基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白及其製備方法和應用的製作方法

2024-01-28 11:22:15 1

專利名稱：基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因重組融合蛋白，特別是鹼性成纖維細胞生長因子與膠原蛋白融合蛋白。
背景技術：
喊性成纖維細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor, bFGF),是成纖維生長因子家族中的一員，最初是從牛腦垂體中提取得到的，因其能促進成纖維細胞增殖，且等電點為9. 6，故將其稱之為鹼性成纖維細胞生長因子。鹼性成纖維細胞生長因子由155個
胺基酸組成，分子量約為18kD，對熱不穩定，易被蛋白酶降解，它廣泛存在於來源於中胚層及神經外胚層的細胞及多種腫瘤細胞中，是一種能促進中胚層及神經外胚層細胞增殖的多肽生長因子。在生物進化上，鹼性成纖維細胞生長因子具有很強的保守性，人和牛的鹼性成纖維細胞生長因子只有兩個胺基酸不同，其胺基酸同源性高達98. 7%。鹼性成纖維細胞生長因子的活性半衰期只有幾個小時，在體內作用的發揮，需持續長時間與靶細胞上的高親和力受體結合。成纖維細胞生長因子受體是一類具有自主性磷酸化活性的跨膜糖基化受體，鹼性成纖維細胞生長因子與之結合後激活受體細胞內酪氨酸激酶活性區，從而引起一系列信號傳遞。鹼性成纖維細胞生長因子發揮作用還離不開低親和力受體，即硫酸乙醯肝素蛋白聚糖的輔助，硫酸乙醯肝素蛋白聚糖具有促進鹼性成纖維細胞生長因子與成纖維細胞生長因子受體結合、增強鹼性成纖維細胞生長因子穩定性、調節鹼性成纖維細胞生長因子活性等生物學作用。鹼性成纖維細胞生長因子是一種具有廣泛生物活性的生長因子，實驗證實，鹼性成纖維細胞生長因子能有效促進新生血管的形成如毛細血管基底膜降解、內皮細胞遷移增生和膠原的合成等；能通過趨化作用和促細胞遷移作用引導巨噬細胞、間充質細胞、內皮細胞、成纖維細胞等向創傷部位聚集，啟動創傷癒合過程，從而促進軟組織損傷的修復；能促進軟骨細胞產生硫酸軟骨蛋白聚糖、II型膠原，使其維持分化形態，從而促進骨組織損傷的修復；也能促進神經軸突生長，延長神經細胞的存活期，營養神經，從而修復神經組織損傷；還能促進肢體再生。體內實驗證明，鹼性成纖維細胞生長因子對去神經支配的兩棲動物類肢體再生胚基有促進作用。近些年來，重組鹼性成纖維細胞生長因子還被廣泛應用於臨床治療創傷、潰瘍及神經系統等疾病,但表達量普遍低下而使其生產成本相對較高。膠原蛋白(collagen)是體內含量最多的一種蛋白質，其對維護細胞、組織、器官的正常生理功能和損傷修復有重要作用。另外，膠原蛋白具有良好的細胞粘附性，與細胞結合對細胞遷移、膠原分解代謝以及血小板凝聚具有一定的作用。鑑於膠原蛋白固有的生物兼容性、生物降解性和吸收性以及促細胞形成等諸多功能，在生物醫用材料、組織工程、化妝品等領域具有廣泛的應用價值。鹼性成纖維細胞生長因子作為一種臨床上治療各種創傷、燒燙傷、潰瘍等的有效藥物，與膠原蛋白結合製成的新型生物活性材料，具有快速止血、力口速創面癒合和促進組織修復等功能，其在重度滲血創面的止血癒合、婦科宮頸糜爛的治療及牙周組織再生等臨床試驗中取得顯著效果。

發明內容
本發明所要解決的一個技術問題在於提供一種用途廣、使用效果好的基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白。本發明所要解決的另一個技術問題在於提供一種快速、簡便的基因重組人型活性 鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白的製備方法。本發明還要解決的還有一個技術問題在於為基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白提供一種新用途。解決上述技術問題採用的技術方案是該融合蛋白全長762個胺基酸，氮端為I型人膠原蛋白500-1099肽段共600個胺基酸，碳端為人鹼性成纖維細胞因子共154個胺基酸，兩個肽段之間用穀氨酸和苯丙氨酸以及一個含6個胺基酸的柔性肽段連接，該融合蛋白胺基酸序列如下I GVAGPKGPAG ERGSPGPAGP KGSPGEAGRP GEAGLPGAKG LTGSPGSPGP DGKTGPPGPA61 GQDGRPGPPG PPGARGQAGV MGFPGPKGAA GEPGKAGERG VPGPPGAVGP AGKDGEAGAQ121 GPPGPAGPAG ERGEQGPAGS PGFQGLPGPA GPPGEAGKPG EQGVP⑶LGA PGPSGARGER181 GFPGERGVQG PPGPAGPRGA NGAPGNDGAK GDAGAPGAPG