抗重組鹼性成纖維細胞生長因子人源性Fab抗體及其應用的製作方法

2024-01-28 10:34:15 1

專利名稱：抗重組鹼性成纖維細胞生長因子人源性Fab抗體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別涉及一種抗重組鹼性成纖維細胞生長因子(或稱為成纖維細胞生長因子2，FGF-2)人源性Fab抗體及其應用。
背景技術：
鹼性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)又名成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，FGF-2)是成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)家族目前已知的23個成員中發現最早、研究最多的因子。bFGF有多種生物學作用，包括促生長、分裂、分化功能；對成纖維細胞具有強烈的促增殖作用。
bFGF是繼VEGF之後的最重要的刺激血管新生的細胞因子之一。與腫瘤的發生、發展關係密切，bFGF參與多種腫瘤(如神經膠質瘤、橫紋肌瘤、白血病、腎癌、肺細胞瘤、黑色素瘤、肝癌)的生長，有相當部分的腫瘤出現bFGF和bFGF受體的高表達。已知其作用環節主要有(1)促進腫瘤血管的新生，因而增加腫瘤的血液供應、為腫瘤生長提供氧和營養物質。(2)bFGF能促進多種生長因子的分泌，如VEGF，TGF，aFGF等，這些因子相互調節，共同促進腫瘤的發生；(3)腫瘤細胞存在bFGF受體的高表達，通常比正常細胞高10倍以上，bFGF可通過自分泌和(或)旁分泌作用直接刺激腫瘤細胞，使腫瘤組織的各種蛋白酶及膠原酸分泌增加，從而加速腫瘤細胞的侵潤和轉移；(4)bFGF與癌基因關係密切，已發現一些癌基因(hst.int-2 hst/k-fgf)表達的蛋白質與bFGF同原性為39％～50％。而且，bFGF與細胞分化密切相關的Ras，Akt，C-fos，c-myc等有密切聯繫，這些基因均有促進腫瘤發生的作用。(5)多種腫瘤細胞自身高表達bFGF，可以在腫瘤患者的淚液、血液、尿液中檢測到pg/mL水平的bFGF。bFGF還能直接作用腫瘤細胞，促進腫瘤細胞的增殖和加速腫瘤細胞的轉移。
此外，bFGF還參與肝、肺、腎等纖維化的形成，bFGF還與腫瘤的耐藥性有關。在這些病理組織中bFGF的表達明顯增強，因此控制和治療這類疾病的途徑之一就是利用抗bFGF中和抗體來阻斷其的作用。
Matsuzaki等早在1989年開始了bFGF鼠源單抗的抗腫瘤作用研究，他們研製的兩株單抗-抗牛肝素結合生長因子和抗bFGF單抗，在體外，均表現出強的抑制牛靜脈內皮細胞增殖和抗實體瘤的作用。Aonuma等分別對bFGF不同表位的兩株單抗(2G11和1E6)的抗腫瘤作用進行研究，發現，針對bFGF不同表位的單抗具有完全不同的生物學活性。針對bFGF肝素結合區的單抗(2G11)體外具有結合肝素活性但在體內卻沒有抗腫瘤活性。而不與肝素競爭結合的抗bFGF單抗(1E6)卻表現出非常強的抗腫瘤作用。國內，林衛等(2005)利用卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，探討了bFGF在卵巢上皮腫瘤中的表達強度與腫瘤血管生成之間的關係，bFGF鼠源單抗對人卵巢癌移植瘤血管生成和腫瘤生長的影響。謝慶祥等研究了bFGF及其抗體對裸鼠皮下移植膀胱癌生長影響。
bFGF單抗的抑制腫瘤血管新生和抗腫瘤的作用已經得到了國內外學者的證實和肯定，但到目前為止，還沒有見到國內外其他關於抗bFGF人源抗體研究的文獻和專利報導。

發明內容
為了解決上述現有技術的不足之處，本發明的首要目的在於提供一種抗重組鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)(或稱為成纖維細胞生長因子2，FGF-2)人源性Fab抗體，該抗體能特異性中和人bFGF(或FGF-2)。
本發明的另一目的在於提供上述抗重組鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)或成纖維細胞生長因子2(FGF-2)的人源性Fab抗體的應用。
本發明的目的通過下述技術方案來實現一種抗重組鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)(或稱為成纖維細胞生長因子2，FGF-2)人源性Fab抗體，所述抗體片段基因包括重鏈的Fd鏈和輕鏈κ鏈；所述重鏈Fd鏈的基因序列如下CAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGC AGG TCC CTG AGA CTC ACC TGTGCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT GAA GAT TAT GGC ATG CAC TGG GTC CGG CAAGCT CCA GGG AAG GGC CTG GAG TGG GTC TCA GGT ATT AGC TGG AAT AGT GGTAGT ATA GGC TAT GCG GAC TCT GTG AAA GGC CGC TTC ACC ATC TCC AGA GACAAC GCC AAG AAT TCC CTG TAT TTG CAA ATG AAC AGT CTG AGA GCT GAG GAC
