用於誘導神經發生的氧化氮供體的製作方法

2023-11-01 15:05:27

專利名稱：：用於誘導神經發生的氧化氮供體的製作方法
技術領域：
：的方法和化合物。更明確的講，本發明涉及促進神經系統的神經發生和可塑性的方法和組合物。
背景技術：
：如果大腦部分梗塞就會發生中風，就會由於腦部供血中斷而造成腦組織壞死。伴隨急性中風的腦血栓可造成突然和劇烈的神經損傷。在美國的成年人中，中風是第三大死因，也是致殘的重要因素。藥理學上的各種幹涉試圖使那些有可能存活下去的受中風影響的大腦區域血流量達到最大，但是臨床效果讓人很事困惑。正如Harrison的PrinciplesofInternalMedicine(9thED.，1980，p.1926)中所講的，儘管實驗證明...(腦血管擴張)增加了腦部血液流量，正如氧化氮方法檢測的結果，它們還沒有證明這在對瞬時局部缺血攻擊、血栓形成或慢性中風階段的人類中風的仔細研究是有幫助的。給藥煙酸、煙酸千唑啉、乙醇、罌粟鹼和吸入5%二氧化碳是對的...與應用這些方法相反的建議就是血管擴張藥物是有害的，而不是有益的，因為他們降低了系統血壓，從而降低了與碩腔相吻合的血流，或者通過擴張大腦正常區域的血管來從梗阻處銀取血流。因此，開發一種化合物和方法，通過產生神經發生來緩解中風的影響是有用的。
發明內容按照本發明，它提供了一種方法，可通過對需要促進神經發生的患者給藥以治療劑量的氧化氮供體來促進神經發生。在沒有受到損傷的大腦中也可促進神經發生。並且提供了一種化合物，它含有足以促進神經發生的有效劑量的氧化氮供體來誘導神經發生。也提供了一種促進神經發生的氧化氮化合物。此外，本發明也提供了一種方法，它通過對需要增強神經細胞產生的位點給藥以有效劑量的氧化氮供體化合物就可增強此處神經細胞的產生。本發明提供了一種方法，它通過對患者給藥以有效劑量的氧化氮供體化合物來增強神經功能和認知功能。結合其中的圖表，只要通過參考下面的發明詳述你就可更好的理解本發明，你也就很容易的意識到本發明的其他優點。圖l是一張照片，它展示了所選區域的BrdU-陽性細胞核；圖2A和2B是兩個圖表，它們顯示了在subventricular區(SVZ)的BrdU-陽性細月包數量；圖3顯示了在鋸齒狀腦回中的BrdU-陽性細胞數量；圖4A和4B是兩個圖表，它顯示在鋸齒狀腦回中BrdU細胞的分布百分比；圖5是一張照片，它展示了免疫反應性細胞相對於粒細胞層中的粒細胞的大小；圖6A和6B顯示了SVZ中的BrdU-陽性細胞數量；圖7A和7B顯示了嗅覺球(0B)中的BrdU-陽性細胞數量；圖8A和8B顯示了鋸齒狀腦回中的BrdU-陽性細胞數量；圖9顯示了損害體積研究；圖10顯示了時間相對於粘連性去除檢測的結果-MCAo變化；圖ll顯示了Rotarod檢測的結果；圖12顯示了NSS檢測的結果；圖13顯示了重量百分比；圖14顯示了Rotarod檢測的結果；圖15顯示了Rotarod檢測的進一步結果；圖16顯示了footfault檢測的結果；以及圖17顯示了進一步的粘連性去除檢測的結果。發明詳述一般的講，本發明提供了促進神經發生的方法和化合物。更明確的講，本發明提供了可促進神經發生的方法和化合物，它是通過利用有效劑量的可促進神經發生的氧化氮供體來促進神經發生的。多種部位可需要神經發生，這包括但不局限於大腦、CNS、耳或其中含有損傷的神經細胞的部位。'氧化氮供體，是指一類化合物，它能提供氧化氮或促進氧化氮濃度的增加..有多類化合物可提供氧化氮。這些化合物包括DETAN0N0ate(DETAN0N0，.N0N0ate或1-取代diazen-1-ium-1,2-diolate是含有[N(NO)NO]-功能基團的化合物；DEA/NO;SPER/NO;DETA/NO;OXI/NO;SULF/NO;PAPA/NO;MAHMA/NO以及DPTA/NO);PAPANONOate,SNAP(S-亞硝基-N-乙醯青黴胺)，硝普鈉，硝化甘油鈉。這些化合物可促進氧化氮的提高，例如磷酸二酯酶抑制劑和L-精氨酸.此處所用的'促進神經發生'是指促進或增強神經增長.它可包括但不局限於，新神經細胞的增長或增強已存在的神經細胞的生長，以及實質細胞和可促進組織可塑'逸的細胞的增殖和生長。神經發生也包括，但並不局限於，軸突和樹突延伸和突觸發生.此處所用的'增強，指在特定條件下，按照要求對生長進行增強和抑制。因此，如果需要額外的神經元生長，添加氧化氮供體就能提高這種生長。氧化氮供體，或氧化氮源，通過增強受體活化和促進細胞形態改變和細胞增殖使腦組織準備來補償由於損傷、神經變性或老化引起的損傷.此處所用的'神經，和'認知'功能指大腦中的神經生長增強了患者思考、官能或其他的能力，接受氧化氮治療的正常人增強了腦細胞的產生，加快了認知、記憶和運動神經的功能。