檢測稀有循環細胞內多種信號轉導分子的基於抗體的陣列的製作方法

2023-12-05 21:55:06 1

專利名稱：：檢測稀有循環細胞內多種信號轉導分子的基於抗體的陣列的製作方法檢測稀有循環細胞內多種信號轉導分子的基於抗體的陣列相關申請的交叉引用0001本申請要求2006/9/21提交的美國專利申請號U/525,598(該申請已變為美國臨時專利申請No.一)和2007/8/20提交的美國臨時申請號60/913,087的優先權，出於所有目的將它們的內容通過引用全文納入本文。
背景技術：
：經常在癌症不同早期階段的患者血液內發現"微小轉移"腫瘤細胞(散布腫瘤細胞)，在轉移癌中也有發現。血液中腫瘤細胞的數目取決於腫瘤的階段和類型。腫瘤是極其異質性的。因此，單個部位的活檢樣品可能無法代表腫瘤群的異質性。活檢樣品通常從原發性腫瘤上獲得；然而，無法對大多數轉移瘤進行活檢，從而更難於對腫瘤樣品進行分子分析。圖9顯示了在微陣列ELISA中用抗EGFR胞外域的單克隆抗體作為捕獲抗體和抗磷酸化EGFR的單克隆抗體作為檢測抗體檢測A431細胞中的磷酸化EGFR。(a)基於細胞數的捕獲抗體稀釋曲線。微陣列ELISA具有寬動態範圍，可用稀釋系列中各種捕獲抗體濃度檢測約I-IO，OOO個細胞內的磷酸化EGFR。(b)基於捕獲抗體濃度稀釋系列的細胞滴定曲線，顯示可從一個細胞檢測磷酸化EGFR。(c)稀釋系列中各種捕獲抗體濃度的細胞和背景之間的信/噪(S/N)比列表。當捕獲抗體濃度為0.125毫克/毫升時(箭頭)單細胞水平的信噪比為1.33。0019j圖10顯示了在微陣列ELISA中用抗ErBb2胞外域單克隆抗體作為捕獲抗體和檢測抗體檢測SKBr3細胞中的總ErBb2。(a)基於細胞數的捕獲抗體稀釋曲線。微陣列ELISA具有寬動態範圍，可用稀釋系列中各種捕獲抗體濃度檢測約1-10,000個細胞內的ErBb2。(b)基於捕獲抗體濃度稀釋系列的細胞滴定曲線，顯示可從一個細胞(箭頭)檢測ErBb2。(c)稀釋系列中各種捕獲抗體濃度的細胞和背景之間的信/噪(S/N)比列表。當捕獲抗體濃度為0.125毫克/毫升時(箭頭)單細胞水平的信噪比為15.27。0020圖11顯示了在微陣列ELISA中用抗ErBb2胞外域的單克隆抗體作為捕獲抗體和抗磷酸化ErBb2的單克隆抗體作為檢測抗體檢測SKBr3細胞中的磷酸化ErBb2。(a)基於細胞數的捕獲抗體稀釋曲線。微陣列ELISA具有寬動態範圍，可用稀釋系列中各種捕獲抗體濃度檢測約1-10,000個細胞內的ErBb2。(b)基於捕獲抗體濃度稀釋系列的細胞滴定曲線，顯示可從一個細胞(箭頭)檢測磷酸化ErBb2。(c)稀釋系列中各種捕獲抗體濃度的細胞和背景之間的信/噪(S/N)比列表。當捕獲抗體濃度為0.125毫克/毫升時(箭頭)單細胞水平的信噪比為5.45。圖13顯示了單檢測器微陣列ELISA與相近雙檢測器微陣列ELISA的檢測特異性。(a)單檢測器模式下各種捕獲抗體濃度時A431細胞中磷酸化EGFR的滴定曲線。由於該模式下單個檢測抗體缺乏特異性因此觀察到非常高的背景。(b)相近雙檢測器模式下各種捕獲抗體濃度時A431細胞中磷酸化EGFR的滴定曲線。由於該模式下通過檢測兩個檢測抗體之間的相近性獲得了提高的特異性因此觀察了非常低的背景。圖15顯示了在受激A431細胞的滴定分析中檢測磷酸化She的水平。可尋址陣列同時提供EGFR和HER2磷酸化信息。圖18顯示了包含與葡萄糖氧化酶(GO)-寡核苷酸雜交的Alexa647-寡核苷酸-偶聯的抗-EGFR抗體、HRP-偶聯的抗-磷酸化EGFR抗體、以及局限在固相支持體上的EGFR捕獲抗體的多重磷酸化EGFR複合體的形成。術語"分析物"包括任何感興趣的分子，通常是大分子如多肽，其存在、含量和/或同一性是確定的。某些情況下，分析物是實體瘤循環細胞的細胞組分，優選信號轉導分子。術語"活化狀態依賴性抗體"包括對樣品中一種或多種感興趣分析物的特定活化狀態具有特異性(即，結合、被結合或與之形成複合體)的檢測抗體。在優選實施方式中，所述活化狀態依賴性抗體檢測一種或多種分析物如一種或多種信號轉導分子的磷酸化、泛素化和/或複合狀態。一些實施方式中，受體酪氨酸激酶EGFR家族成員的磷酸化和/或EGFR家族成員之間異二聚複合體的形成用活化狀態依賴性抗體檢測。