抑制由鹼性成纖維細胞生長因子誘導的細胞增殖及血管增生的環肽的製作方法

2024-01-28 11:11:15

專利名稱：抑制由鹼性成纖維細胞生長因子誘導的細胞增殖及血管增生的環肽的製作方法
技術領域：
本發明屬於肽技術領域，具體而言，本發明涉及環(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Se r-Pro-Leu-Leu-Gln )肽，其可用於抑制由bFGF誘導的細胞增殖和血管增生以及用於治療結 腸癌等方面的應用。本發明還涉及了包含該環肽的藥物組合物和製備方法等。
背景技術：
哺乳動物成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factors, FGFs)家族由至 少23個結構相關的多肽(FGF1-23)組成，是一類對來源於中胚層和神經外胚層的多種類 型的細胞具有廣泛的生物學活性的細胞生長因子，酸性FGF (aFGF)和鹼性FGF (bFGF) 被認為是整個FGFs蛋白家族的原型。其中，bFGF是一類廣泛存在於體內多種組織的多 肽生長因子，在組織修復、創傷癒合、胚胎發育、成骨分化、血管增生等方面起著重要的作 用。bFGF在體內分布廣泛且具有多種重要的生物學功能，其時空表達及表達水平受到嚴 謹的調控。研究表明，由於bFGF具有促進多種細胞增殖及促血管增生等作用，bFGF表達 的異常上調會引發多種病變,如腫瘤等(參見Rusnati M, Presta M. Fibroblast growth factors/fibroblast growth factor receptors as targets for the development of anti-angiogenesis strategies. Curr Pharm Des, 2007, 13: 2025-2044 ；Cronauer MV, Schulz WA, Seifert HH, et al. Fibroblast growth factors and their receptors in urological cancers: basic research and clinical implications. Eur Urol, 2003, 43: 309-319 MR, Gross JL, Herblin WF, Dusak BA, et al. Effects of modulation of basic fibroblast growth factor on tumor growth in vivo. J Natl Cancer Inst, 1993， 85: 121-131)。經過長期艱苦的研究，並結合一些篩選的運氣，本發明人獲得了一種環肽，令人驚 訝的是，其能夠有效抑制由bFGF誘導的細胞增殖，尤其是抑制由bFGF誘導的腫瘤細胞的增 殖，同時也能抗血管增生，從而可用於治療結腸癌等腫瘤。該肽可以採用現有技術合成，成 本低，但是效果好，適用範圍廣。

發明內容
本發明的目的在於提供一種環肽及其衍生物，其有益效果在於能夠有效抑制由 bFGF誘導的細胞增殖，尤其是抑制由bFGF誘導的腫瘤細胞的增殖，同時也能抗血管增生， 從而可用於治療結腸癌等腫瘤；另外，該肽可以採用現有技術合成，成本低，但是效果好，適 用範圍廣。具體而言，在第一個方面，本發明提供了環(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)肽或其藥學上可接受的鹽或酯。本文中的環肽可以用「環(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)」或 "cyclo (Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)"來互換表示，均指的是如下式所示的環肽
'-Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-'
環(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)中各胺基酸殘基之間通常是通 過肽鍵相連的，儘管其他鍵相連的肽也涵蓋在本發明的範圍內。優選在本發明的第一方面 中，環(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)是由 Ala 的氨基和 Gln 的羧基 形成肽鍵而環化形成的。在本發明的具體實施方式
