6-修飾的雙環核酸類似物的製作方法

2023-11-11 20:17:07

專利名稱：：6-修飾的雙環核酸類似物的製作方法
技術領域：
：本發明才是供了6-修飾的雙環核香及由其製備的寡聚化合物和組合物。更具體而言，本發明提供了具有2'-0-C(H)(R)-4，橋的核苷以及由其製備得到的寡聚物和組合物。在優選的實施方案中，R具有形成(R)或(S)異構體的特定構型。在一些實施方案中，本發明的寡聚化合物和組合物與耙標RNA的一部分雜交以使該靶標RNA喪失正常的功能。
背景技術：
：反義技術是用於減少一種或多種特定基因產物表達的有效手段，因而被證明在治療、診斷和研究應用中具有獨特的用途。化學修飾的核苷常用於整合入反義序列以增強一種或多種屬性，例如核酸酶抗性。一類這樣的化學修飾包括雙環核苷，其中該核苷的呋喃糖部分包含了連接咬響糖上兩個原子以形成雙環狀環系統的橋。該種雙環核苷具有各種名稱，包括對於雙環核酸或鎖核酸分別具有BNA和LNA的名稱。li各種BNA已得到製備，並報導於專利文獻和科技文獻，例如參見Singh等人，Chem.Commun.,1998,4,455-456;Koshkin等人，Tetrahedron,1998,54，3607-3630;Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000,97,5633-5638;Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998，8,2219-2222;Wengel等人，PCT國際申請WO98-DK39319980914;Singh等人，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039,各文獻的全文在此引用作為參考。已授權的美國專利和公布的申請的實例包括，例如美國專利7,053,207、6,770,748、6,268,490和6,794,499以及公布的美國申請20040219565、20040014959、20030207841、20040192918、20030224377、20040143114和20030082807;各文獻的全文在此引用作為參考。許多LNA具有毒性。例如，參見Swayze，E.E.;Siwkowski，A.M.;Wancewicz,E.V.;Migawa，M.T.;Wyrzykiewicz,T.K.;Hung,G.;Monia,B.P.;Bennett,C.F.,Antisenseoligonucleotidescontaininglockednucleicacidimprovepotencybutcausesignificanthepatotoxicityinanimals.Nucl.AcidsRes.,doi:10.1093/nar/gkll071(2006年12月，提前在線出版)因此，對通過反義機制特異性調節基因表達的藥劑仍有著長期需求。本文公開了可用於調節基因表達通路的6-取代的BNA和由其製備得到的反義化合物，包括依賴於RNA酶H、RNAi和dsRNA酶等作用機制，以及基於耙標降解或靶標佔用的其它反義機制的調節。本領域的技術人員在獲知本公開內容後將能夠在不進行過度實驗的情況下鑑定、製備反義化合物和開發其用途。發明概述本發明提供了具有下式的雙環核苷formulaseeoriginaldocumentpage13其中Bx是雜環》鹹基部分；1是H或羥基保護基團；T2是H、羥基保護基團或活性磷基團；Z是C廣C6烷基、CVC6烯基、CVC6炔基、取代的C廣C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、醯基、取代的醯基、或取代的醯胺。在一實施方案中，各被取代的基團獨立地被任選被保護的取代基單或多取代，所述取代基獨立地選自滷素、氧代、羥基、OJi、NJ山、SL、N3、OC(^X)Ji、OC(-X)NJA、NJ3C(-X)NJ山和CN,其中各J"_12和13獨立地為H或C廣C6烷基，X是O、S或Nh。在一實施方案中，各#:取代的基團獨立地祐:取代基單或多取代，所述取代基獨立地選自卣素、氧代、羥基、OL、NJ口2、SJi、N3、OQ^X)Ji和NJ3C(=X)NJjJ2的，其中各JhJ2和J3獨立地為H、CrQ烷基或取代的d-Q烷基，X是O或Nl。在一實施方案中，Z是CrQ烷基或取代的CVQ烷基。在另一實施方案中，Z是C廣C6烷基。在另一實施方案中，Z是甲基(CHr)。在另一實施方案中，Z是乙基(CH3CH2-)。在另一實施方案中，Z是取代的C廣C6烷基。在另一實施方案中，Z是取代的甲基。在另一實施方案中，Z是取代的乙基。在一實施方案中，該取代基為C廣C6烷氧基(例如，Z是被一或多個C廣C6烷氧基取代的C廣C6烷基)。在另一實施方案中，該C廣C6烷氧基取代基為CH30-(例如，Z是CH30CH2-)。在另一實施方案中，該C廣C6烷氧基取代基可被進一步取代，例如N(W2)CH20-(例如，Z是N(Jj2)CH20CH2-)。在另一實施方案中，該取代基團為卣素(例如，Z是被一或多個卣素取代的C!-C6烷基)。在另一實施方案中，該卣素取代基為氟(例如，Z為CH2FCH2-、CHF2CH2-或CF3CH2-)。在另一實施方案中，該取代基為鞋基(例如，Z是被一或多個鞋基取代的C廣C6烷基)。在另一實施方案中，Z是HOCH2-。在另一實施方案中，Z是CHr、CH3CH2-、-CH2OCH3、-CH2F或HOCH2-。在一實施方案中，Z基團為被一個或多個xx取代的C!-C6烷基，其中各xx獨立為OJ"NJ山、SJ!、N3、OC(二X)h、OC(=X)NJltT2、NJ3C(-X)NJ山或CN;其中各Ji、h和J3獨立為H或C廣C6烷基，X是O、S或NJ!。在另一實施方案中，Z基團為被一或多個xx取代的d-C6烷基，其中各XX獨立為卣素(例如，氟)、羥基、烷氧基(例如，CH30-)、取代的烷氧基或疊氮基。在一實施方案中，Z基團為-CH2XX,其中Xx為OJ!、NJJ2、SJ"N3、OQ^X)L、OC—X)NJ^2、NJ3C^X)NJJ2或CN;其中各^、2和3獨立為11或C廣Q烷基，X是O、S或NJ!。在另一實施方案中，Z基團為-CH2XX,其中xx為滷素(例如，氟)、羥基、烷氧基(例如，CH30-)或疊氮基。在一實施方案中，Z基團呈(R)-構型在另一實施方案中，Z基團呈(S)-構型:在一實施方案中，T!和T2分別為雍基保護基團。幾基保護基團的優選列表包括苯甲基、苯甲醯基、2,6-二氯苯甲基、叔丁基二甲基矽烷基、叔丁基二苯基矽烷基、甲磺酸、甲苯磺酸、二甲氧基三苯甲基(DMT)、9-苯基黃噪呤-9-基(Pixyl)以及9-(對甲氧基苯基)黃嘌呤-9-基(MOX)。在一實施方案中，T!為羥基保護基團，該基團選自乙醯、苯甲基、叔丁基二甲基矽烷基、叔丁基二苯基矽烷基和二甲氧基三苯甲基，其中更優選的羥基保護基團T！為4,4，-二甲氧基三苯甲基。在一實施方案中，T2為活性磷基團，其中優選的活性磷基團包括二異丙基氰基乙氧基亞磷醯胺和H-磷酸酯。在一優選的實施方案中，T!為4,4，-二甲氧基三苯甲基且丁2為二異丙基氰基乙氧基亞磷醯胺。本發明還提供了寡聚化合物，其具有至少一個具有下式的單體或下式:或下式:formulaseeoriginaldocumentpage16其中Bx是雜環》鹹基部分；T3為H、羥基保護基團、聯接的共軛基團或與核普、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、單體亞基或寡聚化合物連接的核脊間聯接基團；l為H、羥基保護基團、聯接的共軛基團或與核苷、核苷酸、寡核脊、寡核苷酸、單體亞基或寡聚化合物連接的核普間聯接基團；其中T3和T4中至少一個為與核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、單體亞基或寡聚化合物連接的核苷間聯接基團；且Z是C廣C6烷基、C2-CV歸基、C2-C6炔基、取代的d-Q烷基、取代的CrC6烯基、取代的CVC6炔基、醯基、取代的醯基、取代的醯胺、疏醇或取代的疏。在一實施方案中，各被取代的基團被任選被保護的取代基單或多取代，所述取代基獨立地選自卣素、氧代、羥基、OJ!、NJ!J2、SJ"N3、OC(-X)JbOC(-X)NJ卩2、NJ3Q^X)NJJ2和CN，其中各^、J2和J3獨立地為H或d-C6烷基，X是O、S或NJi。在一實施方案中，各^皮取代的基團獨立地被取代基單或多取代，所述取代基獨立地選自卣素、氧代、羥基、OJ^NJ,J2、SJbN3、OC^X)J!、OC(二X)NJ!J2、和NJ3CtX)NJ^2，其中各h、h和h獨立地為H或C廣C6烷基，X是O或NJlo在一實施方案中，至少一個Z為C!-C6烷基或取代的d-C6烷基。在另一實施方案中，各Z獨立地為d-C6烷基或取代的C廣C6烷基。在另一實施方案中，至少一個Z為C廣C6烷基。在另一實施方案中，各Z獨立地為C廣C6烷基。在另一實施方案中，至少一個z為甲基。在另一實施方案中，各z均為甲基。在另一實施方案中，至少一個z為乙基。在另一實施方案中，各z均為乙基。在另一實施方案中，至少一個Z為取代的C!-C6烷基。在另一實施方案中，各Z分別獨立為取代的d-C6烷基。在另一實施方案中，至少一個z為取代的甲基。在另一實施方案中，各z均為取代的甲基。在另一實施方案中，至少一個z為取代的乙基。在另一實施方案中，各z均為取代的乙基。在一實施方案中，至少一個取代基為CVC6烷氧基(例如，至少一個z是被一或多個C廣C6烷氧基取代的d-Q烷基)。在另一實施方案中，各取代基獨立為C廣C6烷氧基(例如，各Z獨立地為被一或多個C廣C6烷氧基取代的d-C6烷基)。在一實施方案中，至少一個CVQ烷氧基取代基為CH30-(例如，至少一個Z是CH3OCH2-)。在另一實施方案中，各d-C6烷氧基取代基均為CH30-(例如，各Z均為CH3OCH2-)。在一實施方案中，至少一個取代基為卣素(例如，至少一個Z是;^皮一或多個囟素取代的C廣C6烷基)。在另一實施方案中，各取代基獨立地為卣素(例如，各Z獨立地為被一或多個滷素取代的d-C6烷基)。在另一實施方案中，至少一個滷素取代基為氟(例如，至少一個Z為CH2FCH2-、CHF2CH2-或CF3CHr)。在另一實施方案中，各滷素取代基均為氟(例如，各Z獨立地為CH2FCH2-、CHF2CH24CF3CH2-)。在一實施方案中，至少一個取代基為羥基(例如，至少一個Z是被一或多個羥基取代的C廣C6烷基)。在另一實施方案中，各取代基獨立地為羥基(例如，各Z獨立地為被一或多個鞋基取代的C廣C6烷基)。在另一實施方案中，至少一個Z為HOCH2-。在另一實施方案中，各Z均是HOCHr。在一實施方案中，至少一個Z是CH3-、CH3CH2-、CH2OCH3-、CH2F-或HOCH2-。在另一實施方案中，各Z獨立地為CHr、CH3CHr、CH2OCHr、CH2F畫或HOCH2-。在一實施方案中，至少一個Z基團為被一或多個xx取代的d-C6烷基，其中各Xx獨立地為OJ!、J2、SL、N3、OC(二X)h、OC(二X)NJiJ2、N3C(二X)NJ！J2或CN;其中各J!、L和J3獨立地為H或C廣Q烷基，X是O、S或N^。在另一實施方案中，至少一個Z基團為被一或多個xx取代的C廣C6烷基，其中各xx獨立地為囟素(例如，氟)、羥基、烷氧基(例如，CH3(D-)或疊氮基。在一實施方案中，各Z基團獨立地為被一或多個xx取代的C廣C6烷基，其中各Xx獨立地為OJ!、NJtJ2、SJ!、N3、OC(二X)J！、OC(二X)NJ！J2、NJ3C(二X)NJ！J2或CN;其中各J,、J2和h獨立地為H或C廣C6烷基，X是O、S或N^。在另一實施方案中，各Z基團獨立地為被一或多個xx取代的C廣Q烷基，其中各XX獨立地為滷素(例如，氟)、羥基、烷氧基(例如，CH30-)或疊氮基。在一實施方案中，至少一個Z基團為-CH2XX,其中Xx為Oh、NJ山、SJ,，、N3、OC(:X)Ji、OC(^X)NJj2、NJ3C(二X)NJJ2或CN;其中各h、2和13獨立地為H或C廣C6烷基，X是O、S或NL。在另一實施方案中，至少一個Z基團為-CH2XX,其中XX為滷素(例如，氟)、羥基、烷氧基(例如，CH30-)或疊氮基。在一實施方案中，各Z基團獨立地為-CH2XX，其中各xx獨立地為OJi、NJ山、SJ!、N3、OCex)h、OQ^X)NJ,J2、NJ3C(二X)NJ山或CN;其中各J、J2和J3獨立地為H或C廣C6烷基，X是O、S或NL。在另一實施方案中，各Z基團獨立地為-CH2XX，其中各xx獨立地為滷素(例如，氟)、羥基、烷氧基(例如，CH3(D-)或疊氮基。在一實施方案中，至少一個Z為CH3-。在另一實施方案中，各Z均是CH3-。在一實施方案中，至少一個單體的Z基團是由下式表示的(R)-構型formulaseeoriginaldocumentpage19或下式:或下式:formulaseeoriginaldocumentpage19或下式:formulaseeoriginaldocumentpage19在另一實施方案中，具有所述式的各單體的Z基團均為(R)-構型。在一實施方案中，至少一個單體的Z基團是由下式表示的(S)-構型:formulaseeoriginaldocumentpage19或下式:或下式:或下式:formulaseeoriginaldocumentpage20在另一實施方案中，具有所述式的各單體的Z基團為(S)-構型。在一實施方案中，T3是H或羥基保護基團。在另一實施方案中，T4是H或羥基保護基團。在進一步的實施方案中，T3是與核苷、核苷酸或單體亞基連接的核普間聯接基團。在另一實施方案中，T4是與核苷、核苷酸或單體亞基連接的核苷間聯接基團。在另一實施方案中，T3是與寡聚核苷或寡聚核苷酸連接的核苷間聯接基團。在進一步的實施方案中，T4是與寡聚核苷或寡聚核苷酸連接的核苷間聯接基團。在一實施方案中，T3是與寡聚化合物連接的核苷間聯接基團。在進一步的實施方案中，T4是與寡聚化合物連接的核脊間聯接基團。在更進一步的實施方案中，T3和T4中至少一個包含了選自磷酸二酯或疏代磷酸酯的核苷間聯接基團。在一實施方案中，寡聚化合物具有至少一個由至少兩個具有下式的相鄰單體構成的區域或下式:formulaseeoriginaldocumentpage20或下式formulaseeoriginaldocumentpage21在另一實施方案中，寡聚化合物包含至少兩個由至少兩個具有上式的相鄰單體構成的區域。在另一實施方案中，該寡聚化合物包含了有間隙的(gapped)寡聚化合物。在另一實施方案中，該寡聚化合物包含至少一個由約8至約14個相鄰P-D-2，-脫氧核糖基核苷構成的區域。在進一步的實施方案中，該寡聚化合物包含至少一個由約9至約12個相鄰P-D-2'-脫氧核糖基核香構成的區。在一實施方案中，該寡聚化合物包含至少一個由2至3個具有上式的相鄰單體構成的區，任選的由具有上式的1或2個相鄰單體構成的第二區以及由8至14個p-D-2，-脫氧核糖基核苷構成的第三區，其中所述第三區位於該第一和該第二區之間。在另一實施方案中，該寡聚化合物包含8至10個(3-D-2，-脫氧核糖基核苷。在本發明的另一實施方案中，才是供了具有長度為約8至約40個核苷和/或修飾的核苷或模擬物的寡聚化合物。在進一步的實施方案中，寡聚化合物包含了約8至約20個核苷和/或修飾的核普或模擬物。在更進一步的實施方案中，寡聚化合物包含了約10至約16個核香和/或修飾的核苷或模擬物。在另一實施方案中寡聚化合物包含了約10至約14個核苷和/或修飾的核香或模擬物。本發明還提供了抑制基因表達的方法，其包括將一種或多種細胞、組織或動物與本發明的寡聚化合物接觸。本發明提供了6-修飾的雙環核苷、由其製備的寡聚化合物及組合物、新的合成中間體，以及該核苷、寡聚化合物、組合物和新合成中間體的製備方法。更特定地，本發明提供了核香，其在具有式2，-0-C(H)(Z)-4，的核糖部分的4，和2'位之間具有橋，以及由該核香製備的寡聚體和組合物。在優選的實施方案中，Z具有可形成(R)或(S)異構體的特定構型。在一些實施方案中，本發明的寡聚化合物和組合物經設計與靶標RNA的部分雜交。在另一實施方案中，本發明的寡聚化合物可用於設計適體，該適體為能夠在體內環境中結合異常蛋白的寡聚化合物。本發明的雙環核苷可用於增強整合了它們的寡聚化合物的所需性質。本發明的寡聚化合物還可用作診斷應用中的引物和探針。在優選的實施方案中，本發明的6-修飾的雙環核苷具有如下顯示的結構一方面，本發明提4共了具有式I的雙環核苷formulaseeoriginaldocumentpage22發明詳述其中:Bx是雜環鹼基部分;Ti是H或羥基保護基團；T2是H、羥基保護基團或活性磷基團；以及Z是C廣C6烷基、C2-C6烯基、CVC6炔基、C廣C6烷基茚基、C3-C6烯基茚基、取代的C廣C6烷基、取代的C2-Q烯基、取代的C2-C6炔基、取代的d-C6烷基茚基、取代的C3-C6烯基茚基、醯基、取代的醯基、取代的醯胺、疏醇、或取代的疏。在一實施方案中，各被取代的基團獨立地被任選被保護的取代基單或多取代，所述取代基獨立地選自滷素、氧代、羥基、OJ"NJ山、S^、N3、OC(二X)J!、0Q^X)NJJ2、NJ3C(-X)NJ山和CN，其中各^、2和^獨立地為H或d-C6烷基，X是O、S或N^。在本發明的一方面中，製備的雙環核香具有正交保護的活性基團並進一步包含活性磷基團。該種雙環核香可用作寡聚體合成的單體。該種雙環核香單體的示範性例子具有下式其中由虛線框圍繞的基團是可變的。在6位的基團還可製備為S構型(注意，根據基團的不同位置，對R和S的指定可因之而變化)。所顯示的雙環核脊單體一般被稱為二甲氧基三苯甲基亞磷醯胺，或者更正式地採用IUPAC系統命名法為(18，311，411,611,78)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦醯基]-1-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚坑。本發明的6-修飾的雙環核香可用於在一個或多個位置修飾除此以外未經修飾的寡聚化合物。該種修飾的寡聚化合物可描述為具有特定的基序。適用於本發明的基序包括但不限於有間隙的基序、半修飾(hemimer)基序、阻斷修飾(blockmer)基序、全修飾基序、定點修飾基序以及交替基序。結合這些基序，還可採用多種聯接方式，包括但不限於統一或組合使用磷酸二酯和疏代磷酸酯聯接。可簡單優化6-修飾的雙環核苷的定位和聯接策略的使用以針對特定靶標形成最佳活性。指導製備代表性基序的代表性美國專利包括但不限於，5,013,830;5,149,797;5,220,007;5,256,775;5,366,878;5,403,711;5,491,133;5,565,350;5,623,065;5,652,355;5,652,356;以及5,700,922，某些專利為與本申請共同擁有的申請或專利，其全文分別在此引用作為參考。基序還披露於2005年6月2日提交並於2005年12月22日公布為WO2005/121371的國際申請PCT/US2005/019219以及於2005年6月2日提交並於2005年12月22日公布為WO2005/121372的PCT/US2005/019220;其全文分別在此引用作為參考。術語"穩定的化合物"和"穩定的結構"指具有足夠穩固性可從反應混合物分離至有用的純度，並製成有效的治療劑的化合物。本發明僅預期穩定的化合物。此處描述的化合物中選定的取代基以遞歸度表示。上下文中的"遞歸取代基"指一個耳又代基可以引用其本身的另一實例。由於該種3f又代基的遞歸性，理論上，在任意給定權利要求中可出現大量取代基。醫藥化學和有機化學領域的普通技術人員可理解該種取代基的總數受到靶標化合物的預期屬性的合理限定。該種屬性包括，例如但不限於，分子量、溶解性或logP等物理屬性，靶向目的靶標的活性等應用屬性，以及合成容易度等操作屬性。遞歸取代基為本發明的目標方面。醫藥和有機化學領域的普通技術人員可以理解這樣的取代基的多功能性。在本發明的權利要求所示的遞歸取代基的程度下，可根據上文所述確定其總數。此處所用的術語"烷基"指含有最多二十四個碳原子的飽和直鏈或支鏈烴基。烷基基團的實例包括，但不限於，甲基、乙基、丙基、丁基、異丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基基團通常包含l至約24個碳原子，更通常包含1至約12個碳原子(C廣C,2烷基)，更優選包含1至約6個碳原子。此處所用的術語"低級烷基"包含1至約6個^5友原子。此處所用的烷基可任選地包含一個或多個進一步的耳又代基。此處所用的術語"蜂基"指含有最多二十四個碳原子並至少具有一個碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈烴基。烯基基團的實例包括，但不限於，乙烯基、丙烯基、丁烯基、l-甲基-2-丁烯-l-基、如1,3-丁二烯的二烯等。烯基基團通常包含2至約24個^_原子，更通常包含2至約12個碳原子，更優選包含2至約6個碳原子。此處所用的烯基可任選地包含一個或多個進一步的取代基。此處所用的術語"炔基"指含有最多二十四個^_原子並至少具有一個石炭-石友三鍵的直鏈或支鏈烴基。炔基基團的實例包括，但不限於，乙炔基、l-丙炔基、l-丁炔基等。炔基基團通常包含2至約24個^5友原子，更通常包含2至約12個碳原子，更優選包含2至約6個碳原子。此處所用的炔基可任選地包含一個或多個進一步的取代基。此處所用的術語"氨烷基"指氨基取代的烷基。該術語包括了在任何位置具有氨基取代基的CVd2烷基基團，其中該烷基基團將氨烷基連接至母體分子。氨烷基基團的烷基和/或氨基部分可以被取代基進一步取代。此處所用的術語"脂肪族"指最多包含二十四個^f友原子的直鏈或支鏈烴基，其中任意兩個碳原子之間的飽和度為單、雙或三鍵。脂肪族基團優選包含1至約24個碳原子，更通常包含1至約12個碳原子，更優選包含1至約6個碳原子。脂肪族基團的直鏈或支鏈可被包括氮、氧、硫和磷等的一個或多個雜原子所中斷。該種被雜原子中斷的脂肪族基團包括但不限於聚烷氧基，例如聚亞烷基二醇、聚胺和聚亞胺。此處所用的脂肪族基團可任選地包括其它取代基。術i吾"脂環族的"指環狀的環系統，其中該環為脂肪族環。該環系統可包含一個或多個環，其中至少一個環為脂肪族環。優選的脂肪環包括環中具有約5至約9個碳原子的環。此處所用的脂肪環可任選地包括其它取代基團。此處所用的術i吾"烷氧基"指在烷基基團和氧原子之間形成的基，其中該氧原子用於連接烷氧基基團和母體分子。烷氧基基團的實例包括，但不限於，甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基等。此處所用的烷氧基基團可任選地包括其它取代基團。此處所用的術語"卣素"指選自氟、氯、溴和碘的原子。此處所用的術語"芳基"和"芳香族的"指具有一個或多個芳環的單或多環碳環系統的基團。芳基基團的例子包括，但不限於，苯基、萘基、四氫化萘基、茚滿基、茚基等。優選的芳基環系統在一個或多個環中具有約5至約20個^_原子。此處所用的芳基基團可任選地包括其它取代基團。此處所用的術語"芳烷基"指在烷基基團和芳基基團之間形成的基，其中該烷基基團可用於連接芳烷基基團和母體分子。例子包括，但不限於，苯甲基、苯乙基等。此處所用的芳烷基基團可任選地包括與烷基、芳基或兩者連接以形成基團的取代基。此處所用的術語"雜環基"指包括至少一個雜原子並且是不飽和、部分飽和或完全飽和的單或多環的環系統基團，因而包括了雜芳基。雜環還包括融合環系統，其中一種或多個融合環包含至少一個雜原子而其它環可包含一個或多個雜原子或任選地不包含雜原子。雜環基團通常包括至少一個選自石克、氮或氧的原子。