RNase9蛋白及其編碼序列和用途的製作方法

2023-12-02 19:30:31

專利名稱：RNase 9蛋白及其編碼序列和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質工程、基因工程和生物醫藥領域，具體涉及人RNase 9蛋白、其核苷酸編碼序列以及它們的抗菌用途。
背景技術：
已知精子從睪丸中產生以後，並不成熟，需要在附睪管中獲得運動能力和與卵子結合能力。附睪通常分為頭，體， 尾三部分，從頭到尾附睪上皮細胞分泌的成分各不相同，造成了一個獨特的供精子成熟的微環境。附睪同睪丸相比，是理想的男性避孕靶器官，因為它不影響睪丸激素分泌。
同時許多男性不育和附睪病變相關，比如附睪感染髮炎會導致附睪管堵塞，從而造成少精或無精，導致不育。
在1999年前，在人和各種動物附睪動物中有十五個附睪特異基因被克隆。為了發現更多的附睪特異基因可以用於男性避孕的靶點。已有報導用恆河猴作為動物模型，構建了一個附睪特異的cDNA文庫，從中篩選出11個附睪特異新基因的全長cDNA[Liu Q等人Endocrinology，2001，1424529-4539]。
目前，在人附睪特異基因中報導有抗菌活性的有HE2、ESC42、CST11等，其中HE2，ESC42屬於防衛素家族，CST11屬於半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族。
因此，本領域中仍然需要開發和提供新的來自其它蛋白家族的抗菌蛋白。

發明內容
本發明一方面提供了一種分離的蛋白RNase 9，所述蛋白包含選自以下的胺基酸序列，(a)選自序列表SEQ ID NO1或2所示的胺基酸序列；(b)相對於選自SEQ ID NO1或2所示的胺基酸序列有一個或多個胺基酸缺失、替代或插入且具有抗菌活性的胺基酸序列；(c)相對於選自SEQ ID NO1或2所示的胺基酸序列有90％以上同源性且具有抗菌活性的胺基酸序列。
在較佳的實施方案中，所述蛋白具有SEQ ID NO3所示的胺基酸序列。
本發明另一方面提供了一種分離的核苷酸序列或具互補序列，所還核苷酸序列編碼本發明的上述蛋白。
在較佳的實施方案中，所述核苷酸序列具有選自SEQ ID NO4或5的核苷酸序列。
本發明另一方面提供了一種構建物，所述構建物含有上述核苷酸序列。在較佳的實施方案中，所述構建物還包含與所述核苷酸序列操作性相連的表達調控序列。
本發明另一方面提供了一種細胞，所述細胞含有本發明上述的蛋白、核苷酸序列或構建物。
本發明另一方面提供了一種製備本發明蛋白的方法，其特徵在於，該方法包括(a)在適合該蛋白表達的條件下，培養本發明上述的細胞；(b)分離出所述的蛋白。
本發明另一方面還提供了與本發明所述的蛋白特異性結合的抗體。在較佳的實施方案中，該抗體是單克隆抗體。
本發明另一方面還涉及本發明所述的蛋白、核苷酸序列、構建物或細胞在製備抗菌藥物中的用途。
本發明另一方面還提供了一種抗菌藥物組合物，所述組合物包含本發明所述的蛋白、核苷酸序列、構建物或細胞，以及藥學上可接受的載體。
本發明的RNase 9蛋白能夠在附睪內特異性表達，而且所述蛋白表現出抗菌活性，因此其可以用於治療感染，尤其可被用於治療泌尿生殖感染，因為它是一種天然的抗菌肽，可以預見可能具有較少的副作用。本發明的其它優點可從以下的詳細描述獲知。


圖1顯示了本發明的蛋白RNase 9的mRNA在不同獼猴組織內的特異性表達情況，其中Ca表示附睪頭部；Co表示附睪體部；Cd表示附睪尾部；Te表示睪丸；Ad表示腎上腺；Sp表示脾；H表示心臟；Li表示肝；Sa表示唾液腺；Ce表示大腦；Od表示輸卵管；Ov表示卵巢。
圖2顯示了Rnase9 mRNA的雄性激素調節。用Northern雜交分析來自所示附睪區域的總RNA(10微克/泳道)，其中Ca表示頭部；Co表示體部；PCd表示尾部近端；DCd表示尾部遠端。
圖3顯示了RNase 9的Western鑑定結果。以5ng獼猴RNase 9抗原作為陽性對照(用來獲得抗血清)用SDS-PAGE對來自附睪頭部、體部和尾部區域的8微克蛋白進行分析，然後用抗重組成熟獼猴RNase 9蛋白的抗血清進行免疫檢測，圖中C表示抗原對照；Ca表示頭部；Co表示體部；Cd表示尾部。
圖4顯示了獼猴附睪內的免疫染色。玻片用蘇木精復染。A表示頭部(20倍物鏡)；B表示體部(20倍物鏡)；C表示尾部近端(20倍物鏡)；D表示尾部遠端(20倍物鏡)；E表示體部對照(20倍物鏡，免疫前血清)；F表示體部(40倍物鏡)；G表示尾部近端(40倍物鏡)；H表示尾部遠端(40倍物鏡)。圖內的線條表示100微米。
圖5顯示了RNase 9的抗菌活性。
具體實施例方式