ACG GCC TTG TAT TAC TGT GCA AAA GAC AGG CGC TTC GGT GAC TAC GTC CACTCC TAC TAC GGT ATG GAC GTC TGG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCCTCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAGGAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACCAGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TACTCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG AGC ACC CAGACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GACAAG AGA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA；所述輕鏈κ鏈的基因序列如下GAT ATT GAG CTC ACT CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT ATA GGA GACACA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT GAC ATC TAT GTA AATTGG TAT CAG CAC AAA GCA GGC AAA GTC CCT AAA CTC CTA ATG CAT ACT GCATCC AGT TTA GAA AGT GGG GTC CCA CCA AGG TTC AGT GGC AGT GGC TCT GGGACA GAT TTC ACT CTC ACT ATC AGC GGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA ACTTAC TAC TGT CAA CAG AGT TAT CGT CTT GTC AGT TTC GGC CCT GGG ACC AAAGTG GAT ATT AGA CGA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCATCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AATAAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTCCAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GACAGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAGAAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGT TCG CCCGTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT。
所述重鏈Fd鏈的胺基酸序列如下Q S G GG L V Q PG R SL R LT C
A A S G F T F ED Y G M HW V R QCDR1A P G K G L E W V SG I S W N S GCDR2S I G Y A D S V K GR F T I S R DN A K N S L Y L Q M N S L R A E DT A L Y Y C A KD R R F G D Y V HCDR3S Y Y G M D V W P K S C D K；所述輕鏈κ鏈的胺基酸序列如下D I E L T Q S P S S L S A S I G DT V T I T CR A S Q S I D I Y V NCDR1W Y Q H K A G K V P K L L M HT AS S L E SG V P P R F S G S G S GCDR2T D F T L T I S G L Q P E D F A TY Y CQ Q S Y R L V S F G P G T KCDR3V D I R
所述重鏈Fd鏈由633個鹼基組成，編碼211個胺基酸，由抗體重鏈的可變區和恆定1區(CH1)(第111～205位胺基酸即從GPSV到KRVE，95個胺基酸，屬於恆定1區；第206～211位胺基酸屬於絞鏈區部分)構成，可變區含有3個CDR(互補決定簇)區。CDR1編碼5個胺基酸，CDR2編碼7個胺基酸，CDR3編碼17個胺基酸。可變區的框架區與其他人源性抗體的同源性高達97.6％，而3個CDR區則是特異性序列。與其他人源性抗體Fd鏈有較大差異。
所述輕鏈κ鏈由639個鹼基組成，編碼213個胺基酸，由抗體重鏈的可變區和恆定區(CL)(第107～213位胺基酸，即從RTVA到結尾)構成，可變區含有3個CDR(互補決定簇)區。CDR1編碼11個胺基酸，CDR2編碼17個胺基酸，CDR3編碼18個胺基酸。可變區的框架區與其他人源性抗體的同源性為96.7％，而3個CDR區則為特異性序列。與其他人源性抗體κ鏈有較大差異。
抗重組鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)或成纖維細胞生長因子2(FGF-2)人源性Fab抗體蛋白的功能存在於抗體輕重鏈可變區抗原互補決定族(complementarity determing regions CDRs)CDR1、CDR2、CDR3(是本發明的功能活性區)中特異性核苷酸序列決定的，其相應的胺基酸序列構成了抗體特異性bFGF或(FGF-2)抗原結合區。