適合用活化狀態依賴性抗體檢測的活化狀態(在括號中列出)的非限制性例子包括EGFR(EGFRvIII，磷酸化(p-)EGFR，EGFR:Shc，泛素化(u-)EGFR，p-EGFRvIII);ErbB2(p85:截短的(Tr)-ErbB2，p-ErbB2，p85:Tr-p-ErbB2，Her2:Shc，ErbB2:PI3K，ErbB2:EGFR，ErbB2:ErbB3，ErbB2:ErbB4);ErbB3(p-ErbB3，ErbB3:PI3K，p-ErbB3:PI3K，ErbB3:She);ErbB4(p-ErbB4，ErbB4:She);IGF-1R(p-IGF-lR，IGF-1R:IRS，IRS:PI3K，p陽IRS，IGF-1R:PI3K);INSR(p-INSR);KIT(p-KIT);FLT3(p墨FLT3);HGFR1(p-HGFRl);HGFR2(p-HGFR2);RET(p-RET);PDGFRa(p-PDGFRa);PDGFRP(p-PDGFRP);VEGFR1(p-VEGFRl，VEGFR1:PLOy，VEGFR1:Src);VEGFR2(p-VEGFR2，VEGFR2:PLCy，VEGFR2:Src，VEGFR2:硫酸肝素，VEGFR2:VE-鈣粘蛋白)；VEGFR3(p-VEGFR3);FGFR1(p-FGFRl);FGFR2(p-FGFR2);FGFR3(p-FGFR3);FGFR4(p-FGFR4);Tiel(p陽Tiel);Tie2(p隱Tie2);EphA(p陽EphA);EphB(p-EphB);NFKB禾口/或1KB(p-IK(S32)，p-NFKB(S536)，p-P65:IKBa);Akt(p-Akt(T308，S473));PTEN(p-PTEN);Bad(p-Bad(Sl12，S136)，Bad:14-3-3);mTor(p-mTor(S2448));p70S6K(p-p70S6K(T229,T389));Mek(p-Mek(S217，S221));Erk(p-Erk(T202，Y204));Rsk-l(p-Rsk-l(T357，S363));Jnk(p-Jnk(T183，Y185));P38(p-P38(T180，Y182));Stat3(p-Stat-3(Y705，S727));Fak(p-Fak(Y576));Rb(p-Rb(S249，T252,S780));Ki67;p53(p-p53(S392，S20));CREB(p-CREB(S133));c-Jun(p-c-Jun(S63));cSrc(p-cSrc(Y416));以及樁蛋白(p-樁蛋白(Y118))。喹噁啉-7-基)苯基)甲基)-4-哌啶基)-2H-苯並咪唑-2-酮，10-(4'-(N-二乙基氨基)丁基)-2-氯吩噁嗪，3-甲醯色酮縮氨硫脲(Cu(II)Cl2複合體)，API-2，衍生自原癌基因TCL1胺基酸10-24的15聚肽(Hiromura等，/編.CW，279:53407-53418(2004)，KP372-1，和Kozikowski等，T!力m.C/置5bc.，125:1144-1145(2003)和Kau等，C。"cerCe//，4:463-476(2003)所述的化合物；以及它們的組0061化療劑的非限制性例子包括基於鉑的藥物(例如，奧沙利鉬，順鈾，卡鉑，螺鉑，異丙鉑，沙鉑等等)，烷基化劑(例如，環磷醯胺，異磷醯胺，苯丁酸氮芥，白消安，美法侖，氮芥，烏拉莫司汀，塞替派，亞硝基脲等等)，抗代謝物(例如，5-氟尿嘧啶，硫唑嘌呤，6-巰基嘌呤，甲氨蝶呤，亞葉酸，卡培他濱，阿糖胞苷，氟尿苷，氟達拉濱，吉西他濱，培美曲塞，雷替曲塞等等)，植物生物鹼(例如，長春新鹼，長春鹼，長春瑞濱，長春地辛，鬼臼毒素，紫杉醇，多西他賽等等)，拓撲異構酶抑制劑(例如，伊立替康，託泊替康，安吖啶，依託泊苷(VP16)，磷酸依託泊苷，替尼泊苷等等)，抗腫瘤抗生素(例如，多柔比星，阿黴素，柔紅黴素，表柔比星，放線菌素，博來黴素，絲裂黴素，米託蒽醌，普卡黴素等等)，其藥學上可接受的鹽，其立體異構體，其衍生物，其類似物，以及它們的組合。在某些方面，本發明提供基於抗體的陣列，它採用局限在固相支持體上的捕獲抗體的稀釋系列來檢測實體瘤循環細胞的細胞提取物中眾多信號轉導分子的活化狀態。用於本發明試驗的陣列通常包含偶聯於固相支持體表面不同可尋址位點的一定捕獲抗體濃度範圍內的眾多不同的捕獲抗體。掃描抗體陣列的方法是本領域已知的且包括但不限於用來掃描蛋白質或核酸陣列的任何技術。適用於本發明的微陣列掃描儀獲自麻薩諸塞州波士頓的PE公司(PerkinElmer，Boston,MA)、加州帕洛阿託的AT公司(AgilentTechnologies,PaloAlto，CA)，華盛頓州依沙庫哈的AP公司(AppliedPrecision,Issaquah，WA)，麻薩諸塞州比勒瑞卡的GSIL公司(GSILumonicsInc.,Billerica，MA)，以及加州聯合城的AI公司(AxonInstruments,UnionCity,CA)。作為一個非限制性例子，用於螢光檢測的GSIScanArray3000可與進行量化的ImaGene軟體一起使用。