本發明人通過抑制性差減雜交技術構建了猴附睪特異的cDNA文庫，通過測序，從中發現了36個附睪特異新基因的片斷，進一步構建了一個猴附睪常規cDNA文庫，用這些片斷去篩選該文庫，獲得了11個附睪特異新基因的全長cDNA[Liu Q等人Endocrinology，2001，1424529-4539]。而ESC461是其中一個，申請GenBank號為AF218045(未公開)，cDNA長1071bp(SEQ ID NO5)，編碼204胺基酸(SEQ ID NO2)。根據已公開的人基因組序列，根據同源性設計引物，用PCR法獲得了人的對應基因序列，申請GenBank號為AY907670(未公開)，其cDNA全長1068bp(SEQ ID NO4)，編碼205胺基酸(SEQ ID NO1)。由於它跟已發現的RNase A超家族具有一定的同源性(20％)，且含有保守的4對二硫鍵，因而命名為RNase 9。
具體而言，本發明首先提供了一種分離的蛋白RNase 9，所述蛋白包含選自以下的胺基酸序列，(a)選自序列表SEQ ID NO1或2所示的胺基酸序列；(b)相對於選自SEQ ID NO1或2所示的胺基酸序列有一個或多個胺基酸缺失、替代或插入且具有抗菌活性的胺基酸序列；(c)相對於選自SEQ ID NO1或2所示的胺基酸序列有90％以上同源性且具有抗菌活性的胺基酸序列。
在本發明中，術語「分離的」在用於核酸或蛋白質時，表示核酸或蛋白質基本上不含其它在天然狀態下相關的細胞成分，其最好呈均質狀態，但也可以是幹的或水溶液。純度和均一性通常可用分析化學方法如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相色譜法來測定。
術語「包含」指該蛋白中除了含有所示的胺基酸序列外，還可含有其它對於該蛋白的生物活性或功能沒有實質影響的胺基酸殘基。如本領域技術人員所周知的，該蛋白還可與其它基因或基因片段形成融合蛋白。適用於本發明的所述其它基因沒有特別限制，幾乎所有的基因、基因片斷或多聚核苷酸都可用於本發明。代表性的例子包括(但並不限於)穀胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖結合蛋白(MBP)等。
在較佳的實施方案中，所述蛋白基本上由選自上述(a)、(b)或(c)的胺基酸序列組成。在更佳的實施方案中，所述蛋白具有選自上述(a)、(b)或(c)的胺基酸序列。
術語「蛋白(質)」、「肽」或「多肽」可互換使用。它們指通過肽鍵或醯胺鍵連接在一起的兩個或多個胺基酸的鏈，無論是否經過翻譯後修飾(例如，糖基化或磷酸化)。本發明所述的RNase 9蛋白包括了具有序列表SEQ ID NO1所示胺基酸序列的人源RNase 9蛋白，以及具有序列表SEQ ID NO2所示胺基酸序列的猴RNase 9蛋白。然而，本發明定義內還包括與所述RNase 9具有進化相關性的其它物種的RNase 9蛋白。
本發明的蛋白還包括了所述蛋白多肽的具有相同或相似生物活性或功能的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)相對於天然蛋白的胺基酸序列有若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代。另外，所述缺失或插入(增加)也可發生在C末端和/或N末端(通常有20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內的胺基酸缺失或增加)。在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。提供功能相似胺基酸的保守性置換表是本領域所熟知的。下列5組各自含有能相互保守置換的胺基酸脂族甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)；芳族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；鹼性精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸(H)；酸性天冬氨酸(D)、穀氨酸(E)、天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q)。另外，該術語還包括了蛋白的片段或衍生物，條件是該片段或衍生物保留了所希望的蛋白生物活性。在較佳的實施方案中，所述片段具有SEQ ID NO3所示的胺基酸序列。
上述變異形式還包括上述蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然蛋白的差別可以是胺基酸序列上的差異和/或不影響序列的修飾形式上的差異。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。
本發明的蛋白多肽還包括與其相同(同源)或基本上相同(同源)的多肽，例如，有至少60％、更佳70％、還要佳80％、90％、甚至95％以上的同源性或相同性的多肽。