此外，當進行氧化氮治療之後，遭受神經疾病或損傷的患者可提高認知、記憶和運動神經細胞的功能。本發明的目的就是通過誘導神經發生和細胞變化來促進功能的提高，從而促進在局部缺血性腦損傷或其他神經損傷治療中取得改良性的成果。在患有中風、CNS損傷和神經變性疾病之後，患者會遭受神經和功能性缺陷。這些發現提供了一種方法來增強大腦在CNS損傷或惡化之後的補償機制。在患者遭受中風、損傷、老化和退化疾病之後，通過對氧化氮給藥來誘導神經元和細胞的變化就可促進患者的功能性改進這種方法也有益於遭受其他神經疾病，例如，但又不局限於ALS、MS和Huntingtons的患者，在遭受CNS損傷之後，在適當的時間對氧化氮給藥可促進大腦的神經發生，並且能加快神經發生。這種效果的主要機制是NO活化了穀氨酸受體。這些穀氨酸受體促進了長期增強作用，並且隨後誘導了神經元的再生.在最初的實驗中，選用一種長半衰期(約為50小時)並可產生NO的化合物——DETA/NO來進行實驗。在從中風起始計245小時時和24小時以外時對這種4匕合物給藥，檢測新神經元增加的數百。本文包括的實驗數據表明一種設計來誘導NO產生的藥理學介入能促進神經發生。選用兩種化合物，DETAN0N0ate和SNAP,這兩種化合物成功的誘導了中風後的神經發生和提高了功能性結果(functionaloutcome),選用的這些化合物可能跨過了血腦屏障。在神經科學研究中，神經發生是主要的最後目標。發明一種方法來促進神經元的產生將會為治療多種神經疾病、CNS損傷和神經變性提供機會.也可能在非損傷大腦中增強神經元的產生，從而可提高其功能.能促進神經元產生的一族藥物的市場是巨大的.氧化氮供體，其中DETAN0N0時一個例子，可促進神經發生.提高神經發生可轉化為一種方法，它可隨著年齡增長和在損傷與疾病後提高、改進神經、行為和認知功能。上迷討論為使用氧化氮來促迎神經發生提供了一個事實基礎。應用的方法和這些方法在本發明中的應用可通過隨後的這些非限制性示例和圖表來展示。方法分子生物學中的一般方法本領域中熟知的和沒有特別描述的標準分子生物學技術一般是按照ColdSpringHarborLaboratorypress,NevYork(1989)出版的、Sambrook等編寫的MolecularCloning:ALaboratoryManual和JohnffileyandSons，Baltimore，Maryland(1989)出版的、Ausubel等編著的CurrentProtocolsinMolecularBiology,以及Perbal編箸的、JohnWiley$Sons，NevYork(1988)出版的APracticalGuidetoMolecularCloning,以及Watson等編著的、ScientificAmericanBooks,NeirYork出版的RecombinantDNA，以及Biiren等編著、ColdSpringHarborLaboratorypress,NewYork(1998)出版的GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries,Vols.1-4中的技術，並且美國專利4，666,828、4,683,202、4,801，531、5,192,659和5,272，057中提出的方法也在此處一併應用作為參考。多聚酶鏈式反應(PCR)—般時按照AcademicPress,SanDiego,CA(1990)出版的PCRprotocols:AGuidetoMethodsandApplications中的方法進行的.將原位(in-cell)PCR和流動血細胞計數結合來檢測含有特定DNA和mRNA序列的細胞(Testonietal，1996,Blood87:3822).免疫學中的一般方法本領域中熟知的和沒有特別描述的標準免疫學方法一般是參考Appleton&Lange,Norwalk，CT(1994)出版的、Stites等編著的basicandClinicalImmunology(8thEdition)和W.H,FreemanandCo,,Newyourk(1980)出版的、Mishell和Shiigi(eds)編著的SelectedMethodsinCellularImmunology,治療劑的傳送本發明中的化合物的給藥和劑量確定是按照良好的醫學實踐進行的，要考慮到醫生已知的個體患者的醫療條件、給藥位點和方法、給藥的時間安排、患者年齡、性別、體重以及其他的因素.在此處來講，藥理學上的有效劑量是通過這些本領域中熟知的考慮事項來確定的.這個劑量必須能夠取得有效成果.它包括但並不局限於增加的存活率或更快的恢復、或增加或減少一些症狀或由本領域中的熟練技術人員精選出來作為適當標準的其他的指標.