雜環基團的實例包括，[1，3]二惡茂烷、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唾啉基、。米唾烷基、哌啶基、哌噪基、噪唾烷基、異噪唾烷基、嗎啉基、四氫噻唑基、異四氫噻唑基、喹喔啉基、噠溱酮基、四氫呋喃基等。此處所用的雜環基團可任選地包括其它取代基。此處所用的術i吾"雜芳基"和"雜芳香族的"指包含單或多環芳環、環系統或融合環系統的基，其中至少一個環為芳環且包括一個或多個雜原子。雜芳基還包括例如融合環系統，其包含一個或多個不含雜原子的融合環的系統。雜芳基通常包括選自疏、氮或氧的一個環原子。雜芳基的例子包括，但不限於，吡啶基、吡。秦基、嗜啶基、吡p各基、吡唑基、。米唑基、瘞唑基、噪唑基、異噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、苯疏基、呋喃基、四氬喹啉基、異四氫唾啉基、苯並咪唑基、苯並噁唑基、喹喔啉基等。雜芳基可直接或通過脂肪族基團或雜原子等連接部分連接至母體分子。此處所用的雜芳基任選地包括其它取代基。此處所用的術語"雜芳烷基"指具有可將雜芳烷基基團連接至母體分子的烷基的如前文定義的雜芳基。例子包括，但不限於，吡啶甲基、嗜啶乙基、27萘啶基丙基等。此處所用的雜芳烷基基團可在雜芳環或烷基部分的一個或兩者上任選地包括其它取代基團。本發明中採用的術語"單或多環結構"包括具有融合或聯接的環的單或多環的所有環系統，並包括獨立選自脂肪族、脂環族族、芳基、雜芳基、芳烷基、雜環、雜芳基、雜芳香族、雜芳烷基的單環和混合環系統。該種單或多環結構可包含一致或變化的飽和度(包括完全飽和、部分飽和或完全不飽和)的環。各個環可包含選自C、N、O和S的環原子以形成雜環以及僅含有C環原子的環，其可表示為混合基序，例如，苯並咪唑，其中一個環僅具有石友環原子而融合環具有兩個氮原子。單或多環結構可進一步被取代基取代，例如，具有連接至其中一個環的兩個=0基的鄰苯二甲醯亞胺。在另一方面，單或多環結構可直接通過環原子，通過取代基或雙功能連接部分連接到母體分子。此處所用的術語"醯基"指從有機酸去除羥基基團並具有通式-C(O)-X的基團，其中X通常為脂肪族、脂肪環族或芳香族。例子包括脂肪族羰基、芳香羰基、脂肪磺醯基、芳香亞磺醯基、脂肪族亞磺醯基、芳香磷酸酯、脂肪族磷酸酯。此處所用的醯基基團可任選地包括其它取代基。術語"烴基"包括包含C、O、H的基團。包括具有任意飽和度的直鏈、支鏈和環狀基團。這樣的烴基基團可包括一個或多個選自N、O和S的雜原子並可進一步被一或多個取代基單或多取代。此處所用的術語"取代基"包括通常添加至其它基團或母體化合物以增強所需性質或產生所需效果的基團。取代基可以是保護的或未保護的，並可添加至母體化合物的一個或多個可能的位點。取代基還可進一步被其它取代基所取代並且可以直接或通過聯接基團(例如烷基或烴基基團)連接至母體化合物。該種基團包括但不限於卣素、羥基、烷基、烯基、炔基、醯基(-C(O)Raa)、羧基(-C(O)O-Raa)、脂肪族基團、脂肪環族基團、烷氧基、取代的氧代(-O-Raa)、芳基、芳烷基、雜環基、雜芳基、雜芳烷基、氨基(-NRbbRce)、亞氨基(-NRbb)、氨基(-C(O)N-RbbRcc或-N(Rbb)C(O)Raa)、疊氮基(-化)、硝基(-N02)、氰基(-CN)、脲基(-OC(O)NRbbRee或-N(Rbb)C(0)ORJ、脲基(-N(Rbb)C(O)NRbbRcc)、疏脲基(-N(Rbb)C(S)NRbbRcc)、胍基(-N(Rbb)C—NRbb)NRbbRcc)、amidinyl(-C(=NRbb)NRbbRce或-N(Rbb)C(NRbb)Raa)、硫醇(-SRbb)、亞磺醯基(-S(0)Rbb)、磺醯基(-S(0)2RH)、磺醯氨基(-S(0)2NRbbR^或-N(RHbb)-S(0)2Rbb)以及共軛基團。其中Raa、Rbb和Rcc分別獨立為H，任選聯接的化學功能基團或進一步的取代基，其優選列表包括但不限於H、烷基、烯基、炔基、脂肪族、烷氧基、醯基、芳基、芳烷基、雜芳環、脂環族、雜環基和雜芳烷基。術語"氧代"指基團(=0)。此處所述的化合物(例如，雙環核苷)可通過例如，如下文實施例所示的任意有機合成的適用技術進行製備。眾多該類技術已為本領域公知。多種已知技術歹'J舉於CompendiumofOrganicSyntheticMethods(JohnWiley&Sons,NewYork)第1巻,IanT.Harrison和ShuyenHarrison(1971);第2巻,IanT.Harrison和ShuyenHarrison(1974);第3巻,LouisS.Hegedus和LeroyWade(1977);第4巻，LeroyG.WadeJr.,(1980);第5巻，LeroyG.WadeJr.(1984);和第6巻，MichaelB.Smith;以及March,J.,AdvancedOrganicChemistry,第3版,JohnWiley&Sons,NewYork(1985);ComprehensiveOrganicSynthesis.Selectivity,Strategy&EfficiencyinModernOrganicChemistry,第9巻中,BarryM.Trost主編,PergamonPress,NewYork(1993);AdvancedOrganicChemistry,PartB:ReactionsandSynthesis,第4版；Carey和Sundberg;KluwerAcademic/PlenumPublishers:NewYork(2001);AdvancedOrganicChemistry,Reactions,Mechanisms,andStructure,第2版,March,McGrawHill(1977);ProtectingGroupsinOrganicSynthesis,第2版,Greene,T.W.，和Wutz，P.G.M.,JohnWiley&Sons,NewYork(1991);以及ComprehensiveOrganicTransformations,第2版，Larock,R.C.,JohnWiley&Sons,NewYork(1999)。在本發明的一方面中，寡聚化合物可通過共價連接一個或多個共軛基團進行修飾。一般而言，共軛基團可修飾所連接的寡聚化合物的一種或多種屬性，包括但不限於，藥效動力學、藥代動力學、結合、吸收、細胞分布、細胞攝取、儲存和清除。共軛基團常用於化學領域並直接或通過任選聯接部分或聯接基團聯接至諸如寡聚化合物等的母體化合物。共軛基團的優選列表包括但不限於，嵌入劑、報告分子、多胺、聚醯胺、聚乙二醇、疏醚、聚醚、膽固醇、疏膽固醇、膽酸部分、葉酸、脂肪、磷脂、生物素、吩溱、菲啶、蒽醌、金剛烷、吖啶、螢光素、若丹明、香豆素和染料。如本領域技術人員所知的聯接基團或雙功能聯接部分可適用於本發明。聯接基團可用於將化學功能基團、共軛基團、報告基團和其它基團連接至如寡聚化合物等母體化合物的選擇性位點。一般而言，雙功能聯接部分包含具有兩個功能基團的烴部分。功能性基團之一被選擇用於結合母體分子或乾標化合物，而另一基團被選擇用於主要結合任意選定基團，例如化學功能性基團或共軛基團。在一些實施方案中，該接頭包含重複單元例如乙二醇或胺基酸單元的鏈結構或寡聚體。在雙功能聯接部分中常用的功能基團的實例包括，但不限於，用於與親核基團反應的親電試劑以及用於與親電基團反應的親核試劑。在一些實施方案中，雙功能聯接部分包括氨基、鞋基、羧酸、疏醇、不飽和性(例如，雙或三鍵)等。雙功能聯接部分的部分非限制性實例包括8-氨基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、琥珀醯亞胺4-[N-馬來醯亞胺基甲基]環己烷-l-羧酸(SMCC)以及6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其它的聯接基團包括但不限於，取代的Q-do烷基、取代的或未取代的C2-Cu)烯基或取代的或未取代的C2-C10炔基，其中優選取代基的非限制性列表包括羥基、氨基、烷氧基、羧基、苯甲基、苯基、硝基、疏醇、疏烷氧基、囟素、烷基、芳基、烯基以及炔基。此處所用的術i吾"保護性基團"指如下所述的化學部分，其在本領域中已知可針對合成過程中不希望出現的反應來保護反應性基團(包括但不限於幾基、氨基和疏醇基等)。保護性基團通常可以選擇性和/或正交採用以在其它活性位點的反應中保護位點，並可隨後去除以留下不受保護的基團或供進一步反應。本領i或已知的4呆護性基團一般描述於Greene和Wuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,第3版，JohnWiley&Sons,NewYork(1999)。基團可作為前體選擇性地結合至本發明的寡聚化合物。例如氨基基團可作為疊氮基團結合進本發明的化合物，並可在合成中理想的時間點被化學轉化為氨基基團。一般來說，基團可被保護或作為前體存在，其對於修飾母體分子其它部位的反應呈現惰性，以在適當的時間轉化成為其最終的基團。其它代表性保護或前體基團的討論參見Agrawal,等人，ProtocolsforOligonucleotideConjugates,Eds,HumanaPress;NewJersey,1994;第26巻，第1-72頁。羥基保護基團的實例包括，但不限於，乙醯基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氫吡喃基、1-乙氧基乙基、l-(2-氯乙氧基)乙基、對氯苯基、2,4-二硝基苯基、苯甲基、2,6-二氯苯甲基、二苯基甲基、對硝基苯甲基、二(2-乙醯氧基乙氧基)甲基(ACE)、2-三甲基矽烷基乙基、三甲基矽烷基、三乙基矽烷基、叔丁基二甲基矽烷基、叔丁基二苯基矽烷基、三苯甲基矽烷基、[(三異丙基矽烷基)氧基]甲基(TOM)、苯甲醯甲酸鹽、氯乙醯基、三氯乙醯基、三氟乙醯基、特戊醯基、苯甲醯基、對苯基苯甲醯基、9-剪甲基碳酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、三苯甲基(trityl)、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、三甲氧基三苯甲基、1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(FPMP)、9-苯基黃嘌呤-9-基(Pixyl)以及9-(對甲氧基苯基)黃嘌呤-9-基(MOX)。其中優選的羥基保護基團包括但不限於，苯甲基、2,6-二氯苯甲基、叔丁基二甲基矽烷基、叔丁基二苯基矽烷基、苯甲醯基、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、二甲氧基三苯甲基(DMT)、9-苯基黃噤呤-9-基(Pixyl)以及9-(對甲氧基苯基)黃噤呤-9-基(MOX)。氨基保護基團的實例包括但不限於，氨基甲酸鹽保護基團，例如，2-三甲基矽烷基乙氧基羰基(Teoc)、l-甲基-l-(4-聯苯基)-乙氧基羰基(Bpoc)、叔丁氧基羰基(BOC)、烯丙氧基羰基(Alloc)、9-芴甲基甲基氧基羰基(Fmoc)、以及苯甲基氧基羰基(Cbz);醯胺保護基團，例如甲醯基、乙醯基、三卣代乙醯基、苯甲醯基、以及硝基苯基乙醯基；磺醯胺保護基團，例如2-硝基苯磺醯基；以及亞胺和環狀醯亞胺保護基團，例如苯二甲醯亞胺和二石克琥珀醯基。疏醇保護基團的實例包括，但不限於，三苯甲基(trityl)、苯甲基(Bn)等。在一些優選的實施方案中，可以用任選被保護的含磷核苷間聯接來連接核苷從而製備寡聚化合物。含磷核香間聯接(例如磷酸二酯和硫代磷酸酯聯接)的代表性保護基團包括P-氰乙基、二苯基矽烷基乙基、S-氰丁烯基、氰對二甲苯基(CPX)、N-甲基-N-三氟乙醯乙基(META)、乙醯氧基苯氧基乙基(APE)以及丁烯-4-基基團。例如參見美國專利號4,725,677以及Re.34,069(p-氰乙基);Beaucage,S丄.和Iyer,R.P.,Tetrahedron,49No.10,第1925-1963頁(1993);Beaucage,S丄.和Iyer,R.P.,Tetrahedron,49No.46,第10441-10488頁(1993);Beaucage,S丄.和Iyer,R.P.,Tetrahedron,48No.12，第2223-2311頁(1992)。此處所用的術語"正交保護"指以不同類別的保護性基團保護的功能基團，其中各類保護性基團可以按任意順序並在所有其它類別存在的情況下去除(例如，Barany,G.和Merrifield,R.B.,J.Am.Chem.Soc,1977,99,7363;idem,1980,102,3084.)。正交保護已在例如自動寡核普酸合成等領域得到了廣泛應用。功能基團可在一種或多種不受去阻斷過程影響的其它被保護功能基團的存在下被去阻斷。該被去阻斷的功能基團以某種形式反應，且在某一時間點另一正交保護性基團在一組不同反應條件下被去除。這使得可以用選擇性化學法獲得所需的化合物或寡聚化合物。本發明提供了具有可用於形成核香間聯接(包括例如磷酸二酯和疏代磷酸酯核苷間聯接)的活性磷基團的化合物。該種活性磷基團已為本領域所知並包含處於Pin或Pv價態的磷原子，包括但不限於亞磷醯胺、H-磷酸酯、磷酸三酯和含磷手性助劑。優選的合成的固相合成採用亞磷醯胺(P111化學)作為反應性亞磷酸。在優選的實施方案中，中間體亞磷酸化合物隨後通過已知的方法被氧化至pv狀態以獲得磷酸二酯或疏代磷酸酯核苷酸間聯接。其它的活性磷酸酉旨牙口亞石粦酸才皮露於TetrahedronReportNumber309(Beaucage牙口Iyer,Tetrahedron,1992，48,2223-2311)。可用於本發明的寡聚化合物的特定實例包括含有修飾的例如非天然的核要類別。具有磷原子的修飾的核苷間聯接包括，但不限於，疏代磷酸酯、手性疏代磷酸酯、二疏代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基磷酸酯包括3，-亞烴基磷酸酯、5，-亞烴基磷酸酯以及手性磷酸酯、亞磷酸酯、氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基碌酸酯、疏羰基氨基磷酸酯、疏羰基烷基磷酸酯，疏羰基烷基磷酸三酯、具有正常3，-5，鍵的硒代磷酸酯和硼代磷酸酯、它們的2'-5'聯接的類似物，以及具有反轉極性的硒代磷酸酯和硼代磷酸酯，其中一種或多種核香酸間聯接為3'至3'、5'至5'或2'至2'聯接。具有反轉極性的寡核脊酸可在3'-最末端核普酸間聯接包含單個3，至3'聯接，即，可能是無鹼基(核苷鹼基缺失或該位置被鞋基取代)的單個反轉核苷殘基。可包括多種鹽、混合鹽和游離酸的形式。指導製備上述含磷聯接的代表性美國專利包括但不限於，美國專利號3,687,808;4,469,863;4,476,301;5,023,243;5,177,196;5,188,897;5,264,423;5,276,019;5,278,302;5,286,717;5,321,131;5，399，676;5,405,939;5,453,496;5,455,233;5,466,677;5,476,925;5,519,126;5,536,821;5,541,306;5,550,111;5,563,253;5,571,799;5,587,361;5,194,599;5,565,555;5,527,899;5,721,218;5,672,697以及5,625,050，其中某些專利為與本申請共同擁有的專利，各專利全文在此引用作為參考。不具有磷原子的修飾的核苷間聯接包括但不限於，由短鏈烷基或環烷基核苷間聯接、混合雜原子和烷基或環烷基核苷間聯接，或者一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷間聯接構成的核苷間聯接。這包括具有矽氧烷骨架；疏化物，亞碸和碸骨架；甲縮醛和闢u甲縮醛骨架;亞甲基甲縮醛和石克甲縮醛骨架;核糖乙醯骨架;含烯烴骨架；氨基磺酸鹽骨架;亞甲基亞胺和亞甲基肼基骨架;磺酸鹽和磺醯胺骨架;醯胺骨架;和其它具有混合的N，O，S和CH2的組成部分的核苷間聯接。指導製備上述寡核苷酸的代表性美國專利包括但不限於，美國專利號5,034,506;5,166,315;5,185,444;5,214,134;5,216,141;5,235,033;5,264,562;5,264,564;5,405,938;5,434,257;5,466,677;5,470,967;5,489,677;5,541,307;5,561,225;5,596,086;5,602,240;5,610,289;5,602,240;5,608,046;5,610,289;5,618,704;5,623,070;5,663,312;5,633,360;5,677,437;5,792,608;5,646,269以及5，677,439，其中某些專利為與本申請共同擁有的專利，各專利全文在此引用作為參考。此處描述的化合物包含一個或多個不對稱中心，並因此形成了對映體、非對映體以及其它立體異構形式，其從絕對立體化學的角度可定義為(R)-或(S)-、a或p、或(D)-或(L)-(如胺基酸)。本發明意在包括所有這些可能的異構體，以及它們的外消旋和光學純形式。光學異構體可通過上述的過程由其相應的光學活性前體製備，或通過拆分外消旋混合物進行製備。該種拆分可在拆分劑的存在下，通過色譜或重複結晶或本領域技術人員已知的這些技術的組合進行。有關拆分進一步的細節可參見Jacques,等人，Enantiomers，Racemates,andResolutions(JohnWiley&Sons,1981)。當此處所述的化合物包含烯烴雙鍵、其它不飽和性或其它幾何不對稱中心時，除非另行指明，該化合物意在同時包括E和Z幾何異構體或順式-和反式-異構體。同樣地，同樣意在包括所有的互變異構形式。此處所示的任意碳-碳雙鍵的構型僅為便利目的選擇，若非文中指明，並非意在指定特定的構型；因此，此處任意描述的碳-碳雙鍵或碳-雜原子雙鍵可以是順式、反式或任意比例的兩者的混合物。本發明的上下文中的術語"寡聚化合物"指具有至少一個能與核酸分子雜交的區域的聚合物。術語"寡聚化合物"包括寡核苷酸、寡核苷酸類似物和寡核苷以及核苷酸模擬物和/或包含核酸和非核酸成分的混合聚合物。寡聚化合物通常可線性製備，但可連接或以其它方式製備成環狀，且還可包括分支。寡聚化合物可形成雙鏈構建4本，例如，雜交形成雙鏈組合物的雙鏈。該雙Mi旦合物可連接或分離並可在末端包含懸端(overhangs)。一般而言，寡聚化合物包含聯接的單體亞基的骨架，其中每個聯接的單體亞基直接或間接地連接至雜環鹼基部分。寡聚化合物還可包括未聯接至雜環鹼基部分的單體亞基，從而提供非鹼基位點。這些聯接連接單體亞基、糖部分或替代物，且該雜環鹼基部分可被獨立修飾。包括或不包括雜環鹼基的聯接-糖單元可被肽核酸單體等模擬物取代。在寡聚化合物的各個位點修飾或取代部分或全部單體的能力可形成大量可能的基序。如本領域所知，核苷是鹼基-糖組合。核普的鹼基部分通常為雜環鹼基部分。該種雜環鹼基最常見的兩種類別為噤呤和嘧啶。核苦酸為進一步包括了共價聯接至核苷糖部分的磷酸基團的核苷。對於包含了呋喃戊糖的核香，該磷酸基團可被聯接至糖的2'、3'或5'羥基部分。在形成聚核苷酸時，該磷酸基團共價聯接彼此相鄰的核苷以形成線性聚合化合物。該線性聚合結構的相應末端可被連接以通過雜交或通過形成共價鍵得到環狀結構，然而，通常希望開放的線性結構。在寡核苷酸結構中，磷酸基團通常形成寡核苷酸的核苷間聯接。RNA和DNA的常見核香間聯接為3'至5'磷酸二酯聯接。在本發明的上下文中，術語"寡核苷酸"指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的寡聚體或聚合物。該術語包括由天然存在的核苷鹼基、糖和共價核香間聯接構成的寡核苷酸。術語"寡核苷酸類似物"指具有一個或多個非天然存在部分的寡核苷酸。該種非天然存在的寡核普酸由於其具有理想的性質而通常比天然存在的形式更理想，例如，提高的細胞攝取，對核酸耙標增強的親和力以及在核酸酶存在下提高的穩定性。在本發明的上下文中，術語"寡核苷，，指由不帶磷原子的核普間聯接連接的核苷序列。該種類型的核普間聯接包括短鏈烷基、環烷基、混合雜原子烷基、混合雜原子環烷基、一或多種短鏈雜原子以及一或多種短鏈雜環。這些核苷間聯接包括，但不限於，矽氧烷、疏化物、亞碸、碸、乙醯基、甲縮醛、疏甲縮醛、亞甲基甲縮醛、碌u甲縮醛、烯基、氨基磺酸鹽、亞甲基亞胺基、亞甲基肼基、磺酸鹽、磺醯胺、醯胺和其它具有混合的N、O、S和CH2的組成部分的核普間聯接。指導製備上述寡核苷酸的代表性美國專利包括但不限於，美國專利號5,034,506;5,166,315;5,185,444;5,214,134;5,216,141;5,235,033;5,264,562;5,264,564;5,405,938;5,434,257;5,466,677;5,470,967;5,489,677;5,541,307;5,561,225;5,596,086;5,602,240;5,610,289;5,602,240;5,608,046;5,610,289;5,618,704;5,623,070;5,663,312;5,633,360;5,677,437;5,792,608;5,646,269以及5,677,439，其中某些專利為與本申請共同擁有的專利，各專利全文在此引用作為參考。此處所用的術語"核香鹼基"或"雜環鹼基部分"意在與"核酸鹼基或其模擬物"同義。一般而言，核苷鹼基為含有一個或多個能與核酸鹼基氫聯接結合的原子或原子組合的任意結構。此處所用的"未修飾的"或是"天然的"核苷鹼基包括噤呤鹼基腺噤呤(A)和鳥嘌呤(G),以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嗜啶(U)。修飾的核苷鹼基包括其它合成的和天然的核苷鹼基，例如，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃噤呤、2-氨基腺噤呤、腺噤呤和鳥噤呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺噤呤和鳥噤呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-疏代尿嘧啶、2J克代胸腺嘧啶和2J克代胞嘧啶、5-卣代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C^C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶鹼基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嗜啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-疏代尿嘧啶、8-卣代、8-氨基、8-疏醇、8-疏代烷基、8-羥基和其它8-取代的腺噤呤和鳥噤呤、5-卣代特別是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥噤呤和7-甲基腺噤呤、2-F-腺噤呤、2-氨基-腺"票呤、8-氮雜鳥噪呤和8-氮雜腺噪呤、7-去氮鳥噤呤和7-去氮腺噤呤、3-去氮鳥噪呤和3-去氮腺噤呤、通用i威基、疏水》威基、混雜鹼基、大小擴增鹼基以及此處定義的氟化鹼基。