中，環(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)中任意兩個相鄰的胺基酸都是通過肽鍵相連的。本文中所使用的肽及胺基酸、胺基酸殘基和化學基團的表示方法均為所屬領域公 認的表示方法。其中胺基酸或胺基酸殘基的縮寫可參照表1中定義，這些縮寫可以指L-型 的胺基酸，也可以指D-型的胺基酸。在本發明的具體實施方式
中，胺基酸或胺基酸殘基指 L-型的胺基酸或胺基酸殘基。表1胺基酸縮寫表
對於本發明的肽，可以進行合適的修飾，如，對胺基酸殘基側鏈基團修飾以形成藥學上 可接受的酯，環(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)與高分子物質形成的 綴合物，或這些修飾的組合等。在本文中，「藥學上可接受的酯」指適於與人或動物的組織接 觸而且無過多的毒性、刺激或變態反應等的酯。通常，酯化修飾後能降低機體中的蛋白酶對 肽的水解。對本發明的環肽的側鏈基團進行修飾可以形成藥學上可接受的酯。對胺基酸側 鏈基團的修飾包括但不限於蘇氨酸的側鏈羥基與羧酸發生的酯化反應。在本發明的具體實 施方式中，優選不對環肽的胺基酸側鏈基團進行修飾。使用本領域已知的方法，環(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln) 與高分子物質可以形成綴合物，其中，高分子物質通常是藥學上可接受的水溶性多聚物部 分。該綴合物一般能顯示出延長環肽的循環半衰期的效應。合適的水溶性多聚物包括聚 乙二醇(PEG)、單甲氧基-PEG、單-(C1,)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、聚-(N-乙烯吡咯烷 酮)PEG、三甲氧基PEG、單甲氧基-PEG丙醛、PEG丙醛、二-琥珀醯亞胺碳酸PEG、丙烯乙二醇同聚物、聚丙烯氧化物/乙烯氧化物共聚物、聚氧乙烯多羥基化合物(如，甘油)、單 甲氧基-PEG 丁醛、PEG 丁醛、單甲氧基-PEG乙醛、PEG乙醛、甲氧基PEG-琥珀醯亞胺丙 酸、甲氧基PEG-琥珀醯亞胺丁酸、聚乙烯醇、右旋糖苷、纖維素或其他糖類的多聚物。合 適的PEG可具有約600至約60，000的分子量，包括如，5，000道爾頓，12，000道爾頓， 20，000道爾頓，30，000道爾頓，和40，000道爾頓，其可以是直鏈的或分支的。PEG化 可通過現有技術中已知的PEG化反應來進行(如參見，Delgado等的Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249 (1992), Duncan 禾口Spreafico白勺 Clin. Pharmacokinet. 27: 290 (1994)，和 Francis 等的 Int J Hematol 68: 1 (1998))。例 如，PEG化可用反應性聚乙二醇分子由醯化反應或由烷基化反應來進行。在可選的方法中， 綴合物由縮合活化的PEG來形成，其中PEG末端的羥基或氨基被活化的接頭分子替代(如 參見，Karasiewicz 等，US5382657A)。綴合物也可以是環(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-S er-Pro-Leu-Leu-Gln)同其它蛋白交聯形成的綴合物。所述其它蛋白優選人白蛋白、牛白蛋 白或IgG分子的Fc部分。例如，本發明的環肽可以與牛血清白蛋白交聯形成肽綴合物。在本文中，「藥學上可接受的鹽」指適於與人或動物的組織接觸而且無過多的毒 性、刺激或變態反應等的鹽。藥學上可接受的鹽是本領域熟知的。這種鹽可以在本發明多 肽的最終分離和純化的過程中製備，也可以將肽與適當的有機或無機酸或鹼反應單獨制 備。代表性酸加成鹽包括但不限於乙酸鹽、二己酸鹽、藻酸鹽、檸檬酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲 酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、 己酸鹽、富馬酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺 酸鹽、煙酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、3-苯基丙酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、磷酸鹽、 穀氨酸鹽、碳酸氫鹽、對甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。