抗體的製造根據不同方法，將具有所需結合特異性的抗體可變區(抗體-抗原結合位點)融合於免疫球蛋白恆定區序列。優選與含有絞鏈區、CH2和CH3區的至少一部分的免疫球蛋白重鏈恆定區融合。優選使含有結合輕鏈所需位點的第一重鏈恆定區(CH1)出現在至少一個融合物中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物，如果需要還有免疫球蛋白輕鏈的DNA插入單獨的表達載體中，共同轉染到合適的宿主生物體中。在用於構建的不同比例的三種多肽鏈提供最優產率的實施方式中，這為調節三個多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。然而，當表達比例相同的至少兩種多肽鏈導致高產率或該比例沒有特別意義時，可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體中。作為一個非限制性例子，可採取Beerepoot等，0"co/ogv，15:139-145(2004)描述的免疫磁分離/富集技術分離活的CEC和CEPC。簡言之'將外周血與已經偶聯於抗-CD146單克隆抗體(KLS公司)的磁珠(DynalM450IgG,)一起培育。該抗體識別外周血中的所有內皮細胞譜系，但不識別造血細胞或上皮細胞(George等，J.Immunol.Meth.，139:65-75(1991))。用偶聯於合適抗體的磁珠(例如，用Dynal-CD45珠耗盡白細胞，用Dynal-CD14珠耗盡單核細胞，用Dynal-EpCAM耗盡上皮細胞(加州卡爾斯拜德的英傑公司(Invitrogen;Carlsbad，CA)))進行正選擇之前可對造血細胞和上皮細胞進行負選擇。在該實施例中僅採用正選擇。樣品製備1)徵得患者同意後，從早期乳腺癌患者獲得骨髓標本。2)如Bauer"。/.，C//".Om.6:3552-3559(2000))所述加工骨髓抽吸物。通過Ficoll-Hyp叫ue密度梯度離心，採用BeckmanGS-6離心機在4000xg離心35分鐘並用PBS洗滌兩次來富集含有任何彌散性腫瘤細胞的單核細胞組分。分鄉CTC遊鄉微鄉焦.用藥物處理進行細胞刺激(反饋環(feedbackloop)):1)樣品用治療有效濃度的赫賽汀、拉帕它尼(Lapatanib)、塔可弗(Tarceva)和/或雷帕黴素類似物在37'C處理30分鐘。2)然後用TGF-a(100nM)、調蛋白(100nM)和/或IGF(100nM)刺激細胞並在37。C培育120分鐘。採用以下方案裂解刺激過的CTC:1)將表1中所列試劑混合來新鮮製備新鮮的裂解緩衝液。2)最後的洗滌後在冰上將細胞重懸於100微升冷卻的緩衝液。3)在冰上培育30分鐘。4)混合物在微量離心機(microftige)中以最大速度旋轉10分鐘以分離珠和裂解液。5)將裂解液轉移到新的試管中進行測定或儲存於-8(TC。tableseeoriginaldocumentpage51分柳CTC浙或CE屍C遊浙艦浙棘歉0185認為VEGF能通過激活CEPC(Larrivee等，J5/o/.C/^肌，278:22006-22013(2003))和已經從管壁脫落的成熟CEC(SoIovey等，說ooaf，93:3824-3830(1999))中的抗凋亡途徑從而促進存活。VEGF還能刺激CEPC或成熟CEC增殖，儘管與CEPC相比成熟CEC似乎只有有限的增殖能力(Lin等，■/C//"./"vew.，105:71-77(2000))。出於這些原因，在裂解之前將CEC和/或CEPC與VEFG—起培育進行激活。0186細胞刺激1)在細胞中加入生長因子VEGF、FGF、PDGF、PIGF和/或血管生成素(各100nM)並在37"C培育5分鐘。[0187用藥物處理進行細胞刺激1)37t:用治療有效濃度的阿伐斯汀(Avastin)、耐克斯伐(Nexavar)、休頓特(Sutent)和/或雷帕黴素類似物處理樣品30分鐘。2)然後加入生長因子VEGF、FGF、PDGF、PIGF和/或血管生成素(各100nM)刺激細胞並在37'C培育5分鐘。10188用藥物處理進行細胞刺激(反饋環)1)37t:用治療有效濃度的阿伐斯汀(Avastin)、耐克斯伐(Nexavar)、休頓特(Sutent)和/或雷帕黴素類似物處理樣品30分鐘。2)然後加入VEGF、FGF、PDGF、PIGF和/或血管生成素(各100nM)剌激細胞並在37'C培育120分鐘。0189j採用以下方案裂解分離的CTC和/或CEPC:1)混合表1中所列試劑來新鮮製備新鮮的裂解緩衝液。2)最後洗滌之後在冰上將細胞重懸於100微升冷卻的緩衝液。3)在冰上培育30分鐘。4)混合物在微量離心機(microfuge)中以最大速度旋轉10分鐘以分離珠和裂解液。