其它修飾的核脊鹼基包括三環嘧啶如吩噁嗪胞啶(lH-嘧啶並[5，4-b][l,4]苯並噁"秦-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞啶(lH-嘧啶並[5,4-b][l,4]苯並噻喚-2(3H)-酮)、G型夾(G-clamps)例如取代的吩噁嗪胞啶(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶並[5,4-b][l，4]苯並噁嗪-2(3H)-酮)、呼唑胞啶(2H-嘧啶並[4,5-b]"引咮-2-酮)、吡啶吲哚胞啶(H-吡啶[3，,2，:4,5]吡咯並[2,3-d]嗜啶-2-酮)。修飾的核苷鹼基還可包括以其它雜環取代噤呤或嘧啶鹼基的核苷鹼基，例如7-去氮-腺嘌呤、7-去氮鳥苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其它的核苷鹼基包括披露於美國專利3,687,808的核苷鹼基，披露於TheConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineering,第858-859頁,Kroschwitz,J丄編，JohnWiley&Sons,1990的核普石威基；披露於Englisch等人，AngewandteChemie,InternationalEdition,1991，30,613的才亥苦石威基；以及才皮露於Sanghvi,Y.S.,第15章，AntisenseResearchandApplications,第289-302頁，Crooke，S.T.和Lebleu，B.編，CRCPress,1993的核苷鹼基。修飾的核普鹼基包括，但不限於，此處定義的通用鹼基、疏水鹼基、混雜鹼基、大小擴增鹼基以及氟化鹼基。這些核普鹼基中部分可特別用於提高本發明的寡聚化合物的結合親和力。這包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的噤呤，包括2-氨基丙基腺噤呤、5-丙炔基尿嘧咬和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代基已顯示可以提高核酸雙鏈穩定性0.6誦1.2。C(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.牙口Lebleu,B.編,AntisenseResearchandApplications,CRCPress,BocaRaton,1993,第276-278頁)並且是目前優選的石威基取代基，特別是在與2，-0-甲氧基乙基糖修飾組合時。38指導製備某些上述提到的修飾核苷鹼基以及其它修飾的核普鹼基的代表性美國專利包括，但不限於，上述美國專利3,687,808以及美國專利4,845,205;5,130,302;5,134,066;5,175,273;5,367,066;5,432,272;5,457,187;5,459,255;5,484,908;5,502,177;5,525,711;5,552,540;5,587,469;5,594,121;5,596,091;5,614,617;5,645,985;5,830,653;5,763,588;6,005,096;以及5,681,941,其中某些專利為與本申請共同擁有的專利，各專利全文在此引用作為參考；以及美國專利5,750,692，其為與本申請共同擁有的專利，並在此引用作為參考。本發明的寡聚化合物還可包含一種或多種具有修飾糖部分的核苷。呋喃基糖環可以多種方式修飾，包括以取代基取代，橋連形成BNA以及以S或N(R)等雜原子取代4'-0。指導該種修飾糖的製備的部分代表性美國專利包括，但不限於，美國專利4,981,957;5,118,800;5,319,080;5,359,044;5,393,878;5,446,137;5,466,786;5,514,785;5,519,134;5,567,811;5,576,427;5,591,722;5,597,909;5,610,300;5,627,053;5,639,873;5,646,265;5,658,873;5,670,633;5,792,747;5,700,920;6,600,032以及於2005年6月2日提交並於2005年12月22曰公布為WO2005/121371的國際申請PCT7US2005/019219,其中一部分為與本申請共同擁有的申請或專利，各文獻全文在此引用作為參考。優選的修飾糖的代表性列表包括但不限於具有2'-F、2，-OCH2或2，-0(CH2)2-OCH3取代基的取代糖；4，-疏代修飾的糖以及雙環修飾的糖。此處所用的術語"核苷模擬物"意在包括那些用於替換寡聚化合物的一個或多個位點的糖或非聯接的糖和鹼基的結構，例如，具有嗎啉或雙環[3丄0]己基糖模擬物(例如，具有磷酸二酯聯接的非呋喃糖)的核香模擬物。術語"糖替代物"與含義更廣的術語"核苷模擬物"略微重疊，但僅指糖單元(呋喃糖環)的替換。術語"核苷酸模擬物"意在包括用於替換寡聚化合物的一個或多個位點的核香和聯接的結構，例如，肽核酸或嗎啉(被-N(H)-C^O)-0-或其它非-磷酸二酯聯接的嗎啉)。如本發明所述的寡聚化合物可包含長度從約8至約80個的核普和/或修飾核苷或模擬物。本領域的普通技術人員將可理解本發明包含長度為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個或其中任意範圍的核苷和/或修飾核苷或模擬物的寡聚化合物。在另一實施方案中，本發明的寡聚化合物為長度8至40個的核普和/或修飾核普或模擬物。本領域普通技術人員將可理解其可具體為長度是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個或其中任意範圍的核苷和/或修飾核苷或模擬物的寡聚化合物。在另一實施方案中，本發明的寡聚化合物為長度8至20個的核苦和/或修飾核苷或模擬物。本領域普通技術人員將可理解其可具體為長度是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個或其中任意範圍的核普和/或修飾核苷或模擬物的寡聚化合物。在另一實施方案中，本發明的寡聚化合物為長度10至16個的核普和/或修飾核苷或模擬物。本領域普通技術人員將可理解其可具體為長度是IO、11、12、13、14、15或16或其中任意範圍的核苷和/或修飾核苷或模擬物的寡聚化合物。在另一實施方案中，本發明的寡聚化合物為長度10至14個的核苷和/或修飾核苷或模擬物。本領域普通技術人員將可理解其可具體為長度是IO、11、12、13或14個或其中任意範圍的核苷和/或修飾核香或模擬物的寡聚化合物。嵌合寡聚化合物在兩個或多個位置具有不同的修飾的核苷並通常定義為具有基序。本發明的嵌合寡聚化合物可形成上述兩個或多個寡核脊酸、寡核苷酸類似物、寡聚核苷和/或寡核苷酸模擬物的複合結構。指導製備這樣雜交結構的代表性美國專利包括，但不限於，美囯專利5,013,830;5，149，797;5,220,007;5,256,775;5,366,878;5,403,711;5,491,133;5,565,350;5,623,065;5,652,355;5,652,356;以及5,700,922，其中某些專利為與本申請共同擁有的專利，各專利全文在此引用作為參考。本發明的一方面中，修飾和未修飾的核苷及其模擬物可參照文獻描述的針對DNA(ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs,Ed.Agrawal(1993),HumanaPress)和/或RNA(Scaringe,Methods(2001),23,206-217;Gait等人,ApplicationsofChemicallysynthesizedRNAinRNA:ProteinInteractions,Ed.Smith(1998),1-36;Gallo等人，Tetrahedron(2001),57,5707-5713)合成的適當方法進行寡聚。固相合成的其它方法可參見Caruthers的美國專利4,415,732;4,458,066;4,500,707;4,668,777;4,973,679;和5,132,418;以及Koster的美國專利4,725,677和Re.34,069。常規用於基於支持基質合成寡聚化合物和相關化合物的的商業可獲取設備已由多家供應商出售，包括，例如AppliedBiosystems(FosterCity,CA)。本領域已知的任何其它該類合成方法均可另外或替代性採用。適用的固相技術(包括自動合成技術)的描述可見F.Eckstein(編)，OligonucleotidesandAnalogues,aPracticalApproach,OxfordUniversityPress,NewYork(1991)。隨著對RNAi-投入的增加，RNA和相關類似物的合成相對於DNA和相關類似物的合成也逐漸增加。目前在商業上採用的初級RNA合成策略包括5'-0-DMT-2，-0-叔丁基二甲基矽烷基(TBDMS)、5，-0-DMT-2，-0-[l(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基](FPMP)、2，-0-[(三異丙基矽烷基)氧基]甲基(2，-0-CH2-0-Si(iPr)3(TOM)、以及5'-0-矽醚-2，-ACE(5，-0-二(三甲基矽氧基)環十二烷氧基矽醚(DOD)-2，-0-二(2-乙醯氧基乙氧基)甲基(ACE)。目前提供RNA產品的主要的公司包括PierceNucleicAcidTechnologies、DharmaconResearch乂〉司、AmeriBiotechnologies乂>司禾口IntegratedDNATechnologies乂>司。PrincetonSeparations公司正在推廣RNA合成活化劑，該活化劑才居宣傳可以特別針對TOM和TBDMS化學法減少偶合次數。該種活化劑也適用於本發明。用於商業RNA合成的初級基團為TBDMS=5'-0-DMT-2，-0-叔丁基二甲基矽烷基；TOM=2'-0-[(三異丙基矽烷基)氧基]甲基；DOD/ACE=(5，-0-二(三甲基矽氧基)環十二烷氧基矽醚-2，-0-二(2-乙醯氧基乙氧基)甲基FPMP=5，-0-DMT-2，-0-[l(2-氟苯基)-4-甲氧基派啶-4-基]。所有前述的RNA合成策略均適用於本發明。上述策略的混合(例如，採用一種策略中的5'-保護基團和另一策略中的2，-0-保護基團)通常可根據本發明而調整。在本發明的上下文中，"雜交"指寡聚化合物互補鏈的配對。在本發明中，一種配對機制涉及寡聚化合物鏈的互補核苷或核苷酸鹼基(核苷鹼基)之間的氫4建結合，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氳鍵結合。例如，腺噪呤和胸腺嘧啶為通過形成氫鍵進行配對的互補核普鹼基。雜交可在多種條件下進行。當寡聚化合物與耙標核酸的結合幹擾耙標核酸的正常功能引起活性損失，且當具有足夠程度的互補性以在希望產生特定結合的條件下(即，在體內測定或治療時在生理條件下，以及在進行體外測定時在測定條件下)避免寡聚化合物和非靶標核酸序列的非特異性結合時，寡聚化合物具有特異可雜交性。此處所用的"互補性"指兩個核苷鹼基無論其所在位置精確配對的能力。例如，如果在寡聚化合物某位置的核苷鹼基能夠與耙標核酸(該耙標核酸為DNA、RNA或寡核苷酸分子)某位置的核苷鹼基氫鍵結合，則寡核普酸和靶標核酸之間的氬鍵結合的位置被認為是互補性位置。當各分子中的互補性位置被可以彼此以氫鍵結合的核苷鹼基佔據時，該寡聚化合物和該DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此具有互補性。術語"特異可雜交性"和"互補性"是用於表示足夠數量的核苷鹼基中有足夠精確的配對或互補程度、由此在寡核苷酸和耙標核酸之間形成穩定和特異性結合的術語。在本領域中可以理解寡聚化合物的序列不需要對其耙標核酸具有100%的互補性以達到特異可雜交性。此外，寡核苷酸可在一個或多個片段上雜交從而使中間的或鄰近的片段不參與雜交(例如，環結構或髮夾結構)。本發明的寡聚化合物對其耙向的耙標核酸序列中的耙標區域具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約99%的序列互補性。例如，當寡聚化合物中20個核苷中有18個與靶標區域互補，因而該寡聚化合物具有特異雜交性，則該寡聚化合物具有90%互補性。在該實例中，剩餘的非互補性核苷鹼基可以成簇或散布在互補性核苷鹼基中，不需要彼此鄰近或與互補性核苷鹼基鄰近。同樣地，具有4(四)個非互補性核脊鹼基(其側翼連接兩個與把標核酸完全互補的區域)的長度為18個核苷鹼基的寡聚化合物對靶標核酸具有77.8%的總體互補性，並因此在本發明的範圍之內。寡聚化合物與耙標核酸區域的互補性百分比可通過本領域已知的BLAST程序(基本局部比對搜索工具)和PowerBLAST程序常規測定(Altschul等人，J.Mol.Biol.，1990,215,403-410;Zhang和Madden,GenomeRes"1997,7，649-656)。本發明進一步包括了如反義寡聚化合物、反義寡核普酸、核酶、外部指導序列(EGS)寡核苷酸、選擇性剪切體、引物、探針等寡聚化合物，以及與靶標核酸的至少一個部分雜交的其它寡聚化合物。因此，這些寡聚化合物可以以單鏈、雙鏈、環狀或髮夾寡聚化合物的形式引入，並可包含例如內部或末端突起或環的結構元件。本發明的寡聚化合物在引入系統後可引發一種或多種酶或結構蛋白的作用以實現對#巴標核酸的修飾。該種酶的非限制性實例之一為RNA酶H，一種裂解RNA:DNA雙鏈的RNA鏈的細胞內切酶。本領域已知"類DNA"單鏈寡聚化合物引發RNA酶H。RNA酶H的激活可導致RNA耙標的裂解，從而大大增強寡核苷酸-介導的基因表達抑制的效率。其它的核糖核酸酶(例如屬於RNA酶III和核糖核酸酶L酶家族的核糖核酸酶)也假定具有類似的作用。儘管寡聚化合物的一種形式為單鏈反義寡核香酸，在許多物種中已顯示引入雙鏈結構(例如雙鏈RNA(dsRNA)分子)可以導致基因或其相關基因產物功能的強效和特異性反義介導的減少。該現象同時存在於植物和動物，並被認為與病毒防禦和轉座子沉默具有進化聯繫。在一些實施方案中，在篩選可以調節所選定蛋白表達的其它寡聚化合物中可採用"適當的靶標片段"。"調節劑"為降低或提高編碼蛋白的核酸分子表達、並且至少包含與適當靶標片段互補的8-核苷鹼基部分的寡聚化合物。該篩選方法包括將編碼蛋白的核酸分子的適當靶標片段與一種或多種候選調節劑接觸，並選擇一種或多種提高或降低編碼蛋白的核酸分子表達的候選調節劑的步驟。一旦顯示候選調節劑能夠調節(例如，提高或降低)編碼肽的核酸分子表達，該調節劑可進一步用於肽功能的研究，或如本發明所述用作研究、診斷或治療劑。本發明的適當靶標片段還可與其相應的本發明互補性反義寡聚化合物組合形成穩定的雙鏈寡核苦酸。本領域已顯示該種雙鏈寡核苷酸部分可通過反義機制調節單巴標表達並調節翻譯和RNA加工。此外，對該雙鏈部分還可進行化學修飾(Fire等人，Nature,1998,391,806-811;Timmons和Fire,Nature1998，395,854;Timmons等人，Gene,2001,263,103-112;Tabara等人，Science,1998,282,430-431;Montgomery等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998，95，15502-15507;Tuschl等人，GenesDev.,1999,13,3191-3197;Elbashir等人,Nature,2001，411,494-498;Elbashir等人，GenesDev.2001,15,188-200)。例如，這種雙鏈部分已顯示可通過雙鏈的反義鏈與耙標進行經典雜交從而引發耙標的酶降解來抑制耙標(Tijsterman等人，Science,2002,295,694-697)。本發明的寡聚化合物還可用於藥物開發和靶標確證領域。本發明包含了在藥物開發中使用本發明的寡聚化合物和耙標以闡明蛋白和疾病狀態、表型或症狀之間存在的關係。這些方法包括檢測或調節乾標肽，包括將樣本、組織、細胞或生物體與本發明的寡聚化合物接觸，在處理後一定時間檢測耙標核酸或蛋白水平和/或相關的表型或化學終點，並任選地將測量值與未處理樣本或以本發明其它寡聚化合物處理的樣本進行比較。這些方法可以平行進行或與其它實驗組合進行，以確定靶標確證過程中未知基因的功能，或者測定特定基因產物作為治療或預防特定疾病、症狀或表型的耙標的有效性。核苷修飾對RNAi活性的作用參照現有文獻進行了評估(Elbashir等人，Nature(2001),411,494-498;Nishikura等人，Cell(2001)，107，415-416;以及Bass等人，Cell(2000),101,235-238)。本發明的寡聚化合物可用於診斷、治療、預防，並可作為研究試劑和試劑盒。此外，能特異性抑制基因表達的反義寡核苷酸也常被本領域的普通技術人員用來闡明特定基因的功能或區分生物通路各種組分的功能。對於試劑盒或診斷應用，單獨或與其它寡聚化合物或治療劑聯合使用的本發明寡聚化合物可用作差異性和/或組合分析的工具，以闡明在細胞和組織內表達的基因的部分或完整互補體的表達模式。作為一個非限制性實例，以一種或多種寡聚化合物處理的細胞或組織的表達模式可與未以寡聚化合物處理的對照細胞或組織進行比較，並分析各模式基因表達的差異水平，它們與例如疾病關聯性、信號轉導途徑、細胞定位、以及所檢測基因的表達水平、大小、結構或功能有關。這些分析可在影響表達模式的其它化合物和/或寡聚化合物存在或不存在的情況下對刺激或未刺激細胞進行。本領域已知的基因表達分析方法的實例包括DNA陣列或微陣列(Brazma和Vilo,FEBSLett.,2000,480,17-24;Celis等人,FEBSLett,2000,480，2-16)、SAGE(基因表達系列分析)(Madden等人，DrugDiscov.Today,2000,5,415-425)、READS(消化的cDNA的限制性酶擴增)(Prashar和Weissman,MethodsEnzymol"1999,303,258-72)、TOGA(總基因表達分析)(Sutcliffe等人,Pro"Natl.Acad.Sci.U.S.A"2000,97,1976-81)、蛋白陣列和蛋白組學(Celis等人，FEBSLett"2000,480,2-16;Jungblut等人，Electrophoresis,1999,20,2100-10)、表達序列標記(EST)序列(Celis等人，FEBSLett"2000,480,2-16;Larsson等人,J.Biotechnol.,2000,80,143-57)、消減RNA指紋(SuRF)(Fuchs等人，Anal.Biochem.,2000,286,91-98;Larson等人，Cytometry,2000,41,203-208)、消減克隆、差異展示(DD)(Jurecic和Belmont,Curr.Opin.Microbiol.,2000,3，316-21)、比較基因組雜交(Carulli等人，J.CellBiochem.Suppl.，1998,31,286-96)、FISH(螢光原位雜交)技術(Going和Gusterson,Eur.J.Cancer,1999,35,1895-904)以及質譜方法(To,Comb.Chem.HighThroughputScreen,2000,3,235-41)。本發明的寡聚化合物可用於研究和診斷，因為這些寡聚化合物可與編碼蛋白的核酸雜交。例如，可在此處披露的條件下以在此披露的效率雜交從而成為有效蛋白抑制劑的寡核苷酸將在有利於基因擴增或檢測的條件下分別作為有效的引物或探針。這些引物和探針可用於需要特異性檢測編碼蛋白的核酸分子的方法，並可用於核酸分子擴增以供檢測或在進一步研究中使用。本發明的反義寡核苷酸，特別是引物和探針與核酸的雜交可通過本領域已知的方法進行檢測。該種方法可包括將酶偶聯至寡核苷酸，對該寡核香酸放射性標記或任何其它適用的檢測方法。還可製備使用這些檢測手段檢測樣本中選定蛋白水平的試劑盒。本發明已根據其一些實施方案進行了具體描述，以下實施例僅用於闡述本發明，並非意在對其進行限制。實施例1尿苷6-(R)-甲基BNA亞磷醯胺,(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-l-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(15)的製備formulaseeoriginaldocumentpage48示意圖1(a)TBSC1,Et3N,DMAP,CH2C12,室溫，16小時，來自3的產率為59%;(b)Swern氧化(c)MeMgBr,CeCl3，THF,-78°C，來自3的產率為80%;(d)MsCl,Et3N，DMAP，CH2C12，室溫，16小時，91%;(e)AcOH,Ac20,H2S04,室溫，16小時，88%;(f)尿嗜啶,BSA，TMSOTf,CH3CN,回流，2小時；(g)K2C03,MeOH,室溫，16小時；(h)TBDPSCI,Et3N,DMAP,CH2C12,室溫，16小時，來自8的產率為79%;(i)BC13,CH2C12,-15°C,60%;(j)Et3N.3HF,Et3N,THF,室溫，16小時；(k)DMTCl，嘧啶，室溫，16小時，來自12的產率為89%;(1)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唾，NMI,DMF。A)5-0-(叔丁基二甲基矽烷基)-3-0-苯甲基-1，2-0-異亞丙基-4-C-幾甲基-a-D-赤式-戊呋喃糖(3)通過加料漏鬥在10分鐘內向含有二醇2(12g,38.8mmol,參照Moffatt等人，J.Org.Chem.1979,44,1301,參考1的方法進行製備)、三乙胺(l1.44mL,81.5mmol)以及4-二甲基氨乙基嘧啶(0.47g,3.9mmol)的CH2C12(184mL)冷(0"C)溶液中添加叔丁基二甲基矽烷基氯(6.24g,40.7mmol)的二氯甲烷(lOmL)溶液。添加完成後，將反應逐漸加熱至室溫，並繼續攪拌16小時。用CH2Cl2稀釋反應物，依次以5。/。HCl水溶液、飽和NaHCCb、鹽水洗滌，乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02，以10%至30%的EtOAc/己烷洗脫)純化產生白色固體的醇3(11.53g,59%)和醇4(3.93g,22%)。B)醇(6)將二甲基亞碸(3.36mL,47.5mmol)逐滴加入含有草醯氯(2.08mL,23.7mmol)的CH2C12冷(-78。C)溶液(130mL)。攪拌30分鐘後，向反應中添加醇3(6.7g,15.8mmol)的CH2Cl2溶液(20mL)。在-78。C繼續攪拌45分鐘並向反應中添加三乙胺(10.0mL,71.2mmo1)。在-78。C下將反應物攪拌15分鐘，隨後取走冰浴，並在45分鐘內對反應物逐漸加溫。然後將反應物倒入CH2Cl2中，有機相先後以5。/qHC1水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌，乾燥(Na2S04)並真空濃縮以提供醛5，其在不作進一步純化下使用。將氯化鈰ni(5.84g,23.7mmol)的THF(130mL)懸浮液在室溫下攪拌90分鐘。在冰浴中冷卻反應物，在5分鐘內添加甲基溴化鎂(17.0mL的1M甲基溴化鎂的THF溶液)，繼續攪拌90分鐘。將含有粗製醛5(由前面獲得)的THF(20mL)加入反應物中。繼續攪拌90分鐘後，以飽和NH4C1溶液淬滅反應並將反應物倒入EtOAc。依次以5。/。HCl水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02，以15。