能用於形成藥學上可接受鹽的優選的酸 是鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、草酸、馬來酸、琥珀酸和檸檬酸。藥學上可接受的鹼加成鹽中的 陽離子包括但不限於鹼金屬或鹼土金屬離子如鋰、鈉、鉀、鈣、鎂和鋁等，以及非毒性季銨陽 離子如銨、四甲基銨、四乙基銨、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、二乙基胺、乙基胺、 二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。優選的鹼加成鹽包括磷酸鹽、tris和乙酸鹽。這 些鹽一般能夠增加多肽的溶解性，而且所形成的鹽基本上不改變多肽的活性。本發明的多 肽可以單獨使用，也可以以藥學上可接受的鹽形式使用。在第二方面，本發明提供了組合物，其包括本發明第一方面所述的肽或其藥學上 可接受的鹽或酯，以及藥學上可接受的載體。本文中使用的「藥學上可接受的載體」指無毒 固態、半固態或液態填充劑、稀釋劑、佐劑、包裹材料或其他製劑輔料。根據本領域的公知技 術，可以根據治療目的、給藥途徑的需要將藥物組合物製成各種劑型，優選該組合物為單位 劑量形式，如片劑、膜劑、丸劑、膠囊(包括持續釋放或延遲釋放形式)、粉劑、顆粒劑、酊劑、 糖漿劑和乳液劑、消毒的注射用溶液或懸浮液、氣霧劑或液體噴劑、滴劑、針劑、自動注射裝 置或栓劑。例如，以片劑或膠襄的口服給藥，上述活性藥物組分可以與一種口服的無毒的藥 物學可接受的惰性載體組合在一起，如乙醇、等滲葡萄糖溶液、甘油、生理鹽水或其它組合。 組合物中還可以添加輔料，如人血清白蛋白、低分子量肽、胺基酸和金屬陽離子等多肽保護 劑等。在本發明的具體實施方式
中，本發明的環肽直接用緩衝液(如，PBS )稀釋成組成物。優選在本發明的第二方面中，所述組合物是藥物組合物，即達到藥用純度、製劑等 要求的組合物。藥物組合物可通過所屬領域技術人員所熟知的給藥方式來進行給藥，例如
5口服、直腸、舌下、肺部、透皮、離子透入、陰道及鼻內給藥。本發明的藥物組合物優選胃腸道 外給藥，如皮下、肌內或靜脈內注射。給藥劑量根據製劑形式和期望的作用時間以及治療對 象的情況而有所變化，實際治療所需的量可以由醫師根據實際情況(如，病人的病情、體重 等)而方便地確定。對於一般的成人，本發明的藥物組合物的劑量，以環(Ala-Thr-Leu-Gly -Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)肽計，可以是每kg成人體重Ing - IOgo對於注射給藥 模式來說，優選的劑量是每kg體重IOOng - 10mg，更優選的是每kg Img - lmg，最優選的 是每 kg IOmg - IOOmg0
在第三方面，本發明提供了本發明第一方面所述的肽或其藥學上可接受的鹽或酯在制 備抑制細胞增殖的組合物中的應用。其中所述組合物可以是藥物組合物，也可以是只適於 體外應用的組合物，優選是藥物組合物。優選在本發明的第三方面中，細胞增殖是由鹼性成纖維細胞生長因子誘導的。本 發明人經研究發現，本發明的環肽可以特異性地抑制由鹼性成纖維細胞生長因子誘導的腫 瘤細胞的增殖，因此也優選在本發明的第三方面中，細胞是腫瘤細胞，在本發明的具體實施 方式中，細胞是結腸癌細胞，如Caco2和LoVo細胞。另外，在本發明的具體實施方式
中，本發明的環肽是唯一抑制增殖活性成分，因此 也優選提供，本發明提供了本發明第一方面所述的肽或其藥學上可接受的鹽或酯作為唯一 抑制增殖活性成分在製備抑制細胞(如，腫瘤細胞，更優選如結腸癌細胞)增殖的組合物中 的應用。
在第四方面，本發明提供了本發明第一方面所述的肽或其藥學上可接受的鹽或酯在 製備抗血管增生的藥物或試劑中的應用。在本文中，如無相反指示，藥物可以與藥物組合物 互換使用；試劑指的是只適於體外應用的組合物。優選在本發明的第四方面中，血管是雞胚絨毛尿囊膜血管。本發明人經研究發現， 本發明的環肽可以特異性地抑制由鹼性成纖維細胞生長因子誘導的雞胚絨毛尿囊膜血管 增生，而且其是作為唯一抗血管增生活性成分使用的。因此也優選提供，本發明第一方面所 述的肽或其藥學上可接受的鹽或酯作為唯一抗血管增生活性成分在製備抗血管(如，雞胚 絨毛尿囊膜血管)增生的藥物或試劑中的應用。
在第五方面，本發明提供了本發明第一方面所述的肽或其藥學上可接受的鹽或酯在 製備抗腫瘤的藥物中的應用。本發明人經研究發現，本發明的環肽不但能夠單獨抑制腫瘤 細胞本身的增殖，而且能夠單獨抗血管增生，從而潛在地減少腫瘤組織的供血量，因此疊加 這兩方面的效應，可以用於預防和/或治療腫瘤。優選在本發明的第五方面中，腫瘤是結腸癌。