上述的抗重組鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)或成纖維細胞生長因子2(FGF-2)人源性Fab抗體的用途該特異性結合bFGF或(FGF-2)的功能性中和抗體基因，此重組抗體是由存在於抗體輕鏈和重鏈可變區中的高變區(CDRs)特異性的基因序列決定的，基於上述輕重鏈可變區基因，可採用基因工程方法，構建和表達成多種形式的小分子基因工程抗體(如Fab抗體、F(ab)2、單鏈抗體(scFv)、納米抗體(Nanobody)、抗體融合蛋白)和IgG全抗體。
在原核細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和真核細胞獲得該抗體基因表達或以此基因為基礎改建後的含有該抗體基因可變區的任何其他基因。獲得具有中和人bFGF的抗體產物，可在臨床上(1)用於腫瘤的診斷，(2)抑制腫瘤血管新生和抑制腫瘤的生長和轉移，(3)抑制肝、肺、腎纖維化的進程。
上述的抗重組鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)或成纖維細胞生長因子2(FGF-2)人源性Fab抗體在製備用於診斷和治療腫瘤以及抑制腎、肝或肺等纖維化的抗體藥物中的應用。
本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果本發明獲得的抗bFGF或FGF-2人源性Fab抗體，該抗體是全人源的，是從人血淋巴細胞分離RNA，反轉錄cDNA，構建的人噬菌體抗體庫，並從中篩選到的抗體，具有高親和力和特異性，因為是全人源性的抗體，可以直接開發為人用的抗體藥物。開發人源性抗bFGF抗體的優勢主要體現在(1)人源性抗體bFGF抗體解決了鼠源單抗無法避免人抗鼠抗體(HAMA)反應，可以直接開發抗體藥物用於人體治療。(2)bFGF是人源蛋白，本身並不能引起人的免疫反應，且bFGF與腫瘤關係密切，所以不能直接用其開發疫苗；(3)直接用人的淋巴細胞為材料克隆抗體基因構建抗體庫，篩選到的人源性抗bFGF抗體具有特異性結合bFGF的特點，可有效中和腫瘤和纖維化患者體內過渡表達的bFGF，能有效抑制腫瘤的生長和轉移，還可用於抑制肝、肺或腎等纖維化的形成。


圖1為bFGF或FGF-2的人源性抗體(Fab)的Fd鏈基因及胺基酸序列。
圖2為bFGF或FGF-2的人源性抗體(Fab)的κ鏈基因及胺基酸序列。
圖3為不同噬菌體抗體克隆的ELISA結果圖。
其中，1～6分別為不同的噬菌體抗體克隆(Clone2，Clone6，Clone15，Clone16，Clone25，Clone26)，7為空白對照，8為陰性對照。
圖4為不同Fab抗體克隆的表達產物粗提液的ELISA檢測結果圖。
其中，1～3分別為pComb3H-Fab-6、pComb3H-Fab-25、pComb3H-Fab-26的表達產物粗提液；4空載體pComb3H表達產物粗提液。
圖5為Fab抗體克隆表達產物的SDS-PAGE檢測結果圖。
其中，1為陰性對照，2～4分別為為pComb3H、pComb3H-Fab-6、pComb3H-Fab-25、pComb3H-Fab-26的SDS-PAGE結果，M為分子量標記。
圖6為Fab抗體克隆表達產物的Western blot檢測結果圖。
其中，1為1pComb3H-Fab-6、2為pComb3H-Fab-25、3為pComb3H-Fab-26的Western blot結果，4為陰性對照。
具體實施例方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
實施例1抗重組鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)或成纖維細胞生長因子2(FGF-2)人源性Fab抗體的構建方法1、Fd鏈、κ鏈基因的克隆及κ鏈文庫的構建從高滴度bFGF或(FGF-2)自身抗體患者外周血分離淋巴細胞。用Trizol(TAKARA公司，RNA提取試劑)試劑提取細胞總RNA，採用Olig-dt引物，ReverTra Ace-a(詳見TOYOBO公司試劑盒產品說明書)試劑盒反轉錄合成cDNA。用一組特異性IgG Fab的Fd和κ鏈引物(見表1)(Fd-6鏈3』引物為VH2和5』引物為VH6；κ-6鏈3』引物為Vκ1，κ-6鏈5』引物為Vκ3)對人源性Fab的Fd和κ鏈進行PCR擴增(反應體系見表2)，PCR條件為94℃5min，[94℃45 Sec，52℃40 Sec，72℃50 Sec]×29，72℃10min。
表1 PCR擴增人抗體Fab段基因的引物


表2 Fd鏈和κ鏈的PCR擴增條件

上述PCR產物經瓊脂糖凝膠回收試劑盒(公司)回收純化，獲得650～700bp左右的人源性抗體的Fd鏈、κ鏈PCR產物。
2、噬菌體抗體庫的構建將輕鏈κ鏈PCR純化產物混合，分別用Sac I和Xba I雙酶切，產物用清潔PCR試劑盒(Xgene公司產品)回收，插入到用Sac I和Xba I雙酶切的pComb3載體(Babas，et al.Proc.Natl.Acas.Sci.USA.1991，8910164-10168)中。連接物經乙醇沉澱回收，電轉化感受態XL1-Blue細菌(美國Stretigene公司)(電轉條件BTX電轉儀，0.2cm電轉杯，2.0kv)，電轉化後迅速加入1mL SOC培養基(配製方法為20g胰蛋白腖，5g酵母提取物，0.5g NaCl，950mL去離子水，20mL 0.25mol/LKCl，用5mol/LNaOH將pH值調至7.0，加入去離子水定容至1L，高壓滅菌存4℃備用。使用前加入5mL滅菌的2mmol/L MgCl2和20mL除菌的1mol/L葡萄糖溶液。)