/。的EtOAc/己烷洗脫)純化提供醇6(5.52g,來自3的產率為80%)。C)甲磺酸(7)向含有醇6(2.77g，6.4mmol)、三乙胺(l.lmL,7.7mmol)和4-二甲基氨基嘧啶(84mg，0.7mmol)的CH2C12(14mL)冰(0。C)溶液添加甲烷磺醯氯(0.55mL,7.0mmo1)。室溫攪拌l小時後，將反應物倒入CHCl3，有機層依次以5Q/。HC1水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌，乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02，以15%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供甲磺酸7(2.97g,91%)。D)三乙酸酯(8)將濃H2S04(3滴)加入甲磺酸7(2.97g,5.8mmol)的水醋酸(29mL)和乙酸肝(5.8mL)溶液。室溫攪拌l小時後，將反應物倒入EtOAc，有機層依次以水、飽和NaHC03、鹽水洗滌，乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02，以33%至50%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供三乙酸酯8(2.48g,88%)。NMR(CDC13，|3異頭體)57.39-7.30(m,5H),6.23(s,1H),5.37(d,1H),5.19(q,1H)，4.62(d，1H),4.52(d,1H),4.38(s,1H),4.34(d，1H),3.98(d,1H),2.91(s，3H),2.12(s,3H),2.08(s,3H),2.06(s,3H),1.55(d，3H)。LCMS:保留時間1.35分鐘；M+23計算值511.1，實測值511.0。E)核苷(ll)向三乙酸酯8(2.47g,5.0mmol)和尿嘧啶(0.70g，6.3mmol)的CH3CN(15mL)懸浮液添加N,O-二(三甲基矽烷基)乙醯胺(4.9mL，20.0mmol)。在40。C下加熱15分鐘以獲得澄清溶液，向反應中添加三甲基矽烷基三氟甲基磺酸鹽(1.18mL，6.5mmol)。回流2小時後，將反應冷卻至室溫並倒入EtOAc。以飽和NaHC03、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並真空濃縮以提供粗製核香9，其可在不作任何純化下使用。向核苷9(由前面獲得)的MeOH(50mL)溶液添加K2CO3(2.07g，15mmol)。在室溫下攪拌16小時後，真空去除溶劑並在25。/o嘧啶/EtOAc和鹽水中分配殘留物。收集有機相，乾燥(Na2S04)並真空濃縮提4共10，其在不作進一步純化下使用。！H僱R(MeOD):57.74(d,2H),7.29-7.14(m，5H),5,53(d,1H),5.38(s,1H),4,48(s，2H)，4.18(s,1H)，4.14(sm,1H)，3.92(s,1H),3.66(s，2H),1.08(d,3H)。LCMS:保留時間2.40分鐘；M+H計算值360.1，實測值361.0。向核苷10(由前面獲得)、三乙胺(1.4mL,10.0mmol)和4-二曱基氨基嘧啶(80mg,0.7mmol)的CH2C12(9mL)冰((TC)溶液中添加叔丁基二苯基矽烷基氯(1.73mL,6.7mmol)。室溫攪拌16小時後，將反應物倒入EtOAc，依次以5%HC1水溶液、飽和NaHC03洗滌有機相，乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02,以50%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體的核苷11(2.02g,來自8的產率為79%)。F)核苷(12)將三氯化硼(1M三氯化硼的16.7mLCH2Cl2溶液)小心加入核苷11(2.0g,3.3mmol)的CH2C12(40mL)冷(-15。C)溶液。在-15。C下攪拌1小時後，將反應物冷卻至-78。C並通過添加MeOH/CH2Cl2(l:l,10mL)小心淬滅反應。繼續攪拌10分鐘後，將反應物倒入CH2Cl2,依次以5n/。HCl水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機相，乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02，以50%至80%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體的核苷12(1.02g，60%)。G)核苷(13)在聚丙烯管中向核苷12(1.86g,3.7mmol)和三乙胺(1.03mL,7.3mmol)的THF(36mL)溶液中添加三乙胺三氫氟酸鹽(2.98mL，18.3mmol)。室溫攪拌16小時後，真空濃縮反應物並將殘留物溶解於EtOAc。依次以水、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機相，乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02，以15%的MeOH/CHCl3洗脫)純化提供白色固體核苷13(1.31g，產物中摻雜了三乙胺)。H)核普(14)向核苷13(由前面獲得)的嘧啶(18mL)溶液添加4,4，-二甲氧基三苯甲基氯(DMTC1)(1.23g,3.7mmol)。室溫攪拌16小時後，向反應添加額外的DMTC1(0.12g)，繼續攪拌8小時。然後將反應物倒入EtOAc，隨後以鹽水萃取有機相，乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02，以15。/。的丙酮/CHCl3洗脫)純化^是供白色泡沫狀的核苷14(1.85g,89%)。^麗R(CDC13):S8.03(d，1H)，7.44-2.28(m,14H),6.86(d,4H),5.63(d,1H),5.60(s,1H),4.32(m,1H)，4.13(s,1H),3.81(s,6H),3.49(d,1H),3.37(d,1H)，1.18(d,3H)。I)亞磷醯胺,(lS,3R,4R,6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]_1_(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(15)的製備將2-氰乙基四異丙基亞磷二醯胺(0.69mL,2.2mmol)加入核苷14(0.83g,1.4mmol)、四唑(80mg,1.2mmol)和N-甲基咪哇(29|iL,0.36mmol)的DMF(7.2mL)溶液中。室溫攪拌8小時後，將反應物倒入EtOAc，依次以90%鹽水、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並濃縮。將殘留物溶解於最少量的EtOAc中，將該溶液添加至己烷中。收集所得的沉澱物，進一步通過柱層析(Si02,以66%至75%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體亞磷醯胺15(1.04g,94%)。31PNMR(CDC13)S:149.21,149.79。實施例2formulaseeoriginaldocumentpage53示意圖2(a)TBSCI,咪唑，DMF，室溫，16小時，99%;(b)P0C13,1,2,4-三唑,Et3N，CH3CN,室溫，4小時；(c)NH3水溶液，1,4-二惡坑，室溫，16小時；(d)Bz20,DMF，室溫，16小時，來自15的產率為90%;(e)Et3N.3HF，Et3N,THF,室溫，16小時，93%;(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四唾,NMI,DMF,95%。A)核苷(16)將叔丁基二甲基矽烷基氯(0.79g，5.2mmol)添加至核苷14(1.0g,1.7mmol)和咪唑(0.70g,10.4mmol)的DMF(3.5mL)溶液。室溫攪拌16小時後，將反應物倒入EtOAc,以鹽水萃取有機相，乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02，以50%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體的核苷16(1.17g，99%)。B)核苷(19)將三氯氧磷(1.27mL,13.6mmol)添加至1,2,4-三唑(4.0g，58.0mmol)的CH3CN(21mL)冷((TC)懸浮液中。攪拌15分鐘後，向反應中添加三乙胺(9.57尿普N-Bz-胞嘧啶-6-(R)-甲基BNA亞磷醯胺,(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲醯胞嘧啶_1_基)_6-甲基-2,5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(21)的製備formulaseeoriginaldocumentpage53mL,68mmol)，繼續攪拌30分鐘。在0。C下向反應中添加核苷16(1.17g,1.7mmol)的CH3CN(10mL)溶液。攪拌10分鐘後，去除冰浴並在室溫下攪拌反應物4小時。真空去除溶劑，在EtOAc和水之間分配殘留物。然後以飽和NaHC03、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並真空濃縮以提供粗產物17，其可在不作任何純化下使用。將氨水(4mL)添加至核普17(由前面獲得)的二惡烷(20mL)溶液中。在室溫下攪拌16小時，真空濃縮反應物並在高度真空下乾燥8小時以提供核苷18,其可在不作任何純化下使用。向核普18(由前面獲得)的DMF(3mL)溶液添加苯甲酸酐(0.65g，2.9mmol)。室溫攪拌16小時後，將反應物倒入EtOAc,以飽和NaHC03、鹽水萃取有機相，乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02,以50%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體的核苷19(1.2g,來自16的產率為90%)。C)核苷(20)在聚丙烯管中向核苷19(1.86g,3.7mmol)和三乙胺(1.03mL,7.3mmol)的THF(15mL)溶液添加三乙胺三氫氟酸鹽(1.48mL,9.1mmo1)。室溫下攪拌16小時後，真空濃縮反應物並將殘留物溶解於EtOAc，依次以水、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機相，乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02,以5%MeOH/CHCl3洗脫)純化提供白色固體核苷20(0.91g,90%)。&NMR(MeOD)S:8.62(d,1H),8.02(d.IH),7.63(m,6H)，7.38(m,7H),6.96(d，4H),6.65s，1H),4.49(s,1H),4.36(s,1H),4.25(m,1H),3.53(d,1H),3.41(d，1H),1.18(d,3H)。D)(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲醯胞嘧啶-l-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(21)將2-氰乙基四異丙基亞磷二醯胺(0.63mL,2.0mmol)加入含有核苷20(0.89g,1.3mmol)、四哇(73mg,l.lmmol)和N-甲基咪哇(26^L,0.33mmol)的DMF(6.6mL)溶液中。室溫攪拌8小時後，將反應物倒入EtOAc，依次以90%鹽水、鹽水洗滌有機相，乾燥(Na2S04)並濃縮。將殘留物溶解於最少量的EtOAc，將該溶液添加至己烷。收集所得的沉澱物，進一步通過柱層析(Si02，以75%至90%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體亞磷醯胺21(1.1g,95%)。31P麗R(CDC13)5:149.34,149.77。實施例3尿苷-6-(S)-甲基BNA亞磷醯胺,(lS，3R，4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(38)的製備formulaseeoriginaldocumentpage56示意圖3(a)NaH，溴化萘，DMF,室溫，2h,98%;(b)醋酸，H20,室溫，16小時；(c)NaI04,二惡烷，H20,室溫，90分鐘；(d)HCHO,NaOH，THF,H20,室溫，16小時，由22為80%;(e)TBDPSC1,Et3N,DMAP,CH2C12，室溫，16小時，61%;(f)草醯氯，DMSO,Et3N,-78°C;(g)MeMgBr,CeCl3，來自26的產率為89%;(h)草醯氯,DMSO，Et3N,-78°C;(i)DiBAL，CH2C12,隱78。C;(j)MsCl,Et3N,DMAP，CH2C12,室溫，1小時；(k)Ac20，AcOH,H2S04,由28為58%;(1)BSA,尿嘧啶，TMSOTf,MeCN,回流，2小時；(m)K2C03，MeOH，室溫，16小時，來自34的產率為76%;(n)DDQ,CH2C12,H20,室溫，8小時，80%;(o)Et3N.3HF,Et3N,THF,定量;(p)DMTC1,嘧啶，室溫，16小時，86%;(q)CN(CH2)2OP(NiPr2)2,四唑，NMI,DMF，97%。A)醇(22)將氬化鈉(2.39g,59.8mmol)小心添加至可從市場購得的1,2:5,6-二-O-異亞丙基-a-D-呋喃阿洛糖1(12.0g,46mmol)的DMF(75mL)冷(0。C)溶液中。攪拌20分鐘後，向反應中添加溴化萘(11.12g，50.8mmol)並繼續攪拌2小時。以H20小心淬滅反應並將其倒入EtOAc，以水、鹽水洗滌有機層，乾燥並濃縮。柱層析(Si02，以10%至33%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體醇22(18.1g,98%)。B)二醇(25)將醇22(18g,46mmol)溶解於冰醋酸(150mL)和H20(60mL)。在室溫下攪拌反應物16小時，然後將其真空濃縮。然後將殘留物溶解於EtOAc，以飽和NaHC03、鹽水洗滌有機層，乾燥並濃縮得到粗品23,其在不作進一步純化下使用。將高碘酸鈉(48mmol,10g)水溶液(350mL)添加至上面獲得的粗產品二醇23的1,4-二惡烷(140mL)的溶液。室溫攪拌90分鐘後，以EtOAc萃取反應物，以水、鹽水進一步洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並濃縮得到醛24，其可不作進一步純化下使用。將由前面獲得的粗品醛24溶解於THF:H20(1:1,100mL)混合物，並將反應物在冰浴中冷卻。向反應中添加甲^(25mL,35。/。w/w)和1NNaOH(100mL)。室溫攪拌16小時後，向反應添加甲醛(5mL)並繼續攪拌32小時。將反應物濃縮至乾燥，在EtOAc和水之間分配殘留物。分層並以另外的1NNaOH、水、鹽水洗滌有機相，乾燥並濃縮得到白色固體二醇25(12.96g,80%,三步)。C)醇(26)將叔丁基二苯基矽烷基氯(0.75mL,2.9mmol)添加至二醇25(1g,2.8mmol)和三乙胺(0.45mL,3.2mmol)的冷(0。C)溶液。室溫攪拌16小時後，將反應物倒入EtOAc，並依次用5%HC1、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機相，乾燥(Na2SOzt)並濃縮。柱層析(Si02，以10%至40%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供油狀的醇26(1.02g，61。/o)(還分離得到0.42g區域異構矽保護的二醇)。D)醇(28)將二甲基亞碸(1.6mL,22.4mmol)逐滴加入草醯氯(0.98mL,11.2mmol)的CH2Cl2(70mL)冷(-78。C)溶液。攪拌30分鐘後，向反應中添加醇26(4.8g,8.0mmol)的CH2C12(20mL)溶液。在-78。C繼續攪拌45分鐘並向反應中添加三乙胺(4.72mL,33.7mmo1)。在-78。C下將反應物攪拌15分鐘，隨後取走冰浴，並在45分鐘內對反應物逐漸加溫。然後將反應物倒入CH2C12，依次以5。/。HCl水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌，乾燥(Na2S04)並真空濃縮以^是供醛27，其可在不作進一步純化下使用。將氯化鈰111(2.96g,12.0mmol)的THF(50mL)懸浮液在室溫下攪拌90分鐘。在冰浴中冷卻反應物，歷經5分鐘添加甲基溴化鎂(1.4M甲基溴化鎂的8.6mLTHF的溶液，12mmol)，繼續攪拌90分鐘，然後將反應冷卻至-78'C。將粗醛27(由前面獲得)的THF(20mL)溶液加入反應物。繼續攪拌90分鐘後，以飽和NH4C1溶液淬滅反應並倒入EtOAc。依次以5%HC1水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02,以20%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供醇28(4.37g,來自26的產率為89%)。E)二乙酸(32)將二甲基亞碸(1.41mL,19.9mmol)逐滴加入草醯氯(0.87mL，10.0mmol)的CH2Cl2(70mL)冷(-78。C)溶液。攪拌30分鐘後，向反應中添加醇28(4.35g，7.1mmol)的CH2C12(20mL)溶液。在-78。C繼續攪拌45分鐘並向反應中添加三乙胺(4.20mL，30.0mmo1)。在-78。C下將反應物攪拌15分鐘，隨後取走冰浴，並在45分鐘內對反應物逐漸加溫。然後將反應物倒入CH2Cl2，先後以5。/oHCl水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌，乾燥(Na2S04)並真空濃縮以才是4共醛29，其可在不作進一步純化下使用。將二異丁基氫化鋁(13.7mL1M二異丁基氫化鋁的CH2C12溶液，13.7mmol)添加至酮29(由前面獲得)的CH2C12(15mL)冷溶液。在-78"C下攪拌2小時後，添加飽和NH4C1淬滅反應並將其倒入CHC13。然後以5%HC1水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並真空濃縮以提供醇30，其可在不作任何純化下^f吏用。向含有醇30(由前面獲得)、三乙胺(1.77mL,10.5mmol)和4-二甲基氨基嘧啶(85mg，0.7mmol)的CH2C12(21mL)冷(0。C)溶液添加曱烷磺醯氯(O.llmL，1.4mmo1)。室溫攪拌1小時後，將反應物倒入CHCl3,依次以5%HC1水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並真空濃縮以提供甲磺酸31，其在不作任何純化下使用。將濃H2S04(2滴)加入甲磺酸31(由前面獲得)的冰醋酸(15mL)和乙酸酐(3.0mL)溶液。室溫攪拌1小時後，將反應物倒入EtOAc，依次以水、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機相，千燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02，以20%至33%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供二乙酸32(3.0g,由28為58%)。F)核苷(34)向二乙酸32(3.0g，4.1mmol)和尿嘧咬(0.57g,5.1mmol)的CH3CN(20mL)懸浮液添加N,O-二(三甲基矽烷基)乙醯胺(3.45mL,14.0mmol)。在40。C下加熱15分鐘以獲得澄清溶液後，向反應中添加三甲基矽烷基三氟甲基磺酸鹽(0.95mL,5.3mmol)。回流2小時後，將反應冷卻至室溫並倒入EtOAc。以飽和NaHC03、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並真空濃縮以提供粗製核苷33,其可在不作任何純化下使用。向核香33(由前面獲得)的MeOH(40mL)溶液添加K2C03(1.66g,12.0mmol)。室溫下攪拌16小時後，真空濃縮反應物並將殘留物溶解於25%嘧啶/EtOAc,以鹽水萃取，乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02，以40%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體核苷34(2.0g,來自32的產率為76%)。G)核苷(35)向核苷34(2.0g,3.1mmol)的二氯甲烷(30mL)和H20(1.5mL)溶液添加2,3-二氯-5,6-二氰-l,4-苯醌(DDQ)(1.4g,6.2mmo1)。室溫下攪拌3小時，再次向反應添加DDQ(0.5g)。再攪拌10分鐘後，真空濃縮反應物並將殘留物溶解於EtOAc。依次以水、水:飽和NaHC03(l:l)、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02，80%的EtOAc/己烷)純化提供白色固體核苷35(1.25g，80%)。H)核普(36)在聚丙烯管中向核苷35(1.25g，2.5mmol)和三乙胺(l,OmL,7.4mmol)的THF(25mL)溶液添加三乙胺三氫氟酸鹽(2.4mL,14.7mmol)。室溫攪拌24小時後，真空濃縮反應物並將殘留物溶解於EtOAc。依次以水、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機層，乾燥並濃縮(Na2S04)。柱層析(Si02，以5%至10%的MeOH/CHCl3洗脫)純化提供白色固體核苷36(0.88g)(產物混有Et3N)。I)核苷(37)向核苷36(由前面獲得)的嘧啶(12mL)溶液添加二甲氧基三苯甲基氯(0.91g,2.7mmo1)。室溫攪拌16小時後，將反應物倒入EtOAc,以鹽水洗滌有機層，乾燥並濃縮。柱層析(Si02,以90%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體核香37(1.28g，來自36的產率為86%)。J)(lS，3R,4R,6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(38)將2-氰乙基四異丙基亞磷二醯胺(0.46mL,1.5mmol)加入含有核普37(0,59g,1.0mmol)、四唾(57mg，l.lmmol)和N-甲基咪峻(20|iL，0.25mmol)的DMF(5mL)溶液。