在兩個或多個核酸或多肽序列的情況下，術語「相同」或「相同性百分數」是指，當比較和排列對比其最大一致性(用下列序列對比算法之一(或本領域技術人員可獲得的其他算法)或目視觀察來測定)時，兩個或多個序列或亞序列相同，或具有指定百分數的相同胺基酸殘基或核苷酸。術語「基本上相同」是指，當比較和排列對比其最大一致性(用下列序列對比算法之一或目視觀察來測定)時，兩個或多個序列或亞序列具有至少60％、較佳的80％、最佳的90-95％的核苷酸或胺基酸殘基相同性。這樣的「基本上相同的」序列通常被認為是同源的。為了比較序列和確定同源性，通常將一個序列作為參比序列與測試序列比較。當用序列對比算法時，將測試和參比序列輸入計算機內，指定亞序列坐標，如果需要，指定序列算法程序參數。然後，序列比較算法根據指定的程序參數計算測試序列相對於參比序列的序列相同性百分數。序列比較的最優序列排列對比可採用例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)中的局部同源性算法、Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)中的同源性排列算法、Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci(USA)852444(1988)中的相似性搜尋方法、這些算法的計算機化操作(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics軟體包，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)來進行。
本發明所用的術語「(所希望的)生物活性」指該RNase 9蛋白的抗菌活性。
本發明另一方面還涉及編碼本發明上述蛋白的核苷酸序列，以及含有所述核苷酸序列以及任選的與所述核苷酸序列操作性相連的表達調控序列的構建物。所述核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。本發明還涉及了上述核苷酸序列或其片段的互補序列，這樣的反義序列可用於抑制細胞內RNase 9蛋白的表達。
本發明的核苷酸序列通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，通常可通過重疊(overlapping)擴增，例如進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
本文所用的術語「可操作連接」是指核苷酸序列與包括指導轉錄起始、翻譯起始、轉錄終止和翻譯終止的調控序列之間的連接。「構建物」是指包含編碼本發明的寡肽、短肽、多肽或蛋白的核苷酸序列以及指導其轉錄起始、翻譯起始、轉錄終止和翻譯終止的調控序列的載體或質粒。「載體」指本領域熟知的原核或真核克隆和表達質粒、病毒載體(噬菌體、植物病毒、昆蟲病毒、哺乳動物病毒)或其他載體。此外，載體包含一個或多個選擇性標記基因，以用於選擇轉化或轉染的宿主細胞的表型，如真核細胞使用的新黴素抗性，大腸桿菌使用的四環素或氨苄青黴素抗性等。
在本發明中，使用本領域的技術人員熟知的方法將包含編碼本發明的蛋白的核苷酸序列插入到載體中。這些方法包括但不限於體外重組DNA技術、體內重組技術等(Sambrook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。
上述載體可用於轉化或轉染適當的原核和真核細胞，以使其能夠表達所編碼的本發明的蛋白。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如昆蟲細胞和哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌、畢赤酵母、果蠅S2或Sf9細胞、哺乳動物CHO、COS、293細胞等。可採用的轉化、轉染方法包括但並不限於磷酸鈣共沉澱法、顯微注射、電穿孔、脂質體介導等。
因此，本發明另一方面還提供了含有本發明上述的蛋白、核苷酸序列或構建物的細胞。
本發明的蛋白在細胞內表達。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種方法分離和純化表達產物。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、聲波破菌、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
本發明還包括可用作探針和引物的核酸分子，該分子通常具有RNase 9蛋白編碼序列中的約8-100個，較佳地約15-50個連續核苷酸。該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼RNase 9蛋白的核酸分子。