在本發明的方法中，本發明中的化合物可以多種方式給藥.應該指出的是他們可以化合物或藥物上可接受的鹽的形式給藥，也可單獨給藥或作為活性組分與藥物上可接受的載體、溶劑、助劑和媒介物結合給藥。這些化合物可通過口、皮下或包括靜脈內、動脈內、肌肉、腹膜內和鼻內在內的腸胃外注射，以及鞘內注射和輸注技術來給藥.將化合物植入的給藥方式也是有效的。接受治療的患者是溫血動物，並且特別是哺乳動物，包括人.藥物上接受的載體、溶劑、助劑和媒介物以及植入栽體一般指惰性的、無毒的固態或液態填充物、溶劑或不與本發明中的活性成分反應的膠嚢包被物質.必須指出的是對人進行的治療時間要比對鼠或此處示例中的其他實驗動物的治療時間要長，這些治療時間是與患病時間和藥效成比例的。這些藥劑可以是長時間的單獨給藥或重複給藥，但優逸的是單獨給藥這些藥劑可以是長時間的單獨給藥或重複給藥.治療時間是與患病時間和藥效以及接受治療的患者的種類相適合的.當對本發明中的化合物進行腸胃外給藥時，一般是將這些化合物製備為單位劑量的可注射形式(溶^0懸浮液，乳狀液).適於注射的藥物製劑包括無菌水溶液或懸浮泉以及可重構於無菌可注射溶液或懸浮液中的無菌粉.載體可以是溶劑或分散介質，包括如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙烯乙二醇、液態丙烯乙二醇等等)、它們的運當混合物以及植物油。適當的流動性是可以維持的，例如，可通過應用糖衣如卵磷脂、通過在懸浮液中維持所要求的顆粒大小以及通過使用變性劑，非水媒介物，如棉籽油、芝麻油、大豆油、玉米油、向曰葵油或花生油以及醋如異丙基豆蔻酸酯也可用做複合組合物的溶劑體系。此外，也可添加多種可增強組合物的穩定性、無菌狀態以及等張性的添加劑，包括抗菌防腐劑、抗氧化劑、螯合劑以及緩衝液，通過添加多種抗真菌和抗細菌藥物，如對羥基笨甲酸酯類、酚、山梨酸等可保證預防徵生物的作用。在很多情況下最好是包括等張因子，如糖、氯化鈉等。對可注射藥物形式的延長吸收可通過應用延緩吸收的藥物如單硬脂酸鋁和凝膠來實現。然而，按照本發明，應用的所有稀釋劑或添加劑都要與這些化合物相協調。將本發明示例中使用的化合物連同其他需要的多種成分溶解到所要求量的溶劑中，就可製備無菌注射溶液.本發明中的藥劑可以含有多種載體，如多種媒介物、助劑、添加劑以及稀釋劑的注射製劑形式對患者給藥；或者本發明中的化合物可以緩釋皮下植入物或耙定傳送體系，如單克隆抗體、載體傳送、離子電滲析、聚合物基質、脂質體和徵球體等形式進行腸胃外給藥。本發明中有效的傳送體系示例包括5,225,182;5,169,383;5,167,616;4，959，217;4，925，678;4,487，603;4，486，194;4，447，233;4,447,224;4,439,196;以及4，475,196.許多其他的植入物、傳送體系和組件對於本領域中的熟練技術人員來講是熟知的。本發明中的化合物藥劑可以口服形式對患者給藥.傳統的給藥方法入對這些化合物以片劑、懸浮波、溶液、乳劑、膠嚢、粉劑、糖漿等都是適用的.優選的是那些已知可經口或皮下傳送藥物並且能保留藥物的生物活性的技術.在本發明的一個實施方案中，本發明中的藥物最初是通過皮下注射給藥使血液水平達到一個合適的水平.然後再通過口S^藥劑的形式來維持患者體內的水平，其他依賴患者身體情況的給藥形式以及上面提到的給藥形式都可使用.給藥量因接受治療的患者不同而不同，大約為100ng/kg體重/天一100mg/kg體重/天，優選的使10mg/kg體重/天一10mg/kg體重/天。示例示例1發明了一種藥物學方法來促進大腦的神經發生.通過在雄性Wistar鼠的右MCA的起端放入動脈內凝塊使得大鼠患中腦動脈(MCA)梗塞.在誘導中風之後的第24和48小葉對動物給藥(iv/ip)以氧化氮供體化合物(DETANONO)(組1)，或者在24小時之後每天注射(ip)NO供體化合物(組2)。BrdU是一種胸普類似物，它可檢測新細胞的形成，從局部缺血後開始每天注射(ip)BrdU,並持續14天。通過特異細胞的免疫活性標記來確定細胞類型.因此，可通過表達NeuN和MAP2來檢測神經細胞，通過GFAP來檢測星形膠質細胞.在大腦特定區域、subventricularzone和鋸齒狀腦回檢測神經發生.結果數據表明，相對於沒有進行治療的組，接受DETANONO治療的大鼠中可觀察到BrdU陽性細胞數量的顯著增加.對於組2來講，結果如下subventricularzone:2748±326/1653±91.4,鋸齒狀腦回粒狀細胞層，135±18.9/37.3±3.6;53.7±6.3/34.9±2.8,解門，43.8±10.2/10.1±2.4,對組1來講，分別在接受治療的鼠的粒狀細胞層和未接受治療的鼠的粒狀細胞層中檢測到89.5±12/37.3±3.6的BrdU細胞數量顯著增加。