室溫攪拌8小時後，將反應物倒入EtOAc，依次以90%鹽水、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02，以66%至75%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體亞磷醯胺38(0.75g,97%)。31PNMR(CDC13)5:149.36,149.53。實施例4N-Bz-胞嘧啶-6-(11)-甲基BNA亞磷醯胺,(1S,3R，4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二曱氧三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯曱醯胞嘧啶_1-基)_6-甲基-2,5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(44)的製備A)核苷(39)將叔丁基二甲基矽烷基氯(0.45g,5.2mmol)添加至核苷37(0.59g,1.0mmol)和咪唑(0.41g,6.0mmol)的DMF(2mL)溶液中。室溫攪拌16小時後，將反應物倒入EtOAc，隨後以鹽水萃取有機相，乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02，以50o/o的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體的核香39(0.68g,97%)。B)核苷(42)將三氯氧化磷(0.74mL,8.0mmol)添加至1,2，4-三唾(2.35g,34.0mmol)的CH3CN(16mL)冷(0。C)懸浮液。攪拌15分鐘後，向反應添加三乙胺(5.6mL,40mmol)，繼續攪拌30分鐘。在(TC下向反應添加核苷39(0.68g,1.0mmol)的CH3CN(7mL)溶液。攪拌10分鐘後，去除冰浴並在室溫下攪拌反應物4小時。formulaseeoriginaldocumentpage62示意圖4(a)TBSC1,Et3N,DMAP,CH2C12,室溫，16小時97%;(b)P0C13,1,2,4陽三唑，Et3N,CH3CN,室溫，4小時；(c)NH3水溶液，1,4-二惡烷，室溫，16小時；(d)Bz20,DMF,室溫，16小時，來自39的產率為91%;(e)Et3N.3HF,Et3N,THF，室溫，16小時，87%;(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四峻，NMI,DMF,90%。formulaseeoriginaldocumentpage62真空去除溶劑，在EtOAc和水之間分配殘留物。然後以飽和NaHC03、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並真空濃縮以提供粗產物40，其可在不作任何純化下使用。將氨水(2.5mL)添加至核苷40(由前面獲得)的二惡烷(12mL)溶液。在室溫下攪拌16小時，真空濃縮反應物並在高度真空下千燥8小時以提供核苷41,其可在不作任何純化下使用。向核苷41(由前面獲得)的DMF(25mL)溶液添加苯甲酸酐(0.38g，1.7mmol)。室溫攪拌16小時後，將反應物倒入EtOAc,以飽和NaHC03、鹽水萃取有機層，乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02，以50%的EtOAc/己烷洗脫)純化4是供白色固體的核苷42(0.72g,來自39的產率為91%)。C)核苷(43)在聚丙燁管中向含有核苷42(0.72g,0.91mmol)和三乙胺(0.30mL,2.2mmol)的THF(9mL)溶液添加三乙胺三氬氟酸鹽(0.89mL,5.5mmol)。室溫下攪拌16小時後，真空濃縮反應物並將殘留物溶解於EtOAc,依次以水、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02，以25%至40%的丙酮/CHCl3洗脫)純化提供白色固體核普43(0.53g,87%)。&NMR(CDC13):58.34(s,br，1H),8.33(d,1H),7.83(d，1H),7.57-7.26(m,16H)，6.89(d,4H),5.72(s,1H),4.75(s,1H)，4.22(s,1H),4,14(m,1H),3.83(s,6H),3.63(d,1H),3.46(s，1H),1.20(d,3H)。D)(lS，3R,4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基曱基)-3-(4-N-苯甲醯胞嘧啶-1-基)-6-甲基-2，5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(44)將2-氰乙基四異丙基亞磷二醯胺(0.37mL,1.2mmol)加入含有核苷43(0.89g,1.3mmo1)、四唑(43mg，0.63mmol)和N-甲基口米唾(16(iL,0.20mmol)的DMF(4mL)溶液。室溫攪拌8小時後，將反應物倒入EtOAc,依次以90%鹽水、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02,以75%至90%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體亞磷醯胺44(0.61g,90%)。實施例5(lS,3R，4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(6-N-苯甲醯腺嘌呤-9-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(51)formulaseeoriginaldocumentpage64示意圖5(a)6-N-苯甲醯腺嘌呤,BSA,TMSOTf,DCE,回流，8小時；(b)K2C03，MeOH,室溫,16小時,來自32的產率為73%;(c)Bz20,DMF,室溫；(d)DDQ,CH2C12,H20,室溫；(e)Et3N.3HF,Et3N,THF,室溫，16小時；(f)DMTC1,嘧啶，室溫，16小時；(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四峻,NMI,DMF。A)核)和6-N-苯甲醯腺噪呤(0.48g，2.0mmol)的二氯乙烷(14mL)懸浮液添加N,O-二(三甲基矽烷基)乙醯胺(l.lmL,4.50mmol)。反應混合物在回流45分鐘後變澄清，並在冰浴中冷卻，添加三甲基矽烷基三氟甲基磺酸鹽(0.49mL,2.7mmol)。回流8小時後，將反應冷卻至室溫並倒入EtOAc。以飽和NaHC03和鹽水洗滌有機相，乾燥(Na2S04)並真空濃縮以提供粗製核苷45，其可在不作純化下使用。向核苦45(由前面獲得)的MeOH(14mL)溶液添加K2CO3(0.38g,2.7mmol)。室溫攪拌24小時後將反應物真空濃縮。將殘留物懸浮於EtOAc，用水和鹽水萃取，然後乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02,以1%至2.5%的MeOH/CHCl3洗脫)純化提供白色固體核苷46(0.69g,來自32的產率為73%)。B)核苦47核苷47可由核苷46通過與幹DMF中的苯甲酸酐(1.5-2當量)反應進行製備。C)亞磷醯胺51亞磷醯胺51可通過實施例3所示的由核苷34得到亞磷醯胺38的方法由核苷47進行製備。實施例6(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(6-N-苯甲醯腺噤呤-9-基)-6-甲基-2，5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(60)formulaseeoriginaldocumentpage66鉍示意圖6(a)MsCl,Et3N，DMAP,CH2CI2,室溫，4小時;(b)Ac20,AcOH,催化量H2S04,室溫，3小時，來自28的產率為87%;(c)6-N-苯甲醯腺噤呤，BSA，TMSOTf，DCE,回流，2小時；(d)K2C03，MeOH，室溫，16小時；(e)Bz20,DMF,室溫；(f)DDQ，CH2C12，H20,室溫；(g)Et3N.3HF,Et3N，THF,室溫，16小時；(h)DMTC1,嘧啶，室溫，16小時；(i)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI,DMF。A)二乙酸(52)向含有醇28(7.37g,12.0mmol)、三乙胺(2.82mL,20.2mmol)和DMAP(0.20g,Ummol)的二氯甲烷(25mL)冷溶液(0。C)逐滴添加甲烷磺醯氯(1.33mL，16.8mmol)。室溫下攪拌2小時後，以二氯甲烷稀釋反應物，以5%HC1、飽和碳酸氫鈉溶液、鹽水洗滌有機相，乾燥(Na2S04)並濃縮。由此獲得粗品甲磺酸52,其可在不作純化下使用。B)二乙酸(53)將濃石克酸(IO滴)加入甲磺酸52(由前面獲得)的乙酸酐(7.2mL)和醋酸(36mL)溶液。室溫攪拌2小時後將反應物在高度真空下濃縮。將殘留物溶解於乙酸乙酯，以水、飽和碳酸氬鈉溶液(直至pH〉8)和鹽水小心洗滌有機層，然後乾燥(Na2S04)並濃縮。以柱層析(Si02,以25。/。至35Q/。EtOAc/己烷洗脫)純化殘留物以才是供粘性油二乙酸53(7.66g，來自28的產率為87%)。C)亞磷醯胺(60)亞磷醯胺60可通過實施例3所示的由二乙酸32得到亞磷醯胺51的方法由二乙酸53進行製備。實施例7(lS,3R，4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(2-N-異丁醯鳥嘌呤-9-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(67)formulaseeoriginaldocumentpage67示意圖7(a)2-氨基-6-氯嘌呤,BSA，TMSOTf,DCE,回流，2小時；(b)3-羥基丙腈,NaH,THF,4小時，來自32的產率為82%;(c)異丁酸酐，DMAP,DMF,60C,24小時，71%;(d)DDQ，CH2C12,H20,室溫，16小時，91%;(e)Et3N.3HF,Et3N,THF,室溫，16小時，97%;(f)DMTCl，嘧啶，室溫，16小時，85%;(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI,DMF。A)核苷(61)向二乙酸32(3.44g，4.7mmol)和2-氨基-6-氯噤呤(1.18g,7.0mmol)的二氯乙烷(46mL)懸浮液添加N,0-二(三甲基矽烷基)乙醯胺(3.8mL，15.5mmol)。回流45分鐘得到澄清溶液後，在冰浴中冷卻反應物並添加三甲基矽烷基三氟甲基磺酸鹽(1.69mL,9.4mmol)。回流8小時後，將反應冷卻至室溫並倒入氯仿。以飽和NaHC03和鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並真空濃縮以摘供粗製核普61，其可在不作純化下使用。B)核苷(62)向氫化鈉(1.07g,27.0mmol,60%w/w)的幹THF(10mL)攪拌懸浮液逐滴添加3-羥基丙腈(1.67mL,24.5mmol)。攪拌20分鐘後，添加粗品核苷61(由前面獲得)的千THF(25mL)溶液。室溫下繼續攪拌5小時，然後通過添加飽和氯化銨溶液小心淬滅反應。然後將反應物倒入乙酸乙酯，以鹽水萃取有機層，乾燥(Na2S04)並濃縮。以柱層析(Si02,以CHC13至2.5%MeOH/CHCl3洗脫)純化殘留物以提供淺棕色固體的核苷62(3.18g,來自32的產率為82%)。C)核苷(63)將異丁酸酐(1.5mL,9.3mmol)添加至核苷62(3.19g,4.6mmol)和4-二甲氨基甲基嘧啶(0.11g,0.93mmol)的DMF(27mL)溶液。在60°C下攪拌14小時後，向反應再加入異丁酸酐(1.5mL，9.3mmol),繼續在60。C下攪拌12小時。將反應冷卻至室溫，以EtOAc稀釋，並以水、飽和^炭酸氫鈉溶液、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02，以5%至15Q/。的丙酮/CHCl3洗脫)純化才是供黃色泡沫狀的核苷63(2.5g，71%)。D)核苷(64)向核苷63(2.5g,3.3mmol)的二氯甲烷(33mL)和H20(1.7mL)溶液添加DDQ(1.12g,5.0mmol)。在室溫下攪拌2小時後再次添加DDQ(1.0g)。繼續在室溫下攪拌6小時，然後將反應物在冰箱(4'C)中儲存16小時。然後真空濃縮反應物並將殘留物溶解於乙酸乙酯。以水、10Q/。亞闢L酸氫鈉溶液(2x)、飽和碳酸氫鈉溶液和鹽水洗滌有機層，然後乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02，以5%MeOH/CHCl3洗脫)純化提供核苷64(1.84g,91%)。E)核苷(65)在聚丙烯管中向核普64(1.84g,3.0mmol)和三乙胺(1.25mL,8.9mmol)的THF(30mL)溶液添加三乙胺三氫氟酸鹽(2.88mL,17.9mmo1)。室溫攪拌24小時後，真空濃縮反應物並將殘留物溶解於EtOAc。依次以水、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機層，然後乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02,以5%至10%的MeOH/CHCl3洗脫)純化提供白色固體的核苷65(1.05g，97%)。F)核苷(66)向核苷65(1.00g，2.7mmol)的嘧啶(13mL)溶液添加二甲氧基三苯甲基氯(1.07g,3.2mmol)。室溫攪拌16小時後，將反應物倒入EtOAc，以鹽水洗滌有機層，乾燥並濃縮。柱層析(Si02，以2.5%至5%的MeOH/CHCl3洗脫)純化提供白色泡沫狀的核苷66(1.52g,85%)。G)(lS,3R,4R，6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4，4'-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(2-N-異丁醯鳥嘌呤-9-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(67)將2-氰乙基四異丙基亞磷二醯胺(1.06mL,3.4mmol)加入含有核苷66(1.52g,2.2mmol)、四唾(0.12g,1.7mmol)和N-甲基咪唾(45pL,0.56mmol)的DMF(l1mL)溶液。室溫攪拌8小時後，將反應物倒入EtOAc,依次以90%鹽水、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02,以2.5%的MeOH/CHCl3洗脫)純化提供白色固體亞磷醯胺67(1.65g,84%)。31PNMR(CDC13)S:148.70,145.81。實施例8(lS，3R，4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4，4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(2-N-異丁醯鳥噤呤-9-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(74)9ONap79國、,cl..iTBDPSOMe'HO、M錢^*<I72DMTO、7374示意圖8(a)2-氨基-6-氯嘌呤,BSA,TMSOTf,DCE,回流,2小時；(b)3-羥基丙腈,NaH,THF,4小時；(c)異丁酸酐，DMAP,DMF,60C,24小時；(d)DDQ,CH2C12,H20,室溫，16小時；(e)Et3N.3HF,Et3N,THF,室溫，16小時；(f)DMTC1,嘧啶，室溫，16小時；(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四唑，NMI,DMF。亞磷醯胺74可通過與所示的由二乙酸32得到亞磷醯胺67的相同方法由二乙酸53進行製備。實施例9(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4，4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2,5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(83)formulaseeoriginaldocumentpage71示意圖9(a)草醯氯，DMSO，Et3N，CH2C12，-78°C;(b)MeOCH2Br,Mg,HgCl2，THF，-20°C,由26為>95%;(c)MsCl,Et3N,DMAP,CH2C12,85%;(d)Ac20，AcOH,H2S04,室溫，3小時,84%;(e)尿嘧啶,BSA，TMSOTf,MeCN,回流，2小時；(f)K2C03,MeOH,來自77a-b的產率為89%;(g)DDQ,CH2C12,H20,8小時，室溫，80a和80b的聯合產率為98%;(h)Et3N.3HF,Et3N,THF，室溫，16小時；(i)DMTCl,嘧啶，16小時，室溫，90%;(J)CN(CH2)2OP(N-iPr2)2,四唾，NMI，DMF,96%。A)醇(75a-b)在-78。C下向草醯氯(2.2mL,25.0mmol)的二氯甲烷(130mL)溶液添加二甲亞碸(3.5mL,50.0mmol)。攪拌30分鐘後，在10分鐘向反應中添加醇26(10.0g,16.7mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液。繼續攪拌45分鐘後，向反應中緩慢添加三乙胺(10.5mL，75.0mmol)。添加完成後，去除冰浴並將反應逐漸升溫至(TC(約1小時)並轉移至分液漏鬥。先後以5。/。HCl、飽和碳酸氪鈉溶液和鹽水洗滌有機層，然後乾燥(Na2S04)並濃縮以提供醛27，其在高度真空下乾燥(18小時)並可在不作純化下4吏用。以幹THF(5mL)覆蓋鎂帶(2.5g,102.8mmol)和氯化汞(11)(93mg,0.34mmol)的混合物，並將反應物冷卻至-20。C。滴入數滴純甲氧基甲基溴以起始反應。等待數分鐘後，經大約3小時向反應加入甲氧基甲基溴(9.33mL，102.8mmol)的THF(12mL)溶液(lmL/10分鐘，通過注射器)。在添加過程中外部浴的溫度小心維持在-20和-25。C之間。間歇(在3小時內)加入少量的幹THF(5mL)以促進攪拌。添加溴化物完畢後，在-25。C下攪拌反應物100分鐘，然後添加粗品醛(27)的THF(30mL)溶液。在-20。C下攪拌45分鐘後，通過TLC未檢測到起始材料趁27。以飽和氯化銨溶液小心淬滅反應並用乙酸乙酯稀釋。以5。/。HCl、飽和)碳酸氫鈉溶液和鹽水洗滌有機層，然後乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02,以25%至30%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供混合物醇75a-b(定量)(約1:1的異構體)。B)甲磺酸(76a-b)向溶於三乙胺(5.3mL,37.9mmol)的醇75a-b(13.38g,20.8mmol)和DMAP(0.36g,2.9mmol)的二氯甲烷(42mL)冷溶液(0。C)添加甲烷磺醯氯(2.3mL,29.2mmol)。攪拌2小時後另外加入甲烷磺醯氯(0.5mL)。繼續攪拌1小時，以氯仿稀釋反應物。先後以5。/qHC1、飽和)瞍酸氪鈉溶液和鹽水洗滌有機層，然後乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02,以20y。的EtOAc/己烷洗脫)純化提供粘性油狀的甲磺酸76a-b(12.8g,85%)。C)二乙酸(77a醫b)將濃石克酸(6滴)加入甲磺酸76a-b(12.8g,17.8mmol)的醋酸(50mL)和乙酸酐(10mL)溶液。室溫下攪拌3小時後以LCMS對反應物進行完全鑑定，並在高度真空下揮發掉大部分溶劑。用乙酸乙酯稀釋濃縮的混合物，以水、飽和碳酸氫鈉溶液(直至pH〉10)和鹽水洗滌有機相，然後乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02，以20%的EtOAc/己烷洗脫)純化^是供祐性油狀的二乙酸77a-b的異頭體混合物(11.44g,84%)。D)核苷(79a-b)向二乙酸77a-b(11.44g,15.0mmol)和尿嘧啶(3.35g,29.9mmol)的CH3CN(75mL)懸浮液添加N,O-二(三甲基矽烷基)乙醯胺(14.76mL,59.9mmol)。40。C加熱15分鐘得到澄清溶液後，在水浴中冷卻反應物並添加三甲基珪烷基三氟甲基磺酸鹽(4.06mL，22.5mmol)。回流2小時後，將反應冷卻至室溫並倒入EtOAc。以半飽和石友酸氫鈉和鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並真空濃縮以提供粗品核苷78a-b，其可在不作純化下使用。向核普78a-b(由前面獲得)的甲醇(130mL)溶液添加石炭酸鉀(5.30g，38.4mmo1)。室溫攪拌16小時後將反應物真空濃縮。將殘留物溶劑於乙酸乙酯，用水和鹽水萃取，然後乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02，以5至7.5%的丙酮/氯仿洗脫)純化提供白色固體的核苷79a-b(9.0g,來自77a-b的產率為89%)。E)核苦(80a和80b)向核普79a-b(9.0g,13.3mmol)的二氯甲烷(130mL)和水(6.5mL)溶液添加DDQ(20.0mmol，4.5g)。將兩相反應物在室溫下攪拌2小時，然後再次添加DDQ(向反應添加2.75g)。另外2小時後再次向反應添加DDQ(l.lg)，繼續攪拌4小時，然後將反應物在冰箱中貯存16小時。第二日早，LCMS顯示了痕量的核脊79a-b，因此再次向反應中加入DDQ(0.9g),繼續攪拌2小時，此時通過TLC和LCMS再未檢測到核苷79a-b。真空揮發溶劑，並在乙酸乙酯和水之間分配殘留物。以亞4t酸氫鈉溶液(2x)、々包和石友酸氫鈉溶液和鹽水洗滌有機層，然後乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02，以10至20%的丙酮/氯仿洗脫)純化分別提供核脊80a(洗脫較慢的點)和80b(洗脫較快的點)(7.0g，聯合產率為98%)。F)核苷(81)向核苦80a(6.7g，12.5mmol)和三乙胺(5.2mL,37.4mmol)的THF(120mL)溶液添加三乙胺三氫氟酸鹽(12.2mL,74.8mmol)。室溫攪拌16小時後將反應物真空濃縮至乾燥。柱層析(Si02,以7.5至12.5%的MeOH/CHCl3洗脫)純化提供核苷81(混有三乙胺.氫氟酸鹽，產率>100%)，其可在不作進一步純化下使用。G)核苷(82)向核普81(約12.5mmol)的嘧啶(75mL)溶液添加4,4，-二甲氧基三苯甲基氯(DMTCl,4.8g,14.3mmol)。在室溫下攪拌16小時後再次向反應添加DMTC1(2.4g)。