本發明還包括對RNase 9蛋白或其片段具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於RNase 9基因產物或片段。較佳地，指那些能與RNase 9基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制RNase 9蛋白的分子，也包括那些並不影響RNase 9蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的RNase 9基因產物結合的抗體。本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的RNase 9基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達RNase 9或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
發明人通過研究進一步發現，該蛋白是附睪特異表達的，且在附睪體部表達最高(圖1)，且它的表達在附睪尾部受雄激素調控(圖2)。發明人在大腸桿菌中表達了猴RNase9蛋白，用其免疫兔子，獲得了其多抗血清。發明人用Western blot在附睪體部檢測到一條26kd條帶(圖3)，由於大於預測條帶，提示它可能有糖基化存在。經用該抗體做免疫組化試驗，發明人發現該蛋白在附睪體部主細胞表達，在附睪尾部部分主細胞表達(圖4)。另外，該蛋白還表現出具有很好的抗菌活性，且其可能具有獨特的抗菌機制。
因此，本發明還涉及上述蛋白、核苷酸序列、構建物或細胞在製備抗菌藥物中的用途，以及含有所述蛋白、核苷酸序列、構建物或細胞的藥物組合物。該藥物組合物將包含治療有效量的本發明的蛋白、核苷酸序列、構建物或細胞。本文所用的術語「有效量或治療有效量」指治療劑治療、緩解或預防目標疾病或狀況的量，或是表現出可檢測的治療或預防效果的量。該效果例如可通過化學標記或抗原水平來檢測。治療效果也包括生理性症狀的減輕，例如導致體溫降低。對於某一對象的精確有效量取決於該對象的體型和健康狀況、病症的性質和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預先指定準確的有效量是沒用的。然而，對於某給定的症狀而言，可以用常規實驗來確定該有效量，臨床醫師是能夠判斷出來的。
另外，所述蛋白、核苷酸序列、構建物或細胞還可以與合適的藥學上可接受的載體聯用。術語「藥學上可接受的載體(或賦形劑)」指用於治療劑(例如多肽、基因或其它治療劑)給藥的載體或賦形劑，其應當與本發明的蛋白、核苷酸序列、構建物或細胞相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低藥物組合物的效果。可作為藥學上可接受的載體或賦形劑或其組分的一些物質的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；澱粉，如玉米澱粉和土豆澱粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween；潤溼劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調味劑；壓片劑、穩定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩衝液等。另外，在Remington′sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到關於藥學上可接受的賦形劑的充分討論。
本發明的藥物組合物可根據需要製成各種劑型，通常可將藥物組合物製成可注射劑，例如液體溶液或懸浮液；還可製成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。脂質體也包括在藥學上可接受的載體的定義中。本發明的藥物組合物可由醫師根據患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。為了提高用藥效果，本發明的蛋白也可以與其他藥物共同使用。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。除非另有描述，本發明的實施將採用分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規技術，這些均是本領域技術人員所知的。