在鋸齒狀腦回中絕大多數新形成的細胞(>90%)是神經細胞。在大腦的其他區域，新形成的細胞具有神經膠質細胞和星形膠質細胞表型.對非局部缺血大腦的DETANONO治療對沒有接受任何外科手術的大鼠進行DETANONO治療。藥物是以單劑量(iv0.12mg)給藥的。在開始治療後持續14天每天注射BrdlL—組大鼠(組3)在BrdU注射的最後一天處理.另一組(組4)在最後的BrdU注射後4星期處理。按照與接受DETANONO治療的鼠(組5)的方法對不進行DETANANO給藥的動物進行BrdU注射.組3/組5的結果如下在subventricularzone結果分別是2952±102.6/1432±104.6和2725.3±115.5/1655.2土102.9;在鋸齒狀腦回(粒狀細胞層)是73.7±6.11/39.9±7.26.在糹且4/糹且5中，在subventricularzone結果分另'J是456-5±42.3/214.6±67.9和518.4±67.2/233.1±49.2;在鋸齒狀腦回(解門)是7.71±89/3.23±1.22。相對於沒有接受處理的組，接受DETAN0N0治療的大鼠在兩個時間點都表現出新形成細胞的顯著增加。新形成細胞在subventricularzone和海馬狀突起有明顯增加.用神經標記物NeuN和MAP2以及星形膠質細胞標記物GFAP對BrdU活性細胞進行雙重標記。新形成的細胞表達神經細胞或星形膠質細胞蛋白.圖1表明遭受中風並且接受DETAN0N0治療的鼠中，在海馬狀突起通過BrdU和神經標記物NeuN和MAP2、BrdU和星形膠質細胞標記物以及GFAP進行雙重標記免疫組織化學。細胞對這些標記都表現了免疫組織活性，這表明新形成細胞是神經細胞元(neuronalcell)和星形膠質細胞表型。估計在海馬狀突起中新形成的細胞大於90X是神經細胞表型.這些數據表明對NO供體給藥促進了局部缺血大腦的神經發生。這種方法適用於多種形式的CNS病理和損傷。此外，NO液促進了正常成人大腦中的神經發生。本發明的目的是通過誘導神經發生來促進在對大腦局部缺血損傷或其他神經損傷進行的治療方面取得改進性成果。在患有中風、CNS損傷和神經變性疾病之後，患者會遭受神經和功能缺陷.這些發現提供了一種方法來增強大腦補償性機制以提高遭受CNS損傷和神經變性後的大腦功能。神經元誘導將促進中風後官能提高。在遭受CNS損傷之後，在適當的時間對氧化氮給藥可促進大腦的神經發生，並且能加快神經發生。這種效果的主要機制是N0活化了穀氨酸受體。這些穀氨酸受體促進了長期增強作用，並且隨後誘導了神經元的再生。在最初的實驗中，選用一種長半衰期(約為50小時)並可產生N0的化合物---DETA/N0來進行實驗。在從中風起始計24小時時和24小時以上時對這種化合物給藥，檢測新神經元增加的數目。本文包括的實驗數據表明一種設計來誘導N0產生的藥理學介入能促進神經發生。選用兩種化合物，DETAN0N0ate和SNAP,這兩種化合物成功的誘導了中風後的神經發生和提高了功能性成果。選用的這些化合物可能跨過了血腦屏障。在神經科學研究中，神經發生時主要的最後目標。發明一種方法來促進神經元的產生將會對治療多種神經疾病、CNS損傷和神經變性提供機會.也可能在非損傷大腦中增強神經元的產生，從而可提高其功能.能促進神經元產生的一族藥物的市場時巨大的。氧化氮供體，其中DETAN0N0時一個例子，可促進神經發生。提高的神經發生可轉化為一種方法，它可隨著年齡增長和在損傷與疾病後提高、改進神經、行為和i人知功能.在此之前沒有NO供體或藥物，尤其是中風後可誘導神經發生的藥物的專利申請.在成年嚙齒類動物的整個生命過程中，在其大腦的subventricularzone(SVZ)和海馬狀突起的鋸齒狀腦回能夠產生神經祖細胞。然而，祖細胞增殖和分化的信號還不為所知，氧化氮(N0)是生物體系中的一種化學信使，可作為大腦中的一幹神經遞質.在本發明的研究中，探討了N0對成年鼠SVZ和鋸齒狀腦回的神經粗細胞增殖的影響.進行了兩個實驗.在第一個實驗中，檢測了N0對非局部缺血成年鼠的SVZ和鋸齒狀腦回的神經祖紐胞增殖的影響，在第二個實驗中，檢測了NO對局部缺血成年鼠的SVZ和鋸齒狀腦回的神經祖細胞增殖的影響。本發明中選用的是體重為300-350克的成年Wistar鼠(CharlesriverBreedingCompany,Wilmington,MA).從ALEXISBiochemicalCorporation購買了生理狀態的、半衰期為20小時的NO供體一DETANOPNOate.從Sigmachemical購買了作為有絲分裂標記的胸苷類似物一溴尿普(BrdU).從BoehringerMannheim購買了抗BrdU的鼠單克隆抗體。