5)將裂解液轉移到新的試管中進行測定或儲存於-80。C。分縱csc遊浙蘑微艦歉'10190刺激的細胞1)在細胞中加入生長因子TGF-a(100nM)、調蛋白(IOOnM)和/或IGF(100nM)並在37'C培育5分鐘。用藥物處理刺激的細胞1)37t:用治療有效濃度的赫賽汀、拉帕它尼(Lapatanib)、塔可弗(Tarceva)和/或雷帕黴素類似物處理樣品30分鐘。2)然後加入生長因子TGF-a(100nM)、調蛋白(IOOnM)和/或IGF(100nM)刺激細胞並在37t:培育5分鐘。該實施例說明，在多重、高通量、相近雙檢測器微陣列試驗中進行捕獲抗體連續稀釋能提高分析稀有循環細胞中信號轉導分子活化狀態的動態範圍1)將捕獲抗體印刷於16-襯墊FAST載玻片(沃特曼有限公司)。各捕獲抗體2倍連續稀釋獲得總共9種濃度(從1毫克/毫升開始；結束於0.004毫克/毫升)。2)乾燥過夜後用Whatman封閉緩衝液封閉載玻片。3)以10倍連續稀釋在各個襯墊中加入80微升細胞裂解液。將載玻片室溫培育2小時。4)用TBS-Tween洗滌6次後在載玻片上加入80nl稀釋於TBS-Tween/2%BSA/1%FBS的檢測抗體用於相近試驗。使用的檢測抗體是(1)直接偶聯於葡萄糖氧化酶(GO)的抗-EGFR單克隆抗體；和(2)直接偶聯於HRP的識別磷酸化EGFR的單克隆抗體。室溫培育2小時。5)或者，檢測步驟利用識別磷酸化EGFR的單克隆抗體的生物素偶聯物。這些情況中，洗滌6次後還包括與鏈黴抗生物素蛋白-HRP—起培育1小時的額外連續步驟。6)或者，檢測步驟利用抗-EGFR抗體的寡核苷酸-介導的葡萄糖氧化酶偶聯物。可使用直接偶聯的或生物素-鏈黴抗生物素蛋白(SA)連接的磷酸化EGFR抗體的HRP偶聯物。7)為進行信號放大，加入80微升5pg/ml的生物素-酪醯胺並反應15分鐘。載玻片用TBS-Tween洗滌6次，用20%DMSO/TBS-Tween洗滌2次，並用TBS洗滌一次。8)加入80微升SA-Alexa555並培育30分鐘。然後將載玻片洗滌兩次，乾燥5分鐘，並用微陣列掃描儀(PE公司)掃描。[02121圖16顯示了抗-EGFR捕獲抗體的稀釋曲線。採用可尋址陣列在單細胞水平檢測受激A431細胞的磷酸化EGFR和總EGFR。該試驗的動態範圍大於5個log。每條單獨曲線的動態範圍約為2個log，當將6條提供信息曲線的信息組合時動態範圍顯著增加。實施例7寡核苷酸與抗體的偶聯。[0213該實施例例舉了生成寡核苷酸偶聯的抗體或酶的偶聯和質控過程。[0214偶聯1)用5'-SH基團和6-碳間隔子合成72-聚體寡核苷酸接頭。2)將凍幹的寡核苷酸接頭溶於20mMTris-HCl，pH7.4。125納摩爾接頭然後用0.5MTCEP-HC1(伊利諾州羅克福德的皮爾斯生物技術公司)室溫處理2小時，終濃度為50mM。用脫鹽旋轉柱(desaltingspincolumn)除去反應混合物中的Tris、TCEP和未偶聯的接頭。3)用100微升反應體積的異雙功能交聯劑如SMCC使所得去保護的寡核苷酸接頭與靶蛋白(例如，抗體或酶)的伯胺偶聯。4)將反應混合物室溫培育2小時。寡核苷酸-偶聯的抗體或酶用SephacrylS-200HR柱(新澤西州皮斯卡塔韋的GE健康護理公司(GEHealthcare;Piscataway，NJ))通過凝膠過濾純化。10215偶聯物的鑑定1)使葡萄糖氧化酶(GO)分子與第一寡核苷酸接頭偶聯，在純化後收集所得GO-寡核苷酸的三個組分並以10倍稀釋系列印刷於硝酸纖維素塗布的載玻片。2)使IgG與Alexa647和第二寡核苷酸接頭，該接頭具有第一寡核苷酸接頭的互補序列。將所得Alexa647-寡核苷酸-偶聯的抗體應用於晶片，在IXPBS緩衝液中室溫雜交1小時，並洗滌數次。3)將載玻片乾燥並用微陣列掃描儀掃描以證實核苷酸序列-特異性雜交。4)葡萄糖氧化酶的酶試驗證實偶聯過程不會改變酶的功能。10216圖17顯示Alexa647-寡核苷酸-偶聯的抗體對組分13-15中的GO-寡核苷酸具有最高結合親和力。實施例8同時檢測總EGFR和磷酸化EGFR的寡核苷酸-偶聯的抗體。02171該實施例列舉了一種採用實施例7所述寡核苷酸偶聯物分析稀有循環細胞內信號轉導分子活化狀態的多重、高通量、微陣列試驗1)將捕獲抗體印刷於16-襯墊FAST載玻片(沃特曼有限公司)。2)乾燥過夜後用Whatman封閉緩衝液封閉載玻片。3)以10倍連續稀釋在各個襯墊中加入80微升細胞裂解液。將載玻片室溫培育2小時。4)用TBS-Tween洗滌6次後在載玻片上加入80|nl稀釋於TBS-Tween/2%BSA/1%FBS的檢測抗體用於相近試驗。