這些技術在下列文獻中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆實驗指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover編輯1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait編輯，1984)；《核酸雜交》(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯.1984)；《蛋白質純化原理和實踐》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《實驗免疫學手冊》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell編輯1986)。或者，可按照試劑生產商所提供的說明書進行。
實施例1 RNase 9的克隆睪-睪丸差減文庫用美國CLONTECH公司的PCR-select cDNA Subtraction kit構建，猴附睪常規cDNA文庫用美國Stratagene公司的ZAP cDNA synthesis kit構建。從差減文庫測序分析發現ESC-461片段，用該片斷去篩選附睪常規cDNA文庫，獲得了含有1071bp插入的克隆。根據猴序列與人基因組的同源性，設計引物(兩個前向引物hF1(5′-GCTCTACCTCTTGGACTT-3′；SEQ ID NO6) 和hF2(5′-GGGTGGCAGAACATTACT-3′；SEQ ID NO7)及一個逆向引物。用Takara公司的反轉錄酶體系和LA-Taq，用hF1和hR1兩個引物將大部分人RNase9(包括編碼區)。進一步用3′RACE方法，將人RNase9的3′末端獲得。以猴RNase9質粒為模板，用逆向引物5′GCGGCCGC CTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG GGG CGG TAT GAC AAA GAC3′(SEQID NO8)和前向引物5′GGCC ATG GAT GTG CAG TTT CAA GAG GTG GAT3′(SEQ ID NO9)PCR法擴增出RNase9的成熟蛋白(SEQ ID NO3)的編碼序列，將其插入來自美國Novagen公司的pET-28a表達載體，進一步轉入BL21-codon plus-RIL表達宿主菌，將該蛋白表達。
實施例2 RNase 9的鑑定各組織RNA根據《分子克隆》用CsCl離心法製備，轉膜和雜交根據《分子克隆》進行。雄激素調控實驗做法如下三隻不同的猴子同時處理，一隻猴子做假手術，另兩隻猴子去除睪丸，其中一隻猴子睪丸摘除後立即注射睪酮外源補充雄激素，三隻動物六天後取出附睪抽RNA分析。將編碼猴Rnase 9從ASN83到C末端的序列用PCR法擴增，插入pET-28a載體中，表達純化後免疫兔子，獲得效價大於10萬的多抗血清。將所抽提的猴附睪蛋白通過半乾法轉到Amersham公司的Hybond-P PVDF膜上，用PIERCE公司的化學發光試劑盒檢測。用於免疫組化的猴組織用Bouin’s溶液(75ml飽和苦味酸，5ml冰醋酸，25ml 37％甲醛)固定，石蠟包埋，用華美公司的ABC試劑盒DAB顯色。
通過Northern blot試驗發現，該RNase 9蛋白是附睪特異表達的，且在附睪體部表達最高(圖1)，且它的表達在附睪尾部受雄激素調控(圖2)。在大腸桿菌中表達了猴RNase9蛋白，用其免疫兔子，獲得了其多抗血清。發明人用Western blot在附睪體部檢測到一條26kd條帶(圖3)，由於大於預測條帶，提示它可能有糖基化存在。經用該抗體做免疫組化試驗，發現該蛋白在附睪體部主細胞表達，在附睪尾部部分主細胞表達(圖4)。
實施例3 RNase 9的抗菌活性試驗1)聲波破菌在含卡那黴素50微克/毫升、氯黴素33微克/毫升的表達培養基LB中，以37℃生長溫度、37℃誘導溫度以250-300rpm培養實施例1獲得的BL21-codon plus-RIL 5小時。4℃下放置10分鐘，收集菌體5000克。
將菌體重懸於含溶菌酶0.1mg/ml的裂解緩衝液(50mM Tris HCl pH 8.0、25％蔗糖(W/V)、1mM EDTA)中至至少1ml/g溼菌體，在冰上放置30分鐘。反覆凍融3次，冰浴，超聲破菌。加1體積的洗滌劑緩衝液(0.2M NaCl，1％脫氧膽酸(w/v)，1％NP-40(V/V))至裂解液中，室溫混勻1小時，15000g離心10分鐘，冷卻至4℃，棄上清。然後將沉澱物重懸於Triton X-100/EDTA(1％triton X-100(V/V)，1mM EDTA)，12000g下離心10分鐘，冷卻至4℃，棄上清。重複上步驟多次直至沉澱上不再有果醬樣的沉澱。
沉澱用1M尿素洗3-5次，離心同上，SDS-PAGE電泳檢查上清直到沒有可溶蛋白存在。沉澱保存-20℃。