將體重為300-350克的雄性Wistar(n=28)鼠通過面罩用氟烷(在70%N20和30%02混合物中的濃度為1-3.5%)進行麻痺.在整個外科手術過程中，通過反饋調節水加熱系統將鼠直腸溫度控制在37±1TC.在右股動脈和靜脈中插入PE-50導管來分別進行血壓持續監測和測量血波中的氣體(pH、p02、pC02),以及給藥.DETAN0N0ate是通過靜脈或腹膜注射的方式對鼠給藥的.DETAN0N0治療將鼠隨機分為4組.在組1(單Rx)中，每15分鐘就皮下注射一個DETAN0N0大丸劑(每個0.lmg/kg),共注射4次(總共0.4mg/kg).在組2(2Rx)中，每15分鐘就皮下注射一個DETAN0N0大丸劑(每個0.lmg/kg),共注射4次(總共0.4mg/kg),並且在24小時之後重複進行第二次治療。在紐3(7Rx)中，在第一個實驗曰，每15分鐘就對鼠皮下注射一個DETANONO大丸劑(每個0.lmg/kg)，共注射4次(總共0.4mg/kg),以後每天腹膜注射一個DETANONO大丸劑(每個0.4fflg/kg),連續注射6天。在組4(對照)中，僅僅對鼠注射鹽水(單劑量)。在進行DETANONO治療的第一天，對鼠進行腹膜注射BrdU(50mg/kg),每天注射，連續14天.為了確定SVZ和鋸齒狀腦回中的細胞分化和增殖是否受到了NO的影響，在笫一劑DETANONO治療後分別在第14天(n-3-5/組)和第42天(11=3-5/組)將鼠殺死.將鼠利用含在pH7.4的100毫升磷酸緩衝液中的4%多聚甲醛進行經心灌注.將腦取出並固定在4%甲醛中。對於BrdU免疫染色來講，首先通過將腦切片(6uin)在65C、50%甲醯胺2XSSC中培育2小時進ff變性，然後在37C的2NHC1中培育30分鐘.然後用Tris緩衝液衝洗腦切片，並且用1%11202處理來阻斷內源過氧化物酶.腦切片在室溫與抗BrdU(1:100)的第一種抗體培育1小時，然後與生物素化的第二種抗體(1:200，vector,burlingame，CA)共培育1小時，利用3'3'-4基聯苯胺-四氫氯化物(DAB,Sigma)。在40X顯徵鏡(01ympusBX40)下通過MCID計算機成像分析系統(ImagingResearch,St.Catharines,Canada)將BrdU免疫染色切片進行數位化顯示。在計算機監視器上進行BrdU核技術以提高可見性，並且使用單焦平面奉避免重複計數.對結構的取樣是通過選擇每個切片(RMS和OB)上預先確定的區域或通過分析每個切片(鋸齒狀腦回和SVZ)的整個結構來確定的。選取每隻鼠在AP+10.6咖處的驕胝體膝和AP+8.74mm處的前聯合交叉點之間總共7個切片的每個第40冠狀部分(PaxinosandWaston，1986).對在側心室壁上的BrdU免疫反應陽性細胞核進行計數.在這些區域的所有BrdU免疫反應陽性細胞核都以BrdU免疫反應細胞數/咖2表示。將這七個切片的密度進行平均以獲得每隻鼠的平均密度.選取每隻鼠在OB前沿皮層前後向上的連續總共6個切片的每個第20部分。如圖1中所描述的，在每個部分上，對RMS中的兩個預先確定區域(100x100um)和0B的粒狀細胞層(GCL)中的四個區域進行了分析。在這些選定區域中，所有BrdU性細胞核都以BrdU免疫反應細胞數/咖2表示將這6個切片的密度進行平均以獲得每隻鼠的平均密度，選取每隻鼠在AP+5.86mm和AP+2.96mm間，包括解門、亞粒狀區(SGZ)和內部第一、笫二、第三束i狀細胞層(GCL)在內總共8個切片的每個第50冠狀切片。SGZ是GCL和解門交界處的一個有兩個細胞厚的帶，它一直是與GCL結合進行計數的.在這些選定區域中，所有BrdU陽性細胞核都以BrdU免疫反應細胞數/mn^表示.將這8個部分的密度進行平均以獲得每隻鼠的平均密度.結果相對於接受鹽水治療的鼠，在進行治療後的第14天和第42天，接受DETANONO治療的鼠的SVZ中的BrdU免疫反應細胞數量顯著增加(P<0.05)(圖2a).相對於在治療後14天給藥1和2劑DETANONO的鼠，給藥7劑DETANONO的鼠顯示了更高數量的免疫反應細胞.在給藥1劑和7劑DETANONO鼠之間檢測到BrdU細胞數量有顯著的差異(圖2b),這表明BrdU細胞數量的增加是以劑量依賴形式進行的.雖然相對於在處理後笫14天給藥的鼠相比，BrdU細胞數量下降了，但是相對於對照的鹽水組鼠BrdU細胞數量還是顯著增加了(圖2a)在處理後第42天和第14天進行DETANONO治療的鼠的RMS中，BrdU細胞數量沒有顯著增加(表1)然而，相對於對照組，在接受單劑DETANONO治療後第42天的OB中，以及在接受2劑和7劑DETANONO治療後第42天的OB中檢測到BrdU細胞數量顯著增加(表1),這表明SVZ祖細胞的遷移增加.