使用的檢測抗體是(1)直接偶聯於Alexa647和寡核苷酸接頭的抗體，其中所述寡核苷酸接頭包含與偶聯於葡萄糖氧化酶(GO)的寡核苷酸接頭互補的序列；和(2)直接偶聯於辣根過氧化物酶(HRP)的識別磷酸化EGFR的單克隆抗體。使Alexa647-寡核苷酸-偶聯的抗-EGFR抗體接觸GO-寡核苷酸以形成圖18所示複合體。用TBS-Tween洗滌6次以除去過量的未結合試劑。5)然後在反應體系中接入葡萄糖以及酪醯胺-Alexa555。6)通過Alexa647-寡核苷酸-偶聯的抗-EGFR抗體的直接結合檢測總EGFR水平。通過GO-寡核苷酸與HRP-偶聯的抗-p-EGFR抗體的相近結合併通過酪醯胺信號放大可視化來檢測磷酸化EGFR。7)在微陣列掃描儀(PE公司)上用Alexa647和Alexa555的特定雷射掃描載玻片。0218圖19顯示了總EGFR和磷酸化EGFR的同時檢測。總EGFR(t-EGFR)通過僅有10個細胞的直接結合試驗來檢測，磷酸化EGFR(p-EGFR)從1個細胞檢測。10e5p-EGFR分子採用相近信號放大法(proximitysignalamplificationmethod)檢測。採用該相近試驗模式使得p-EGFR的檢出限提高100倍以上。實施例9檢測乳腺癌患者的循環腫瘤細胞(CTC)信號傳導。02191按照Chan等，Ato.M/.，10:1390-1396(2004)描述的方法進行微陣列製造和處理。將針對信號轉導分子EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF-1R、Akt、Erk、p70S6K、Bad、Rsk、Mek、cSrc、細胞角蛋白、微管蛋白、卩-肌動蛋白的抗體和抗-小鼠抗體(陽性對照)(4/4陣列)轉移到384孔聚丙烯平板(50pl/孔)，使用裝備有固態點樣針的接觸印刷自動微陣列儀(contactprintingrobotic1*咖汀^^)(加州赫爾克裡斯的伯樂公司)將抗體點在？八8丁@載玻片上銜澤西州沃佛羅漢姆公園的沃特曼有限公司)。使用塗有8個扇形襯墊的載玻片。印刷之後用3%酪蛋白溶液封閉載玻片。載玻片在乾燥環境中儲存至少一夜後再使用。102201按照公布的評價乳腺癌疑似女性循環腫瘤細胞的研究確定患者選擇標準、樣品製備方法和研究設計(參見，例如，Wulfmg等，Omcwi^.，12:1715-1720(2006);禾卩Reinholz等，C//".Ca"cer，11:3722-3732(2005))。成像檢測顯示乳腺異常並要接受乳腺活檢的女性被採納進行該研究。包括至少42名被診斷為原發性乳腺癌的患者。至少35名患者在初步診斷沒有明顯的轉移跡象。至少7名患者在診斷時有遠端轉移並被作為陽性參比組。沒有患者有既往癌症史。收集各患者的年齡和治療信息(例如，手術療法、化療、放療、內分泌療法等等)。從各患者收集約20毫升血液並給所有血液樣品指定唯一標識號。所有試驗由不知道活檢結果的研究人員進行。[0221將外周血(18毫升)加入AccuspinHistop叫ue-1077系統(密蘇裡州聖路易斯的西格瑪阿爾德裡奇公司(SigmaAldrich;St.Louis，MO))並在BeckmanCS-6R臺式離心機(加州帕洛阿託的貝克曼儀器公司(BeckmanInstruments;PaloAlto，CA))中以1500rpm離心10分鐘。將單核的細胞層除去，用PBS洗滌兩次，並用PBS/O.P/。牛血清白蛋白稀釋到1毫升。使用Dyna珠上皮細胞富集試劑盒按照製造商(挪威奧斯陸的戴納公司)的說明用附於磁珠的抗Ber-EP4抗體通過免疫磁捕獲富集上皮細胞。將細胞與20毫升1-107珠混合併振蕩1小時。除了鱗狀上皮細胞、肝細胞和周緣細胞的淺表層，Ber-EP4抗體識別上皮細胞表面上和胞質內的兩種糖蛋白。將懸浮液在磁體上放置至少6分鐘並小心除去上清液。附於磁珠的細胞用1mlPBS/0.1。/。牛血清白蛋白洗滌三次。在細胞中加入生長因子TGF-a(100nM)、調蛋白(IOOnM)和IGF(100nM)並在37。C培育5分鐘。將細胞濃縮並用隨試劑盒提供的裂解結合緩衝液裂解。裂解的細胞懸浮液(附有珠子)儲存於80。C直到處理。[0222試驗方法1:將裂解產物(40微升)施加於陣列，培育過夜，並用洗滌緩衝液洗滌三次。在陣列中加入抗各種信號轉導分子的HRP-標記的抗-磷酸化抗體(按照例如Kuhlmann，《免疫酶技術》(ImmunoEnzymeTechniques),VC出版社(VerlagChemie)，維海姆(Weinheim)，第1-162頁(1984)的描述偶聯)和葡萄糖氧化酶(按照Kuhlmann的描述偶聯，同上)標記的抗-總抗體(即，活化狀態非依賴性)，培育2小時，並用洗滌緩衝液洗滌三次。加入酪醯胺試劑(分子探針公司(MolecularProbes))和葡萄糖，反應1小時，洗滌三次。