殼內鳥卵的卵內活化的製作方法

2023-12-05 09:21:16

專利名稱：殼內鳥卵的卵內活化的製作方法
背景技術：
大小與繁殖能力地面繁殖方法對繁殖火雞根本行不通，因為商用的火雞品種要經過嚴格挑選，而不能自然交配，以便增加肌肉產量。同樣，對肉仔雞的繁殖也有同樣的趨勢。經過挑選以增加肉仔雞大小，就會損害交配和受精能力。預計隨著體重的增加，受精能力將逐漸下降。這就意味著給家禽生產商帶來進退兩難的境地，因為受精能力的降低直接會給他們的盈虧結算線帶來負面影響。
無效廢物的除去自然交配必須在固體的地板上進行，以避免使鳥受傷。這種設計要求不能使用自動廢物清除系統，而要求在連續的鳥群間使用手工清除。這就會增加勞動量和提高成本，而降低了對設施的生產性使用。
卵的生產和質量因為卵在收集之前與鳥群一起留在室內，所以卵經常汙染有汙物及排洩物等，降低了其孵化率。此外，一般有3-5％的卵直接產在室內的地板上，而不是在提供的產卵箱裡，這些卵必須被丟棄。
無效空間和設備利用將雄鳥和雌鳥放在同一室內，要求安裝獨立的餵養和供水系統，因為每種性別有不同的營養和生產需求。同時，也要求安裝產卵箱和自動卵收集系統。所有這些設備佔用了室內有限的地板空間。基於這些原因，地板飼養較堆積籠系統(stacked cagesystem)而言，不能有效的利用室內空間和設備。
死亡率和繁殖力好鬥的雄鳥愛相互打鬥，導致較高的雄性死亡率。在室內地板飼養時，雄鳥的平均死亡率在13％，而在籠養時僅為2％。在交配期間，雄鳥對雌鳥的挑逗性攻擊行為也會逐漸增加雌鳥的死亡率，降低繁殖力，以及縮短鳥的產卵周期。隨著雄鳥逐漸變老，繁殖力開始下降。標準的解決辦法就是用年輕的雄鳥充實鳥群，以增強受精能力。然而，這又開始了新一輪的攻擊行為，引起繁殖力下降和死亡率增加。在室內地板養殖更容易引起鳥類疾病，因為經常接觸帶病原體的草墊和廢棄物。
降低飼料轉化率運轉一個有競爭力的家禽場的關鍵是控制飼料成本，比如飼料成本佔肉仔雞(broiler chick) 飼養成本的60％。在一項研究中，對於同樣的產量而言，地板飼養的鳥比籠養的鳥要多消耗20％的飼料。產生這個差別的原因除了地板飼養的鳥具有較高水平的活動量外，還有較高水平群居相互作用。雄性比雌性要消耗更多的飼料，從飼料的消耗而言，因為地板飼養要保持更多的雄鳥，故地板飼養變得相對的低效率。
在繁殖方法上有限的靈活性由於地板飼養方案中雄鳥和雌鳥處於一個大群體中，飼養者很難對種群進行先進的雜交和選擇。因此，室內地板主要用作預選遺傳種群以產生商用雜交品種的工具。
人工受精繁殖方案另一種產生孵化卵的方法叫作人工受精(AI)。AI被「繁殖金字塔(breeding pyramid)」頂部的「初級飼養者」廣泛運用，但通常不會被處於金字塔底部的商業生產商所採用。初級飼養者是指此類公司，他們擁有並用雜交等方式改進優良純種遺傳品系，以產生最終商用產品——肉仔雞、產卵雞及火雞。鳥的數量按指數式增加，就像你沿繁殖金字塔向下移動，從祖父種群、父輩種群到實際的商用鳥為止。在繁殖金字塔頂部的具有優良遺傳組成的鳥類相當昂貴，然而在繁殖金字塔底部的鳥卻不昂貴。因此，在不同的水平採用不同的運行模式進行繁殖。
在AI系統中，雄性和雌性處於同一房間裡，但在不同的籠子裡。雌鳥的籠子裡通常裝2-5隻雌鳥，而雄性籠子裡只裝一隻雄鳥。AI方案針對以上指出的地面繁殖房間的許多局限性。例如採用有籠子的房間，廢物的除去可進行自動化。所以房間要乾淨得多，很少有發生疾病的問題。產卵的方式也得到了改進，因為卵會滾出籠子而不會產在骯髒的地板上。設備和飼養空間可得到更有效的利用。死亡率因為群居攻擊行為和疾病的減少而被降到最低。受精水平也因為繁殖過程中群居和身體相互作用的消除而保持更一致，飼料轉化率增加了。最後，生產體系為先進的雜交和篩選增加了靈活性，這對於初級飼養者而言，是改進遺傳種群的性能，以保持市場競爭能力必須的。以上所列舉的大多數優點，對進行商業水平繁殖的飼養者而言也是很重要的，但這些優點被致命的缺點所抵消，即用AI方法繁殖要求較高的勞動力成本。
AI方案使用人工勞動取代家禽天生的性驅動力。工作人員必須從籠養的雄鳥手工收集精液，並以7天輪迴對籠養的雌鳥進行受精。這些方法中所進行的操作要求較熟練的勞動力。因此，儘管AI方案在操作上是先進的，但對商業水平繁殖方案來說沒有經濟實用性。即使使用矮小的雌鳥(一種具有相同的卵生產量而可減少30％的飼料消耗量的創新)，對於商業水平繁殖的飼養者來說，也不能補償用AI方案增加的勞動力成本。
繁殖過程在排卵期，鳥類卵母細胞含有一個胚盤，其含有雌性原核和黃色的卵黃物質。胚盤和卵黃由卵母細胞膜所包圍，叫做卵膜。圍繞卵膜為卵周層(PL)，也被稱為內卵周層(IPL)。卵膜和IPL之間的空間被叫作卵周隙，有顆粒細胞橫貫。一旦卵母細胞從鳥類的濾泡釋放出來，就被稱為卵子。卵子移動進入輸卵管，而後被吞入漏鬥，如果在此遇到精子，便完成受精作用。
隨著卵子進入後漏鬥，外卵周層(OPL)就會包圍卵子。這層膜可防止多精受精作用(多精受精是一種致命的情況，是指在胚盤處多個精子結合併穿過卵子)。然後鳥卵被額外的多層卵帶及厚和薄的卵清層所包圍。當卵子移動到峽部時，兩層殼膜沉積下來，小的碳酸鈣晶體便沉積在上面，因此開始形成卵殼。
以上事件在受精後的前幾個小時內發生。爾後卵子移動到子宮，在接下來的18-20小時中，鈣殼便徹底形成了。然後卵進入陰道，保留幾分鐘後從陰道排除或被產出。此時，如果卵已受精，包含的胚胎有大約40,000-70,000個細胞。(Johnston，「In Vitro SpermBinding，Penetration，and Fertilization of Recently OvipositedChicken Eggs，」December 1988，Clemson University)；Olsen，M.W.，J.Morph.70413-5331942)；Etches et al.，in Methods in MolecularBiology，vol.62 Recombinant Gene Expression Protocols，Ed.R.Tuan，Humana Press，Inc.Totowa，NJ，pp.433-4501997)；Petitteet al.，in Manipulation of the Avian Genome，Ed.Etches et al.，CRC Press，Boca Raton，FL，pp.81-1011993)。
基因轉移長期以來，將目標基因直接插入鳥類的生殖系以補充傳統的選擇程序一直是鳥類遺傳學家們的一個目標。這條路線在哺乳動物已經取得了巨大進步，其早期胚胎可獲得，原核可見，可插入外源DNA。產生轉基因鼠、牛、綿羊及山羊已成為大規模商業操作的常規程序。相反，在鳥類，早期胚胎不易獲得，原核也不明顯，使得對卵內早期胚胎中的基因組進行操作幾乎是一個不可逾越的目標。
經過遺傳修飾的鳥的開發很大程度要求獲得早期的多能性胚胎細胞。因為胚胎的最早期發育在雌性的輸卵管，只有將雌性體內的胚胎取出，才可能將外源DNA引入胚胎，這要求殺死雌性鳥類。而且，將早期胚胎培養以使其完成孵化是一個相當繁瑣的方法，孵化後的成活率僅10％左右。Sang et al.，in Manipulation of the Avian Genome，Ed.Etches et al.，CRC Press，Boca Raton FL，pp.121-133(1993)。
本發明提供了一種在殼內活化產出卵的方法，並從殼內孵化出存活雛鳥，因此叫做卵內活化，從而從根本上改進了鳥類的生物學。這些方法給地面繁殖和人工受精提供了一種可選擇的方法，從而可大大提高家禽生產的效率。這些方法也便於得到早期鳥類胚胎，使得更容易開發轉基因的鳥類。
發明概述本發明涉及鳥類繁殖領域。尤其是本發明提供了在殼內活化鳥卵的方法。本發明也提供了孵化出存活雛鳥的殼內活化鳥卵的方法。