，37℃振蕩培養1h，取100μL經10倍倍比稀釋後鋪LB平板檢測庫容，餘下接入50mL LB液體培養基中(含10mg/L四環素，50mg/L氨苄青黴素)，37℃培養過夜，次日從培養的細菌中提質粒，得到輕鏈κ基因庫pComb3-L。Fd鏈PCR純化產物及pComb3-L分別用Xho I和Spe I雙酶切，按輕鏈同樣的方法進行連接，電轉化XL1-Blue。電轉化後迅速加入1mL SOC培養基，37℃振蕩培養1h，取100μL經10倍倍比稀釋後鋪LB平板檢測庫容，餘下接入50mL LB液體培養基中(含10mg/L四環素，50mg/L氨苄青黴素)37℃培養過夜。將上述過夜培養物取10mL分10管保留菌種，取80mL菌液用鹼裂解法提取重組質粒DNA，該質粒即為帶Fab片段的pComb3(即Fab基因庫)，命名為pComb3-Fab。保存於-30℃。將上述剩餘菌液併入100mL LB(含50mg/L氨苄青黴素和25mg/L四環素)，37℃振蕩培養至OD600≈0.6。加入400μL(約1012pfu)噬菌體VCSM13，37℃振蕩培養2h。然後加入70μg/ml卡那黴素，37℃振蕩培養過夜。細菌培養液在4℃，4000rpm離心15min，將上清置另一無菌三角瓶中，加入4％PEG8000(聚乙二醇)和3％NaCl，待PEG和NaCl溶解後，置三角瓶於冰浴中，沉澱30min。8500rpm 4℃離心30min。棄上清，將離心管倒置於無菌吸水紙上10min，除去PEG液。用2mL PBS pH7.2重懸噬菌體沉澱，瞬時離心，即得噬菌體Fab抗體噬菌體原始庫。分裝0.4mL/管存放於-20℃。用於從中篩選高親和力的人源性Fab抗體克隆。
3、噬菌體抗體庫的篩選將重組人鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)或成纖維細胞生長因子2(FGF-2)(暨南大學生物工程研究所提供)用50mmol/L碳酸氫鈉(pH10.0)稀釋至1mg/L，包被ELISA板；1％BSA-PBS封閉後加入100μL製備的噬菌體Fab抗體噬菌體原始庫(約1011pfu)，孵育2h，PBST(PBS緩衝液加0.1％吐溫-20)液洗1次(第2輪洗5次，第3輪洗10次，每次5min)，以200μL洗脫液回收噬菌體，pH8.0的Tris緩衝液調節pH至中性，感染對數生長期的大腸桿菌XL1-Blue菌株進行富集。轉入三角瓶後補加10mL LB培養基(含20mg/L氨苄青黴素和10mg/L四環素)，分別取10μL和1μL塗LB(Amp+)平皿，滴定洗脫下來的噬菌體，其餘的於37℃振蕩培養1h。加入100mL上述培養基，37℃振蕩培養至OD600＝0.6，加入VCSM13(約1012pfu)進行噬菌體抗體庫活化，測定CFU(噬菌斑形成單位)後進行下一輪篩選。按相同方法進行3輪淘選。得到陽性噬菌體Fab抗體克隆。
4、噬菌體抗體的鑑定與序列分析挑取16株經3輪篩選獲得的陽性克隆，接種於含50μg/mL氨苄青黴素的LB培養液中，37℃培養至OD600＝0.3～0.4，加入輔助噬菌體(VCSM13)進行活化富集噬菌體。富集的各個噬菌體克隆採用ELISA方法進行特異性鑑定，每孔包被人重組bFGF 100ng，加70μL噬菌體抗體，HRP標記的鼠抗M13抗體顯色。結果見圖3。
分別以3株特異性高親和力的陽性噬菌體抗體質粒為模板，PCR擴增出相應的Fd鏈和κ鏈(依次命名為Fd-6鏈、κ-6鏈；Fd-25鏈、κ-25鏈；Fd-26鏈、κ-26鏈)，分別連接到T載體上分別構建重組質粒pMD18-T-Fd-6、pMD18-T-Fd-25、pMD18-T-Fd-26；pMD18-T-κ-6和pMD18-T-κ-25、pMD18-T-κ-26。經測序(送上海生物工程有限公司測序)分析。測定序列經資料庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)分析表明其為人源性抗體基因，且可變區序列為特異性序列。pMD18-T-Fd-6、pMD18-T-κ-6為Fd-6鏈、κ-6鏈構建的重組質粒，即本發明的抗體，Fd-6鏈、κ-6鏈序列測序結果如圖1、圖2所示。
表達產物的SDS-PAGE檢測結果根據上海生工測序結果預測表達產物的分子量，Fd-6、Fd-25和Fd-26的蛋白分子量為25kD左右，κ-6、κ-25和κ-26的蛋白分子量為22 kD左右。經SDS-PAGE和Western blot檢測，對照空載體pComb3H，表達產物粗提液在22kD和25kD處各出現一條帶，分別對應κ鏈和Fd鏈，與預期結果相符(見圖5、圖6)。
5、可溶性bFGF抗體Fab段表達載體的構建質粒pMD18-T-Fd-6、pMD18-T-Fd-25和pMD18-T-Fd-26分別用Xho I和Spe I雙酶切，按DNA凝膠回收試劑盒說明書分別回收Fd-6、Fd-25和Fd-26基因片段後，連接到與經過同樣Xho I和Spe I雙酶切的pComb3H載體上，進行連接，轉化XL1-Blue。質粒pMD18-T-κ-6、pMD18-T-κ-25和pMD18-T-κ-26分別用Sac I和Xba I雙酶切，按DNA凝膠回收試劑盒說明書分別回收κ-6、κ-25和κ-26基因片段後，分別與對應的同樣經過Sac I和Xba I雙酶切的pComb3H-Fd-6、pComb3H-Fd-25和pComb3H-Fd-26載體，進行連接，轉化XL1-Blue。構建的質粒分別經Nhe I和Spe I雙酶切，去除基因III片斷後自身環化，即構建成pComb3H-Fab-6、pComb3H-Fab-25和pComb3H-Fab-26可溶性表達質粒。