在第六方面，本發明提供了 製備環(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-G In)肽的方法，其包括，合成線性肽，然後環化。本發明第六方面的方法優選包括，合成線性 肽Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln,然後環化。通過化學方法合成已知 結構的肽對於所屬領域技術人員來說都是顯而易見的。詳細的方案可參照以下文獻所述的方法進行，如用固相法合成多肽可參考J.M. Steward和J.D. Young的《Solid Phase Peptide Synthesis》(第二版，Pierce Chemical Co. , Rockford, Illinois (1984))禾口 J. Meienhofer 的《Hormonal Proteins and Peptides》(第 2 卷，Academic Press,紐約 (1973))等；用液相法合成多肽可參考E. Schroder和K. Lubke的《The Peptides))(第1 卷，Academic Press，紐約(1965))等。目前線性肽有著很成熟的自動合成技術，如可以採 用市售的自動合成儀來合成。環肽也可以利用專門的自動合成儀來合成，如利用對_硝基 苯基甲酮肟樹脂的固相合成儀。但是，本發明優選先合成線性肽，然後再環化。現有的線性 肽環化的方法包括但不限於，直接法，即在氨基和羧基端都呈游離狀態的線性肽稀溶液中 加入縮合試劑，直接有效的縮合成環；活潑酯法，即用硝基苯酯、羥基琥珀醯亞胺或五氟苯 酯等將線性肽的羧基端製成反應活性酯，然後脫去N端保護基，使之成環；疊氮法，即將線 性肽的羧基端製成醯基疊氮活潑中間體，然後在稀釋的鹼性溶液中成環，等等。在本發明的 一個具體實施方案中，優選通過固相法先合成線性肽，然後環化。優選在本發明第六方面中，環化後的環肽優選進一步純化，如進行HPLC純化。本 發明的肽優選是純化的肽，即純化到> 80%純度，優選> 90%純度，更優選> 95%純度，尤 其優選達到藥物純的狀態，即純度是大於等於98%的純度，而且不含感染源和熱源。優選本 發明的肽實質上不含有其它多肽或蛋白質，尤其是動物來源的那些肽或蛋白質。
為了便於理解，以下將通過具體的實施例對本發明進行詳細的描述。需要特別指出的 是，這些描述僅僅是示例性的描述，並不構成對本發明範圍的限制。依據本說明書的論述， 本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見了。另外本發明引用的公 開文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本文進行參考，就好像它們的 全文已經在本文中重複敘述過一樣。
具體實施例方式實施例1環肽的合成
根據已知的固相法合成線性肽的方法和環化線性肽的方法，合成本發明的環肽。簡而 言之，使用413A型自動肽合成儀(購自Perkin Elmer公司)來合成線性肽Ala-Thr-Leu-Gly -Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln，其中的胺基酸殘基均為L-型的胺基酸。合成的具體過程 如下首先，保護胺基酸單體上的反應性基團胺基酸的α氨基用9-芴基甲氧羰基(Fmoc) 保護；並對以下特定胺基酸進行側鏈保護對Ser和Thr的側鏈保護基為叔丁基，對Gln的 側鏈保護基為三苯甲基(Trt)。然後，以N，N- 二異丙基碳二亞胺/1-羥基苯並三唑作為活 化試劑，使受保護的胺基酸依次偶聯，偶聯每次40分鐘。在15%乙二硫醇/ 二甲硫醚/茴 香醚(體積比為1 1 1)存在的情況下，肽與三氟乙酸(85%)在室溫反應120分鐘，從 而從聚合體支持物上切割下來。接著用無水乙醚沉澱肽，然後用無水乙醚多次洗滌，充分除 去硫醇。在水/叔丁醇(1 1)中沉澱，冷凍乾燥，得到線性肽。將合成的線性肽以1 :1. 5的摩爾比與對硝基酚混合溶解在乙酸乙酯中， 加入縮合劑1，3- 二環己基碳二亞胺(DCC)，得到線性肽羧基末端硝化的肽，然後加入三氟 乙酸(85%)脫去氨基端的保護基，同時脫除側鏈保護基。蒸去溶劑後，將固體產物溶於 0. IM NaHCO3和0. IM Na2CO3的二氧六環溶液中，於室溫反應3小時。接著用無水乙醚沉澱
7肽，然後用無水乙醚多次洗滌，在水/叔丁醇(1 1)中沉澱，冷凍乾燥，得到環肽粗品。將 環肽粗品在30分鐘內以反相HPLC純化，以37-42%乙晴/0. 9% TFA梯度進行。然後進行 濃縮、凍幹，由此得到純化的環(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)肽，經 HPLC檢測，其純度> 98%。