本發明也提了在發育早期所產出的鳥卵。發明詳述本發明所使用的詞，「一個(a，an)或此(the)」指的是「一個或多個」。比如「一個」卵意思可以是「一個或一個以上卵」。「此」也意味著「一個或一個以上卵」。
本發明中，「活化」意思是產出的未受精卵或卵母細胞胚胎發育的啟動。下文提出了許多形式的活化。產出卵的殼內活化過程此處稱作「卵內活化」(IOA)。
本發明提供了活化殼內鳥卵(其中，鳥卵包含由膜包被的卵黃和卵子)的方法，也包括使卵子活化。本發明也涉及意料之外而驚人的發現，即未經受精的產出鳥卵經過殼內活化後可孵出存活雛鳥。本發明中，殼內鳥卵被叫做產出卵，也即是從鳥的陰道裡排出的帶有碳酸鈣外殼的卵。鳥卵的排出叫做「產卵」。因此，在這裡所提及的「殼內卵」或「產出卵」是同一個意思。
當鳥卵產出時，含有一個硬的、鈣化的外殼。殼內含有卵黃，含有支持胚胎生長發育的營養。這裡的「胚胎」指的是在卵受精過程中，由雄性原核和雌性原核融合產生的一種正在發育的有機體。儘管一個受精的(單細胞)卵子可被叫做胚胎，單細胞胚胎在此也被特稱為受精卵。
儘管卵內活化可在產出卵在室溫維持兩周後進行，但活化剛產出的卵會得到最好的結果。在優選實施方案中，在卵產出後的0-96小時內進行活化。在更加優選的實施方案中，在卵產出後的0-72小時內進行活化。甚至還要更加優選的實施方案中，在卵產出後0-48小時內活化。在高度優選的實施方案中，在卵產出後0-24小時內活化。因此，最好對產出的卵儘快進行活化。然而準確的時間限制取決於所產卵是在什麼樣條件下保存的，如什麼樣的溫度和溼度等。如果讓未受精而產出的卵冷卻前進行活化，將會提高活化效果。
在本發明的方法中，殼內鳥卵活化的方法是通過機械破壞卵或遞送一個生物樣品、如含有一個或多個精子、細胞或核的樣品到產出的卵中。可用以下一些方法將卵破壞或遞送生物樣品。這些方法允許將樣品遞送至殼內，包括(但不局限於)用酸溶液等或電穿孔的方法溶解卵殼的一個區域，以及諸如用針或解剖刀等工具穿透卵殼或使其產生縫隙，從而使卵殼有一開口。
在將樣品遞送到殼內之前，為了防止對鳥卵的汙染，遞送樣品或破壞卵子所要穿透的卵殼某一區域的表面應該進行消毒。任何和遞送生物樣品的方法相適應的方法都可用來對卵殼進行消毒處理，包括(但不局限於)消毒劑IOFEC-20和3％的過氧化氫。可將卵殼上將要被穿透的位點用消毒劑擦洗或噴灑，或者將鳥卵浸泡在含有消毒劑的容器中進行處理。
如上所述，可用小刀或針等工具在卵殼上作一個開口，所用的工具最好是無菌的。例如，在一個兩步法中，首先用小刀或其它的銳器在卵殼上開一個小孔。第二步，用注射器的針頭將樣品通過小孔注入到卵內。將樣品引入到卵殼內也可用其它的方式，包括(但不局限於)使用移液管，例如微移液管等。在一步法中，用注射器的針頭直接刺破卵殼，將所吸取的樣品注入到卵內。因此，「開口」可包括由針形成的小孔。當然，本領域普通技術人員能選擇適用的針頭，其規格大小足以使所有的樣品都能通過針頭。在一種實施方案中，所用的針頭要是最小規格的，從而將樣品完整的遞送到卵殼內，而且，針頭要足夠的堅韌，以便足以穿過鈣質的卵殼。另外，可用一個單獨的針頭在卵殼上作一個開口。在典型情況下，可使用30號(gauge)到16號的針頭。在一個具體的實施方案中，使用22號的針頭。
可在卵殼上能使卵活化的任何區域開口，但通常在胚盤附近卵殼的某一區域開口。儘管可將鳥卵進行處理，以便將胚盤置於卵的不同位置，但剛產出卵的胚盤一般位於覆蓋卵黃附近的氣室的卵殼的大末端。一旦卵殼上已作了開口，優選用針頭或移液管等通過氣室將樣品注入到位於氣室下面的膜(內層殼膜)下。
為了防止卵的汙染和胚胎的死亡，最好將殼上的開口密封。可用非毒性的粘合劑直接將卵殼的開口密封。或者，將卵殼的碎片作為補丁將開口關閉，也可用非毒性粘合劑將碎片粘到卵殼上。在一個具體實施方案中，所用非毒性粘合劑為Elmer’s膠水。在另一實施方案中，粘合劑為一種聚矽酮密封劑。進一步，也可用任何「組織膠水」密封卵殼。「組織膠水」是外科手術過程中用來將組織結合起來的無菌、非毒性粘合劑。
用本發明所述方法來活化的鳥卵由選自以下一組的鳥類產出雞、鶴鶉、火雞、雉、鴕鳥、鴯鶓、鵝、孔雀、松雞、美洲鴕、鸚鵡、雞尾鸚鵡、美冠鸚鵡、長尾小鸚鵡、以及其它的具有商業價值的鳥類。
本發明提供了殼內活化鳥卵的方法，其中，卵包含由膜包圍的卵黃。本發明也提供了孵化存活雛鳥的方法。
按照本發明所述方法將鳥卵活化後，將卵進行孵化處理，直到孵出存活雛鳥。本領域的技術人員應該知道孵化特定種受精鳥卵的時間和優選條件。以下為許多種鳥的孵化周期雞-21天，鵪鶉-23天，Corunix鵪鶉-17-18天，雉-23天，火雞-28天，鴨-28-33天，鵝-28-30天，長尾小鸚鵡-18天，鸚鵡-28天，鴿-14天，八哥-14天，雀-14天，紐扣鵪鶉(Button Quail)-16天，峽谷鵪鶉(Valley Quail)-21-22天，天鵝-30-37天。和天然受精卵的孵化相比，用本發明所述方法對受精卵進行孵化時，其區別僅在於孵化時間可以延長，以便包括受精卵產出前在雌鳥體內所保留的時間。在一個優選實施方案中，雞卵的孵化周期可持續21-23天。本領域普通技術人員將容易確定孵化某一特定種鳥卵的最佳溫度，典型的溫度為95°F-100°F。雞卵在約99.5°F進行孵化。在一個更加優選的實施方案中，當接近孵出點時，雞卵的孵化溫度應降低。因此，在當前的優選實施方案中，在孵化雞卵的1-18天，在99.5°F進行孵化，從19天開始在98.5°F下進行孵化至孵出雛雞。
本領域所熟知，要使鳥卵孵出雛鳥，其孵化的溼度水平是很重要的。因此，卵孵化時典型的溼度為75％-90％。優選孵化溼度為約80％。更優選地，在接近孵出點時，孵化卵的溼度水平將升高。因此，在一個優選實施方案中，雞卵孵化時，從1-18天，在80％的溼度下孵化，19天以後在85％的溼度孵化至孵出雛雞。在一個特別優選的實施方案中，在孵化的1-18天，在99.5°F和80％的溼度下孵化卵，從第19天開始，在98.5°F和85％的溼度下孵化至孵出雛雞。正如在本領域所熟知的，在孵化期間，翻動鳥卵有利於促進胚胎的生長。
進一步優選在商用的孵卵箱裡孵化鳥卵。商用孵化器(hatcher)調節器(setters)由許多公司生產，包括PAS Reform，Jamesway，Chickmaster，Buckeye，Cumberland，Petersime，Humidaire IncubatorCo.等等。優選在孵出之前約三天，將卵從調節器孵卵箱(setterincubtor)移到孵化器孵卵箱(hatcher incubator)中。孵化籃(hatcherbasket)可使卵置於雛鳥更易破殼出來的位置。該籃也允許雛鳥在孵出後立即走動，這對於雛鳥的發育和成活是必要的。
在另一實施方案中，本發明提供一種產出的鳥卵，其中含有天然胚胎，此胚胎含有的細胞少於40,000個，能發育成為存活雛鳥。「天然」意思是正在生長的，活著以及產生於它來源的地方。因此，天然胚胎指的是其發育和孵出時同雌鳥的原核形成所處卵殼相同的胚胎。因此，胚胎是從天然的卵子遺傳下來的。當天然受精卵產出時，典型的正在發育的胚胎含有40,000-70,000個細胞。然而，本發明所指的卵在產出後，在殼內完成受精。因此，本發明中，卵中正在發育的胚胎，其孵化期間的細胞數有時不足40,000個。實際上，當活化鳥卵時，本發明的卵中的胚胎僅有一個細胞，即受精卵。隨著鳥卵中胚胎的生長，正常的細胞分裂發生了，細胞數量也增加。因此，本發明所提供的活化的、產出的鳥卵，在孵化的某一時間將有以下細胞數的胚胎例如1,100，1,000，10,000，20,000 30,000，或40,000，以及細胞數位於這些之間的胚胎。兩種商業上優選的鳥卵是雞和火雞的卵。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種殼內鳥卵，其含有一個細胞數少於40,000(例如30,000，20,000，10,000，1,000，100和1(受精卵))的胚胎，其中，胚胎能夠發育成存活雛鳥，卵殼上有一個小於4釐米的開口。在另一個實施方案中，卵殼上的開口小於2釐米。在另一個實施方案中，卵殼上的開口小於1釐米或0.5釐米。在另一個實施方案中，卵殼上的開口小到僅能容納一個22號針頭。因此，開口可能是以下大小之間的任何大小，最小的開口僅允許注入樣品或破壞卵子的工具，最大到小於將體外(在殼外)受精的卵放回殼內所要求的孔。「開口」意味著鳥卵產出後的某個時間，在殼上開的一個孔。對開口鳥卵的理解也包括隨後又被密封的鳥卵。例如，用針頭刺一個孔，並將樣品注入，而後又將開口密封的鳥卵，甚至密封以後，都是在有開口鳥卵的定義範圍之內。對鳥卵而言，胚胎可能是天然的或非天然的。「非天然」包括那些從某一卵子發育，但對產出此卵的殼不是天然的那些胚胎。兩種商業上優選的鳥卵來自雞和火雞。另外，本發明提供了一種產出的鳥卵，其含有一個胚胎和一個天然的卵黃，其中，胚胎的細胞數少於40,000，30,000，20,000，10,000，5,000，1,000或100，以及介於1-40,000之間。從這些卵孵出的雛鳥都有正常的核型和正常的發育。