將陣列與鏈黴抗生物素蛋白-HRP—起培育30分鐘，洗滌並用增強的魯米諾(分子探針公司)顯影。信號採用CCD照相機檢測。[0223試驗方法2:將抗2，4-二硝基苯酚(DNP)抗體(1毫克/毫升)轉移到384孔聚丙烯平板(5微升/孔)，使用裝備有固態點樣針的接觸印刷自動微陣列儀(加州赫爾克裡斯的伯樂公司)將抗體點在FAST載玻片上(新澤西州沃佛羅漢姆公園的沃特曼有限公司)。使用塗有8個扇形襯墊的載玻片。印刷之後用3%酪蛋白溶液封閉載玻片。載玻片在乾燥環境中儲存至少一夜後再使用。[02241將裂解產物(40微升)與總DNP-標記的抗上述各信號轉導分子的抗體、用Oligo和AlexaFluor647標記的抗-磷酸化抗體、以及用Oligo和AlexaFluor647標記的抗-總抗體混合，加入抗-DNP抗體，培育過夜，並用洗滌緩衝液洗滌三次。加入2，4-二硝基賴氨酸(分子探針公司)從抗-DNP抗體上釋放免疫複合體。將釋放的免疫複合體加入郵編碼陣列(參見，例如，Keramas等，LWC7>，4:152-158(2004);和Delrio-Lafreniere等，D/ag".M/craWo/./"/edZXs.，48:23-31(2004))並培育過夜。將該陣列洗滌三次並用GenePix4000A微陣列掃描儀(艾克森掃描儀公司(AxonScanner))以10微米解析度掃描處理過的載玻片。實施例10檢測乳腺癌患者中循環內皮細胞(CEC)和循環內皮祖細胞(CEP)的信號傳導。[0225釆用實施例9中所述相同的患者樣品、樣品製備和試驗方法，但CEC和CEP細胞採用附於磁性Dyna珠的單克隆抗體P1H12或CD146通過免疫磁捕獲富集。採用實施例9所述方法製造和處理微陣列，但排列的抗體對以下分析物具有特異性VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、TIE1、TIE2、PDGFR-a、PDGFR-p、FGFR1、FGFR2、Akt、Erk、p70S6K、Rsk、cSrc和卩-肌動蛋白。實施例9所述試驗方法被用於檢測CEC和CEP的信號傳導。[0226本說明書引用的所有發表物和專利申請通過引用納入本文，就好像各發表物或專利申請專門且單獨地表明通過引用納入本文那樣。雖然出於清晰理解的目的已經通過說明和舉例的方式詳細描述了本發明，但本領域普通技術人員根據本發明的教導不難了解，可以在不背離所附權利要求書的構思和範圍的情況下作出某些改變和修改。權利要求1.一種進行具有高動態範圍的多重、高通量免疫測定的方法，該方法包括(a)將細胞提取物與該細胞提取物中一種或多種分析物的特異性捕獲抗體的眾多稀釋系列一起培育以形成眾多捕獲分析物，其中所述捕獲抗體局限在固相支持體上；(b)將所述眾多捕獲的分析物與相應分析物的特異性檢測抗體一起培育以形成眾多可檢測的捕獲分析物，其中所述檢測抗體包含(1)眾多用易化部分標記的活化狀態非依賴性抗體，和(2)眾多用信號放大對的第一成員標記的活化狀態依賴性抗體，其中所述易化部分產生導向信號放大對的第一成員並與其反應的氧化劑；(c)將眾多可檢測的捕獲分析物與信號放大對的第二成員一起培育以產生放大信號；和(d)檢測信號放大對的第一和第二成員產生的放大信號。2.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述細胞提取物包括實體瘤循環細胞的提取物。3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述細胞是通過免疫磁分離從患者樣品中分離的。4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述患者樣品選自下組全血，血清，血漿，尿液，痰液，支氣管灌洗液，淚液，乳頭抽吸物，淋巴液，唾液，細針抽吸物，以及它們的組合。5.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述分離細胞選自下組循環腫瘤細胞，循環內皮細胞，循環內皮祖細胞，癌症幹細胞，以及它們的組合。6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述分離細胞用生長因子體外刺激。7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述分離細胞用生長因子刺激之前與抗癌藥一起培育。8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述抗癌藥選自下組單克隆抗體，酪氨酸激酶抑制劑，免疫抑制劑，以及它們的組合。9.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述分離細胞用細胞因子刺激之後被裂解以產生細胞提取物。