SQGAPGLQGM PGERGAAGLP241 GPKGDRGDAG PKGADGSPGK DGVRGLTGPI GPPGPAGAPG DKGESGPSGP AGPTGARGAP301 ⑶RGEPGPPG PAGFAGPPGA DGQPGAKGEP GDAGAKGDAG PPGPAGPAGP PGPIGNVGAP361 GAKGARGSAG PPGATGFPGA AGRVGPPGPS GNAGPPGPPG PAGKEGGKGP RGETGPAGRP421 GEVGPPGPPG PAGEKGSPGA DGPAGAPGTP GPQGIAGQRG VVGLPGQRGE RGFPGLPGPS481 GEPGKQGPSG ASGERGPPGP MGPPGLAGPP GESGREGAPG AEGSPGRDGS PGAKGDRGET541 GPAGPPGAPG APGAPGPVGP AGKS⑶RGET GPAGPAGPVG PVGARGPAGP QGPRGDKGET601 EFGGSGGSAA GSITTLPALP EDGGSGAFPP GHFKDPKRLY CKNGGFFLRI HPDGRVDGVR661 EKSDPHIKLQ LQAEERGVVS IKGVCANRYL AMKEDGRLLA SKCVTDECFF FERLESNNYN721 TYRSRKYTSff YVALKRTGQY KLGSKTGPGQ KAILFLPMSA KS本發明的柔性肽段的胺基酸序列為Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser。上述基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白的製備方法包括下述步驟I、基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白表達載體的構建I. I基因的獲得從離體的人胎盤組織中提取總RNA，反轉錄獲得cDNA，根據I型人膠原蛋白及鹼性成纖維細胞生長因子基因序列，設計PCR擴增引物，引入限制性酶切位點Xho I , EcoRI、Not I和信號肽切割位點AAACGAGAAGCT，鹼性成纖維細胞生長因子上遊添加柔性肽序列 GGAGGAAGCGGAGGAAGC。I型人膠原蛋白(C0L600)的引物序列為F:CGCTCGAGAAACGAGAAGCTGGTGTTGCTGGTCCCAR:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)的引物序列為
F:GCGAATTCGGAGGAAGCGGAGGAAGCGCAGCCGGGAGCATCR:ATGCGGCCGCTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAA採用PCR方法擴增獲得I型人膠原蛋白和鹼性成纖維細胞生長因子基因。I. 2載體pPIC9K與I型人膠原蛋白和鹼性成纖維細胞生長因子的連接對pPIC9K及I型人膠原蛋白進行Xho I和EcoR I雙酶切，回收酶切產物，用DNA連接酶連接，並轉化大腸桿菌，提取質粒，命名為PPIC9K-C0L600 d#pPIC9K-C0L600質粒與鹼性成纖維細胞生長因子分別進行EcoR I及Not I雙酶切，回收酶切產物，用DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌，提取質粒，命名為pPIC9K-C0L600-6P-bFGF ;該重組DNA序列如下PPIC9K載體購置於Invitrogen公司。該重組DNA序列如下I CTCGAGMAC GAGAAGCTGG TGTTGCTGGT CCCAAGGGTC CCGCTGGTGA ACGTGGTTCT61 CCTGGCCCTG CTGGCCCCAA AGGATCTCCT GGTGMGCTG GTCGTCCCGG TGAAGCTGGT121 CTGCCTGGTG CCAAGGGTCT GACTGGAAGC CCTGGCAGCC CTGGTCCTGA TGGCAAAACT181 GGCCCCCCTG GTCCCGCCGG TCAAGATGGT CGCCCCGGAC CCCCAGGCCC ACCTGGTGCC241 CGTGGTCAGG CTGGTGTGAT GGGATTCCCT GGACCTAAAG GTGCTGCTGG AGAGCCCGGC301 AAGGCTGGAG AGCGAGGTGT TCCCGGACCC CCTGGCGCTG TCGGTCCTGC TGGCAAAGAT361 GGAGAGGCTG GAGCTCAGGG ACCCCCTGGC CCTGCTGGTC CCGCTGGCGA GAGAGGTGM421 CMGGCCCTG CTGGCTCCCC