繼續攪拌4小時後添加MeOH(10mL)。攪拌30分鐘後，以乙酸乙酯稀釋反應物，並以水和鹽水洗滌有機相，然後乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2,5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(83)將2-氰乙基四異丙基亞磷二醯胺(1.58mL,5.0mmol)加入核苷82(2.0g,3.3mmo1)、四唾(0.19g,2.6mmol)和N隱甲基咪唾(68(iL,0.83mmol)的DMF(16mL)溶液。室溫攪拌8小時後將反應物倒入EtOAc。依次以90%鹽水和鹽水洗滌有機層，然後乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02，以66%至75%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體亞磷醯胺83(2.54g，96%)。31PNMR(CDC13)S:149.78，149.44。實施例10(lS,3R,4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(86)DMTO9、嶋"0，、8$示意圖10(a)Et3N.3HF,Et3N,THF,室溫，16小時；(i)DMTC1,嘧啶，16小時，室溫，91%;(j)CN(CH2)2OP(N-iPr2)2,四唑，NMI,DMF，96%。A)核苷(84)向核苷80b(6.43g,12.0mmol)和三乙胺(5.0mL,35.7mmol)的THF(125mL)溶液添加三乙胺三氫氟酸鹽(11.6mL,71.5mmol)。室溫攪拌16小時後將反應物真空濃縮至乾燥。柱層析(Si02，以7.5至12.5%的MeOH/CHCl3洗脫)純化殘留物提供核苦84(混有三乙胺.氫氟酸鹽，產率>100%),其可在不作進一步純化下使用。B)核苷(85)向核苷84(約12.0mmol)的嘧啶(72mL)溶液添加4,4，-二甲氧基三苯甲基氯(DMTCl,4.6g,13.8mmo1)。在室溫下攪拌16小時後再次向反應添加DMTC1(2.3g)。繼續攪拌4小時後添加MeOH(10mL)。攪拌30分鐘後，以乙酸乙酯稀釋反應物，並以水和鹽水洗滌有機相，然後乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析C)(lS,3R，4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(86)將2-氰乙基四異丙基亞磷二醯胺(1.58mL,5.0mmol)加入核苷85(2.0g,3.3mmo1)、四唑(0.19g,2.7mmol)和N-甲基咪唑(68(iL,0.83mmol)的DMF(17mL)溶液。室溫攪拌8小時後將反應物倒入EtOAc。依次以90%鹽水和鹽水洗滌有機層，然後乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02，以66%至75%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體亞磷醯胺86(2.55g，96%)。31PNMR(CDC13)5:149.97，149.78。實施例11(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲醯胞嘧啶-l-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(92)formulaseeoriginaldocumentpage77示意圖11(a)TBSC1,Et3N,DMAP,CH2C12,室溫，16小時98%;(b)POCl3,1，2,4-三唑,Et3N,CH3CN,室溫，4小時；(c)NH3水溶液，1，4-二惡烷，室溫，16小時；(d)Bz20,DMF，室溫，16小時，來自82的產率為91%;(e)Et3N.3HF,Et3N,THF，室溫，16小時，94%;(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四哇，NMI，DMF,84%。A)核苷(87)將叔丁基二甲基矽烷基氯(2.40g,15.9mmol)添加至核苷82(3.20g,5.3mmol)和咪唑(2.16g，31.8mmol)的DMF(10.6mL)溶液。室溫攪拌16小時後將反應物倒入EtOAc。以鹽水萃取有機相，乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02，以50%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體核苷87(3.70g,98%)。B)核苷(90)將三氯氧磷(3.86mL,41.4mmol)添加至1,2,4-三哇(12.15g,176.1mmol)的CH3CN(80mL)冷懸浮液(0。C)。攪拌15分鐘後加入三乙胺(29.0mL,207.2mmol),繼續攪拌30分鐘。在0°C下向反應混合物添加核普87(3.70g,5.2mmol)的CH3CN(20mL)溶液。攪拌10分鐘後，去除冰浴並在室溫下攪拌反應物4小時。然後真空去除溶劑，在EtOAc和之間分配殘留物。然後以飽和NaHC03和鹽水洗滌有機相，然後乾燥(Na2S04)並真空濃縮以才是供粗產物88,其可在不作任何純化下使用。將氨水(10mL)添加至核苷88(由前面獲得)的二惡烷(50mL)溶液。在室溫下攪拌16小時後，真空濃縮反應物並在高度真空下乾燥8小時以^是供核脊89，其可在不作純化下使用。向核苷89(由前面獲得)的DMF(IOmL)溶液添加苯甲酸酐(1.99g,8.8mmol)。室溫攪拌16小時後將反應物倒入EtOAc。依次以飽和NaHC03和鹽水萃取有機層，然後乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02，以50%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體的核苷90(3.86g，來自87的產率為91%)。C)核苷(91)在聚丙烯管中向核苷90(3.81g,4.7mmol)和三乙胺(1.56mL,11.2mmol)的THF(46mL)溶液添加三乙胺三氫氟酸鹽(4.54mL，27.9mmol)。室溫攪拌16小時後，真空乾燥反應物並將殘留物溶解於EtOAc。依次以水、飽和NaHC03和鹽水洗滌有機層，然後乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02,以5%MeOH/CHCl3洗脫)純化提供白色固體核苷91(3.07g,94%)。D)(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲醯胞嘧啶-1-基)-6-甲基-2，5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(92)將2-氰乙基四異丙基亞磷二醯胺(0.90mL,4.3mmol)加入核苷91(2.0g,2.8mmo1)、四唑(0.16g，2.3mmol)和N-甲基。米唾(58(iL,0.71mmol)的DMF(14mL)溶液。室溫攪拌8小時後將反應物倒入EtOAc。依次以90%鹽水和鹽水洗滌有機層，然後乾燥(Na2S04)並濃縮。將殘留物溶解於最小量的EtOAc，將該溶液添加至己烷。收集所得的沉澱物，進一步通過柱層析(Si02,以75%至90%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體亞磷醯胺92(2.14g,84%)。31PNMR(CDC13)S:149.82。實施例12(lS,3R,4R，6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲醯胞嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(98)示意圖12(a)TBSC1,Et3N,DMAP,CH2C12,室溫，16小時，97%;(b)POCl3，1,2,4-三唑,Et3N，CH3CN，室溫，4小時；(c)NH3水溶液，1，4-二惡烷,室溫，16小時；(d)Bz20,DMF,室溫，16小時，來自93的產率為89%;(e)Et3N.3HF,Et3N，THF,室溫，16小時，89%;(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四。坐，NMI，DMF,84%。A)核苷(93)將叔丁基二甲基矽烷基氯(2.25g,15.0mmol)添加至核苷85(3.0g,5.0mmol)和咪唑(2.03g，29.9mmol)的DMF(IOmL)溶液。室溫攪拌16小時後將反應物倒入EtOAc。以鹽水萃取有機相，乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02，以50%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體核普93(3.45g,97%)。B)核苷(96)將三氯氧磷(3.59mL,38.5mmol)添加至1,2，4-三唾(11.3g，163.9mmol)的CH3CN(80mL)冷懸浮液(0。C)。攪拌15分鐘後向反應中加入三乙胺(27.0mL,192.8mmol)，繼續攪拌30分鐘。在(TC下向反應中添加核苷93(3.45g,4.82mmol)的CH3CN(20mL)溶液。攪拌10分鐘後，去除冰浴並在室溫下攪拌反應物4小時。真空去除溶劑，在EtOAc和之間分配殘留物。然後以NaHC03飽和溶液和鹽水洗滌有機相，然後乾燥(Na2S04)並真空濃縮以糹是供粗產物94，其在不作任何純化下使用。將氨水(10mL)添加至核香94(由前面獲得)的二惡烷(50mL)溶液。在室溫下攪拌16小時，真空濃縮反應物並在高度真空下乾燥8小時以才是供核香95,其在不作純化下使用。向核苷95(由前面獲得)的DMF(9mL)溶液添加苯甲酸酐(1.63g,7.2mmol)。室溫攪拌16小時後將反應物倒入EtOAc。依次以飽和NaHC03和鹽水萃取有機層，然後乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02，以50%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體核苷96(3.53g,來自93的產率為89%)。C)核苷(97)在聚丙烯管中向核苷96(3.53g,4.3mmol)和三乙胺(1.43mL,10.3mmol)的THF(43mL)溶液添加三乙胺三氫氟酸鹽(4.20mL，25.8mmol)。室溫攪拌16小時後，真空乾燥反應物並將殘留物溶解於EtOAc。依次以水、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機相，然後乾燥(Na2S04)並真空濃縮。柱層析(Si02，以25%至40%的丙酮/CHCl3洗脫)純化^是供白色固體的核苦97(2.87g,95%)。D)(lS,3R,4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯曱基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲醯胞嘧啶-1-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環庚烷(98)將2-氰乙基四異丙基亞磷二醯胺(1.35mL,4.3mmol)加入核苷97(2.0g,2.8mmo1)、四唑(0.16mg，2.3mmol)和N-甲基咪唑(58nL,0.71mmol)的DMF(14mL)溶液。室溫攪拌8小時後，將反應物倒入EtOAc,依次以90%鹽水和鹽水洗滌有機相，乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02，以75%至90%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體核苷98(2.15g,84%)。31PNMR(CDC13)5:150.33。實施例13(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(6-N-苯甲醯腺嘌呤-9-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(105)formulaseeoriginaldocumentpage82示意圖13(a)6-N-苯甲醯腺嘌呤，BSA,TMSOTf,CH3CN,回流，8小時；(b)K2C03,MeOH，室溫，16小時；(c)Bz20，DMF,室溫；(d)DDQ,CH2C12,H20,室溫；(e)Et3N.3HF，Et3N,THF,室溫，16小時；(f)DMTCl,嘧啶，室溫，16小時；(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四唑，NMI,DMF。亞磷醯胺105通過所示的由二乙酸混合物77a-b合成亞磷醯胺83的方法由二乙酸77a-b製備。實施例14(lS,3R,4R，6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4，4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(6-N-苯甲醯腺嘌呤-9-基)-6-甲基-2,5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(雨)formulaseeoriginaldocumentpage83示意圖14(a)Et3N.3HF,Et3N，THF，室溫，16小時；(b)DMTC1,嘧啶，室溫，16小時；(c)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四唾，NMI,DMF。亞磷醯胺108通過所示的由80b合成亞磷醯胺86的方法由核脊102b製備c實施例15(lS,3R，4R，6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲&)-3-(2-N-異丁醯鳥嘌呤-9-基)-6-甲氧基甲基-2,5-二氧雜-雙環[2.2.1]庚烷(114)formulaseeoriginaldocumentpage84示意圖15(a)2-氨基-6-氯嘌呤，BSA，TMSOTf，CH3CN,回流，2小時；(b)3-幾基丙腈，NaH,THF,4小時；(c)異丁酸酐，DMAP,DMF,60°C,24小時；(d)DDQ，CH2C12，H20，室溫，16小時；(e)Et3N.3HF,Et3N,THF,室溫；(f)DMTC1,嘧啶，室溫；(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四唾，NMI，固F。亞磷醯胺114通過所示的由二乙酸混合物77a-b合成亞磷醯胺83的方法由二乙酸77a-b製備。實施例16(lS,3R,4R，6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(2-N-異丁醯鳥嘌呤-9-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧雜-雙環庚烷(in)formulaseeoriginaldocumentpage85示意圖16(a)Et3N.3HF,Et3N,THF,室溫，16小時；(b)DMTC1,嗜啶，室溫，16小時；(c)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四唾，NMI,DMF。亞磷醯胺117通過所示的由80b合成亞磷醯胺86的方法由核苦11lb製備。實施例176-CH2OHBNA合成A)核普118將二甲基亞碸(1.77mL,25.0mmol)逐滴加入草醯氯(1.10mL，12.5mmol)的二氯甲烷(60mL)冷溶液(-78。C)。攪拌30分鐘後，向反應中添加醇26(5.0g,8.4mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液。在78。C下繼續攪拌45分鐘，然後逐滴向反應中添加三乙胺(5.05mL,37.5mmo1)。攪拌10分鐘後，去除冰浴並將反應formulaseeoriginaldocumentpage86示意圖17(a)草醯氯，DMSO,Et3N,CH2C12,-78至0°C;(b)Ph3PCH2Br,nBuLi,THF,-78。C至室溫，來自26的產率為97%;(c)TBAF，THF，室溫，16小時，97%;(d)NaH,BnBr，DMF,室溫，1小時，定量；(e)Os04,NMO，95%丙酮水溶液，室溫，48小時，87%;(f)TBSCI,嘧啶,0°C,4小時，定量；(g)MsCl,Et3N,DMAP,CH2C12,室溫，16小時，分別為44%和40%收率;(h)Et3N.3HF,Et3N,THF,定量；(i)PivCl,DIPEA,DMAP,CH2C12,室溫，16小時；(j)AcOH,Ac20,催化量H2S04,來自125的產率為92%;(k)BSA,尿嘧啶,TMSOTf,CH3CN,回流2小時；(I)K2C03,MeOH,來自127的產率為74%。逐漸升溫至約Or，此時TLC顯示沒有起始醇。以二氯甲烷稀釋反應物，並先後以10Q/qHC1、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機相，乾燥(Na2S04)並濃縮以提供醛27,其不經純化用於下一步驟。B)核苷118向三苯基溴化磷(3.88g,10.9mmol)的幹THF(60mL)冷攪拌溶液(0。C)逐滴添加nBuLi(2.5M,4.34mL,10.9mmol)。攪拌1小時後，將紅色溶液冷卻至-78°C,並逐滴向反應中添加由前面獲得的醛27(8.4mmol)的幹THF(15mL)溶液。將反應物逐漸加熱至室溫，繼續攪拌16小時。使用飽和NH4C1小心淬滅反應，且反應物在EtOAc和水之間分配。然後以鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02，以10%EtOAc的己烷溶液洗脫)純化^是供無色油狀的烯烴118(4.84g，由26為97%)。C)核苷119將氟化四丁基銨(1M存在於THF中，10,00mL,10.0mmol)添加至烯烴118(4.83g,8.1mmol)的THF(35mL)溶液。室溫攪拌反應物16小時後，真空去除溶劑並將殘留物溶解於EtOAc。然後以水、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02,以40。/。EtOAc的己烷溶液洗脫)純化提供無色油狀的醇119(2.79g，97%)。D)核苷120將氫化鈉(60%w/w存在於礦物油中，0.4g，10mmol)添加入醇119(1.44g,4.1mmol)和苯甲基溴(0.71mL,6.0mmol)的DMF(16mL)冷溶液(0。C)。在0°C下攪拌l小時後，用水小心淬滅反應並在EtOAc和水之間分配。以鹽水分離並洗滌有機相，乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02，以10至25%EtOAc的己烷溶液洗脫)純化3是4共無色油狀的烯經120(1.84g，定量)。E)核苷121將四氧化鋨(25%Os04的iPrOH溶液，lmL)添加至烯烴120(1.80g，4.0mmol)和N-甲基嗎砵畫N畫氧化物(NMO，0.94g,8.0mmol)的95%丙酮/水(25mL)溶液。在室溫下攪拌16小時後，向反應中再度添加OsO4溶液(0.5mL)和NMO(0.40g)。攪拌總計48小時後，以EtOAc稀釋反應物並以10%NaHS03、鹽水洗滌，乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02，以40%至50%EtOAc的己烷溶液洗脫)純化提供無色油狀的二醇121(1.68g，87%,約1:1的異構體混合物)。F)核香122和123將TBSC1(0.66g,4.4mmol)添加至二醇121(1.63g,3.4mmol)的嘧咬(17mL)冷溶液((TC)。在0。C下攪拌4小時後，以EtOAc稀釋反應物，以水、鹽水洗滌有機層，乾燥並濃縮。柱層析(Si02,以10至20%EtOAc的己烷溶液洗脫)純化提供無色油狀的醇122和123(0.90g和L117g,未指定絕對立體化學)。G)核苷124向醇123(未指定絕對立體化學,0.9g,1.5mmol)、三乙胺(0.46mL,3.3mmol)和二甲基氨基嘧啶(37mg,0.3mmol)的二氯甲烷(5mL)冷溶液(0。C)添加甲烷磺醯氯(0.24mL,3.0mmo1)。在室溫下7小時後，再向反應中添加甲基磺醯氯(0.12mL)和三乙胺(0.23mL)。室溫下攪拌9小時後，將反應物倒入EtOAc，以10。/。HC1、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機相，乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02，以10%至15%EtOAc的己烷溶液洗脫)純化提供甲磺酸124(0.44g,44%)和起始的二醇123(0.32g,40%)。H)核苷125向甲磺酸124(0.44g,0.6mmol)和三乙胺(0.23mL,1.7mmol)的THF(7mL)溶液添加三乙胺三氫氟酸鹽(0.64mL，4.0mmol)。室溫下攪拌16小時後，以EtOAc稀釋反應物，並以飽和NaHCOs、鹽水洗滌有機相，乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02，以50Q/oEtOAc的己烷溶液洗脫)純化提供醇125(0.40g,定量)。I)核苷127向醇125(0.72mmol,0.4g)、二異丙基乙基胺(DIPEA，0.17mL,1.0mmol)和二甲基氨基嘧啶(12mg,0.1mmol)的二氯甲烷(2mL)的冷溶液((TC)逐滴添加特戊醯氯(0.12mL，l.Ommol)。去除冰浴，在室溫下攪拌反應物2小時，然後再向反應中添加DIPEA(0.17mL)和新戊醯氯(0.12mL)，並在室溫下攪拌16小時。然後以EtOAc稀釋反應物，以10%HC1、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並濃縮得到粗品pivaloate126，其在不作進一步純化下^吏用。將濃疏酸(2滴)加入鬥且品pivaloate126(由前面獲得)的冰醋酸(2.5mL)和乙酸酐(0.5mL)溶液。在室溫下攪拌2小時後在高度真空下去除溶劑並將殘留物溶解於EtOAc,以飽和NaHC03、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02，以10至15%EtOAc的己烷溶液洗脫)純化提供無色油狀的二乙酸127(0.45g，來自125的產率為92%)(異構體混合物)。J)核苷129a向二乙酸127(0.45g,0.65mmol)和尿嘧咬(0.15g,1.3mmol)的CH3CN(3.5mL)懸浮液添加N,O-二(三甲基矽烷基)乙醯胺(0.8mL,3.3mmol)。