10，如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述一種或多種分析物包括眾多信號轉導分子。11.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述固相支持體選自下組玻璃，塑料，晶片，針，濾器，珠，紙，膜，纖維束，以及它們的組合。12.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述活化狀態非依賴性抗體還包含可檢測部分。13.如權利要求12所述的方法，其特徵在於，所述可檢測部分是螢光團。14.如權利要求12所述的方法，其特徵在於，所述可檢測部分的量與一種或多種分析物的量相關。15.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述活化狀態非依賴性抗體用導向部分直接標記。16.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述活化狀態非依賴性抗體通過偶聯於活化狀態非依賴性抗體的寡核苷酸與偶聯於導向部分的互補寡核苷酸之間的雜交而用導向部分標記。17.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述活化狀態依賴性抗體用信號放大對的第一成員直接標記。18.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述活化狀態依賴性抗體通過偶聯於活化狀態依賴性抗體的結合對第一成員與偶聯於信號放大對的第一成員的結合對第二成員之間的結合而用信號放大對的第一成員標記。19.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述結合對的第一成員是生物素。20.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述結合對的第二成員是鏈黴抗生物素蛋白。21.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述導向部分是葡萄糖氧化酶。22.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述氧化劑是過氧化氫(H202)。23.如權利要求22所述的方法，其特徵在於，所述信號放大對的第一成員是過氧化物酶。24.如權利要求23所述的方法，其特徵在於，所述過氧化物酶是辣根過氧化物酶(HRP)。25.如權利要求23所述的方法，其特徵在於，所述信號放大對的第二成員是酪醯胺試劑。26.如權利要求25所述的方法，其特徵在於，所述酪醯胺試劑是生物素-酪醯胺。27.如權利要求26所述的方法，其特徵在於，所述放大信號由過氧化物酶氧化生物素-酪醯胺產生活化的酪醯胺而生成。28.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述活化的酪醯胺是直接檢測的。29.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述活化的酪醯胺在加入信號檢測試劑後檢測。30.如權利要求29所述的方法，其特徵在於，所述信號檢測試劑是鏈黴抗生物素蛋白-標記的螢光團。31.如權利要求29所述的方法，其特徵在於，所述信號檢測試劑是鏈黴抗生物素蛋白-標記的過氧化物酶與顯色試劑的組合。32.如權利要求31所述的方法，其特徵在於，所述顯色試劑是3,3',5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)。33.—種具有高動態範圍的陣列，其包含細胞提取物中一種或多種分析物的特異性捕獲抗體的眾多稀釋系列，其中所述捕獲抗體局限在固相支持體上。34.如權利要求33所述的陣列，其特徵在於，所述細胞提取物包括實體瘤循環細胞的提取物。35.如權利要求34所述的陣列，其特徵在於，所述細胞是通過免疫磁分離從患者樣品中分離的。36.如權利要求35所述的陣列，其特徵在於，所述患者樣品選自下組全血，血清，血漿，尿液，痰液，支氣管灌洗液，淚液，乳頭抽吸物，淋巴液，唾液，細針抽吸物，以及它們的組合。37.如權利要求35所述的陣列，其特徵在於，所述分離細胞選自下組循環腫瘤細胞，循環內皮細胞，循環內皮祖細胞，癌症幹細胞，以及它們的組合。38.如權利要求35所述的陣列，其特徵在於，所述分離細胞用生長因子體外刺激。39.如權利要求38所述的陣列，其特徵在於，所述分離細胞用生長因子刺激之前與抗癌藥一起培育。40.