢測的ELISA讀數的S/P值([待檢樣品孔讀數-已知陰性對照孔讀數]/[標準陽性對照孔讀數-已知陰性對照孔讀數])大於0.5，呈現強陽性，最高的一隻雞血清的S/P值竟高達1.3891，只有一隻雞血清的S/P值為0.48，儘管我們用標準判定為陰性，但其值也遠高於對照雞(編號為5～7)血清的0.02。隨著免疫時間的延長，雞體內REV的中和抗體滴度開始下降。在第二次免疫注射後34d檢測時，儘管4隻雞中仍然有3隻可以判定為陽性，但其S/P的平均值已降至0.7977。在二免後45d，雞血清中REV的中和抗體滴度進一步下降，除一隻雞意外死亡外，其餘3隻雞血清的S/P值均已降至0.5以下，但仍高於對照組雞。
表1用亞單位疫苗免疫的SPF雞體內產生抗REV抗體的ELISA檢測結果

+判定為陽性；-判定為陰性；*接近陽性；ND沒有做。
a.以S/P值大於0.5為判定陽性ELISA S/P值([待檢樣品孔讀數-已知陰性對照孔讀數]/[標準陽性對照孔讀數-已知陰性對照孔讀數])8亞單位疫苗免疫SPF雞後的REV病毒攻毒試驗按本說明書」6」項中敘述的方法製備含有env基因表達產物的重組杆狀病毒油乳苗，以0.5ml/只的劑量免疫45日齡SPF雞。所有SPF雞在無菌隔離罩內飼養。待30d後，用REV病毒以106TID50/只的量進行攻毒，以後每隔10天無菌採血，進行血液病毒分離試驗並採用間接免疫螢光試驗進行檢測，以確定血液中REV病毒是否存在。
2.5 env基因重組表達產物免疫SPF雞後的REV病毒攻毒試驗結果攻毒後10d和20d分別採血分離病毒結果全部為陰性。血清用ELISA標準試劑盒檢測，其抗體水平並未升高。以上說明REV病毒並未在雞體內增殖，從而證明SPF雞在免疫此重組疫苗後，能產生堅強的免疫，以抵抗REV病毒的侵襲。


附圖1.轉染後3天(A)和7天(B)以REV特異性單克隆抗體11B118做間接免疫螢光抗體反應顯示SF9細胞中的REV抗原。
附圖2用免疫轉印實驗顯示REV-env蛋白。
槽1用能表達REV-env的重組杆狀病毒感染的Sf9細胞；槽2天染杆狀病毒感染的Sf9細胞；槽M蛋白質分子量標誌。
本發明的優點本發明使用真核表達的囊膜糖蛋白免疫SPF雞後，確實可以刺激雞體產生抗REV抗體，在免疫接種16d後REV中和抗體的滴度最高可達1.3891。攻毒試驗結果表明在免疫此重組疫苗後，REV病毒並未在雞體內增殖，能使免疫雞產生堅強的免疫，以抵抗REV病毒的侵襲。
權利要求
1一種用於預防禽網狀內皮組織增殖症病毒亞單位疫苗的生產方法，其特徵是用重組杆狀病毒以MOI值即感染倍數為2～3的量感染處於對數生長期的Sf9細胞，37℃培養4～5d，細胞膨脹變大，並有部分感染細胞懸浮於上清中後，收集細胞，經超聲波裂解，以常規法按水相∶油相＝1∶3的比例製成油乳苗，相當於每毫升油乳苗中含有400萬感染的Sf9細胞。
2按照權利要求1所述的禽網狀內皮組織增殖症病毒亞單位疫苗的生產方法，其特徵是製備疫苗所用含REV env基因重組杆狀病毒，是通過利用Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統，構建了能表達禽網狀內皮組織增殖症病毒囊膜糖蛋白基因的重組杆狀病毒，該病毒命名為REVenv-rAcNPV，2005年7月20日送藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC 1417。
全文摘要
本發明涉及一種禽網狀內皮組織增殖症病毒亞單位疫苗的製備方法，即利用Bac－to－BacBaculovirus Expression Systems，構建了能表達禽網狀內皮組織增殖症病毒(REV)囊膜糖蛋白基因(env)的重組杆狀病毒。用REV特異性單克隆抗體分別做間接免疫螢光抗體試驗(IFA)和免疫轉印試驗，均可從感染的Sf9昆蟲細胞中檢出REV env。重組杆狀病毒感染的Sf9細胞裂解後製備成油乳疫苗免疫SPF雞後，可以誘發維持45天以上的特異性抗REV抗體，並可抵抗REV病毒感染。
文檔編號A61P31/12GK1765418SQ200510012279
公開日2006年5月3日 申請日期2005年7月29日 優先權日2005年7月29日
發明者崔治中, 王錫樂 申請人:山東農業大學