在4(TC下加熱15分鐘以獲得澄清溶液後，向反應中添加三甲基矽烷基三氟甲基磺酸鹽(0.24mL,1.3mmol)。回流2小時後，將反應冷卻至室溫並倒入EtOAc。以飽和NaHC03、鹽水洗滌有機層，乾燥(Na2S04)並真空濃縮以^是供粗製核苷128a，其在不作任何純化下使用。向核香128a(0.11g,0.15mmol)的MeOH(1.5mL)溶液添加K2CO3(40mg,0.3mmol)。在室溫下攪拌16小時後，真空去除溶劑並在EtOAc和鹽水之間分配殘留物。收集有機相，乾燥(Na2S04)並真空濃縮，提供129a(未確定絕對立體化學)。柱層析(Si02，以35。/。丙酮的CHCl3溶液洗脫)純化提供核苷129a(57mg,由127為74%)。&麗R(CDC13):S9.37(s,1H),7,92-7.61(m,5H),7.55-7.23(m,9H)，5.58(s,IH)，5.43(d,1H，J=8.1)，4.79(d,1H,J-11.7)，4.66(d,1H,J=11.7),4.58(m,2H),4.51(s,IH)，4.44(m,1H),4.05(s，IH)，3.95-3.72(m,4H)。LCMS:保留時間3.34min;M+H計算值517.19，實測值517.1。實施例18formulaseeoriginaldocumentpage90示意圖18(a)N-Bz-胞嘧啶或6-N-Bz-腺嘌呤或2-氨基-6-氯嘌呤，BSA,TMSOTf,MeCH，回流；(b)K2C03,MeOH,室溫，16小時(對於129b-c);(c)NaH,3-幾基丙腈，室溫(對於129d);(d)TMSC1,嘧啶，BzCl或Bz20,DMF(對於130b-c);(e)TMSC1,嘧啶，異丁醯氯(對於130d)核*128b、128c和128d可分別採用N-Bz-胞嘧啶，6-N-Bz-腺噤呤和2-氨基-6-氯嘌呤通過Vorbrugen反應由糖前體127製備得到(示意圖18)。以K2C03和MeOH處理128b和128c可分別提供核普129b和129c。以氬化鈉和3-羥基丙腈處理128d可提供核苷129d。以TMSCl瞬時保護羥基基團然後與苯甲醯氯反應可分別提供核苷130b和130c。可選擇地，上述轉化也可通過以DMF為溶劑，將核普129b和129c與苯甲酸酐反應來實現。核苦130d可通過以存在於嘧啶中的過量TMSCl瞬時保護，再與異丁醯氯反應製備得到。實施例196'-取代類似物的製備示意圖19formulaseeoriginaldocumentpage92R、R,和R2分別獨立為H、烷基、烯基、炔基、取代的烷基、耳又代的烯基、取代的炔基或保護性基團可以使用二氯甲烷為溶劑，通過如DAST等氟化劑處理核苷130製備得到核普131。核香132可通過首先以Dess-Martin高價碘或在Swern條件下氧化130的伯鞋基，然後以DAST處理所得的醛製備得到。核香133可通過首先以Dess-Martin高Y介石典或在Swern條件下氧化130的伯羥基，然後在冰醋酸和還原劑(例如，硼氫化氰鈉)存在下以伯胺或仲胺將所得的醛還原胺化製備得到。核苷134可通過先將130的幾基基團轉化為離去基團(甲磺酸、甲苯磺酸、囟化物)，然後與過量的疊氮化鈉加熱製備得到。核普135可通過先將130的伯醇氧化為羧酸，然後在HATU或任意其它肽偶合劑的存在下與胺反應製備得到。核苷136可通過先以羰基二咪唑活化130的羥基基團，然後與胺反應製備得到。核苷137可通過先以適當的鹼將130的羥基基團去質子化，然後以烷基化試劑淬滅陰離子製備得到。核苷138可通過先將130的羥基基團轉化為離去基團，然後以疏醇親核試劑取代製備得到。核苷139可通過還原134的疊氮基團，然後與異氰酸酯或異疏氰酸酯反應製備得到。核香140可通過還原134的疊氮基團並與FmocNCS反應提供活化的硫脲進行製備。fmoc活化的疏醇在EDC存在下進一步與胺反應可提供取代胍。去除fmoc保護性基團釋放核苷140。實施例206-取代的BNA亞磷醯胺核普的製備示意圖20formulaseeoriginaldocumentpage93可通過催化氫化去除核苷130-140的3'-和5'-0保護基團製備得到核苷142。或者，可通過首先以DDQ去除130-140的3'O-Nap基團，然後催化氬化去除5，0-苯甲基基團製備得到142。將5'輕基基團後續保護為二甲氧基三甲苯基醚，然後通過亞磷醯化反應可提供亞磷醯胺143。實施例21formulaseeoriginaldocumentpage94示意圖23(a)DAST,CH2Cl2,.78。C至室溫，16小時，52%(b)DDQ,CH2C12,H20,室溫，8小時，定量，(e)10%Pd/C,H2氣球，50%(d)DMTC1,嘧啶，55%(e)(iPr2)2NPOCH2CH2CN,四唑，麗I，DMFA)核苷(131a)將二乙基氨基三氟化疏(DAST,0.16mL,1.4mmol)加入核香129a(0.1g,0.2mmol)的二氯甲烷(2mL)的冷溶液(-5(TC)。將反應逐漸加熱至室溫並攪拌16小時，然後以飽和NaHC03溶液小心淬滅反應。在EtOAc和鹽水之間分配反應物，乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02，33%EtOAc的己烷溶液)純化提供核苦131a(51mg,52%，混有15-20%的開環雜質)的異構體混合物。19FNMR(CDC13):S-227.98(m)和-231.07(m)。LCMS:保留時間3.84分鐘；M+H計算值519.19，實測值519.1，以及3.89min;M+H計算值519.19,實測值519.1。B)核苷(141a)向核苷131a(51mg，0.1mmol)的二氯甲烷(lmL)和7jc(2滴)溶液添加DDQ(44mg，0.2mmol)。室溫下攪拌8小時後，以EtOAc稀釋反應物，並以10%NaHS03溶液、飽和NaHC03溶液、鹽水洗滌有機相，乾燥(Na2S04)並濃縮。柱層析(Si02,30%丙酮的氯仿溶液)純化提供核苷141a(41mg,作為異構體混合物定量)。19FNMR(CDC13):5-229.3(m)和-230.97(m)。LCMS:保留時間2.66分鐘；M+H計算值379.12，實測值379.0。C)核苷(142a)使用氫氣球氫化核苷141a(41mg,由前面獲得)和10%鈀炭(10mg)在甲醇(2mL)中的混合物。3小時後，所有的起始核苦141a被耗盡(通過對反應混合物的LCMS分析顯示)。以硅藻土過濾反應物並減壓濃縮濾除液。柱層析(Si02，10至20%甲醇的氯仿溶液)純化提供作為異構體混合物的核苷142a(14mg，50%)。19FNMR(CDC13):5-231.45(t)和-232.88(dt)。LCMS:保留時間1.72分鐘；M+Na計算值311.08,實測值311.0。D)核苷(142aa)向核苷142a(14mg,0.049mmol)的嘧咬(0.25mL)溶液添加DMTC1(24mg,0.07mmol)。室溫攪拌3小時後將反應物減壓濃縮。柱層析(Si02,20至30%丙酮的氯仿溶液)純化提供作為異構體混合物的核苷142aa(16mg，55%)。19FNMR(CDC13):S-228.6(t)和-230.91(dt)。LCMS:保留時間3.56分鐘；M+Na計算值613.21,實測值613.1。E)亞磷醯胺(143a)亞磷醯胺143a可參照實施例1的描述通過亞磷醯化(phosphitilation)反應由核苷142aa製備得到。實施例22核香亞磷醯胺的合成核香亞磷醯胺可參照此處和本領域(例如但不限於美國專利6,426,220和公開的PCT申請WO02/36743)所述的方法進行製備。實施例23寡核普酸和寡核普的合成如本發明所述的寡聚化合物可通過公知的固相合成技術進行常規製備。進行該種合成的設備已由多家銷售商出售，例如，AppliedBiosystems(FosterCity,CA)。本領域已知的任何其它該類合成方法均可額外或替代性採用。使用類似技術製備寡核普酸如疏代磷酸酯和烷基化衍生物已眾所周知。寡核苷酸未取代和取代的磷酸二酯(P二O)寡核苷酸可在自動化DNA合成儀(AppliedBiosystems394型)上採用被碘氧化的標準亞磷醯胺化學法合成得到。除以下區別外，硫代磷酸酯(P二S)的合成類似於磷酸二酯寡核苷酸採用10%w/v的3，H-l,2-苯並二硫醇-3-酮1,1-二氧化物的乙腈溶液氧化亞磷酸聯接以產生疏雜化。該闢^雜化反應步驟的時間提高至180秒且在此之前進行常規的帶帽步驟。從CPG柱裂解並在55。C下於濃氨水中去封閉(12-16小時)後，以大於3倍體積的乙醇從lMNH4OAc溶液中沉澱回收寡核苷酸。亞磷酸酯寡核苷酸可參照美國專利5,508,270的描述進行製備。烷基磷酸酯寡核普酸可參照美國專利4,469,863的描述進行製備。3，-脫氧-3，-亞甲基磷酸酯寡聚核苷酸可參照美國專利5,610,289或5,625,050的描述進行製備。亞磷醯胺寡核普酸可參照美國專利5,256,775或5,366,878的描述進行製備。烷基疏代磷酸酯寡核苷酸可參照公布的PCT申請PCT/US94/00902和PCT/US93/06976(分別公布為WO94/17093和WO94/02499)的描述進行製備。3，-脫氧-3，-氨基磷醯胺酯寡核苷酸可參照美國專利5,476,925的描述進行製備。磷酸三酯寡核普酸可參照美國專利5,023,243的描述進行製備。硼烷磷酸酯寡核苷酸可參照美國專利5,130,302和5,177,198的描述進行製備。寡核苷酸亞甲基甲亞胺基連接的寡核苷(也被稱為MMI連接的寡核苷)、亞甲基二甲基肼連接的寡核苷(也被稱為MDH連接的寡核香)、和亞甲基羰基氨基連接的寡核苷(也被稱為醯胺-3連接的寡核香)、和亞甲基氨基羰基連接的寡核苷(也被稱為醯胺-4連接的寡核苷)，以及具有例如交替的MMI和P=0或P=S聯接的混合骨架寡聚化合物可參照美國專利5,378,825;5,386,023;5,489,677;5,602，240和5,610,289的描述進行製備。甲縮醛和硫甲縮醛連接的寡核苷可參照美國專利5,264,562和5,264,564的描述進行製備。環氧乙烷連接的寡核苷可參照美國專利5,223,618的描述進行製備。實施例24寡核苷酸分離從可控孔玻璃固相載體上裂解並在55°。的濃氨水中去封閉12-16小時後，以大於3倍體積的乙醇從lMNH4OAc溶液中沉澱回收寡核香酸或寡核香。合成的寡核苷酸可通過電噴霧質譜(分子量測定)和毛細管凝膠電泳進行分析。在合成中獲得的疏代磷酸酯和磷酸二酯聯接的相對數量可通過正確分子量相對-16amu產品(+/-32+/-48)的比例進行確定。在某些研究中寡核苷酸通過HPLC進行純化，例如描述於Chiang等人，J.Biol.Chem,1991,266,18162-18171。HPLC-純化材料所得的結果通常類似於從非-HPLC純化材料獲得的結果。實施例25寡核苷酸合成-96孔板形式寡核苷酸可在能夠以96-孔形式同時裝配96個序列的自動化合成器中通過固相P(III)亞磷醯胺化學法合成得到。磷酸二酯核香酸間聯接可通過碘水溶液氧化得到。硫代磷酸酯核苷酸間聯接可通過使用無水乙腈中的3,H-1,2苯並二硫醇-3-酮l,l-二氧化物(Beaucage試劑)疏化得到。標準的鹼基被保護的卩-氰乙基-二異丙基亞碌醯胺可從銷售商(例如PE-AppliedBiosystems,FosterCity:CA或Pharmacia,Piscataway,NJ)處購得。非標準核苷可參照標準和專利方法進行合成。它們可作為鹼基保護的(3-氰乙基-二異丙基亞磷醯胺。寡核苷酸從載體上裂解並在升高的溫度(55-60。C)下在濃NH4OH中去保護12-16小時，在真空下乾燥所釋放的產品。將乾燥的產品重懸於無菌水中以提供主平板，從該平板上使用機械移液管稀釋得到所有的分析和測試平板樣本。實施例26採用96-孔板形式進行寡核普酸分析各徵孔中的寡核香酸濃度可通過稀釋樣本和UV吸收廣譜測定。單個產品的全長完整性可以96-孔形式(BeckmanP/ACETMMDQ)或針對單獨製備的樣本在商用毛細管電泳設備(例如，BeckmanP/ACE5000,ABI270)上通過毛細管電泳(CE)進行評估。鹼基和骨架組成可採用電噴霧質譜對寡聚化合物進行質譜分析確定。所有的測試平板均從主平板採用單和多道機械移液器稀釋得到。如果平板上至少85%的寡聚化合物具有至少85%全長，則可認為該平板可接受。實施例27細胞培養和寡核香酸處理寡聚化合物對耙標核酸表達的作用可在各種細胞類型中進行測試，只要該靶標核酸以可測水平在該細胞類型中存在。這可通過使用，例如PCR或Northern印跡分析等方法常^見測定。來自多種組織和物種的細胞系可從美國菌種保藏中心(ATCC,Manassas,VA)獲得。下列提供的細胞類型僅供闡述目的，也可常規採用其它細胞類型，只要把標在選定的細胞類型中表達。這可通過本領域常規的方法，例如，Northern印跡分析、核糖核酸酶保護測定或RT-PCR等進行簡便的測定。b.END細胞小鼠腦內皮細胞系b.END由MaxPlank研究所(BadNauheim，Germany)的WernerRisau博士提供。b.END細胞常規培養於添加了100/o胎牛血清(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)的高糖DMEM中(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)。在匯合度達到約90%時，通過胰蛋白酶化和稀釋進行常規的細胞傳代。將細胞以大約3000細胞/微孔的密度接種至96-孔板(Falcon-Primaria#353872,BDBiosciences,Bedford,MA)，從而用於包括但不限於寡聚化合物轉染實驗。涉及以寡聚化合物處理細胞的實驗當細胞達到適當的匯合度時，採用所述的轉染方法以寡聚化合物對其進行處理。UPOFECTIN當細胞達到65-75%匯合度時，以寡核苷酸對其進行處理。將寡核苷酸與LIPOFECTINTM(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)在Opti-MEMTM-l低血清培養基(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)中混合，以實現寡核普酸的理想濃度，且LIPOFECTINTM的濃度為每100nM寡核香酸2.5或3pg/mL。將該轉染混合物在室溫下孵育約0.5小時。細胞生長於96-孔板時，以100nLOPTI-MEMTM-l洗滌微孔一次，然後以130pL轉染混合物處理。類似地，用適當體積的培養基和寡核香酸處理生長於24-孔板或其它標準組織培養板中的細胞。重複兩次或三次處理細胞並取得數值。在37。C下處理約4-7小時後，以新鮮培養基替換含轉染混合物的培養基。寡核普酸處理後16-24小時採集細胞。本領域已知的其它適用轉染試劑包括，但不限於，CYTOFECTINtm、LIPOFECTAMINEtm、OLIGOFECTAMINEtm和FUGENE。本領域已知的其它適用的轉染方法包括，但不限於電穿孔。實施例28寡核普酸抑制靶標表達的分析靶標表達的反義調節可通過本領域已知的多種方法進行測定。例如，耙標mRNA水平可通過，例如，Northern印跡分析、竟爭性聚合酶鏈式反應(PCR)或實時PCR進行定量。目前希望採用實時定量PCR。可對總細胞RNA或poly(A)+mRNA進行RNA分析。本發明的一種RNA分析方法採用總細胞RNA，如本文其它實施例中所描述。RNA分離的方法已為本領域公知。Northern印跡分析也是本領域的常i見方法。實時定量(PCR)通過^^用來自PE-AppliedBiosystems,FosterCity,CA的ABIPRISM7600、7700或7900序列檢測系統並參照生產商iJt明得以便利地實現。靶標蛋白水平可通過本領域公知的多種方法進行定量，例如免疫沉澱、Western印跡分析(免疫印跡)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)或焚光激活細胞分類(FACS)。針對靶標的抗體可從多種來源例如抗體的MSRS目錄(AerieCorporation,Birmingham,MI)鑑定並獲得，或者可通過本領域公知的常規單克隆或多克隆抗體生成方法製備得到。製備多克隆抗血清的方法可參見，例如，Ausubel,F.M.等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻,第11.12.1-11.12.9頁，JohnWiley&Sons,Inc.，1997。單克隆抗體的製備可參見，例^口，Ausubel，F.M.等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻，第11.4.1-11.11.5頁，JohnWiley&Sons,Inc.,1997。免疫沉澱法是本領域的標準方法，並可參見例如，Ausubel,F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻，第10.16.1-10.16.11頁，JohnWiley&Sons,Inc.,1998。Western印跡(免疫印跡)分析是本領域的標準方法，並可參見例如,Ausubel,F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻，第10.16.1-10.80.21頁，JohnWiley&Sons,Inc.,1997。酶聯免疫吸附測定(ELISA)是本領域的標準方法，並可參見例如，Ausubel,F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻，第11.4.1-11,2.22頁,JohnWiley&Sons:Inc.，1991。實施例29對把標抑制劑用途的表型測定和體內研究的設計表型測定一旦把標抑制劑通過此處披露的方法進行鑑定，可在一個或多個表型測定中進一步考察該寡聚化合物，其中每個測定具有預示對特定疾病狀態或症狀進行治療的效力的可測端點。表型測定、其中適用的試劑盒和試劑已為本領域技術人員公知，並在此處用於考察靶標在健康和疾病中的作用和/或關聯。代表性的表型測定(可從多個銷售商中購得)包括測定細胞活性、細胞毒性、擴增或細胞存活的測定(MolecularProbes,Eugene,OR;PerkinElmer,Boston,MA)，基於蛋白的測定包括酶法測定(Panvera，LLC,Madison,WI;BDBiosciences,FranklinLakes,NJ;OncogeneResearchProducts,SanDiego,CA)，糹田月包調節、信號轉導、炎症、氧化過禾呈以及凋亡(AssayDesignsInc.,AnnArbor,MI)、甘油三酉旨積累(Sigma-Aldrich，St.Louis,MO)、血管生成測定、管道形成測定、細胞因子和激素觀'J定以及^U射觀'J定(ChemiconInternationalInc.,Temecula，CA;AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。在一個非限制性實例中，經測定適用於特定表型測定的細胞(即，選擇用於乳腺癌研究的MCF-7細胞；用於肥胖研究的脂肪細胞)用體外研究鑑定的耙標抑制劑和對照化合物在最佳濃度下處理(通過上述方法測定的)。在處理末期，用一種或多種對測定特異的方法來分析經處理和未經處理的細胞來確定表型結果和終點。表型終點包括細胞形態隨時間或處理劑量的變化以及細胞成分如蛋白、脂質、核酸、激素、糖或金屬等的水平變化。對細胞狀態(包括pH、細胞周期階段、細胞對生物指示劑的攝取或排除)的檢測通常是感興趣的。對處理後的細胞中一種或多種基因表達的檢測同樣可用作把標抑制劑的效力或功效的指示。同時檢測經處理和未經處理的細胞中的純度印記基因或懷疑與特定疾病狀態、症狀或表型有關的那些基因。體內研究本文所述的體內研究中的個體對象為溫血脊推動物，包括人。實施例30RNA分離Poly(A)+mRNA分離Poly(A)+mRNA的分離可參照Miura等人的方法(Clin.Chem.,1996，42,1758-1764)。其它的poly(A)+mRNA分離方法為本領域的常規方法。簡言之，對於生長於96-孔板的細胞，從細胞去除生長培養基並以200冷PBS洗滌每個微孔。向每個孩i孔添加60nL裂解緩沖液(IOmMTris-HCl，pH7.6,1mMEDTA，0.5MNaCl，0.5%NP-40,20mM氧釩-核糖核苷複合物)，輕柔搖動平板並在室溫下孵育五分鐘。將55|iL裂解產物轉移至塗覆了寡聚d(T)包被的96-孔板(AGCTInc.,IrvineCA)。將平板在室溫下孵育60分鐘，以200洗滌緩衝液(10mMTris-HClpH7.6,1mMEDTA，0.3MNaCl)洗滌3次。末次洗滌後，以紙巾吸去多餘的洗滌緩衝液，然後空氣乾燥5分鐘。將預熱至7(TC的60pL洗脫緩衝液(5mMTris-HClpH7.6)添加至各微孔，將平板在90°C熱板上孵育5分鐘，然後將洗脫物轉移至新鮮的96-孔板。生長於100mm或其它標準平板的細胞也可採用適當體積的所有溶液進行類似處理。總RNA分離總RNA可採用由QiagenInc.(Valencia,CA)購得的RNEASY96頂試劑盒和緩衝液並參照生產商的推薦方法進行分離。簡言之，對於生長於96-孔板的細胞，從細胞去除生長培養基並分別以200冷PBS洗滌每個微孔。向每個微孔添加150緩衝RLT並將平板劇烈搖動20秒。將150的70%乙醇添加至各微孔，然後通過上下吹吸三次混合內含物。隨後將樣本轉移至裝配了廢物採集盤並連接至真空源的QIAVactm集流腔所連接的RNEASY96tm孔板上。抽真空1分鐘。將500[iL緩衝RW1添加至RNEASY96頂板的各微孔中並孵育15分鐘，再次抽真空1分鐘。再次將500|iL緩衝RW1添加至RNEASY96tm板的各微孔中並再次抽真空2分鐘。然後將1mL的緩衝RPE添加至RNEASY96tm板的各微孔中並抽真空90秒鐘。重複用緩衝RPE洗滌，再次吸真空3分鐘。然後從QIAVACTM集流腔取走平板並用紙巾吸乾。重新將平板連接至裝配了含1.2mL採集管的採集管架的QIAVACtm集流腔。然後通過向各微孔中移入140無RNA酶的水，孵育1分鐘，抽真空3分鐘洗脫RNA。重複移液和洗脫步驟可通過QIAGENBio-Robot9604(Qiagen,Inc.,ValenciaCA)自動完成。簡言之，裂解培養平板上的細胞之後，將平板轉移至進行移液、DNA酶處理和洗脫步驟的機械平臺上。實施例31耙標mRNA水平的實時定量PCR分析耙標mRNA水平可採用ABIPRISM7600、7700或7900序列檢測系統(PE-AppliedBiosystems，FosterCity,CA)並參照生產商的i兌明通過實時定量PCR實現定量。這是一個閉管、非凝膠式螢光檢測系統，其允許對聚合酶鏈式反應(PCR)產物進行實時高通量定量。與擴增產物在PCR完成後定量的標準PCR不同，在實時定量PCR中的產物在其積累時定量。這一點可通過在PCR反應中包含在正向和反向PCR引物之間特異性退火併包含兩個螢光染料的寡核苷酸探針來實現。報告染料(例如，FAM或JOE，來自PE-AppliedBiosystems,FosterCity,CA,OperonTechnologiesInc.,Alameda,CA或IntegratedDNATechnologiesInc.,Coralville,IA)被連接至探針的5'端而淬火染料(例如，TAMRA，來自PE-AppliedBiosystems,FosterCity,CA,OperonTechnologiesInc.,Alameda,CA或IntegratedDNATechnologiesInc.,Coralville,IA)被連接至探針的3'端。