產出本發明卵的鳥類可能選自例如雞、鶴鶉、鴨、火雞、雉、鴕鳥、鴯鶓、鵝、孔雀、松雞、美洲鴕、鸚鵡、雞尾鸚鵡、美冠鸚鵡、長尾小鸚鵡、天鵝、鴿、以及其它一些有商用價值的鳥類。在一個商業上優選的實施方案中，鳥卵來自適用於本發明所提供方法的一些鳥類物種，選自雞、火雞、鵝、鴨子、鵪鶉和雉等。在一個更優選的商業性實施方案中，通常採用雞卵。本方法也能有效地用於動物園的鳥類物種，如幫助保護瀕臨滅絕的鳥類。
本發明所提供的方法也適用於爬行動物卵的卵內活化。爬行動物卵和鳥卵一樣，包含卵黃和雌性原核，產出時也受到卵殼的保護。一個未受精而產出的爬行動物卵，也可按照本發明所提供的方法進行殼內活化。
在這裡所描述的卵內活化方法也可以與其它的卵內活化方法相結合使用。例如，胚胎可在活化後進行接種(vaccination)。這些接種方法在本領域是熟知的。作為選擇，如果接種不會妨礙胚胎的發育，這樣的接種可和卵內活化同時進行。
另外，卵內活化可自動進行，以便多個卵同時被活化(例如通過注入方式活化)。因此，可將50，100，200，300或更多個卵同時活化。
所產出的未受精卵可用下文提出的多種特定的方法進行活化。上文所描述的活化方法是通過象受精、單性生殖及核轉移的方式完成的。因此，正如下文所述，所轉移的、用於活化未受精卵的樣品可能是含有樣品物質的精子。
受精本發明提供了一種使殼內鳥卵受精的方法，其中，該卵包含由膜包圍的卵黃，該方法包括獲得含有置於生理上可接受的載體中的鳥精子的精子樣品及遞送精子樣品到卵中使其受精的方法。使所產殼內卵受精的過程被稱為「卵內受精」(IOF)。
可用本領域工作人員所熟知的方法從鳥類的精子樣品中獲得精子，例如本領域工作者所熟知的腹部按摩法。用這種方法也可以將含有精子、精液或透明流體的射出物(精液)收集起來。透明流體是一種當陰莖腫脹時通過淋巴管遞送到陰莖表面的淋巴樣的流體。鳥類的精於也可以從本領域技術人員所熟知的商業來源得到。
在一個實施方案中，精子樣品中的精子是從某一隻鳥取得的。在另一個實施方案中，精子樣品中的精子是一隻以上鳥的精子混合物。當將一隻以上鳥的精子混合物用於本發明所述的方法時，使卵受精成功的可能性可以增加，因為如果某一隻鳥的精子是不育的，其它鳥的精子很可能具有使卵受精的能力。
在一個優選的實施方案中，精子樣品含有從同一種鳥取得的精子，用此精子樣品使與精子供體雄鳥同種的雌鳥的卵受精。本發明也考慮使一種鳥的精子與另一種鳥的卵受精(如果此精子能使卵受精)。
然而，特別優選的是，精子應在其收集後的30分鐘內使用，另外，如果精子能夠保持使卵受精的能力，較老的，甚至是以前冷凍過的或者凍幹的精子都可以按照本發明的方法使用。如果要使精子在收集30分後使用，優選和精子補充劑(extender)結合使用(見下文所述)。
如上文所述，精子樣品也包含有生理上可接受的載體。此處所述「生理上可接受的載體」是一種讓精子保持運動能力和存活力的流體。生理上可接受的載體的例子包括(但不局限於)未變化的精液、精液(精子固有的或添加的)、透明流體(精子固有的或加入的)、緩衝鹽溶液、精子補充劑，以及它們的組合。載體優選包括精子補充劑，在本領域也被叫做稀釋劑。正如上文所述，當精子收集後30分鐘內不使用，使用時最好加入精子補充劑。M.R.Bakst，In Manipulationof the Avian Genome，R.J.Etches and AM.Verrinder Gibbons，eds.，CRC Press，Boca Raton，FL，pp.15-281993).此處的精子補充劑是一種生理上可接受的載體，將其用來稀釋精子樣品，使精子樣品的體積增加，以降低精子樣品中精子的濃度。優選地，精子補充劑的組合物除了延長精子的保存期限外，還將稀釋精子，以便用使收集的精子量使更多的卵受精。關於精子補充劑組合物的例子、所建議的稀釋比例、最佳的貯存時間和條件、以及商用的補充劑來源可從Bakst的報導中找到(「Preservation of Avian CellInPoultryBreeding and Genetics，R.D.Crawforded.) Elsevier，New York，pp 91-1081990))。其它一些在家禽工業上常用的稀釋劑為Lago配方鳥類精子補充劑(由Hygeia Biological Laboratories生產)、Semaid火雞補充劑由Poultry Health Laboratories in Davis California生產)、Beltsville家禽精子補充劑Semen Extender由Tri BioLaboratories，Inc.in State College，Pennsylvania生產)。在一個優選的實施方案中，精子補充劑為Avidiludent(由IMB，10rueGeorges，Clemenceau，BP 81，613021』Aigle，France生產)。在另一個實施方案中，精子樣品可以含有精子和精液。另外，精子樣品可能含有精子和用生理上可接受的載體稀釋的精液，所述載體包括(但不局限於)緩衝鹽溶液和精子補充劑。
精子樣品也可由本領域技術人員所熟知的方法製備，包括用緩衝鹽溶液或精子補充劑等溶液洗滌從一隻或多隻鳥獲得的精液，離心所得溶液，除去上清，以及用一體積的緩衝鹽溶液或精子補充劑等溶液重懸所洗滌過的精子。本領域的技術人員很容易理解如何用適當體積的溶液重懸精子，以獲得想要的濃度。例如，離心並除去上清後，將沉積精子稱重，精子的數量可通過已知的鳥精子的重量值進行估計。然後用適量體積的溶液重懸精子，以獲得所需要的濃度。作為選擇，除去上清後的精子可以重懸，然後再離心，以便測定沉積精子的體積(Johnston，1998)。隨後，可用Maeza和Buss公式計算精子的濃度。(Poultry Sci.5520591976))。
典型的，雞精液中精子的濃度為3～8×108個/ml，火雞為8～15×108個/ml，珍珠雞(guinea fowl)為4～8×108/ml，北京鴨為0.2～6×108/ml。人工受精時的標準精子數量為1×108/50μl精液。在本發明的方法中，由於將精子直接置於雌性原核旁邊，故用來使卵受精的精子比通常要少得多。因此，本發明的方法中也可用少到只有一個精子的情況。實際上，本發明能夠使用的精子濃度範圍很大。在一個實施方案中，將雞精液用等體積的Avidiluent稀釋，然後將大約0.01ml的這種精子樣品注入卵內。因此，大約一百萬個精子可沉積在雌性原核的旁邊。
在本發明的一個方法中，將精子樣品遞送到卵，使殼內的鳥卵受精。精子樣品的遞送可用上文描述的方法完成。精子在其最寬點大約0.5μm，長度為100μm。因此，在一個更加優選的實施方案中，用一個內徑至少10μm的針頭進行注射。在一個實施方案中，注射完後，針頭仍可留在卵殼裡。許多將疫苗注入卵的針頭和方法都可用於或適合於精子的遞送。