6、可溶性bFGF抗體Fab段的表達將重組可溶性表達質粒pComb3H-Fab-6、pComb3H-Fab-25和pComb3H-Fab-26分別轉化大腸桿菌XL1-Blue，在2YT培養基(該培養基配方為5g酵母汁、5g胰蛋白腖、2.5g NaCl，1000mL，pH7.0)中37℃培養過夜，次日以1∶100(體積比)轉接至300mL 2YT(含20mg/L氨苄青黴素和10mg/L四環素)培養基，37℃培養至OD600＝0.3～0.6時，加入IPTG(終濃度為1mmol/L)，30℃誘導表達12～15小時。4℃4100rpm離心菌體15min，用6mL0.02mol/L PBS(pH7.4)重懸菌體，反覆凍融3次，超聲破碎10min，8000rpm離心20min，上清即為表達產物粗提液。
7、表達產物的活性檢測包被重組人bFGF 1μg/孔，4℃過夜，1％BSA 37℃封閉1h，PBS-T洗4次，樣品孔加入表達產物粗提液100μL/孔，陰性對照孔加入誘導表達後的空載體pComb3H菌液超聲破碎上清100μL/孔，37℃孵育1h，PBS-T洗5次，加入經1∶40,000稀釋的鹼性磷酸酶標記Fab特異的羊抗人IgG抗體，100μL/孔37℃孵育1h，PBS-T洗5次，加入底物鄰苯二胺，25℃孵育30min，讀取A405值。結果見圖4。3株克隆(pComb3H-Fab-6、pComb3H-Fab-25和pComb3H-Fab-26)的表達產物粗提液經ELISA檢測，A405均為陰性值的2.5倍以上。因此，三株克隆的表達產物都能與bFGF特異性的結合(如圖4所示)。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
SEQUENCE LISTING110暨南大學120抗重組鹼性成纖維細胞生長因子人源性Fab抗體及其應用130281604170PatentIn version 3.22101211633212DNA213Artificial sequence220
223重鏈Fd鏈的基因序列4001cagtctgggg gaggcttggt acagcctggc aggtccctga gactcacctg tgcagcctct 60ggattcacct ttgaagatta tggcatgcac tgggtccggc aagctccagg gaagggcctg120gagtgggtct caggtattag ctggaatagt ggtagtatag gctatgcgga ctctgtgaaa180ggccgcttca ccatctccag agacaacgcc aagaattccc tgtatttgca aatgaacagt240ctgagagctg aggacacggc cttgtattac tgtgcaaaag acaggcgctt cggtgactac300
gtccactcct actacggtat ggacgtctgg ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc360tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc420gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg480gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc540agcttgagca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg600gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac aaa 6332102211639212DNA213Artificial sequence220
223輕鏈κ鏈的基因序列4002gatattgagc tcactcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctataggaga cacagtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gagcattgac atctatgtaa attggtatca gcacaaagca120ggcaaagtcc ctaaactcct aatgcatact gcatccagtt tagaaagtgg ggtcccacca180aggttcagtg gcagtggctc tgggacagat ttcactctca ctatcagcgg tctgcaacct240gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttatcgtc ttgtcagttt cggccctggg300accaaagtgg atattagacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct360
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc420agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag480agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg540agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg600agttcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt 6392103211211212PRT213Artificial sequence220