CGGATTCCAG GGTCTCCCTG GTCCTGCTGG TCCTCCAGGT481 GMGCAGGCA MCCTGGTGA ACAGGGTGTT CCTGGAGACC TTGGCGCCCC TGGCCCCTCT541 GGAGCAAGAG GCGAGAGAGG TTTCCCTGGC GAGCGTGGTG TGCAAGGTCC CCCTGGTCCT601 GCTGGTCCCC GAGGGGCCAA CGGTGCTCCC GGCAACGATG GTGCTMGGG TGATGCTGGT661 GCCCCTGGAG CTCCCGGTAG CCAGGGCGCC CCTGGCCTTC AGGGMTGCC TGGTGAACGT721 GGTGCAGCTG GTCTTCCAGG GCCTAAGGGT GACAGAGGTG ATGCTGGTCC CAAAGGTGCT781 GATGGCTCTC CTGGCAMGA TGGCGTCCGT GGTCTGACTG GCCCCATTGG TCCTCCTGGC841 CCTGCTGGTG CCCCTGGTGA CAAGGGTGAA AGTGGTCCCA GCGGCCCTGC TGGTCCCACT901 GGAGCTCGTG GTGCCCCCGG AGACCGTGGT GAGCCTGGTC CCCCCGGCCC TGCTGGCTTT961 GCTGGCCCCC CTGGTGCTGA CGGCCMCCT GGTGCTAAAG GCGAACCTGG TGATGCTGGT1021 GCTAAAGGCG ATGCTGGTCC CCCTGGCCCT GCCGGACCCG CTGGACCCCC TGGCCCCATT1081 GGTAATGTTG GTGCTCCTGG AGCCAMGGT GCTCGCGGCA GCGCTGGTCC CCCTGGTGCT1141 ACTGGTTTCC CTGGTGCTGC TGGCCGAGTC GGTCCTCCTG GCCCCTCTGG AAATGCTGGA1201 CCCCCTGGCC CTCCTGGTCC TGCTGGCAAA GAAGGCGGCA AAGGTCCCCG TGGTGAGACT1261 GGCCCTGCTG GACGTCCTGG TGAAGTTGGT CCCCCTGGTC CCCCTGGCCC TGCTGGCGAG1321 AMGGATCCC CTGGTGCTGA TGGTCCTGCT GGTGCTCCTG GTACTCCCGG GCCTCAAGGT1381 ATTGCTGGAC AGCGTGGTGT GGTCGGCCTG CCTGGTCAGA GAGGAGAGAG AGGCTTCCCT1441 GGTCTTCCTG GCCCCTCTGG TGAACCTGGC AAACMGGTC CCTCTGGAGC AAGTGGTGM1501 CGTGGTCCCC CTGGTCCCAT GGGCCCCCCT GGATTGGCTG GACCCCCTGG TGMTCTGGA
、
1561 CGTGAGGGGG CTCCTGGTGC CGAAGGTTCC CCTGGACGAG ACGGTTCTCC TGGCGCCAAG1621 GGTGACCGTG GTGAGACCGG CCCCGCTGGA CCCCCTGGTG CTCCTGGTGC TCCTGGTGCC1681 CCTGGCCCCG TTGGCCCTGC TGGCAAGAGT GGTGATCGTG GTGAGACTGG TCCTGCTGGT1741 CCCGCCGGTC CTGTCGGCCC TGTTGGCGCC CGTGGCCCCG CCGGACCCCA AGGCCCCCGT
1801 GGTGACMGG GTGAGACAGA ATTCGGAGGA AGCGGAGGAA GCGCAGCCGG GAGCATCACC1861 ACGCTGCCCG CCTTGCCCGA GGATGGCGGC AGCGGCGCCT TCCCGCCCGG CCACTTCAAG1921 GACCCCMGC GGCTGTACTG CAAAAACGGG GGCTTCTTCC TGCGCATCCA CCCCGACGGC1981 CGAGTTGACG GGGTCCGGGA GAAGAGCGAC CCTCACATCA AGCTACAACT TCAAGCAGM2041 GAGAGAGGAG TTGTGTCTAT CAAAGGAGTG TGTGCTAACC GTTACCTGGC TATGAAGGM2101 GATGGAAGAT TACTGGCTTC TAAATGTGTT ACGGATGAGT GTTTCTTTTT TGAACGATTG2161 GMTCTMTA ACTACAATAC TTACCGGTCA AGGAMTACA CCAGTTGGTA TGTGGCACTG2221 AMCGAACTG GGCAGTATAA ACTTGGATCC AAAACAGGAC CTGGGCAGAA AGCTA·TACTT2281 TTTCTTCCAA TGTCTGCTAA GAGCTGAGCGGCC GC2、畢赤酵母電轉化將10 ii g經Sal I內切酶線性化的pPIC9K-C0L600-6P_bFGF質粒，與80 ii L畢赤酵母GSl 15感受態細胞混勻，其它畢赤酵母感受態細胞也可使用，如SMDl 168、KM71，轉至0. 