在處理後第14天和笫42天，單劑量的DETANONO治療沒有顯箸增加鋸齒狀腦回中的BrdU免疫反應細胞數量(圖3)。相反，相對於對照組，在處理後第14天和第42天，接受2劑量和7劑量DETANONO治療的鼠鋸齒狀腦回中的BrdU免疫反應細胞數量顯著增加(圖3)。相對於對照組，在處理後第42天和第14天，鋸齒狀腦回中的BrdU免疫反應細胞分配百分比表明DETANONO治療顯著降低了BrdU免疫反應細胞在亞粒狀區域的百分比，但顯著增加了在粒狀細胞層的BrdU免疫反應細胞百分比(圖4a和4b)，這暗示了NO促進了BrdU免疫反應細胞的遷移。在粒狀細胞層中的BrdU克疫反應細胞是卵圓形的和圓形的，大小與粒狀細胞的細胞核相同或比其小。數據表明，對成年鼠進行DETANONO治療不僅增加了SVZ和鋸齒狀腦回祖細胞的增殖，而且延長了增殖的祖細胞的存活.在鋸齒狀腦回中的一些BrdU免疫反應細胞具有粗狀細胞的形態學特徵。因此，數椐表明NO增強了成年鼠大腦的神經發生。基於以上數據，進行了第二個實驗來探討NO對focalemboliccerebralischemicbrain的影響。除下列搡作外，其他所有操作與第一個實驗相同.體重為300-350克的雄性Winstar鼠(n=30)都遭受中腦動脈(MCA)栓塞.通過在MCA起端處放置栓塞物使MCA栓塞。簡單的講，就是利用15咖長、已經修飾過的PE-50導管在MCA起端放置一個完整且富舍血纖維蛋白、形成時間為24小時的同源血塊(約lul)。實驗分為四組.組I(對照組)中的鼠接受MCA血栓處理，並且在局部缺血後的第24小時接受連續4次皮下注射鹽水大丸藥(每次0.52ml,每隔15分鐘一次)。組II(DETN0/N0預處理)中的鼠在栓塞前24小時接受連續4次對DETANONO大丸劑的皮下給藥(每次0.lmg/kg,每隔15分鐘一次，總劑量0.4mg/kg)組III(DETANONO兩次組)中的鼠在拴塞後24小時和48小時接受連續四次DETANONO大丸劑皮下給藥(每次0.lmg/kg,每隔15分鐘一次，總劑量0.4fflg/kg).組IV(DETANONO七次組)中的鼠在栓塞後24小時接受連續4史對DETANONO大丸劑的皮下給藥(每次0.lmg/kg，每隔15分鐘一次，總劑量0.4mg/kg)。隨後，每天對鼠進行腹膜內注射0.4mg/kgDETA/N0，持續6天.相對於非局部缺血鼠，在MCA栓塞後的第14天，栓塞性MCA栓塞造成同側SVZ和0B的Brdli免疫反應細胞數量顯著增加(p<0.05)(表2),在MCA栓塞後第42天，BrdU免疫反應細胞數量降低，這表明灶性大腦局部缺血誘導了同側SVZ的祖細胞增殖的暫時增加(表2).MCA栓塞沒有影響SVZ和0B對側祖細胞和鋸齒狀腦回兩側的祖細胞的增殖(表2)'相對於沒有處理的MCA栓塞組，在預處理組中，在進行MCA栓塞後的第14天，在SVZ的對側和在第42天在SVZ的兩側面檢測到BrdU免疫反應細胞數量顯著增加(p<0.05)(圖6A,6B).兩劑量組的鼠中，在進行MCA栓塞後第14天，在SVZ的同側面和第42天在SVZ兩側面的BrdU免疫反應細胞數量都有顯箸的增加(圖6A，6B).在MCA栓塞後的第14天和笫42天，進行七次DETANONO注射組中的鼠的SVZ同側和對側面就表現BrdU免疫反應細胞數量的顯著增加(圖7A,7B).在MCA栓塞後的第14天和42天，進行DETANONO處理的缺血大鼠的0B中，檢測到明顯增加的BrdU免疫反應細胞(圖7A，7B).相對於MCA栓塞對照組，在迚行MCA栓塞之後的第14天和第42天，接受DETANONO處理的局部缺血鼠的鋸齒狀腦回中BrdU免疫反應細胞數量顯著增加(圖8A，8B)。接受DETANONO處理的局部缺血鼠沒有表現出局部缺血損傷體積的顯著減小(圖9).這些數據說明檢塞性MCA檢塞本身增加了SVZ同側面祖細胞的增殖。許多在SVZ產生的細胞沿RMS遷移進OB，它們在那裡分化為神經元，因此，OB同側面BrdU免疫反應細胞數量增加表明SVZ同側面祖細胞遷移的增加。這些數據也表明MCA栓塞後祖細胞增殖信號是短暫的和局部的.然而，但進行MCA栓塞後對局部缺血鼠進行DETANONO處理時的祖細胞增殖顯箸增加至少持續42天。祖細胞增殖的增加是由NO誘導的，因為BrdU免疫反應細胞數量增加不僅涉及到SVZ兩側面，而且涉及到鋸齒狀腦回的兩側面.然而，在接受DETANONO處理的非局部缺血鼠和接受處理的局部缺血鼠的BrdU細胞數量還是有區別的.在MCA栓塞後第14小時和42小時，接受DETANONO處理的非局部缺血鼠鋸齒狀腦回中的BrdU免疫反應細胞絕對數量要多於接受DETANONO處理的局部缺血鼠鋸齒狀腦回中的BrdU免疫反應細胞數量，這表明NO可通過局部缺血來增強已產生的信號以增加祖細胞的增殖.