可在能影響有效受精的卵殼的任何位置開口，但是典型的情況下，在胚盤附近的卵殼某一區域開口。儘管可將卵殼進行處理，以便將胚盤置於鳥卵的不同區域，新產卵的胚盤大多位於覆蓋卵黃的氣室的卵殼的大末端。一旦在卵殼上開了一個口，優選通過引入針頭、移液管等將精子樣品通過氣室遞送到位於氣室下面的膜(內殼膜)下。精子的數量可以增加或減少，這取決於給予精子的地點和形式。在一個更加優選的實施方案中，將精子樣品用針頭注入鳥卵內。在天然情況下，要使卵的受精取得成功，精細胞必須穿透內層卵周膜並和卵膜融合。如果用IOF，在成功受精之前，精細胞也必須穿透外層卵周液膜。為了增加受精效率，可以處理OPL或卵黃膜。任何可使OPL或卵黃膜更易被穿透的處理都可以被採用，例如非毒性的酸、蛋白水解酶、或物理的磨損等。
在一個實施方案中，用針頭、移液管等以約15°的角度推進至卵殼內，並穿透襯在卵殼內的膜。在一個本發明所提供的方法中，針頭、移液管等推進通過氣室，直到達到內層的殼膜。一個練習使用本發明方法的人應知道，當針頭或移液管進一步推進受到輕微阻礙時，表明針頭或移液管已達到殼膜。隨著針頭或移液管的尖端輕微推進，來自膜的阻力消失，針頭或移液管的尖端剛好穿過膜。然後，精子樣品被遞送到了卵內靠近膜的某一區域，也即是胚盤的附近。因此，精子可以剛好被遞送到膜的下面，這個方法叫做細胞質內精子注射法(ICSI)。常規的精子樣品的體積可少至0.005ml，或大到0.10ml。一個典型的精子樣品體積為大約0.01ml。
為了防止卵的汙染和胚胎的死亡，卵殼上的開口優選用上文所述的方法密封。本發明的方法可使許多鳥類物種所產的卵受精，所述鳥類物種選自雞、鵪鶉、鴨、火雞、雉、鴕鳥、鴯鶓、鵝、孔雀、松雞、美洲鴕、鸚鵡、雞尾鸚鵡、美冠鸚鵡、以及其它一些具有商業價值的鳥類。
本發明也提供了一種使殼內鳥卵受精的方法，其中，所述卵含有一個由膜包圍的卵黃；也提供了孵化出存活雛鳥的方法，包括獲得含有置於生理上可接受的載體上的鳥精子的精子樣品，並將精子樣品遞送到卵使其受精，並且孵化卵並從卵孵出存活雛鳥。此處「獲得」包括利用預製備和預遞送的精子樣品。
按照本發明上文所述方法將精子樣品遞送到卵內以後，按上文所述方法將卵進行孵化，直到孵出存活雛鳥。
正如上文所述，本發明的方法也可用於爬行動物卵的卵內受精。爬行動物卵和鳥卵一樣，也含有卵黃和雌性原核，當其產出時也受到卵殼的保護。一個未受精的爬行動物卵產出後，也可用本發明所述方法進行殼內受精，尤其是將含有一個或多個同種爬行動物精子的精子樣品，通過卵殼上的開口遞送到未受精的產出卵的殼內，並遞送到雌性原核附近的卵黃上，在此處發生受精作用。
另外，卵內受精可自動進行，以便多個卵同時受精，例如採用注射技術。因此，50，100，200，300或更多的卵可同時被注射。
單性生殖在本發明的一個實施方案中，所產未受精卵的活化採用單性生殖誘導。此處的單性生殖是指在沒有雄性配子的情況下，由雌性的配子單獨產生胚細胞的過程。
在一個優選方案中，所產未受精卵用單性生殖進行的活化可通過穿透包圍卵黃(卵黃膜)和胚盤的膜的方式進行誘導，例如直接用25號針頭刺破卵殼並進入卵內，穿透包圍卵黃的膜。最好避免使卵黃破裂。因此，對包圍卵黃的膜的穿透和破壞可啟動卵子的活化。需要指出的是，其它一些能破裂包圍卵黃的膜的機械方式也可以用。例如雷射，包括非熱能的YGA(億鋁石餾石)雷射，可用來破壞包圍卵黃的膜，而在此方法中並不使用針頭。
有證據表明，胞質中Ca2+濃度短暫的增加啟動卵發育。胞質中Ca2+濃度可通過直接注入Ca2+到卵內或使用攜帶Ca2+的離子載體如A23187的方式人為地增加。這使得目前所測試過的所有動物的卵都得到了活化Alberts 1983)。通過注入Ca2+螯合劑EGTA防止Ca2+濃度的增加，從而可抑制受精後卵的活化。因為胞質中Ca2+濃度的增加是短暫的，僅在受精後持續2-3分鐘，很明顯，它不能直接調節卵活化後期所觀察到的各種事件，包括DNA和蛋白質的合成等。相反，Ca2+濃度的增加只是啟動了各種發育事件的整個順序；當Ca2+濃度處於高水平時，卵內一定會發生一些更加持久性的改變。
儘管有關卵活化的機理還不完全為人們所理解，很明顯，精子只是啟動了卵內的一個預設程序。精子本身並不是必須的。卵可以被許多非特異性的物理或化學處理活化。這些方法通常被認為提高了細胞內的Ca2+濃度(Rickord and White，1992)。例如用針刺的方式可活化蛙卵(Alberts，1983)。小鼠卵母細胞可用如下的方式活化暴露於無Ca2+-Mg2+的培養基(Surani and Kaufman，1977)、含透明質酸酶的培養基(Graham，1970)、暴露於乙醇(Cuthbertson)、Ca2+載體或螯合劑(Steinhardt et al.，1974；Kline and Klinge，1992)、蛋白質合成抑制劑(Siracusa et al.，1978)以及電刺激(Tarkowskiet al.，1970)等。有人報導用乙醇(Nagai，1978)、電刺激(Ware etal.，1989)、暴露於室溫(Stice and Keefer，1992)、以及將電刺激和環己醯亞胺相結合使用(First et al..，1992；Yang et al.，1992)等方式活化牛的卵母細胞。這些方法可用來活化產下的未受精鳥卵。
用單性生殖進行卵內活化的一個應用就是快速生產種禽的純的近交系。目前，工業實踐包括使用純合母系的不同組合已生產出商業上獨特的鳥類。一直有人在努力獲得、提高和維持這些品系。用單性生殖的方式，一個雌性的配子能經過誘導發育成存活雛鳥，而不需要來自雄性的遺傳貢獻。所產生的雛鳥在每一個等位基因完全是純合的。因此，純合品系可在一代中產生，而不是今天所要求的多輪近交。而且，不需要用鳥群來產生純合品系，而只需要用某一個優良的個體。因為在某一繁殖種群中，一些個別鳥的表現比一般的要好，所以，用這種方法可以使商業上的最佳遺傳性狀進入最終的商業產品。
核轉移核轉移/細胞微操作技術可被用來活化產出的未受精的產出鳥卵。因此，本發明的一個單獨考慮的實施方案涉及到了將含細胞核或「核質(nucleoplasts)」的流體懸液進行遞送的方法。核質可用先進的離心方法大規模的產生。據測定，在許多物種，如綿羊、奶牛和小鼠，從某一個細胞分離的核質可以被插入到另一個去核的細胞中，以便產生相同的，克隆的個體。此處所用的「核轉移」是指插入一個核，也即核質，(或者處於細胞中，或者獨立於細胞的核)，到一個天然核無效(例如通過取出或切除)的細胞中的過程。這裡所描述的方法允許生產商有效地將優良遺傳品系繁殖成商用的鳥類，並作為發展自動化核轉移儀器平臺的基礎。
實現這個方法所要求的主要的步驟如下(1)開發合適的細胞系及培養核質供體的條件；(2)顯現並取出或切除鳥卵和/或受精卵；(3)供體核的分離；(4)將供體核轉移到卵內(胞質)。可引起胚胎發育的重構卵的活化也可能受影響。
核質供體細胞。在幼鳥中，胚胎幹細胞和原始生殖細胞保持著全能性，可用於鳥的NT程序中。用這種方式產生的克隆雞在用於某些家禽繁殖方面是相當有價值的。
作為選擇，體細胞系對於其它家禽繁殖方案可能具有某些優點。一個在選擇體細胞型時要考慮的因素就是體細胞進行「重新設計(reprogramming)」的能力。為了便於核質對所有胚胎細胞系有所貢獻，從而導致胚胎的正常發育，可採用重新設計。培養的胚胎成纖維細胞(CEF)已被廣泛用於哺乳動物，由於其容易培養和遺傳操作，因而產生了很好的結果。在鳥類體系中，CEFs可用於體細胞的核轉移。另外，胚胎來源的胚盤細胞(BCs)已被培養，並可以使用。另一個可用作鳥類核轉移平臺的細胞類型為鳥的B細胞。
用鳥B細胞的一個優點是其能進行高水平的重組。這個能力相當重要，因為它能使外源的DNA摻入鳥基因組的過程變得有效得多。從而將對任何供體細胞系進行的體外修飾摻入到所得到的鳥的基因組中。進行測試，已鑑定出最優的細胞類型。例如，從這些細胞類型中產生核質並將其轉移到鳥的細胞質(受體細胞)。導致最高水平胚胎存活率的細胞類型可被引入標準的技術平臺。