2)蛋白復性將包涵體溶於8mM尿素、50mM Tris HCl，pH8.0、2mM EDTANa中，室溫振搖2小時。4℃下、12000g離心30分鐘。取上清，用bradford法測蛋白濃度。
取適量蛋白質尿素溶液，逐滴加入復性液(10mM trisHCl，0.5M Arg·HCl，2.5mM還原穀胱甘肽，0.6mM氧化穀胱甘肽，0.05mM EDTA，pH8.0)，磁力攪拌子輕攪。蛋白終濃度控制小於50ug/ml，4℃靜置24-48小時。
3)蛋白濃縮和過柱純化復性後的蛋白溶液12000g 30分鐘，4℃離心，上清對雙蒸水連續透析兩次，體積比1∶100，4℃下放置24小時。透析後的蛋白溶液-70℃冷凍，真空乾燥。
凍幹的蛋白重溶於適量的磷酸緩衝液，12000g離心15分鐘。離心上清過G-25或G-50脫去鹽和小分子，層析柱用pH 7.4的磷酸緩衝液平衡，用磷酸緩衝液過柱，用Bradford法測蛋白濃度，用SDS-PAGE檢查。
4)抗菌活性檢測將大腸桿菌K12D31在LB培養基中37℃ 250rpm培養至對數期，菌液4℃ 5000g離心10分鐘。去上清，菌體重懸於冰冷的10mM磷酸緩衝液。菌液4℃ 5000g離心10分鐘，去上清，菌體重懸於冰冷的10mM磷酸緩衝液。
測OD600nm，根據公式計算CFUS/ML＝OD600nm×2.5×108以磷酸緩衝液稀釋菌液至5～8×105cfus/ml，100ul菌液加等體積適當濃度的RNASE9溶液混勻，37℃培養2-3小時。混勻，以磷酸緩衝液作系列10倍梯度稀釋，各梯度取100ul菌液塗LB平板，37℃培養過夜。取50-400克隆之間的平板計數，根據稀釋度計算菌落數。結果顯示在下表1中(以100ul磷酸緩衝液作為對照，各樣品的菌落數與對照的菌落數之比為存活率)。
表130ug/ml50ug/ml 100ug/ml 150ug/ml200ug/ml101.0％69.7％ 26.0％1.50％ 0.
82.4％ 92.4％ 43.1％1.05％ 0.
87.9％ 79.9％ 67.0％5.59％ 0.
根據上表可以看出，本發明的RNase 9蛋白具有抗菌活性。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講述內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110中國科學院上海生命科學研究院120RNase 9蛋白及其編碼序列和用途130058371Z11609170PatentIn version 3.12101211205212PRT213智人(Homo sapiens)4001Met Met Arg Thr Leu Ile Thr Thr His Pro Leu Pro Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Pro Gln Gln Leu Leu Gln Leu Val Gln Phe Gln Glu Val Asp Thr Asp20 25 30Phe Asp Phe Pro Glu Glu Asp Lys Lys Glu Glu Phe Glu Glu Cys Leu35 40 45Glu Lys Phe Phe Ser Thr Gly Pro Ala Arg Pro Pro Thr Lys Glu Lys50 55 60Val Lys Arg Arg Val Leu Ile Glu Pro Gly Met Pro Leu Asn His Ile65 70 75 80Glu Tyr Cys Asn His Glu Ile Met Gly Lys Asn Val Tyr Tyr Lys His85 90 95Arg Trp Val Ala Glu His Tyr Phe Leu Leu Met Gln Tyr Asp Glu Leu100 105 110Gln Lys Ile Cys Tyr Asn Arg Phe Val Pro Cys Lys Asn Gly Ile Arg115 120 125Lys Cys Asn Arg Ser Lys Gly Leu Val Glu Gly Val Tyr Cys Asn Leu130 135 140Thr Glu Ala Phe Glu Ile Pro Ala Cys Lys Tyr Glu Ser Leu Tyr Arg145 150 155 160Lys Gly Tyr Val Leu Ile Thr Cys Ser Trp Gln Asn Glu Met Gln Lys165 170 175