223重鏈Fd鏈的胺基酸序列4003Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Thr1 5 10 15Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr Gly Met His Trp Val20 25 30Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp35 40 45Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr50 55 60Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser65 70 75 80
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Arg Arg85 90 95Phe Gly Asp Tyr Val His Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Pro100 105 110Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr115 120 125Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr130 135 140Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro145 150 155 160Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr165 170 175Val Pro Ser Ser Ser Leu Ser Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn180 185 190His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser195 200 205Cys Asp Lys2102104211213212PRT
213Artificial sequence220
223輕鏈κ鏈的胺基酸序列4004Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly1 5 10 15Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ile Tyr20 25 30Val Asn Trp Tyr Gln His Lys Ala Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Met35 40 45His Thr Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Set Tyr Arg Leu Val Ser85 90 95Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro100 105 110Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr115 120 125Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu145 150 155 160Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser165 170 175Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala180 185 190Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe195 200 205Asn Arg Gly Glu Cys210
權利要求
1.一種抗重組鹼性成纖維細胞生長因子人源性Fab抗體，所述抗體片段基因包括重鏈Fd鏈和輕鏈κ鏈，其特徵在於所述重鏈Fd鏈的基因序列如下CAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGC AGG TCC CTG AGA CTC ACC TGTGCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT GAA GAT TAT GGC ATG CAC TGG GTC CGG CAAGCT CCA GGG AAG GGC CTG GAG TGG GTC TCA GGT ATT AGC TGG AAT AGT GGTAGT AIA GGC TAT GCG GAC TCT GTG AAA GGC CGC TTC ACC ATC TCC AGA GACAAC GCC AAG AAT TCC CTG TAT TTG CAA ATG AAC AGT CTG AGA GCT GAG GACACG GCC TTG TAT TAC TGT GCA AAA GAC AGG CGC TTC GGT GAC TAC GTC CACTCC TAC TAC GGT ATG GAC GTC