在哺乳動物，儘管主要是卵用於核轉移，但用卵和受精卵都已成功地進行了核轉移。對於標準的核轉移程序，一般在引入供體的核之前，將現存的核取出或切除。鳥卵較大，供體核和受體核之間的距離很大，因此不嚴格要求取出受體細胞的核。然而，目前優選去核。
由於有濃稠的卵黃顆粒，使得在光學顯微鏡下鳥卵細胞核的顯現很大程度上無效。因此，目前選擇的鳥卵去核的方法使用了核的螢光標記法。可以使用已知的螢光核染料如Hoescht 33342(二-苯甲醯胺)和DAPI(4』6-二脒基-2-苯基吲哚)，因為它們可以使核及其相關DNA顯現。
可除去核的兩個標準方法；(1)通過玻璃微移液管取出核或(2)用雷射切除核。目前，這兩個用於核微操作的方法都在使用。雷射類型和波長可憑經驗確定。通過任何一種方法使胞質中螢光區域的消失，表明核已被除去。在這個時期不僅要取出核DNA，而且優選取出紡錘體形成結構。
有許對因素影響核轉移後的發育，包括要求重構胚胎以維持正常的倍數性。當對一個開始分化細胞的核進行轉移時，基因表達的模式將從分化的細胞型的模式重新設計到早期胚胎細胞型的模式。細胞周期改變的實驗表明發生這個過程的效率受到供體和受體細胞周期階段的影響。
從對哺乳動物的實驗表明，在重構的胚胎中，當DNA開始複製時，會受到供體細胞和受體細胞周期階段的影響。由於細胞質中減數分裂促進因子(MPF)的影響，受體細胞會產生更大的影響(Barnes et al.，1993；Campbell et al.，1993)。在複製期間紡錘體形成時，MPF的活性增加，在減數分裂中期II仍保持在高水平。將核轉移到含高水平MPF的細胞質時，不管供體細胞核周期階段如何，都會導致核膜的裂解、染色體濃集、核膜的重新形成和DNA複製等。相反，當核轉移到具有低水平MPF活性的卵母細胞時，核決定是否進行DNA複製(Campbell et al.，1993，1994)。這項工作使我們相信有兩種作用(1)在細胞周期的特定階段對基因表達進行重新設計有更大機會；(2)轉移到相類似細胞周期階段，會產生益處。
據表明，當供體細胞核處於細胞周期的G0和G1期時，胚胎的發育可得到增強。將去核卵母細胞和處於G0期的乳腺細胞融合，經過發育得到綿羊多利(Dolly)。同樣，在小鼠中，用處於G0期和G1期的Cumulus細胞成功的進行了體細胞的核轉移(Wakayama，et al，1998)。然而，用非靜止供體細胞的核產生了克隆牛(Cibelli et al，1998)。這表明，在家禽中成功進行核轉移的必需條件要憑經驗確定。處於細胞周期不同階段的細胞都可用於確定最佳的實驗方案。供體核遞送可通過供體細胞和去核卵/受精卵的電融合及直接將供體核注入到去核卵的方式進行。由於鳥卵體積大，注射較容易，故將供體核直接注入鳥卵將是核轉移的最佳方法。當將核轉移到減數分裂中期II停止的卵子時，一般要求人工活化卵子。可在核轉移後的許多時間間隔進行活化，如從核轉移後的同時到幾個小時內進行活化都可以。可通過測定這些相同的參數來確定最佳的活化時間。
可設計一個自動高通量系統來執行該過程。這有可能完全消除一個被稱為倍增繁殖(multiplication breeding)的家禽工業的一方面。典型地，在倍增繁殖方法中，從純種系通過祖父系、父繫到最終商用的鳥類，需要幾個世代。進行此過程需要大量的鳥。用核轉移進行IOA，可從某一隻優良的鳥繁殖出最終商用的鳥類。淨效應是用一種非常高效的繁殖方式產生大量遺傳上優良的鳥類。而且，用於核或細胞轉移的細胞可以無限期的貯存，直到終端用戶需要某一個特殊的商業產品為止。另一個同樣重要的好處就是，可以產生一群完全單性的鳥類。例如烤子雞生產商可能只需要雄性的鳥類，以加快生長速率，然而蛋生產商更傾向於全部要雌鳥。
基因轉移本發明也提供了一種產生含異源核酸的鳥胚胎的方法，包括用本發明所公開的方法使鳥卵活化，受精，並引入異源核酸到鳥卵中。此處所述的核酸包括(但不局限於)DNA、cDNA、RNA、mRNA及反義RNA。核酸可能是單鏈、雙鏈或多鏈的。異源核酸可以包括鳥類物種的非天然核酸，以及在鳥細胞或核中被引入位置不能正常表達的核酸。
當鳥卵用IOA的方式活化後，可在發育胚胎的任何階段進行處理，以控制一些或所有胚胎細胞的遺傳組成。對鳥的轉基因最有價值的便是早期胚胎。IOA允許了異源核酸的種系轉移，因為這允許儘可能早的將異源核酸引入早期鳥胚胎。例如，這種對發育中胚胎的遺傳操作可產生轉基因鳥，其包含的遺傳物質能用於調節內源性DNA及其表達，並產生可製造具有商業價值蛋白的細胞。
按照幾個已知的方法，本領域技術人員可將某一核酸轉移到鳥類基因組。(Harlow and Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1988；Lennette et al.，Manual of Clinical Microbiology，14thEd.，Amer.Soc.For Microbiology，Washington，D.C.，1985；Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndEd.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989；Antisense RNAand DNA，D.A.Melton，Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1988)；Freshney，Culture of Animal Cells，A Manual of Basic Technique，2ndEd.Alan R.Liss，Inc.，New York(1987)；Centers for Disease Control Laboratory Manual，U.S.Department of Health，Education，and Welfare Pun.No.79-8375，p.75，Centers for Disease Control，Atlanta，GA；FundamentalVirology，2ndEd.Bernard N.Fields and David M.Knipe，ChiefEds.，Raven PressNew York，1990)。將遺傳物質轉移到鳥類基因組的例子包括(但不局限於)鳥白血病組織增生病毒(ALV)轉導介導的基因轉移、轉座子介導的基因轉移、胚盤細胞介導的基因轉移、原始生殖細胞介導的基因轉移及核轉移等。將異源核酸引入胚胎可在活化事件發生的同時進行，例如在精子樣品引入卵的同時或在胚胎發育的後期進行。
目前用來產生轉基因鳥的標準方法就是產生包含異源DNA插入片段的複製缺陷型ALV病毒來源的轉導顆粒。因為此顆粒在鳥體內沒有複製能力，故沒有在鳥或人體引起病毒血症或疾病的危險。用此處所描述的方法，可將轉導顆粒直接引入含有早期鳥胚的產出卵中。例如，可在胚胎上方開一個孔，直接將轉導顆粒引入胚中的胚下腔。然後將開口密封，把鳥卵放於孵卵器中讓其發育。
另一個將異源核酸引入鳥類基因組的方法為轉座子介導的基因轉移。轉座子是指能夠在宿主基因組中轉座和移動的遺傳元件。在鳥類中沒有已知的轉座子。然而，實驗表明，從其它來源的轉座子，經重新構建，也能在鳥的基因組中起作用。可將這些轉座子工程化，作為有用的核酸載體系統，從而將某些基因插入鳥類基因組。
此外，另一個將異源核酸引入鳥胚胎的方法為胚盤細胞基因轉移法。可從X期胚胎(產出受精卵的胚胎階段)取得胚盤或其它早期細胞，可將這些細胞注回到其克隆、生長和產生嵌合幼鳥的受體胚胎中。「嵌合」幼鳥由來自兩個不同遺傳系的細胞組成。將分離不久的胚盤細胞引入受到輻射的宿主胚胎，它們具有形成所得到的鳥的所有組織，包括生殖系(產生精子和卵並因此產生下面所有世代的細胞)的能力，用本領域技術人員的所有熟知的各種方法，將胚盤細胞培養並用DNA轉染，以試圖產生轉基因禽類。