因此，數據暗示病灶性大腦局部缺血產生了短暫的祖細胞增殖，並且NO增強了局部缺血大腦中祖細胞的增殖。示例2對正常和局部缺血鼠給藥以氧化氮供體(DETA/NO)促進了非局部缺血大腦和局部缺血大腦中的神經發生.此後，進行了額外實驗來檢驗DETA/NO誘導的神經發生促進了中風後的大腦功能性改進這一假說；同時提供了數椐.在誘導中風後第一天(組1)或笫7天(組2)對實驗鼠給藥DETA/NO(iv/ip),隨後是為時7天的每日給藥DETA/NO(ip).另一種NO供體化合物(SWAP)在i秀導中風後的第一天和第二天對局部缺血鼠給藥(iv)(組3)。組1和組2中是選用的幼鼠(3月)。組3中是選用中等年齡的鼠(10-12個月)。從誘導中風後的第一天到第42天，進行了一系列神經功能檢驗.這些檢驗包括1)神經嚴重性分數(NSS)檢測運動功能、感覺功能和反射坊能，它類似於用來描述人的對側忽略實驗。分數越高，損傷越嚴重；2)Rotard檢驗檢測前後肢運動協調和平衡，給出的數據是以下限值的百分數來表示的；3)footfault檢驗檢測前後肢的運動協調作用。數值越高，損傷越嚴重；4)結合去除檢驗檢測運動傳感器損傷.數據以時間(秒)來表示。時間越長，損傷越嚴重；5)動物體重。結果組l:相對於對照組鼠，在接受DETA/N0處理的鼠中檢測到運動和運動傳感功能(圖10為Rotard檢驗，圖11為結合去除檢驗，圖12為NSS檢驗)和實驗鼠體重(圖13)的顯著提高。組2:相對於對照組鼠，在誘導中風後第28和42天僅僅在Rotard檢驗中檢測到神經功能的顯著提高(圖14).組3:相對於對照組鼠，接受SNAP處理的實驗鼠表現了在運動和運動傳感功能上的顯著提高(圖15為Rotard檢驗，圖16為footfault檢驗，圖17為結合去除檢驗).結論這些數據表明1)對大腦局部缺血的鼠給藥DETAN0N0可提高神經功能的恢復，並且甚至在中風七天後也能取得這些提高；2)除給藥DETAN0N0外，對大腦局部缺血的鼠給藥SNAP也提高了神經功能，這表明對NO供體化合物給藥可增強神經功能的恢復；以及3)對中等年齡的鼠給藥SNAP有效的促進了功能恢復，這是很重要的，並且是與臨床相關的，因為中風患者是中年或更老.結合上述的數據，這些數據表明NO供體促進了神經發生，暗示NO供體化合物通過促進局部缺血大腦中的神經發生來增強中風後的神經功能恢復.在本專利申請中，多種出版物，包括美國專利是按照作者和年代來參考引用的，而專利是按照申請號來參考引用的。全文引用的文獻如下所列.因此，全文引用這些出版物和專利作為參考文獻以便更加全面的描述與本發明相關的領域的現狀。本發明是以例證性的方式來播述的，應該明白，本專利中用到的術語在詞彙本身是說明本發明，而不是進行限制本發明的。很顯然，本發明可能按照上逸學說進行多種修飾和變動.因此，應該理解為在本發明描述的範圍內，而不是明確描述，本發明是可以實施的。表l.大腦中新產生的細胞的密度tableseeoriginaldocumentpage18新產生的細胞的密度是以BrdU陽性細胞平均如/mm2土SEM來表示的.它們的值與鹽水處理不同，*p<0.05,"p<0.01-表2.大腦中新產生細胞的密度tableseeoriginaldocumentpage19新產生的細胞的密度是以BrdU陽性細胞平均如/mn^士SEM來表示的.它們的值不同於非局部缺血組，-pO.05,"pO.01.參考文獻BurkeandOlson,"在酵母人工染色體載體上製備克隆庫，，inMethodsinEnzymology,Vol.194,"GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology".Eds.C.GuthrieandG.Fink,AcademicPress,inc.,Chap.17，pp.251-270(1991).Capecchi,"利用同源重組方法來修飾基因組，，science244:1288-1292(1989).Daviesetal.,酵母人工染色體中用於種間基因傳遞的耙定改造，NucleicAcidsResearch,Vol.20，No.11，pp.2693-2698(1992).Dicksonetal.，"通過可插入栽體進行的高頻基因靶定"HumanMolecularGenetics,Vol,2,No-8，pp.1299-1302(1993).DuffandLincoln,"將病原t異基因插入攜帶有人APP基因的酵母人工染色體中並在ES細胞中表達，ResearchAdvancesinAlzheimer，sDiseaseandRelatedDisorders,1995.Huxleyetal.,"通過細胞融合技術將酵母染色體上的人HPRT基因轉移入鼠細胞中後的基因是有功能的基因，Genomics,9;742-750(1991).Jokobovitsetal.,"起源於人的酵母人工染色體的細菌系傳遞和表達，，，Nature，Vol.362,pp.255-261(1993).Lambetal.