Arg Ile Pro His Thr Ile Asn Asp Leu Val Glu Pro Pro Glu His Arg180 185 190Ser Phe Leu Ser Glu Asp Gly Val Phe Val Ile Ser Pro195 200 2052102211204212PRT213恆河猴(Rhesus)4002Met Met Arg Thr Pro Ile Thr Thr Tyr Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Gln Gln Leu Leu Gln Pro Val Gln Phe Gln Glu Val Asp Thr Gly20 25 30Phe Asp Ser Pro Asp Asp Asp Met Glu Glu Phe Glu Glu Tyr Leu Glu35 40 45Glu Phe His Arg Thr Gly Pro Thr Arg Pro Pro Thr Lys Glu Asn Val50 55 60Lys Arg Arg Val Ile Ile Glu Pro Gly Met Pro Leu Tyr Asp Arg Glu65 70 75 80Tyr Cys Asn Ala Glu Ile Met Arg Lys Asn Val Tyr His Lys Gln Arg85 90 95Cys Val Thr Glu His Tyr Phe Leu Leu Met Gln Tyr Asp Glu Leu Glu100 105 110Lys Ile Cys Tyr Asn Arg Ile Val Pro Cys Lys Asn Gly Val Arg Lys115 120 125Cys Asn Arg Ser Lys Gly Leu Val Glu Gly Val Tyr Cys Asn Leu Thr130 135 140Glu Ala Tyr Glu Ile Pro Trp Cys Arg Tyr Lys Ser Phe Tyr Arg Arg145 150 155 160Gly Tyr Val Leu Ile Thr Cys Ala Trp Gln Asn Glu Ile His Lys Leu165 170 175Ile Pro His Thr Ile Asn Asp Leu Val Glu Pro Pro Lys His Arg Ser180 185 190Phe Leu Asn Glu Asp Gly Val Phe Val Ile Pro Pro195 200
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221misc_feature223引物4009gcggccgcct agtgatggtg atggtgatgg ggcggtatga caaagac 4權利要求
1.一種分離的蛋白RNase 9，其特徵在於，所述蛋白包含選自以下的胺基酸序列，(a)選自序列表SEQ ID NO1或2所示的胺基酸序列；(b)相對於選自SEQ ID NO1或2所示的胺基酸序列有一個或多個胺基酸缺失、替代或插入且具有抗菌活性的胺基酸序列；(c)相對於選自SEQ ID NO1或2所示的胺基酸序列有90％以上同源性且具有抗菌活性的胺基酸序列。
2.根據權利要求1所述的分離的蛋白，其特徵在於，所述蛋白具有SEQ ID NO3所示的胺基酸序列。
3.一種分離的核苷酸序列或其互補序列，其特徵在於，所述核苷酸序列編碼權利要求1所述的蛋白。
4.根據權利要求3所述的分離的核苷酸序列，其特徵在於，所述核苷酸序列具有選自SEQ ID NO4或5的核苷酸序列。
5.一種構建物，其特徵在於，所述構建物含有權利要求3所述的核苷酸序列。
6.一種細胞，其特徵在於，所述細胞含有權利要求1所述的蛋白、權利要求3所述的核苷酸序列或權利要求5所述的構建物。
7.一種製備權利要求1所述的蛋白的方法，其特徵在於，該方法包括(a)在適合權利要求1所述的蛋白表達的條件下，培養權利要求6所述的細胞；(b)分離出權利要求1所述的蛋白。
8.一種抗體，其特徵在於，它與權利要求1所述的蛋白特異性結合。
9.權利要求1所述的分離的蛋白、權利要求3所述的分離的核苷酸序列、權利要求5所述的構建物或權利要求6所述的細胞在製備抗菌藥物中的用途。
10.一種抗菌藥物組合物，其特徵在於，所述組合物包含權利要求1所述的分離的蛋白、權利要求3所述的分離的核苷酸序列、權利要求5所述的構建物或權利要求6所述的細胞，以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明涉及了一種蛋白RNase 9，所述蛋白包含選自SEQ ID NO1或2所示的胺基酸序列，本發明還涉及所述蛋白的核苷酸序列、構建物、製備方法、組合物和應用。所述蛋白具有抗菌活性，能夠用於治療感染，尤其是泌尿生殖感染。
文檔編號C12N15/12GK101016333SQ200610023799
公開日2007年8月15日 申請日期2006年2月9日 優先權日2006年2月9日
發明者張永蓮, 刁華, 劉強 申請人:中國科學院上海生命科學研究院