因此，可將胚盤細胞或胚胎幹細胞(ES)注入卵內受精的胚胎，以產生嵌合體家禽。然後這些嵌合體家禽經過雜交，假定它們具有胚盤或ES細胞的生殖系轉移，可以建立原始的注入細胞克隆。
此外，原始生殖細胞介導的基因轉移可用於產生轉基因鳥。隨著發育胚胎的生長，某些細胞會形成生殖系而產生精子和卵。這些原始生殖細胞(PGCs)遷移到發育生殖腺的生殖嵴，並處於靜止狀態，直到雛鳥性成熟。一個進行鳥類基因轉移的方法就是，分離這些PGCs，對它們進行遺傳操作，並放回正在形成的胚胎，讓其繼續發育。這個技術性的方法在其發展程度和潛在應用方面可比得上胚盤細胞基因轉移法。原始生殖細胞和胚盤細胞一樣，當注入受體胚胎時，也可促進的形成生殖系。
本發明的另一個方面包括遞送液體製劑到鳥卵中，以提供關於個別雛鳥的基因型狀態或組成的重要信息。例如，可將DNA和/或RNA探針遞送到鳥胚胎，以便通過性別或其它基因型對胚胎分類。這些探針特異性結合其靶序列，以提供關於鳥類遺傳組成的特異信息。用許多螢光、放射性或化學發光分子標記探針，可得到用於測定基因型狀態的高度可靠的技術。作為選擇，對於抗體和其它蛋白質，可和報告分子一樣，以同樣的方式使用。
利用本發明將核酸摻入單細胞卵母細胞和早期胚胎的方法，可將外源DNA摻入所繁殖鳥的所有或大多數細胞中。然而，在一個可選擇的實施方案中，本發明也適合將這些核酸和核酸載體遞送到後期的胚胎中。目前，一個產生轉基因家禽的方法包括將病毒顆粒注入到正發育鳥胚胎的胚下腔中。另一個應用便是鳥胚胎中，某一個特定基因產物的瞬時表達。可以將核酸製劑遞送到鳥胚以產生基於卵/或動物的生物反應器系統。蛋白質、抗原和抗體也可遞送到胚胎，以影響基因的表達。
本發明所描述的卵內活化方法也可和其它的卵內活化方法結合使用。例如，可在卵受精後接種胚胎。作為選擇，如果疫苗不會妨礙胚胎的發育，可在進行卵內受精的同時進行接種。
自動化IOA可實行自動化，以便使多個卵同時受精，如採用注射技術等。因此，可同時注射50、100、200、300或更多的卵。本領域技術人員都清楚，本發明的方法很容易進行大規模的工業化操作，以實現對新產出鳥卵活化的自動化。因此，為了實現IOA過程的自動化，以前用來免疫產出受精卵的方法可進行改進以引入精子樣品、核，或單性生殖等。
本領域技術人員應理解，自動化卵處理技術被世界範圍的許多獨立發明者同時開發出來。現今的技術包括將液體物質注入到含胚鳥卵的高通量體系。具體的例子包括注入疫苗以改善所產生鳥的免疫狀態，注入病毒以製備可用於動物和人的疫苗，注入蛋白質以影響雛鳥的健康等等。另一個用於家禽生產的自動化體系，可用來對死亡和存活雛鳥進行檢測，其原理是基於用不同的光源照射，或檢測卵臺(eggflat)中兩鄰近鳥卵之間的溫度差別。總的說來，這些技術代表著當今在本領域的發展狀態。然而，有必要建立一個更加先進的特別適於鳥類繁殖者技術平臺，本發明就是針對和滿足這一需要。
最近在精子保存方面所取得的技術進展，結合IOF技術，使得家禽繁殖工業朝著更有效的管理模式方面發展。可將下文所述的幾個重要遺傳技術結合起來，創造出真正的多用途平臺，以實現家禽繁殖技術的自動化。
為了進行IOA操作，例如IOF，如用自動化模式，將包括兩個步驟。第一步，計算加入機器的精子樣品中精子細胞的數量，或包含供轉移物質的細胞或細胞核的樣品中精子細胞的數量。此任務可用集成的分光光度計(有時叫做密度計)完成，類似於市場上ChinoCalifornia公司及其它公司出售的動物繁殖系統(AnimalReproduction Systems)。這個任務也用流式細胞儀來完成。從這些儀器分析中所得到的數據信息可以傳到中央處理器或其它分析系統，以決定所用精液和精子補充劑(稀釋液)、細胞或核物質的最佳體積。這個信息被傳送到一個流體分散裝置，將適量體積的流體分散到卵注射裝置或類似系統的中央流體貯存器中。
第二步，中央處理器激活卵注射裝置，以適當的角度，遞送適量體積的稀釋精子樣品或含某物質製劑的細胞或細胞核樣品到來受精卵特定的深度，完成IOA過程，如IOF。注射過程包括用管狀打孔器在卵殼上穿孔，插入注射針頭，使其通過卵殼膜及卵黃膜，以遞送樣品製劑。
卵注射裝置設計可以類似於工業上由Embrex，inc.，Merck Inc及其它一些公司製造並生產的設備。作為例子，在此引用一個叫做「High Speed Automation Injection System for Avian Embryos」的專利作為參考(U.S.Patent No.4,903,635)。正如專利所揭示的那樣，此設備為鳥胚胎的高速自動化注射系統，可將流體物質，尤其是接種用的流體注入鳥卵內。此設備包括吸入裝置，在注射前，可將卵在接觸處的表面支起，而不是向前推。因此，這臺設備提供了分離的裝置和設備用於在卵殼上開口，然後用流體物質注射鳥胚胎，或周圍環境，避免使用針頭或打孔器穿透卵殼並將流體物質傳到卵的內部。正如本領域所熟知的，本發明也提出了用一個針頭穿透卵殼，並遞送流體物質。其它一些專利也揭示了將流體物質注入卵內的方法，包括U.S.Patent Nos.5,900,929，「Method and Apparatus forSelectively Injection of Poultry Eggs」；5,772,342，「OvoAntibiotic and Microbial Treatment to Diminish SalmonellaePopulations in Avians」；5,699,751，entitled「Method and Apparatusfor in Ovo Injection」；5,438,954，entitled「Method and Apparatusfor Early Embryonic in Ovo Injection」；5,339,766，「Method ofIntroducing Material into Eggs During Early EmbryonicDevelopment」；5,176,101，「Modular Injection System for AvianEmbryos」；5,158,038，「Egg Injection Method，Apparatus andCarrier Solution for Improving Hatchability and Disease」；以及5,136,979，「Modular injection system for avian embryos，」所有這些專利僅供參考。在一個IOF的最簡單實施方案中，使用這些設備時，用精子代替抗原，將注射的深度調節到剛好能完成IOF。
對於IOA過程，如IOF，可設計出能對送到孵化站後的活化，如受精鳥卵進行高通量操作的系統。有利地，本發明的IOF在直接受精過程中，要求使用比平常少得多的精子，以便在某些繁殖方案中顯著降低所使用的雄鳥的數量，從而簡化操作。將現有的雄鳥集中餵養，將產生的足夠新鮮的精液送到孵卵站，使工業上每年產生的成千上萬的鳥卵受精。所使用的雄鳥越少，繁殖工作者可僅用優良的品種進行受精，從而在鳥類繁殖上取得更快的遺傳學進步，從而改進其品系。另外，通過消除或顯著減少雄鳥的數量可對工業繁殖內部結構進行再合理化。例如，一個有效得多的商業孵卵操作方法可直接代替傳統的孵卵設施，因為只需要未受精卵就足夠了。在人工受精方案中，雌性大約要佔95-98％，可以不需要手工受精，減少約95％以上和手工受精相關的勞動力。
通過核轉移進行自動活化，人們可進一步改進鳥卵注射方法使其包含使天然核變得無效的方法。例如用微移液管取出或雷射切除天然核或使其變得無效。
除了通過受精等方式對鳥卵的活化外，本發明還包括遺傳分析、遺傳操作和繁殖過程。本領域技術人員知道，這些手段目前是為實驗室使用而設計，要求較高的技術水平，因此，目前不適於低利潤的家禽養殖工業的常規使用。正如本發明所實現的那樣，許多技術很適合摻入生產人員以及遺傳學家和研究人員使用的完全自動化的操作平臺。