當探針和染料完整時，報告染料的發射被鄰近的3'端淬火染料淬滅。在擴增過程中，探針與靶標序列的退火生成能被Taq聚合酶的5'-核酸外切酶活性裂解的底物。在PCR擴增周期的延伸階段，Taq聚合生成了序列特異性螢光信號。在每一個周期中，附加的報告染料分子從其相應的探針中裂解，並可通過整合在ABIPRISMTM序列檢測系統中的雷射鏡頭定期監測螢光強度。在每一個測定中，一系列包含來自未處理對照樣本的mRNA系列稀釋物的平行反應生成標準曲線，它可用於對測試樣本進行反義寡核苷酸處理後的抑制百分比進行定量。在定量PCR分析之前，對被測耙標基因特異性的引物-探針組與GAPDH擴增反應的"多重性(multiplexed)"能力進行評估。在多重化中，耙標基因和內標基因GAPDH在單個樣本中同時擴增。在該分析中，從未處理細胞中分離的mRNA被系列稀釋。各稀釋物可在僅特異性耙向GAPDH、僅特異性耙向靶標基因("單重")或對兩者都特異(多重)的引物-探針組的存在下擴增。PCR擴增之後，可同時從單重和多重樣本生成作為稀釋函數的GAPDH和耙標mRNA信號的標準曲線。如果從多重樣本中生成的GAPDH和靶標信號的斜率和相關聯繫數均小於從單重樣本所得相應數值的10%之內，則該對把標具有特異性的引物-探針組可認為具有多重性。其它PCR方法已為本領域所知。RT和PCR試劑可從InvitrogenLifeTechnologies(Carlsbad,CA)獲得。RT，實時PCR可通過向含有30jiL總RNA溶液(20-200ng)的96-孔板添加20PCR混合物(2.5x無MgCl2PCR緩衝液，6.6mMMgCl2,dATP、dCTP、dCTP和dGTP各375^M,正向引物和反向引物各375nM，125nM探針，4單位RNA酶抑制劑，1.25單位PLATINUMTaq，5單位MuLV逆轉錄酶以及2.5xROX染料)得以實現。RT反應可通過在48i:下孵育30分鐘得以實現。在95°C下聘育10分鐘以激活PLATINUMTaq後，進行40個循環的兩步PCR法95。C下進行15秒(變性)後在6(TC下進行1.5分鐘(退火/延伸)。通過RT，實時PCR得到的基因目標量通過GAPDH(—種表達恆定的基因)的表達水平或通過以RIBOGREEN(MolecularProbes,Inc.Eugene,OR)定量總RNA來歸一化。GAPDH表達可通過與靶標同時多重或單獨運行實時RT-PCR來定量。總RNA可採用RiboGreenRNA定量試劑(MolecularProbes,Inc.Eugene,OR)進行定量。通過RIBOGREENtm迸行RNA定量的方法可參見Jones,L.J.,等人，(AnalyticalBiochemistry,1998,265,368-374)。在該測定中，170|iL的RIBOGREENTM工作試劑(RIBOGREENTM試劑以1:350稀釋於10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH7.5)以移液管移入含有30|iL純化細胞RNA的96-孔板。在CytoFluor4000(PEAppliedBiosystems)中讀板，激發波長為485nm,發射波長為530nrn。實施例32靶標特異性引物和探針可採用公開的序列信息設計探針和引物，與把標序列雜交。例如，對於人PTEN，可使用公開的序列信息(GENBANRTM錄入號U92436.1,SEQIDNO:l)設計下列引物-探針組正向引物AATGGCTAAGTGAAGATGACAATCAT(SEQIDNO:2)反向引物TGCACATATCATTACACCAGTTCGT(SEQIDNO:3)以及PCR探針FAM-TTGCAGCAATTCACTGTAAAGCTGGAAAGG-TAMRA(SEQIDNO:4),其中FAM為螢光染料，TAMRA為淬火染料。實施例33草巴標蛋白水平的Western印跡分析Western印跡分析(免疫印跡分析)可採用標準方法進行。在寡核苷酸處理後16-20小時採集細胞，以PBS洗滌一次，懸浮於Laemmli緩衝液(100pl/微孔)，煮沸5分鐘並上樣至16%SDS-PAGE凝膠。在150V下跑膠1.5小時，並轉移到膜上進行western印跡。採用適當的針對耙標的一抗，以及針對該一抗的放射標記或焚光標記的二抗。採用PHOSPHORIMAGER(MolecularDynamics,SunnyvaleCA)顯示條帶。實施例34耙向PTEN的6-(R或S)-CH3和6-(R或S)-CH2-0-CH3BNA2-10-2帶間隙寡聚體體外研究如本發明所述，合成寡聚化合物並在一定劑量範圍內檢測其減少PTEN表達的能力。採用此處所述的方法以0.3125、0.0625、1.25、2.5、5、10或20nM濃度的6-(R或S)-CH3-BNA(分別為392748和392749)以及6-(R或S)-CH2-OCH3(分別為396004和396005)修飾的寡聚體處理b.END細胞。如此處其它實施例所述，PTEN的表達水平可通過實時PCR測定並對RIBOGREEN歸一化。所得的劑量-響應曲線可如下所示用於測定EC50。可在pH7的含0.1mMEDTA的100mM磷酸鹽緩衝液中於260nm下使用4|iM6-(R或S)-CH3-BNA或6-(R或S)-CH2-0-CH3修飾的寡聚體和4(iM互補RNA評估Tm。tableseeoriginaldocumentpage108所有的核苷間聯接為硫代磷酸酯，粗體的核香為6-(R或S)-CH3BNA核普，加下劃線和粗體的核香為6-(R或S)-CH2-0-CH3BNA核香，而下標R和S表示了在6位碳原子處的構型。應當指出6-修飾的BNA寡聚化合物顯示了更大的效力，儘管它的Tm略微下降。實施例35耙向PTEN的6-(S)-CH3-BNA和6-(R)-CHrBNA2-10-2帶間隙的寡聚體體內研究在3周中每周兩次向六周大的Balb/c小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)注射劑量為0.5或2|imol/kg的把向PTEN的6-CHrBNA修飾寡聚體(6-(S)或6-(R))。在最後一次施用後48小時處死小鼠。將肝組織勻漿化並按照此處所述通過實時PCR對mRNA水平定量，從而與未處理對照水平進行比較(%UTC)。SEQH>NO.組成(S，至3，)劑量％UTC/腿腸*《鹽水10005/392748C'及U/TAGCACTGGCQfU及2.03105/392748CUffTAG(:ACTGGCC0.58105/392749CyJiTAGCACTGGCCsUs2,02305/392749C函TAGCACTGGCC美0.573所有的核苷間聯接為硫代磷酸酯，粗體核苷為6-CH3-BNA核普而下標R和S表示了在6位^_原子處的構型。實施例36靶向PTEN的6-(S)-CH3-BNA和6-(R)-CHrBNA2-10-2帶間隙的寡聚體體內研究向六周大的Balb/c小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)注射一次劑量為1、2、4或8(imol/kg的靶向PTEN的6-CHrBNA修飾的寡聚體(6-(S)或6-(R))。在施用後72小時處死小鼠。將肝組織勻漿化並按照此處所述通過實時PCR對mRNA水平定量，從而與未處理對照水平進行比較(。/。UTC)。tableseeoriginaldocumentpage110所有的核苷間聯接均為疏代磷酸酯，粗體和帶下劃線的核苷為6-CHrO-CH2-BNA核普而下標S和R表示了6位碳原子處的構型。實施例38以SVPD處理的6-(R或S)-CH3-BNA修飾的寡聚體的核酸酶穩定性6-(R或S)-CH3-BNA(分別為392748和392749)修飾的寡聚體的核酸酶穩定性可採用蛇毒磷酸二酯酶(SVPD)進行測定。該研究分別包括了可進行比較的6-未取代的間隙體(gapmer)(4'-CH2-0-2，橋連的BNA，392745，下標l)和2，-0-MOE間隙體(2，-0-(CH2)2-OCH3，392753,下標e)。各寡聚體製備為含有以下成分的500(iL混合物5)iL100寡聚體，50含於SVPD緩衝液(50mMTris-HCl，pH7.5，8mMMgCl2)的0.5單位/mL磷酸二酯酶，其最終濃度為0.05單位/mL,445pLSVP緩衝液。將樣本在37。C下於水浴中孵育。在第0、1、2和4天取等份(100(iL)並在第1和2天添加新鮮的酶。在等份取出後立即添加EDTA以終止酶活性。在IPHPLC/MS上分析樣本。SEQM)NO'組成(5'至3，)第4天全長％艦SNO,05/392748C教U及TAGCACTGGCC及Ui>9005/392749C函TAGCACTGGCC函>7005/392745CiUiTAGCACTGGCCWi>400S艦753CATAGCACTGGCC具>30SEQIDNO.在24小時的組在48小時的組在96小時的組/ISISNO.成％成％成％05/—神27站100%89%92%0S/392灘96%纖74%05/39274567%56%48%05/39275358%46%36%所有的核苷間聯接為疏代磷酸酯，粗體核苷為修飾的核苷，下標R和S表示了6-CH3-BNA核苦在6位碳原子的構型，下標e表示了2'-OMOE核普而下標1表示了4，-CH2-0-2，修飾的核苷。含有6-甲基取代的BNA的化合物實施例39以SVPD處理的6-(R或S)-CH3-BNA、4，-CHrO-2，BNA和2，-0-MOE修飾的寡聚體的核酸酶穩定性6-CH3-BNA修飾的寡聚體的核酸酶穩定性可採用蛇毒磷酸二酯酶(SVPD)進行測定。各寡聚體製備為含有以下成分的90混合物51iL寡聚體(2pL5pM寡聚體和35，32p-標記的寡聚體)、75H20以及1010x緩衝液(500mMTris-HCl，700mMNaCl以及140mMMgCl2，pH8.6)。在0分鐘，從上述製備的寡聚體樣本取出9並添加至10(iL終止緩衝液(6.67M尿素，16.67%甲醯胺和83.3mMEDTA)然後添加1|iLH20並在IO(TC下加熱2.5至3分鐘。通過添加9SVPD(0.5單位/mL)開始測定動力學。最終的酶濃度為0.05單位/mL。將每等份的10寡聚體動力學溶液添加至10(iL終止緩衝液並按如上所述熱滅活。取l、3、9、27、80、240和1290為動力學時間點。通過12%丙烯醯胺PAGE在45瓦特/凝膠下跑2小時分析樣本。認<|ID膽./腳膽，06/39542107/39542307/395424鵬9542S06/7157組成(5'至3')TTTTTTTTTTU禍TTTTTnTTTTT修飾粗體2-O-MOE粗體4,-CH2-0-2,粗體6-(R〗-CH3未修飾的.(2鄰所有的核苷間聯接均為疏代磷酸酯，粗體核普為修飾的核苷，下標R和S表示了6-CHrBNA核普在6位碳原子的構型，下標e表示2'-0-M0E核脊而下標1表示4，-CHrO-2，修飾核苷。SEQIDNO.在3分鐘的在27分鐘的在80分鐘的在240分鐘在12卯分鐘組成％組成％組成％的組成％的組成％06/39542168.727.917.211.69.007/39542332.64.72.52.22,207/39542496.4狄l83.279.072.007/395425鄰.O86.383.782.70頻575.2L22,0i,70,9,實施例40在三周、多劑量j本內研究中耙向PTEN的6-(S)-CH3-BNA、4，-CH2-0-2-BNA和2'-0-MOE修飾的寡聚體在三周中每周兩次向六周大的Balb/c小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)注射劑量為3.2、1.0、0.32和0.1pmol/kg(以下僅顯示了3.2和1(imol/kg的數據)的靶向PTEN的6-(S)-CH3-BNA(2-10-2,14-聚體)、4，-CH2-0-2，-BNA(2-10-2，14-聚體)和2，-0-MOE(5-10-5,20-聚體)修飾的寡聚體。在最後一次施用後48小時處死小鼠。將肝組織勻漿化並按照此處所述通過實時PCR對mRNA水平定量，從而與未處理對照水平進行比較(G/oUTC)。處死後測定血漿化學和肝重。SEQIDNO,組成(5，至3')劑量％UTCALT鹽水i節41,305/392749C函TM3CACTCK3CC函124.329.803/392稀C函TAOCACTGGCC胸13624.S05/392063C,線TAGCACTGGCCiU畫3,24.2279.308/392063詠C,WTAGCACTGGC,CiT,12641.009/116847CeTeG,CTAGCCTCTGG15341.3ATtHPra^*《le*e^"^e^e所有的核普間聯接為硫代磷酸酯，粗體核香為修飾的位置，下標s表示6-(S)-CH3-BNA,下標1表示4，-CH2-0-2，BNA,下標e表示2，-OM0E而MeC表示5'-甲基胞嘧啶核苷。在研究的最高點，含4，-CH2-0-2，BNA(392063，3.2(imol/Kg劑量組)的寡聚體的高劑量組動物顯示肝重明顯升高的(相對鹽水為153%)。與之相對，含6-(S)-CH3BNA(392749，3.2fimol/Kg劑量組)寡聚體的肝重為鹽水組的117%。含2'O-MOE(116847,1.0|imol/Kg劑量組)寡聚體的肝重為鹽水組的116%。該實施例證明了6-(S)-CH3-BNA修飾在允許設計的反義寡聚體保持4'-CH2-0-2，BNA所賦予的效力的同時，其ALT水平相對4'-CH2-0-2，BNA修飾的化合物有顯著提升。實施例41耙向PTEN的6-(R或S)-CH3和6-(R或S)-CH2-OCH3、4，-CH2-0-2，BNA2-10-2帶間隙的寡聚體體內研究向六周大的Balb/c小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)注射一次劑量為2.5、5、10和201imol/kg(以下僅顯示了5和10(imol/kg的數據)的耙向PTEN的修飾的6-(R或S)-CH3(分別為396568和396024)、6-(R或S)畫CH2-OCH3(分別為396007和396008)、4,-CH2-0-2，BNA2-10-2帶間隙的寡聚體(6-(S)或6-(R))。在施用後66小時處死小鼠。將肝組織勻漿化。SEQIDNO.組成(5'至3')劑量ALT腦)S肌鹽水41.305應024CsU5TAGCACTGGCC:函10250.505/3卿24C函TAGCACT冊CC《U5'572.005/3賜S68C，炎TAGCACTGGCC:函10234.3C函TAGCACTGGCC函562.005jQ^TAGCACTGGCg^10129,S0S/39,gg^TAGCACTGGCgg^5鄉.O05/3卿07g^TAGCACTOGCSia10柳05/39,^^TAGCAC',CS^50咖2啦MeC，T,TAGCACTGGC^C'T,10925,008鵬oe綠C,TiTAGCACTGGC隱CiT,5373.0所有的核苷間聯接均為硫代磷酸酯，粗體的核苷為修飾的核苷，下標R和S表示所示的6-CH3-BNA(僅粗體)和6-CHrO-CH3-BNA(粗體並帶下劃線)核苷在6位碳原子的構型，下標1表示4，-CH2-0-2，核苷而Mec表示5'-甲基胞嘧咬核脊。上述寡核苷中，一個寡核苷(IsisNo.392063)在6位碳原子處不含手性核普，其中其它四個(IsisNo.396024、396568、396008和396007)在6位石友原子處含手性的核苷。特別地，這四個寡核苷在1、2、13和14位具有一個該種核苷。在肝中，在6位碳原子處不含手性核苷的寡核苷比包括在6位碳原子處含手性核苷的四個寡核苷具有相對更高的毒性。實施例42輩巴向PTEN的2-14-2帶間隙的寡聚體體內研究在向六周大的Balb/c小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)注射一次劑量為2或10(imol/kg的靶向PTEN的6-CH3-BNA修飾的寡聚體。在施用後72小時處死小鼠。將肝組織勻漿化並按照此處所述通過實時PCR對mRNA水平定量，從而與未處理對照水平進行比較(Q/oUTC)。SEQIDNO.組成(5，至3，)修飾艦SNCX10/394420wCeTeGCTAGCCTCT<3GATTeTe粗體2'-OMOE1i/4助522mCRUR<3CTA(3CCTCTGGATURUR粗體6"(R)-CH311/4徹523mCsUsGCTAC3CCTCTGGATUsUs粗體11/400524mCRURGCTAi、oBx8.如權利要求1-6任意一項所述的化合物，其中所述Z基團為(S)-構型formulaseeoriginaldocumentpage39.如權利要求1-8任意一項所述的化合物，其中T！和T2中至少一個為羥基保護基團。10.如權利要求9所述的化合物，其中所述的羥基保護基團分別獨立選自苯甲基、苯甲醯、2,6-二氯苯甲基、叔丁基二甲基矽烷基、叔丁基二苯基矽烷基、甲磺酸、甲苯磺酸、二甲氧基三苯甲基(DMT)、9-苯基黃嘌呤-9-基(Pixyl)以及9-(對甲氧基苯基)黃噪呤-9-基(MOX)。11.如權利要求9所述的化合物，其中Tt選自乙醯基、苯甲基、叔丁基二甲基矽烷基、叔丁基二苯基矽烷基以及二甲氧基三苯甲基。12.如權利要求ll所述的化合物，其中所述的Ti為4,4，-二甲氧基三苯甲基。13.如權利要求l-8任意一項所述的化合物，其中T2為活性磷基團。14.如權利要求13所述的化合物，其中所述的活性磷基團為二異丙基氰基乙氧基亞磷醯胺或H-磷酸酯。15.如權利要求1-8任意一項所述的化合物，其中T\為4,4，-二甲氧基三苯甲基，T2為二異丙基氰基乙氧基亞磷醯胺。16.—種寡聚化合物，其具有至少一個具有下式的單體或下式:formulaseeoriginaldocumentpage4formulaseeoriginaldocumentpage5其中Bx是雜環石威基部分；T3為H、鞋基保護基團、聯接的共軛基團或與核苷、核苷酸、寡核香、寡核苷酸、單體亞基或寡聚化合物連接的核香間聯接基團；T4為H、羥基保護基團、聯接的共軛基團或與核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、單體亞基或寡聚化合物連接的核苷間聯接基團；其中至少T3和T4之一為與核苷、核苷酸、寡核苷、寡核普酸、單體亞基或寡聚化合物連接的核普間聯接基團；且Z是C廣C6烷基、C2-Q歸基、C2-C6炔基、取代的d-Q烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、醯基、取代的醯基、取代的醯胺、硫醇或取代的硫。17.如權利要求16所述的寡聚化合物，其中各被取代的基團獨立地被任選被保護的取代基單或多取代，該取代基獨立地選自卣素、氧代、羥基、OJi、NJ山、SJ!、N3、OC(-X)JbOC^X)NJ!J2、NJ3C(二X)NJ!J2和CN，其中各Ji、乙和J3獨立為H或C廣C6烷基，X是O、S或Nh。18.如權利要求16所述的寡聚化合物，其中各Z獨立地為CVC6烷基或取代的CrCe烷基。19.如權利要求18所述的寡聚化合物，其中至少一個Z為甲基。20.如權利要求18所述的寡聚化合物，其中至少一個Z為取代的d-C6烷基。21.如權利要求20所述的寡聚化合物，其中各所述取代基為CH^烷氧基。22.如權利要求20所述的寡聚化合物，其中至少一個Z為CH3OCH2-。23.如權利要求16-22任意一項所述的寡聚化合物，其中各Z為甲基或CH3OCH2-。24.如權利要求16-23任意一項所述的寡聚化合物，其中具有所述式的至少一個單體的Z基團為由下式表示的(R)-構型formulaseeoriginaldocumentpage6(IV)、或下式:formulaseeoriginaldocumentpage6(V或下式formulaseeoriginaldocumentpage7(vi)。25.如權利要求24所述的寡聚化合物，其中具有所述式的各單體的各Z基團為(R)-構型。26.如權利要求16-23任意一項所述的寡聚化合物，其中所述至少一個單體的Z基團為由下式表示的(S)-構型腳27.如權利要求26所述的寡聚化合物，其中具有所述式的各單體的各Z基團為(S)-構型。28.如權利要求16-27任意一項所述的寡聚化合物，其中T3為H或羥基保護基團。29.如權利要求16-27任意一項所述的寡聚化合物，其中T3為與核苷、核苷酸或單體亞基的連接核苷間聯接基團。30.如權利要求16-27任意一項所述的寡聚化合物，其中丁3為與寡核苷或寡核苷酸連接的核苷間聯接基團。31.如權利要求16-27任意一項所述的寡聚化合物，其中丁3為與寡聚化合物連接的核苷間聯接基團。32.如權利要求16-31任意一項所述的寡聚化合物，其中T4為H或羥基保護基團。33.如權利要求16-31任意一項所述的寡聚化合物，其中T4為與核苷、核苷酸或單體亞基連接的核香間聯接基團。34.如權利要求16-31任意一項所述的寡聚化合物，其中T4為與寡核香或寡核苷酸連接的核苷間聯接基團。35.如權利要求16-29任意一項所述的寡聚化合物，其中T4為與寡聚化合物連接的核苦間聯接基團。36.如權利要求16-27任意一項所述的寡聚化合物，其中丁3和T4中至少一個包含選自磷酸二酯或疏代磷酸酯的核苷間聯接基團。37.如權利要求16-36任意一項所述的寡聚化合物，其包含至少一個由至少兩個相鄰的具有所述式的單體組成的區。38.如權利要求37所述的寡聚化合物，其包含至少兩個由至少兩個相鄰的具有所述式的單體組成的區。39.如權利要求38所述的寡聚化合物，其包含有間隙的寡聚化合物。40.如權利要求37或38所述的寡聚化合物，其進一步包含至少一個由約8至約14個相鄰的(3-D-2'-脫氧核糖基核香組成的區。41.如權利要求40所述的寡聚化合物，其進一步包含至少一個由約9至約12個相鄰的(3-D-2，-脫氧核糖基核苦組成的區。42.如權利要求37所述的寡聚化合物，其包含由2至3個具有所示式的相鄰單體組成的一個區，任選的由1或2個具有所示式的相鄰單體組成的第二區以及由8至14個P-D-2，-脫氧核糖基核苷組成的第三區，其中所述的第三區位於所述的第一和所述的第二區之間。43.如權利要求42所述的寡聚化合物，其包含8至10個(3-D-2'-脫氧核糖基核苷。44.如權利要求16-43任意一項所述的寡聚化合物，其包含長度為約8至約40個的核苷和/或修飾的核苷或模擬物。45.如權利要求16-43任意一項所述的寡聚化合物，其包含長度為約8至約20個的核香和/或修飾的核普或模擬物。46.如權利要求16-43任意一項所述的寡聚化合物，其包含長度為約10至約16個的核普和/或修的飾核脊或模擬物。47.如權利要求16-43任意一項所述的寡聚化合物，其包含長度為約10至約14個的核苷和/或修飾的核苷或模擬物。48.—種抑制基因表達的方法，其包括將一種或多種細胞、組織或動物與如權利要求16-45任意一項所述的寡聚化合物接觸。49.用於藥物治療的如權利要求16-47任意一項所述的化合物。50.如權利要求16-47任意一項所述的化合物在製備用於抑制基因表達的藥物中的應用。全文摘要本發明提供了6-修飾的雙環核苷類似物以及包含這些核苷類似物的寡聚化合物。在優選的實施方案中該核苷類似物在6位具有(R)或(S)-手性。這種雙環核苷類似物可用於提高寡聚化合物的性質包括核酸酶抗性。文檔編號C07H19/04GK101410406SQ200780010566公開日2009年4月15日申請日期2007年1月27日優先權日2006年1月27日發明者埃裡克·E·斯威茲,普內特·P·塞思申請人:Isis藥物公司