，"在轉基因鼠中引入和表達400kb前體澱粉體蛋白基因，，，NatureGenetics,Vol.5,pp.2-29(1983).PearsonandChoi.，"在轉基因鼠中表達取自酵母人工染色體的人b-澱粉體前體蛋白基因"，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993.90:10578-82Rothstein，"耙定、破壞、替代、等位基因拯救酵母中的整合DNA轉化，'inMethodologyinEnzymology，vol.194,"GuidetoYeastGeneticsand'MolecularBiology"-Eds.C.GuthrieandG.Fink,AcademicPress,inc.,Chap.17,pp.281-301(1991).Sched丄etal.，"在轉基因鼠中包含有酪氨酸酶基因的酵母人工染色體賦予了拷貝數量依賴型表達，，，Nature,Vol.362，卯.258-261(1993).Straussetal.，"鼠科動物中酵母人工染色體的細菌系傳遞，(1)膠原質位點"，Science,Vol.259，pp.1904-1907(1993).Gibola,E，Eglitis，MA,Kantoff，PW,anderson,WF:利用逆轉錄酶病毒來轉移和表達克隆的基因".Biotechniques4(6):504-512,1986.CreggJl，VedvickTS，RaschkeWC:在Pichiapastoris中表達外源基因的進展，Bio/Technology11;905-910,1993.Culver,1998.用來修復人ADA基因突變的位點介導的重組.(Abstract)AntisenseDNA&RNAbasedtherapeutics,Febrary，1998，Coronado,CA.Hutsonetal,1991"單鏈Fv類似物和融合蛋白的蛋白質工程"inMethodsinEnzymology(JJLangone，ed.;Academicpress,NewYork,NY)203:46-88.JohnsonandBird,1991"單克隆抗體單鏈fvb衍生物的構建以及它們在大腸桿菌中的表達，'inMethodsinEnzymology(JJLangone，ed.;Academicpress,NevYork，NY)203:88-89.MemaughandMernaugh,1995"嗟菌體展示的重組抗體概觀"inMolecularMethodsinplantPathology(RPSinghandUSSingh,eds.;CRCPressInc.,BocaRaton,FL)pp.359—365.2權利要求1.促進神經發生的方法，它包括對需要進行神經發生促進的患者給藥治療劑量的氧化氮供體。2.促進神經發生的化合物，包括足以促進神經發生的有效劑量的氧化氮供體。3.包括包含在藥物上可接受的載體中的氧化氮供體的神經發生促進劑。4.權利要求3中的神經發生促進劑，其中該氧化氮供體增強了組織中的氧化氮。5.權利要求4中的神經發生促進劑，其中該氧化氮供體是選自基本上由磷酸二酯酶和L-精氨酸組成的組。6.增強神經細胞產生的方法，它是通過對需要這種增強作用的位點給藥以有效劑量的氧化氮供體。7.提高神經功能的方法，它是通過對患者給藥以有效劑量的氧化氮供體來實現的。8.提高認知功能和神經功能的方法，它是通過對患者給藥以有效劑量的氧化氮供體來實現的。全文摘要本發明提供了用於誘導神經發生的氧化氮供體。本發明提供了促進神經發生的方法，它可通過對需要促進神經發生的患者給藥以治療劑量的氧化氮供體來達到促進神經發生的目的。並且對於促進神經發生來講，本發明也提供了一種化合物，它含有足以促進神經發生的劑量的氧化氮供體。也提供了可促進神經發生的氧化氮化合物。此外，本發明也提供了一種方法，它通過對需要進行增強的位點給藥以有效劑量的氧化氮供體就可增強腦細胞的產生和加快細胞結構和受體的改變。本發明還提供了一種方法，它可通過對患者給藥以有效劑量的氧化氮供體來提高患者的神經功能和認知功能。文檔編號A61K31/00GK101310772SQ20081009037公開日2008年11月26日申請日期2000年6月14日優先權日1999年6月14日發明者M·喬普,張瑞蘭申請人:亨利福特保健系統公司