本發明也設計了另外一些方法和步驟來遞送各種液體製劑，以便(a)在卵內活化如IOF同時和/或之後影響鳥胚胎內基因的表達；和/或(b)提供有關鳥胚胎基因型狀態的重要信息。遞送裝置可以類似上文所述的遞送精液的卵注射裝置。本發明可以用裝精子的常規貯液器或獨立於精子的貯液器，分別用不同的針頭插入卵內注射每種流體，或用一個針頭先後將流體注入卵內。
本發明也企圖引入一種檢測裝置來進行各種基於基因和蛋白質的分析。這種裝置的一個實施方案就是，用某一波長的光源，如雷射，以及相應的在鳥卵中差別表達的染料作為某一基因型或生理狀態的指示劑。例如，對於這個實施方案，可用螢光標記的性別探針、性別連鎖的啟動子和表達體系以及螢光標記的性別抗體等來分類鳥卵。
這個檢測裝置可以用一個CCD相機或其它合適的螢光信號檢測器來激活一個分類和/或鑑定裝置。在另一個實施方案中，檢測裝置能用放射性的閃爍計數器和/或基於化學發光的方法達到以上同樣的目的。然而，在另一個實施方案中，系統可以用「基因晶片」，基因微陣列和/或基因宏觀陣列技術來達到檢測的目的，例如由Affymetrix公司生產的基因晶片等。
正如本領域技術人員所熟知的，按基因型對鳥分類可用於生產活動中。用性別將鳥分類容許生產能力最佳化。即肉仔雞工業需要雄性，而產卵雞需要雌性。本發明也使遺傳學家能夠基於高速的自動化鑑定對鳥卵進行遺傳篩選和基因型分析，產生更快的遺傳學進步並開發出改進的家禽品系。
不管用哪種方法對基因型進行分類，另一種設計包括將鳥卵分為「活的」或「死的」。在這個方法中也考慮引入簡單的光源和/或溫度裝置，如目前由PAS Reform，Breuil和Embrex公司生產的檢測系統。關於本發明所描述的這一方面，引用Embrex公司的專利作為參考(美國專利No.5,900,929)。
和以下所述的分類設備相結合，本發明注射提供預定指標和其檢測方法的流體製劑，從而建立一個用於各種分子檢測應用的多用途平臺。
在本發明的另一個實施方案中，引入了液體取樣裝置，以從鳥卵中獲取液體樣品。這個裝置用一個真空管和取樣針頭相通，針頭的尖端反覆被各個鳥卵的液體部分包圍，然後將液體取出。作為選擇，此裝置也可用類似PE Biosystems公司的310基因分析儀中所使用的電滲透梯度將流體樣品吸到取樣毛細管中。
為了最大程度利用以上所述裝置，有必要在某些時候用許多技術來放大信號。一個放大檢測信號的實施方案就是，引入一個集成熱循環系統進行DNA擴增，如由PE Biosystems，Hybaid MJ Research及其它公司生產的熱循環系統等。這個裝置對於用基因晶片、微陣列、宏觀陣列進行基因型分析時非常有用，即使不是必需的。
為了獲得分析樣品更詳細的數據信息，可根據大小、分子量、電荷或其它的化學/物理性質分離樣品分子。這種分離裝置的一個實施方案就是電泳單位。例如可用一個類似於PE Biosystems公司生產的310基因分析儀中所使用的集成毛細管電泳單位來分離核酸和蛋白質。本發明的這個實施方案還可用於對來自初級飼養者的家禽品系的鳥卵進行高通量基因型分析。
最後，從以上實施方案獲得的數據，可用軟體在中央處理器或其它設備中進行單個的或集中的處理，以評價卵在離開加工線時的價值和狀態。經過評價後的卵可以標記、分類，以便輸送到孵化籃或孵化盤進行孵化。可用類似於Hewlett Packard和Epson印表機上的噴墨裝置對鳥卵進行標記。鳥卵的分類和輸送可自動進行，用吸杯(suctioncup)和傳送帶，將大批裝卵的盤子從設備體輸送到等待的運卵車上。該設備的這部分的裝置可設計為類似於Breuil，Kuhl Corporation，Pas Reform和Embrex等公司製造的生產系統。
本發明所描述的設備平臺也得益於某些現有的基因/蛋白質分析性能。將這些分析性能直接引入平臺，可使這些方法以高速度和在工業規模上進行。本發明也描述了將這些分析性能直接用於商業化家禽工業的例子。
實施例下面所列的實施例在於給本領域技術人員徹底公開和描述本發明所要求保護的方法是如何進行的，並且只是作為本發明的舉例，並不限制發明者所認為的本發明的範圍。本發明努力確保數字的準確性(例如數量，溫度等)，但也應考慮一些錯誤和偏差。除非特別指出，份數是重量份，溫度的單位為°F，壓力為大氣壓或接近大氣壓。
2.在受精前1小時內，在同一個上午，從4隻相隔絕的Rock雄雞獲得精液，裝入Vacutainer小瓶中。
3.將4隻雄雞的精液集中起來，和1ml的Avidiluent混合。
4.用1號，22號針頭，將精液和Avidiluent混合液吸入1ml的注射器中。
5.用針頭在卵殼大而鈍的末端開一個口，並將針頭與卵殼表面成15角通過開口。
6.將針頭通過氣室，直到其尖端剛好穿透包圍卵黃和胚盤的膜為止。
7.將一滴0.05ml的精子樣品注射到毗鄰膜的卵黃的表面。
8.將附在注射器上的針頭從卵中取出。
9.用一小片卵殼將注射器開的小口補上，用象Elmer’s glue的膠水將補丁粘到卵殼上。
10.將鳥卵放在商用分度調節器中孵化，大約第1-18天時溫度維持為99.5°F，溼度為80％。按照本領域所熟知及商用調節器所用的方法翻動卵。
11.到19天時，將卵轉到商用的孵化器中，溫度維持為98.5°F，溼度為80％，直到孵出雛雞。
按照本發明的方法，對43個卵受精，10天後，用常規的光源照射法檢測哪些卵已成功受精。43個中的35個卵已成功受精，其中32個被成功孵化成雛雞，除一隻外，其餘都是健康的。因此，用本發明的方法，所產的43個卵中，72％能成功孵出存活雛雞。
2.將從雄性Black Giant收集到的精液，立即用稀釋劑按50∶50進行稀釋。
3.在精子收集後的20分鐘內，將精子和卵送到實驗室，進行實驗。
4.將卵分成兩組，實驗組和陰性對照組，每組135個。
5.按照以前所述方法，用10μl的稀釋精液注射實驗用卵。
6.陰性對照組不注射。
7.如前所述，注射後的卵用聚矽酮密封劑密封，放入孵卵器孵化。
8. 5天後檢查生育力，並作記錄。
9.在實驗組的135個卵中，有35個(24％)具有生育能力。對照組中沒有卵有發育的跡象。
1.在早上收集270個新產的卵。
2.卵被分成兩組，實驗組和陰性對照組，每組135個。
3.通過卵殼和殼膜開一個2-3mm的孔，以便能看見卵黃。
4.輕輕的「刺」和/或穿透包圍卵黃和胚盤的膜，注意不要破壞卵黃。(作為選擇，可通過插入25號注射器針頭穿透卵殼並進入卵黃，從而同時在卵殼上開口及穿透卵黃膜)。
5.將處理過的卵用密封劑密封，並放入孵卵器孵化。
6.在第5天時檢查卵的發育情況，並在放回孵卵器前記錄發育比例。
7.允許卵繼續發育，直到孵出雛鳥，記錄好孵化比例和健康條件。
結果1.將卵黃破壞的卵丟棄，剩下131個實驗卵和135個陰性對照卵。
2. 5天後檢查發育情況，131個卵中，有7個(5％)被刺穿的卵有明顯胚胎發育的跡象。
3. 7個胚胎發育的鳥卵中，有5個孵出了正常健康的雛鳥。
4.陰性對照組中，沒有胚胎發育的現象。
在整個應用中，參考了各種文獻。這些文獻的公開，以及本發明所引用的參考文獻，都完整引入這項應用中，以便能更全面的描述有關本發明領域的現狀。
本領域技術人員都知道，對本發明所作的任何修飾和改變都是允許的，只要不偏離本發明的範圍和精神。本領域技術人員考慮在此公開的說明書和實施應明白本發明的其它具體實施方案。本發明所提供的說明和實施例僅是舉例性的，本發明真正的範圍和精神由權利要求指出。
權利要求
1.一種從產出的未受精殼內鳥卵中產生存活雛鳥的方法，其中卵包含由膜包圍的卵黃和卵子，該方法包括活化卵子及孵化鳥卵直至孵出雛鳥。
2.權利要求1的方法，其中，鳥卵來自雞。
3.權利要求1的方法，其中，鳥卵來自火雞。
4.權利要求1的方法，其中，多個卵基本上被同時活化。
5.權利要求4的方法，其中，至少20個卵被活化。
6.權利要求1的方法，其中，活化是通過誘導鳥卵的單性生殖進行的。
7.權利要求6的方法，其中，單性生殖是通過穿透卵黃膜進行誘導的。
8.權利要求7的方法，其中，穿透使用針頭完成的。
9.權利要求1的方法，其中，活化是通過遞送含有置於生理上可接受的載體中的鳥類精子的精子樣品而完成的。
