Cyp450酶亞型生物質譜絕對定量方法
2023-12-05 06:31:16 1
專利名稱：Cyp450酶亞型生物質譜絕對定量方法
技術領域：
本發明屬於蛋白質組學技術領域，涉及一種同時測定人的4種CYP450酶亞型生物質譜絕對定量方法。
背景技術：
P450酶是體內重要的藥物代謝酶。P450酶對藥物進行代謝的同時，藥物也可對 P450酶產生誘導或抑制作用。其中CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5四種P450酶參與了約 85%左右藥物體內代謝過程。P450酶定性和定量分析對於評價藥物的代謝過程和藥物相互作用具有重要的參考價值和意義。現有P450酶定量分析方法主要有探針藥物法，Western Blot法，以及mRNA檢測法等。然而上述方法專屬性差，靈敏度低，只能給出P450酶相對量， 並不能給出P450酶絕對含量，無法滿足藥物對P450酶作用評價的要求。第一，P450酶超家族多屬於同工酶，其底物常常具有交叉現象，很難找到P450酶絕對專一的探針藥物，至今只有極少數P450酶底物的專一性得到了全面的驗證。第二，P450酶特別是亞家族內同工酶序列存在高度同源性，這為Western Blot法中所需特異性抗體的製備和純化提出了很高的要求。第三，蛋白質的表達受到多種機制的調控，利用mRNA表達的水平代表其對應的蛋白含量並不十分可靠。因此，建立一種P450酶亞型絕對定量方法是十分必要的。
發明內容
本發明要解決的技術問題是，建立一種可以同時測定人的4種CYP450酶亞型生物質譜絕對定量方法。涉及的4種CYP450酶亞型是CYP1A2，CYP2B6, CYP3A4, CYP3A5。本發明採取的技術方案是，選取經胰酶水解CYP450酶獲得的特異性肽段，其中特異性是指肽段是產生此肽段的酶所特有的，其他蛋白質經胰酶水解並不能產生該肽段。基於液相色譜-串聯質譜(LC/MS/MS)，利用多重反應監測(MRM)模式對特異性肽段及其穩定同位素標記肽段進行掃描分析，建立特異性肽段穩定、可靠的LC/MS/MS定量方法。鑑於同種元素不同穩定同位素之間質譜響應相同，因此可利用對於蛋白樣品中添加的穩定同位素標記肽段作為標準肽段進行定量分析建立標準曲線，從而實現特異性肽段的定量。每種酶亞型選取3種特異性肽段代表其本身濃度水平，即將肽段濃度取平均值得到相應CYP450酶亞型濃度，經由蛋白濃度校正獲得CYP450酶亞型絕對含量。採取上述方法即可實現利用正常肽段定量CYP450酶亞型水平。正常肽段即是待測肽段。本發明的具體技術方案如下所述。一種CYP450酶亞型生物質譜絕對定量方法，涉及4種CYP450酶亞型CYP1A2、 CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5 ；具體步驟如下A、蛋白樣品預處理(1)蛋白樣品的還原，①於聚乙烯管中加入100μ 1蛋白樣品，②加入5 μ 1變性劑，渦流混勻，
③加入10 μ 1還原劑，渦流混勻，④60°C孵育1小時，得到反應液；(2)半胱氨酸的封閉，於反應液中加入5 μ 1半胱氨酸封閉劑，渦流混勻；室溫孵育IOmin ；(3)蛋白樣品的胰酶消化，經半胱氨酸封閉的反應液中加入100 μ 1消化緩衝液，再加入10 μ 1胰酶溶液，渦流混合，37°C孵育12 16小時得到蛋白樣品反應液；B、標準曲線製備①利用肽段稀釋液將穩定同位素標記肽段標準品溶解至500fmol/ μ 1，得到穩定同位素標記肽段儲備液；②利用蛋白樣品反應液將穩定同位素標記肽段儲備液分別稀釋至5、10、30、100、 300fmol/y 1 ；③取10 μ 1進行液相色譜-串聯質譜分析，記錄色譜圖，以穩定同位素標記肽段濃度為橫坐標，穩定同位素標記肽段峰面積為縱坐標，用加權W = 1/χ2最小二乘法進行回歸運算，求得的直線回歸方程，即為標準曲線；C、蛋白樣品中CYP450酶亞型含量測定取經由A步驟處理後的蛋白樣品反應液10 μ 1進行液相色譜-串聯質譜分析，記錄色譜圖，將肽段峰面積代入標準曲線，求得肽段濃度，此肽段是指選取的3種胰酶水解 CYP450酶亞型得到的肽段；將3種肽段濃度取平均值，即為對應CYP450酶亞型濃度；經樣品蛋白濃度校正，即將CYP450酶亞型濃度除以蛋白濃度，得到蛋白樣品中CYP450酶亞型含量；所述的B步驟標準曲線製備及C步驟蛋白樣品中CYP450酶亞型含量測定，色譜條件為=Agilent 1100型液相色譜系統；色譜柱ρ印tide C18柱， 50mmX2. Imm I. D. ,5 μ m粒徑；流動相含體積百分數佔0. 1 %甲酸的水和含體積百分數佔 0. 甲酸的乙腈，梯度洗脫；柱溫30°C ；流速0. 7ml/min;進樣量10 μ 1 ；質譜條件為ΑΡΙ 4000型三重四極杆液相色譜-串聯質譜儀，配有電噴霧離子化源和Analyst 1. 3數據處理軟體；離子源電噴霧離子化源；正離子方式檢測；離子噴射電壓4000V ；溫度550°C ；源內氣體1 氮氣壓力55psi ；氣體2 氮氣壓力60psi ；氣簾氣體氮氣壓力25psi ；掃描方式為多重反應監測；各肽段離子對及其相應DP、CE以及CXP值見表 1 ；表1肽段多重反應監測設定值