如權利要求39所述的陣列，其特徵在於，所述抗癌藥選自下組單克隆抗體，酪氨酸激酶抑制劑，免疫抑制劑，以及它們的組合。41.如權利要求38所述的陣列，其特徵在於，所述分離細胞用細胞因子剌激之後被裂解以產生細胞提取物。42.如權利要求33所述的陣列，其特徵在於，所述一種或多種分析物包括眾多信號轉導分子。43.如權利要求33所述的陣列，其特徵在於，所述固相支持體選自下組玻璃，塑料，晶片，針，濾器，珠，紙，膜，纖維束，以及它們的組合。44.如權利要求33所述的陣列，其特徵在於，各稀釋系列包含至少3種遞減的捕獲抗體濃度。45.如權利要求33所述的陣列，其特徵在於，各稀釋系列包含至少6種遞減的捕獲抗體濃度。46.如權利要求33所述的陣列，其特徵在於，各稀釋系列內的捕獲抗體連續稀釋至少2倍。47.如權利要求33所述的陣列，其特徵在於，所述一種或多種分析物在約1個細胞內檢測。48.—種進行具有高動態範圍的多重、高通量免疫測定的方法，該方法包括(a)將細胞提取物與該細胞提取物中一種或多種分析物的特異性捕獲抗體的眾多稀釋系列一起培育以形成眾多捕獲分析物，其中所述捕獲抗體局限在固相支持體上；(b)將眾多捕獲的分析物與相應分析物的特異性檢測抗體一起培育以形成眾多可檢測的捕獲分析物；(C)將眾多可檢測的捕獲分析物與信號放大對的第一和第二成員一起培育以產生放大信號；和(d)檢測信號放大對的第一和第二成員產生的放大信號。49.如權利要求48所述的方法，其特徵在於，所述細胞提取物包括實體瘤循環細胞的提取物。50.如權利要求49所述的方法，其特徵在於，所述細胞是通過免疫磁分離從患者樣品中分離的。51.如權利要求50所述的方法，其特徵在於，所述患者樣品選自下組全血，血清，血漿，尿液，痰液，支氣管灌洗液，淚液，乳頭抽吸物，淋巴液，唾液，細針抽吸物，以及它們的組合。52.如權利要求50所述的方法，其特徵在於，所述分離細胞選自下組循環腫瘤細胞，循環內皮細胞，循環內皮祖細胞，癌症幹細胞，以及它們的組合。53.如權利要求50所述的方法，其特徵在於，所述分離細胞用生長因子體外刺激。54.如權利要求53所述的方法，其特徵在於，所述分離細胞用生長因子刺激之前與抗癌藥一起培育。55.如權利要求54所述的方法，其特徵在於，所述抗癌藥選自下組單克隆抗體，酪氨酸激酶抑制劑，免疫抑制劑，以及它們的組合。56.如權利要求53所述的方法，其特徵在於，所述分離細胞用細胞因子刺激之後被裂解以產生細胞提取物。57.如權利要求48所述的方法，其特徵在於，所述一種或多種分析物包含眾多信號轉導分子。58.如權利要求48所述的方法，其特徵在於，所述固相支持體選自下組玻璃，塑料，晶片，針，濾器，珠，紙，膜，纖維束，以及它們的組合。59.如權利要求48所述的方法，其特徵在於，所述檢測抗體包括結合對的第一成員。60.如權利要求59所述的方法，其特徵在於，所述結合對第一成員是生物素。61.如權利要求48所述的方法，其特徵在於，所述信號放大對的第一成員包括結合對的第二成員。62.如權利要求61所述的方法黴抗生物素蛋白。63.如權利要求61所述的方法是過氧化物酶。64.如權利要求63所述的方法化物酶(HRP)。65.如權利要求63所述的方法是酪醯胺試劑。66.如權利要求65所述的方法，其特徵在於，所述酪醯胺試劑是生物素-酪醯胺。67.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述放大信號由過氧化物酶氧化生物素-酪醯胺產生活化的酪醯胺而生成。68.如權利要求67所述的方法，其特徵在於，所述活化的酪醯胺是直接檢測的。69.如權利要求67所述的方法，其特徵在於，所述活化的酪醯胺在加入信號檢測試劑後檢測。70.如權利要求69所述的方法，其特徵在於，所述信號檢測試劑是鏈黴抗生物素蛋白-標記的螢光團。71.如權利要求69所述的方法，其特徵在於，所述信號檢測試劑是鏈黴抗生物素蛋白-標記的過氧化物酶與顯色試劑的組合。72.如權利要求71所述的方法，其特徵在於，所述顯色試劑是3，3',5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)。，其特徵在於，所述結合對的第二成員是鏈，其特徵在於，所述信號放大對的第一成員，其特徵在於，所述過氧化物酶是辣根過氧，其特徵在於，所述信號放大對的第二成員全文摘要本發明提供了用於檢測稀有循環細胞內眾多信號轉導分子的活化狀態和/或總量的基於抗體的陣列以及使用該陣列來幫助癌症預後和診斷及設計個性化、定向治療的方法。文檔編號G01N33/543GK101563609SQ200780042849公開日2009年10月21日申請日期2007年9月20日優先權日2006年9月21日發明者J·哈維,L·劉,P·金,R·巴罕姆,S·辛格,X·劉申請人:普羅米修斯實驗室股份有限公司