2cm冰預冷的電轉化杯中，電擊4 10毫秒，加入ImL冰預冷的lmol/L的山梨醇溶液將菌體混勻，塗布MD培養基平板，30°C倒置培養2 3天，在MD培養基平板上長出菌落。畢赤酵母GS115購買於西安依科西安依科生物技術有限公司。3、多拷貝插入重組子的篩選將MD培養基平板上長出的菌落用無菌牙籤對應接種到G418濃度分別為0. 5g/L、lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，G418購買於西安依科生物技術有限公司，30°C培養，篩選獲得轉化子。4、基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白的發酵將篩選到的轉化子接種於400ml BMGY培養基中，30°C振蕩培養24小時，作為一級種子轉接於裝有4L FBS培養基的5L發酵罐中，溫度設定為30°C，pH值為5.0，培養16 20小時，作為二級種子轉接入裝有FBS培養基的150L大罐發酵，生長溫度30°C，誘導溫度29°C, pH值為5. 5，溶氧控制在20% 30%，流加入質量濃度為75%的含12mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液，FBS培養基與質量濃度為75%的含12mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液的體積比為1:0. 25，誘導發酵36 42小時；5、基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白的純化發酵液經離心進行固液分離，取上清液，對發酵上清液用截留分子量為100KD中空纖維超濾系統進行超濾，收集濾過液，再用截留分子量為20KD的中空纖維超濾系統進行超濾，收集濃縮液，冷凍乾燥，製備成基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白。6、基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白的檢測將純化前、純化後的基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白使用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測方法進行檢測。基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白在製備化妝品中的用途。基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白在製備化妝品中使用，所製備的IOOg化妝品由下述質量配比的原料按化妝品水劑常規方法製成規人型訴性鹼性成纖維_瞻生K因子融合蛋S0,01 0. (Mg
卄油2.0 l(U)g
111-SIWI3.0-6. Og
P^f**1.0 4. Og
水溶性霍霍巴_0. 2-0. 7g
透明質KW (估 0.2g
IIMttrtv Jo. 01-0.03g
氬他蕩麻111. I 0. 2g
水加個:IOOg.基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白在製備化妝品中使用，所製備的IOOg化妝品由下述最佳質量配比的原料按化妝品水劑常規方法製成
■對遺組人型丨甜養性成纖維細胞屮長W P融介進「I0.02g
It'Vll!5. Og
嶋_5. Og
P ~W 聚糖3. Og
^ClSt 剛;:13議『Sg
透賴盾酸_0, Ig
IiFItt, 丁酸 0.02g
MMM嘗A0. Ig
水加至IOOg=採用本發明方法所製備的基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白，檢測其生物活性，表明基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白與鹼性成纖維細胞生長因子標品具有相似的促細胞增殖的活性；經皮膚致敏性試驗，表明基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白無致敏性。