權利要求
1. 一種CYP450酶亞型生物質譜絕對定量方法，涉及4種CYP450酶亞型CYP1A2、 CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5 ；具體步驟如下A、蛋白樣品預處理(1)蛋白樣品的還原，①於聚乙烯管中加入100μ 1蛋白樣品，②加入5μ 1變性劑，渦流混勻，③加入10μ 1還原劑，渦流混勻，④60°C孵育1小時，得到反應液；(2)半胱氨酸的封閉，於反應液中加入5μ 1半胱氨酸封閉劑，渦流混勻；室溫孵育IOmin ；(3)蛋白樣品的胰酶消化，經半胱氨酸封閉的反應液中加入100 μ 1消化緩衝液，再加入10 μ 1胰酶溶液，渦流混合，37°C孵育12 16小時得到蛋白樣品反應液；B、標準曲線製備①利用肽段稀釋液將穩定同位素標記肽段標準品溶解至500fmol/y1，得到穩定同位素標記肽段儲備液；②利用蛋白樣品反應液將穩定同位素標記肽段儲備液分別稀釋至5、10、30、100、 300fmol/y d ；③取10μ 1進行液相色譜-串聯質譜分析，記錄色譜圖，以穩定同位素標記肽段濃度為橫坐標，穩定同位素標記肽段峰面積為縱坐標，用加權W = 1/χ2最小二乘法進行回歸運算， 求得的直線回歸方程，即為標準曲線；C、蛋白樣品中CYP450酶亞型含量測定取經由A步驟處理後的蛋白樣品反應液10 μ 1進行液相色譜-串聯質譜分析，記錄色譜圖，將肽段峰面積代入標準曲線，求得肽段濃度，此肽段是指選取的3種胰酶水解CYP450 酶亞型得到的肽段；將3種肽段濃度取平均值，即為對應CYP450酶亞型濃度；經樣品蛋白濃度校正，即將CYP450酶亞型濃度除以蛋白濃度，得到蛋白樣品中CYP450酶亞型含量；所述的B步驟標準曲線製備及C步驟蛋白樣品中CYP450酶亞型含量測定，色譜條件為Agilent 1100型液相色譜系統；色譜柱p印tide C18柱，50mmX2. Imm I.D.，5 μ m粒徑；流動相含體積百分數佔0. 甲酸的水和含體積百分數佔0. 甲酸的乙腈，梯度洗脫；柱溫300C ；流速0. 7ml/min ；進樣量10 μ 1 ；質譜條件為ΑΡΙ 4000型三重四極杆液相色譜-串聯質譜儀，配有電噴霧離子化源和Analyst 1. 3數據處理軟體；離子源電噴霧離子化源；正離子方式檢測；離子噴射電壓 4000V ；溫度550°C ；源內氣體1 氮氣壓力55psi ；氣體2 氮氣壓力60psi ；氣簾氣體氮氣壓力25psi ；掃描方式為多重反應監測；各肽段離子對及其相應DP、CE以及CXP值見表1 ；表1肽段多重反應監測設定值
2.根據權利要求1所述的CYP450酶亞型生物質譜絕對定量方法，其特徵在於，所述的變性劑，是重量體積比為20%的正-辛基穀氨酸溶液；所述的還原劑，是50mM的三(2-甲醯乙基)膦溶液；所述的半胱氨酸封閉劑，是200mM的甲基甲烷硫代磺酸鹽溶液；所述的消化緩衝液，是0. IM的三羥甲基氨基甲烷與4mM氯化鈣的混合溶液；所述的胰酶溶液，是5mg/ ml的胰酶溶液；所述的肽段稀釋液，是按體積百分數20%乙腈與0. 三氟乙酸的混和溶液。
3.根據權利要求1或2所述的CYP450酶亞型生物質譜絕對定量方法，其特徵在於，所述的色譜條件中梯度洗脫，程序見表2，表2梯度洗脫程序
4.根據權利要求1所述的CYP450酶亞型生物質譜絕對定量方法，其特徵在於，樣品測定期間利用質量控制樣品對方法進行驗證；所述的質量控制樣品按照如下步驟製備①利用肽段稀釋液將穩定同位素標記肽段標準品溶解至500fmol/y1，得到穩定同位素標記肽段儲備液；②利用蛋白樣品反應液將穩定同位素標記肽段儲備液分別稀釋至10、100、300fmol/μ ；③標準肽段每濃度取三個樣本，根據標準曲線，得出標準肽段濃度，計算質量控制樣品準確度。
全文摘要
本發明的CYP450酶亞型生物質譜絕對定量方法，屬於蛋白質組學技術領域。本發明基於LC/MS/MS，利用CYP450經胰酶水解產生的特異性肽段定量酶的策略，實現了同時對肝微粒體等體系中4種CYP450酶亞型CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5的絕對定量。本發明主要包括如下步驟蛋白樣品預處理、標準曲線的製備、蛋白樣品的測定以及質控樣品的製備。本發明的方法線性關係良好、準確度高、重現性好而且靈敏、精密、可靠，可用於藥物代謝及藥物相互作用的評價。
文檔編號G01N30/06GK102175804SQ20101061366
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月30日 優先權日2010年12月30日
發明者何群, 史美雲, 孫嚴彤, 張芸輝, 曾蘇, 楊豔, 蔣惠娣, 顧景凱 申請人:吉林大學