實施例2環肽對腫瘤細胞存活率的影響
將間質幹細胞HUMSC株(作為非腫瘤對照細胞株)以及結腸癌細胞株Caco2和LoVo (均 可購自ATCC)分別置於96孔板的孔中，每孔5000個細胞。其中，HUMSC、Caco2和LoVo細胞 分別在添加了 10%胎牛血清的DMEM培養基中培養24小時後，棄去培養基，加入0. 4%胎牛 血清的DMEM培養基中繼續培養24小時。然後，分別在各孔中等體積加入不同稀釋度的實 施例1製備的環肽、20ng/ml bFGF、以及不同稀釋度的實施例1製備的環肽和20ng/ml bFGF 的混合物，繼續培養48小時。根據MTT法，測定細胞增殖的效應，即用噻唑蘭顯色檢測活細 胞的數量。結果發現，當單獨加入20ng/ml bFGF的時候，這兩種結腸癌細胞以及對照細胞 株都有顯著增殖；當單獨加入不同稀釋度的實施例1製備的環肽的時候，這兩種結腸癌細 胞以及對照細胞株的數量都沒有顯著的改變，即沒有顯著增加，也沒有顯著減少；當加入不 同稀釋度的實施例1製備的環肽和20ng/ml bFGF的混合物的時候，這兩種結腸癌細胞受 20ng/ml bFGF影響而增殖的幅度明顯減少，減少的量是呈環肽劑量依賴性的，經計算得，環 肽對20ng/ml bFGF誘導的Caco2細胞增殖的半抑制濃度(IC50)為3. 8 μ M，而對20ng/ml bFGF誘導的LoVo細胞增殖的半抑制濃度(IC50)為0. 77 μ Μ。
實施例3環肽對血管增生的影響
根據Li，X等(Cancer Letter, 2007, 256 29-32)報導的方法，測定環肽在體內對雞 胚絨毛尿囊膜血管增生的影響。即，將56隻5天大小的雞胚隨機等分成七組，通過照視， 在絨毛尿囊膜的蛋殼上銼成一個三角形裂痕，同時在氣室頂部鑽一小孔，除去蛋殼造成「卵 窗」，勿傷及殼膜；將卵平放，通過造成氣室負壓，使殼膜與尿囊膜之間形成人工氣室；將等 體積(20 μ 1)的PBS (作為空白對照)、bFGF (30ng/ml)、以及bFGF (30ng/ml)和5個稀釋 度(0. 05 μ Μ，0· 2 μ Μ，0· 8 μ Μ，3· 2 μ M，12. 8 μ M)的實施例1製備的環肽的混合物樣品分別 置於尿囊膜上；用玻璃紙蓋住卵窗，周圍塗以熔化的石蠟密封，同時封閉氣室小孔；將雞胚 橫臥，於37°C孵育雞胚72小時後，觀察血管密度。結果發現，相對於PBS對照，bFGF能夠顯 著促進血管增生；然而，如果bFGF中同時加入了不同稀釋度的實施例1製備的環肽，則當環 肽濃度小於0. 8 μ M的時候，環肽呈劑量依賴性地抑制bFGF促血管增生的效應，當濃度達到 0. 8 μ M及其以上的時候，完全抑制了 bFGF促血管增生的效應，即血管增生的水平與PBS對 照組的相當。
權利要求
環(Ala Thr Leu Gly Gly Gly Ser Pro Leu Leu Gln)肽或其藥學上可接受的鹽或酯。
2.權利要求1所述的肽或其藥學上可接受的鹽或酯，其由Ala的氨基和Gln的羧基形 成肽鍵而環化。
3.組合物，其包括權利要求1或2所述的肽或其藥學上可接受的鹽或酯，以及藥學上可 接受的載體。
4.權利要求1或2所述的肽或其藥學上可接受的鹽或酯在製備抑制細胞增殖的組合物 中的應用。
5.權利要求4所述的應用，其中細胞增殖是由鹼性成纖維細胞生長因子誘導的。
6.權利要求4或5所述的應用，其中細胞是腫瘤細胞，優選是結腸癌細胞。
7.權利要求1或2所述的肽或其藥學上可接受的鹽或酯在製備抗血管增生的藥物或試 劑中的應用。
8.權利要求1或2所述的肽或其藥學上可接受的鹽或酯在製備抗腫瘤的藥物中的應用。
9.權利要求8所述的應用，其中腫瘤是結腸癌。
10.製備環(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)肽的方法，其包括，合 成線性肽 Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln,然後環化。
全文摘要
本發明公開了環(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)肽，其可用於抑制由bFGF誘導的細胞增殖和血管增生以及用於治療結腸癌等方面。本發明還公開了包含該環肽的藥物組合物和製備方法等。
文檔編號A61P9/00GK101974076SQ20101052595
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月1日 優先權日2010年11月1日
發明者吳曉萍, 李校堃 申請人:李校堃