圖I是實施例I中重組表達載體pPIC9K-C0L600-6P_bFGF的質粒圖譜。圖2是實施例I中I型人膠原蛋白與鹼性成纖維細胞生長因子基因的PCR產物電泳圖。圖3是實施例I中pPIC9K-C0L600-6P_bFGF質粒雙酶切鑑定電泳圖。圖4是實施例I中基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳圖。圖5是實施例I中基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白的MTT細胞增殖活性圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限於這些實施例。實施例I本實施例的基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白的全長762個胺基酸，氮端為I型人膠原蛋白500-1099肽段共600個胺基酸，碳端為人鹼性成纖維細胞因子共154個胺基酸，兩個肽段之間用穀氨酸和苯丙氨酸以及一個含6個胺基酸的柔性肽段連接，該融合蛋白胺基酸序列如下I GVAGPKGPAG ERGSPGPAGP KGSPGEAGRP GEAGLPGAKG LTGSPGSPGP DGKTGPPGPA61 GQDGRPGPPG PPGARGQAGV MGFPGPKGAA GEPGKAGERG VPGPPGAVGP AGKDGEAGAQ121 GPPGPAGPAG ERGEQGPAGS PGFQGLPGPA GPPGEAGKPG EQGVP⑶LGA PGPSGARGER181 GFPGERGVQG PPGPAGPRGA NGAPGNDGAK GDAGAPGAPG SQGAPGLQGM PGERGAAGLP241 GPKGDRGDAG PKGADGSPGK DGVRGLTGPI GPPGPAGAPG DKGESGPSGP AGPTGARGAP301 ⑶RGEPGPPG PAGFAGPPGA DGQPGAKGEP GDAGAKGDAG PPGPAGPAGP PGPIGNVGAP361 GAKGARGSAG PPGATGFPGA AGRVGPPGPS GNAGPPGPPG PAGKEGGKGP RGETGPAGRP
421 GEVGPPGPPG PAGEKGSPGA DGPAGAPGTP GPQGIAGQRG VVGLPGQRGE RGFPGLPGPS481 GEPGKQGPSG ASGERGPPGP MGPPGLAGPP GESGREGAPG AEGSPGRDGS PGAKGDRGET541 GPAGPPGAPG APGAPGPVGP AGKS⑶RGET GPAGPAGPVG PVGARGPAGP QGPRGDKGET601 EFGGSGGSAA GSITTLPALP EDGGSGAFPP GHFKDPKRLY CKNGGFFLRI HPDGRVDGVR661 EKSDPHIKLQ LQAEERGVVS IKGVCANRYL AMKEDGRLLA SKCVTDECFF FERLESNNYN721 TYRSRKYTSff YVALKRTGQY KLGSKTGPGQ KAILFLPMSA KS上述的柔性肽段的胺基酸序列為Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser。上述基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白的製備方法包括下述步驟I、基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白表達載體的構建構建載體的質粒圖譜見圖1，基因序列如下I CTCGAGAAAC GAGAAGCTGG TGTTGCTGGT CCCAAGGGTC CCGCTGGTGA ACGTGGTTCT61 CCTGGCCCTG CTGGCCCCAA AGGATCTCCT GGTGAAGCTG GTCGTCCCGG TGAAGCTGGT121 CTGCCTGGTG CCAAGGGTCT GACTGGAAGC CCTGGCAGCC CTGGTCCTGA TGGCAAAACT181 GGCCCCCCTG GTCCCGCCGG TCAAGATGGT CGCCCCGGAC CCCCAGGCCC ACCTGGTGCC241 CGTGGTCAGG CTGGTGTGAT GGGATTCCCT GGACCTAAAG GTGCTGCTGG AGAGCCCGGC301 AAGGCTGGAG AGCGAGGTGT TCCCGGACCC CCTGGCGCTG TCGGTCCTGC TGGCAAAGAT361 GGAGAGGCTG GAGCTCAGGG ACCCCCTGGC CCTGCTGGTC