10.權利要求9的方法，其中，卵和精子來自同一物種的成員。
11.權利要求9的方法，其中，載體為精液。
12.權利要求9的方法，其中，載體為稀釋的精液。
13.權利要求12的方法，其中，稀釋的精液含有Avidiluent。
14.權利要求10的方法，其中，精子樣品被遞送到包圍卵黃的膜附近。
15.權利要求14的方法，其中，精子樣品被遞送到位於胚盤附近的膜區域附近。
16.權利要求10的方法，其中，精子樣品被遞送到膜的下面。
17.權利要求10的方法，其中，將膜進行處理，以便允許精子使卵受精。
18.權利要求10的方法，其中，鳥類物種選自雞、鵪鶉、鴨、火雞、雉、鴕鳥、鵝及美洲鴕。
19.權利要求18的方法，其中，鳥類物種為雞。
20.權利要求10的方法，其中，精子樣品包含從一隻以上鳥獲得的精子混合物。
21.權利要求10的方法，其中，通過穿透卵殼在卵殼上開口，將精子樣品引入卵中，從而完成精子樣品的遞送。
22.權利要求21的方法，其中，用針頭完成穿透和引入。
23.權利要求21的方法，其中，開口被密封。
24.權利要求23的方法，其中，開口用粘合劑密封。
25.權利要求10的方法，其中，多個卵基本同時受精。
26.權利要求25的方法，其中，至少使20個卵受精。
27.權利要求25的方法，其中，至少使50個卵受精。
28.權利要求10的方法，其中，卵為雞卵，卵的孵化時間持續21-23天。
29.權利要求10的方法，其中，孵化期的約1-18天的孵化溫度為約99.5°F，從第19天起至孵出雛鳥的孵化溫度為約98.5°F。
30.權利要求10的方法，其中，從孵化的第一天直到孵出雛鳥，採用80％的溼度。
31.權利要求10的方法，進一步包括在孵化期接種胚胎。
32.使產出的殼內鳥卵受精的方法，其中該卵包含由膜所包圍的卵黃，該方法包括a)獲得精子樣品，其中含有置於生理上可接受的載體中的鳥類精子；和b)將精於樣品遞送到卵中，以便使卵受精。
33.權利要求32的方法，其中，卵和精子來自同一物種的成員。
34.權利要求32的方法，其中，載體為精液。
35.權利要求32的方法，其中，載體為稀釋的精液。
36.權利要求35的方法，其中，稀釋的精液包含Avidiluent。
37.權利要求32的方法，其中，精子樣品被遞送到包圍卵黃的膜附近。
38.權利要求37的方法，其中，精子樣品被遞送到位於胚盤附近的膜區域附近。
39.權利要求32的方法，其中，精子樣品被遞送到膜的下面。
40.權利要求32的方法，其中，進一步包括處理膜，以便增加受精。
41.權利要求33的方法，其中，鳥類物種選自雞、鵪鶉、鴨、火雞、雉、鴕鳥、鵝及美洲鴕。
42.權利要求41的方法，其中，鳥類物種為雞。
43.權利要求32的方法，其中，精子樣品包含從一隻以上鳥獲得的精子混合物。
44.權利要求32的方法，其中，通過穿透卵殼在卵殼上開口，將精子樣品引入卵中，從而完成精子樣品的遞送。
45.權利要求44的方法，其中，用針頭完成穿透和引入。
46.權利要求44的方法，其中，開口被密封。
47.權利要求46的方法，其中，用粘合劑密封開口。
48.權利要求32的方法，其中，多個卵基本同時受精。
49.權利要求48的方法，其中，至少使20個卵受精。
50.權利要求48的方法，其中，至少使50個卵受精。
51.一種使殼內雞卵受精的方法，其中，該卵包含由膜包圍的卵黃，該方法包括a)獲得置於生理上可接受的載體中的雞精子樣品；和b)將精子樣品遞送到卵內，以便使卵受精。
52.一種使殼內雞卵受精的方法，其中，該卵包含由膜包圍的卵黃，該方法包括a)獲得稀釋的雞精子；和b)將稀釋的精子遞送到卵內，以使卵受精。
53.一種使殼內雞卵受精的方法，其中，該卵包含由膜包圍的卵黃，該方法包括a)獲得稀釋的雞精子；和b)通過穿透卵殼，將稀釋的精子引入卵內，從而將稀釋精子遞送到卵內。
54.一種使殼內雞卵受精的方法，其中，該卵包含由膜包圍的卵黃，該方法包括a)獲得稀釋的雞精子；和b)通過穿透卵殼，將稀釋的精子引入卵內，從而將稀釋的精子遞送到卵中胚盤附近的膜區域附近。
55.一種使產出的殼內雞卵受精，並孵出存活雛雞的方法，其中卵包含由膜包圍的卵黃，該方法包括將置於生理上可接受的載體中的雞精子樣品遞送到卵內，以便使卵受精並孵化卵直到孵出雛雞。
56.一種使產出的殼內雞卵受精，並孵出存活雛雞的方法，其中卵包含由膜包圍的卵黃，該方法包括將稀釋雞精子遞送到卵內，以便使卵受精並孵化卵直到孵出雛雞。
57.一種使產出的殼內雞卵受精，並孵出存活雛雞的方法，其中卵包含由膜包圍的卵黃，該方法包括通過穿透卵殼並將稀釋精子引入卵內從而將稀釋的雞精子遞送到卵內，以便使卵受精並孵化卵直到孵出雛雞。
58.一種使產出的殼內雞卵受精，並孵出存活雛雞的方法，其中卵包含由膜包圍的卵黃，該方法包括通過穿透卵殼並將稀釋精子引入卵內從而將稀釋的雞精子遞送到卵中胚盤附近的膜區域附近，以便使卵受精並孵化卵直到孵出雛雞。
59.一種產出的鳥卵，其中包含細胞數少於30,000的天然胚胎，其中胚胎能發育成存活雛鳥。
60.權利要求59的卵，其中，胚胎細胞數少於20,000。
61.權利要求59的卵，其中，胚胎細胞數少於10,000。
62.權利要求59的卵，其中，胚胎為受精卵。
63.權利要求59的卵，其為雞卵。
64.一種產出的雞卵，其中包含細胞數少於30,000的天然胚胎，其中胚胎能發育成存活雛雞。
65.一種被產出的雞卵，包含天然受精卵。
66.一種被產出的鳥卵，包含細胞數少於30,000的胚胎，其中，胚胎能發育成存活雛鳥，並且其中卵殼上有一個小於4釐米的開口。
67.權利要求66的卵，其中，胚胎細胞數少於20,000。
68.權利要求66的卵，其中，胚胎細胞數少於10,000。
69.權利要求66的卵，其中，胚胎是一個受精卵。
70.權利要求67的卵，其中，開口被密封。
71.權利要求67的卵，其中，開口小於1釐米。
72.權利要求67的卵，其中，開口小於5毫米。
73.一種被產出的，包含胚胎的雞卵，胚胎的細胞數少於30,000，其中，胚胎能發育成存活雛雞，並且其中卵殼上有一個小於4釐米的開口。
74.一種被產出的，包含胚胎的雞卵，胚胎細胞數少於20,000，其中，胚胎能發育成存活雛雞，並且其中卵殼上有一個小於1釐米的開口。
75.一種被產出的，包含受精卵的雞卵，其中，受精卵能發育成存活雛雞，並且其中卵殼上有一個小於4釐米的開口。
76.一種被產出的，包含受精卵的雞卵，其中，受精卵能發育成存活雛雞，並且其中卵殼上有一個小於1釐米的開口。
77.一種由權利要求9的方法產生的卵，其中，該卵含有一個受精卵。
78.一種被產出的，包含天然卵黃和細胞數少於30,000的胚胎的雞卵，其中，胚胎能發育成存活雛雞。
79.一種被產出的，包含天然卵黃和細胞數少於20,000的胚胎的雞卵，其中，胚胎能發育成存活雛雞。
80.一種被產出的，包含天然卵黃和細胞數少於10,000的胚胎的雞卵，其中，胚胎能發育成存活雛雞。
81.一種產生含異源核酸的鳥胚胎的方法，此方法包括將異源核酸引入由權利要求1的方法產生的鳥卵中。
82.一種產生含異源核酸的鳥胚胎的方法，此方法包括將異源核酸引入由權利要求9的方法產生的鳥卵中。
83.權利要求81的方法，其中，異源核酸編碼藥物蛋白、抗原、激素或抗體。
84.權利要求82的方法，其中，異源核酸編碼藥物蛋白、抗原、激素或抗體。
85.權利要求81的方法，其中，異源核酸包含鳥白血病病毒衍生的轉導顆粒。
86.權利要求81的方法，其中，異源核酸編碼一種蛋白質。
87.權利要求81的方法，其中，異源核酸被穩定整合到鳥基因組中。
全文摘要
本發明涉及鳥類繁殖領域。具體地本發明提供一種在殼內活化卵的方法。本發明也提供孵出了存活雛鳥的殼內活化卵的方法。
文檔編號A01K67/02GK1423521SQ01808067
公開日2003年6月11日 申請日期2001年2月15日 優先權日2000年2月15日
發明者A·沃藤, T·坎特雷爾 申請人:Ovo生物科學公司