CCGCTGGCGA GAGAGGTGAA421 CAAGGCCCTG CTGGCTCCCC CGGATTCCAG GGTCTCCCTG GTCCTGCTGG TCCTCCAGGT481 GAAGCAGGCA AACCTGGTGA ACAGGGTGTT CCTGGAGACC TTGGCGCCCC TGGCCCCTCT541 GGAGCAAGAG GCGAGAGAGG TTTCCCTGGC GAGCGTGGTG TGCAAGGTCC CCCTGGTCCT601 GCTGGTCCCC GAGGGGCCAA CGGTGCTCCC GGCAACGATG GTGCTAAGGG TGATGCTGGT661 GCCCCTGGAG CTCCCGGTAG CCAGGGCGCC CCTGGCCTTC AGGGAATGCC TGGTGAACGT
721 GGTGCAGCTG GTCTTCCAGG GCCTAAGGGT GACAGAGGTG ATGCTGGTCC CAAAGGTGCT781 GATGGCTCTC CTGGCAMGA TGGCGTCCGT GGTCTGACTG GCCCCATTGG TCCTCCTGGC841 CCTGCTGGTG CCCCTGGTGA CAAGGGTGAA AGTGGTCCCA GCGGCCCTGC TGGTCCCACT901 GGAGCTCGTG GTGCCCCCGG AGACCGTGGT GAGCCTGGTC CCCCCGGCCC TGCTGGCTTT961 GCTGGCCCCC CTGGTGCTGA CGGCCMCCT GGTGCTAAAG GCGAACCTGG TGATGCTGGT1021 GCTAAAGGCG ATGCTGGTCC CCCTGGCCCT GCCGGACCCG CTGGACCCCC TGGCCCCATT1081 GGTAATGTTG GTGCTCCTGG AGCCAMGGT GCTCGCGGCA GCGCTGGTCC CCCTGGTGCT1141 ACTGGTTTCC CTGGTGCTGC TGGCCGAGTC GGTCCTCCTG GCCCCTCTGG AAATGCTGGA1201 CCCCCTGGCC CTCCTGGTCC TGCTGGCAAA GAAGGCGGCA AAGGTCCCCG TGGTGAGACT1261 GGCCCTGCTG GACGTCCTGG TGAAGTTGGT CCCCCTGGTC CCCCTGGCCC TGCTGGCGAG1321 AMGGATCCC CTGGTGCTGA TGGTCCTGCT GGTGCTCCTG GTACTCCCGG GCCTCAAGGT1381 ATTGCTGGAC AGCGTGGTGT GGTCGGCCTG CCTGGTCAGA GAGGAGAGAG AGGCTTCCCT1441 GGTCTTCCTG GCCCCTCTGG TGAACCTGGC AAACMGGTC CCTCTGGAGC AAGTGGTGM1501 CGTGGTCCCC CTGGTCCCAT GGGCCCCCCT GGATTGGCTG GACCCCCTGG TGAATCTGGA1561 CGTGAGGGGG CTCCTGGTGC CGAAGGTTCC CCTGGACGAG ACGGTTCTCC TGGCGCCAAG1621 GGTGACCGTG GTGAGACCGG CCCCGCTGGA CCCCCTGGTG CTCCTGGTGC TCCTGGTGCC1681 CCTGGCCCCG TTGGCCCTGC TGGCAAGAGT GGTGATCGTG GTGAGACTGG TCCTGCTGGT1741 CCCGCCGGTC CTGTCGGCCC TGTTGGCGCC CGTGGCCCCG CCGGACCCCA AGGCCCCCGT1801 GGTGACMGG GTGAGACAGA ATTCGGAGGA AGCGGAGGAA GCGCAGCCGG GAGCATCACC1861 ACGCTGCCCG CCTTGCCCGA GGATGGCGGC AGCGGCGCCT TCCCGCCCGG CCACTTCAAG1921 GACCCCMGC GGCTGTACTG CAAAAACGGG GGCTTCTTCC TGCGCATCCA CCCCGACGGC
1981 CGAGTTGACG GGGTCCGGGA GAAGAGCGAC CCTCACATCA AGCTACAACT TCAAGCAGM2041 GAGAGAGGAG TTGTGTCTAT CAAAGGAGTG TGTGCTAACC GTTACCTGGC TATGAAGGM2101 GATGGAAGAT TACTGGCTTC TAAATGTGTT ACGGATGAGT GTTTCTTTTT TGAACGATTG2161 GMTCTMTA ACTACAATAC TTACCGGTCA AGGAMTACA CCAGTTGGTA TGTGGCACTG2221 AMCGAACTG GGCAGTATAA ACTTGGATCC AAAACAGGAC CTGGGCAGAA AGCTATACTT2281 TTTCTTCCAA TGTCTGCTAA GAGCTGAGCGGCC GCI. I基因的獲得從離體的人胎盤組織中提取總RNA,採用GeneCopoeia First-Strand cDNAsynthesis Kit試劑盒按說明書的使用方法進行反轉錄，獲得cDNA, GeneCopoeiaFirst-Strand cDNA synthesisKit試劑盒由西安依科生物技術有限公司銷售。根據I型人膠原蛋白及鹼性成纖維細胞生長因子基因序列，設計PCR擴增引物，引入限制性酶切位點Xho I、EcoR I、Not I和信號肽切割位點AAACGAGAAGCT，鹼性成纖維細胞生長因子上遊添加柔性肽序列GGAGGAAGCGGAGGAAGC。I型人膠原蛋白(C0L600)的引物序列為F:CGCTCGAGAAACGAGAAGCTGGTGTTGCTGGTCCCAR:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)的引物序列為F:GCGAATTCGGAGGAAGCGGAGGAAGCGCAGCCGGGAGCATC
R:ATGCGGCCGCTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAA251^反應體系中含有13.31^滅菌的雙蒸水、2.511110\ 0 buffer，3. 5 ii L2m mol/LdNTP Mix, 2. 5 u L MgCl2,1 u LlO u mol/L Primer F, I u LlO u mol/L Primer R,0. 2u L 0. 5U/ii LTaq 酶，I ii L cDNA 模板。反應條件為95 °C 5min，94 °C 30s，56 °C 30s，72°C 60s, 30 個循環，72°C 10min,4°C lOmin，利用 PCR 儀進行擴增。I型人膠原蛋白和鹼性成纖維細胞生長因子的PCR擴增結果見圖2。I. 2載體pPIC9K和I型人膠原蛋白的雙酶切對pPIC9K和I型人膠原蛋白PCR產物利用Xho I和EcoR I內切酶進行雙酶切。雙酶切體系如下
權利要求
1.一種基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白，其特徵在於該融合蛋白全長762個胺基酸,氮端為I型人膠原蛋白500-1099肽段共600個胺基酸,碳端為人鹼性成纖維細胞因子共154個胺基酸，兩個肽段之間用穀氨酸和苯丙氨酸以及一個含6個胺基酸的柔性肽段連接，該融合蛋白胺基酸序列如下I GVAGPKGPAG ERGSPGPAGP KGSPGEAGRP GEAGLPGAKG LTGSPGSPGP DGKTGPPGPA61 GQDGRPGPPG PPGARGQAGV MGFPGPKGAA GEPGKAGERG VPGPPGAVGP AGKDGEAGAQ121 GPPGPAGPAG ERGEQGPAGS PGFQGLPGPA GPPGEAGKPG EQGVP⑶LGA PGPSGARGER181 GFPGERGVQG PPGPAGPRGA NGAPGNDGAK GDAGAPGAPG SQGAPGLQGM PGERGAAGLP241 GPKGDRGDAG PKGADGSPGK DGVRGLTGPI GPPGPAGAPG DKGESGPSGP AGPTGARGAP301 ⑶RGEPGPPG PAGFAGPPGA DGQPGAKGEP GDAGAKGDAG PPGPAGPAGP PGPIGNVGAP361 GAKGARGSAG PPGATGFPGA AGRVGPPGPS GNAGPPGPPG PAGKEGGKGP RGETGPAGRP421 GEVGPPGPPG PAGEKGSPGA DGPAGAPGTP GPQGIAGQRG VVGLPGQRGE RGFPGLPGPS481 GEPGKQGPSG ASGERGPPGP MGPPGLAGPP GESGREGAPG AEGSPGRDGS PGAKGDRGET541 GPAGPPGAPG APGAPGPVGP AGKS⑶RGET GPAGPAGPVG PVGARGPAGP QGPRGDKGET601 EFGGSGGSAA GSITTLPALP EDGGSGAFPP GHFKDPKRLY CKNGGFFLRI HPDGRVDGVR661 EKSDPHIKLQ LQAEERGVVS IKGVCANRYL AMKEDGRLLA SKCVTDECFF FERLESNNYN721 TYRSRKYTSff YVALKRTGQY KLGSKTGPGQ KAILFLPMSA KS
2.根據權利要求I所述的基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白，其特徵在於所述的柔性肽段的胺基酸序列為Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser。
3.—種權利要求I基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白的製備方法，其特徵在於它包括下述步驟 (I)基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白表達載體的構建 I. I基因的獲得 從離體的新生兒胎盤組織中提取總RNA，反轉錄獲得cDNA，根據I型人膠原蛋白及鹼性成纖維細胞生長因子基因序列，設計PCR擴增引物，引入限制性酶切位點Xho I , EcoRI、Not I和信號肽切割位點AAACGAGAAGCT，鹼性成纖維細胞生長因子上遊添加柔性肽序列 GGAGGAAGCGGAGGAAGC ； I型人膠原蛋白的引物序列為F:CGCTCGAGAAACGAGAAGCTGGTGTTGCTGGTCCCAR:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG鹼性成纖維細胞生長因子的引物序列為F:GCGAATTCGGAGGAAGCGGAGGAAGCGCAGCCGGGAGCATCR:ATGCGGCCGCTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAA 採用PCR方法擴增獲得I型人膠原蛋白和鹼性成纖維細胞生長因子基因； I. 2載體pPIC9K與I型人膠原蛋白及鹼性成纖維細胞生長因子的連接對pPIC9K及I型人膠原蛋白進行Xho I和EcoR I雙酶切，回收酶切產物，用DNA連接酶連接，並轉化大腸桿菌，提取質粒，命名為PPIC9K-C0L600 d#pPIC9K-C0L600質粒與鹼性成纖維細胞生長因子分別進行EcoR I及Not I雙酶切，回收酶切產物，用DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌，提取質粒，命名為pPIC9K-C0L600-6P-bFGF ;該重組DNA序列 如下
4.權利要求I的基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白在製備化妝品中的用途。
5.根據權利要求4所述的基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白在製備化妝品中的用途，其特徵在於所製備的IOOg化妝品由下述質量配比的原料按化妝品水劑的常規方法製成 基因靈組入遲生長_子Bi合蛋Sa Oi ~, 03g IIlllf2,0 10. Og 山梨糖醇3. 0 6. Og1.0-4. Og 水溶性 崔巴油0. 2~. Ig 遞_質酸_0.05-0.2g iiw候醇1基氨￥觀_0. (I I (I. OSg氫化蓮麻_0.卜0. 2g水加個:IOOg0
6.按照權利要求5所述的基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白在製備化妝品中的用途，其特徵在於所製備的IOOg化妝品由下述質量配比的原料按化妝品水劑的常規方法製成
全文摘要
一種基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白，該融合蛋白全長762個胺基酸，氮端為Ⅰ型人膠原蛋白500-1099肽段共600個胺基酸，碳端為人鹼性成纖維細胞因子共154個胺基酸，兩個肽段之間用穀氨酸和苯丙氨酸以及一個含6個胺基酸的柔性肽段連接。製備方法包括基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白表達載體的構建、畢赤酵母電轉化、多拷貝插入重組子的篩選、基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白的發酵、基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白的純化步驟。基因重組人型活性鹼性成纖維細胞生長因子融合蛋白用於製備化妝品。
文檔編號A61Q19/00GK102675473SQ201210139430
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月7日 優先權日2012年5月7日
發明者侯增淼, 李哲, 李曉穎, 趙金禮, 高恩 申請人:西安華澳麗康生物工程有限公司