TGG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCCTCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAGGAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACCAGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TACTCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG AGC ACC CAGACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GACAAG AGA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA；所述輕鏈κ鏈的基因序列如下GAT ATT GAG CTC ACT CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT AIA GGA GACACA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT GAC ATC TAT GTA AATTGG TAT CAG CAC AAA GCA GGC AAA GTC CCT AAA CTC CTA ATG CAT ACT GCATCC AGT TTA GAA AGT GGG GTC CCA CCA AGG TTC AGT GGC AGT GGC TCT GGGACA GAT TTC ACT CTC ACT ATC AGC GGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA ACTTAC TAC TGT CAA CAG AGT TAT CGT CTT GTC AGT TTC GGC CCT GGG ACC AAAGTG GAT ATT AGA CGA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCATCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AATAAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTCCAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GACAGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAGAAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGT TCG CCCGTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT。
2.根據權利要求1所述一種抗重組鹼性成纖維細胞生長因子人源性Fab抗體，其特徵在於所述重鏈Fd鏈的胺基酸序列如下Q S G G G L V Q P G R S L R L T CA A S G F T F ED Y G M HW V R QCDR1A P G K G L E W V SG I S W N S GCDR2S I G Y A D S V K GR F T I S R DN A K N S L Y L Q M N S L R A E DT A L Y Y C A KD R R F G D Y V HCDR3S Y Y G M D V WG P S V F P L A PS S K S T S G G T A A L G C L V KD Y F P E P V T V S W N S G A L TS G V H T F P A V L Q S S G L YS L S S V V T V P S S S L S T QT Y I C N V N H K P S N T K V DK R V E P K S C D K；所述輕鏈κ鏈的胺基酸序列如下D I E L T Q S P S S L S A S I G DT V T I T CR A S Q S I D I Y V NCDR1W Y Q H K A G K V P K L L M HT AS S L E SG V P P R F S G S G S GCDR2T D F T L T I S G L Q P E D F A TY Y CQ Q S Y R L V S F G P G T KCDR3V D I RR T V A A P S V F I F P PS D E Q L K S G T A S V V C L L NN F Y P R E A K V Q W K V D N A LQ S G N S Q E S V T E Q D S K DS T Y S L S S T L T L S K A D Y EK H K V Y A C E V T H Q G L S S PV T K S F N R G E C。
3.根據權利要求1所述一種抗重組鹼性成纖維細胞生長因子人源性Fab抗體在製備用於診斷和治療腫瘤以及抑制腎、肝或肺纖維化的抗體藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抗重組鹼性成纖維細胞生長因子人源性Fab抗體及其應用，抗體片斷基因包括重鏈Fd鏈和輕鏈κ鏈，本發明應用噬菌體表面呈現技術，成功構建能中和重組人bFGF或FGF－2的人源Fab抗體的k鏈和Fd鏈基因。在原核細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和真核細胞獲得有效表達的特異性結合bFGF或FGF－2的功能性中和抗體，製備用於診斷和治療腫瘤以及抑制腎、肝或肺等纖維化的抗體藥物。本發明製備的bFGF或FGF－2人源性Fab抗體，該抗體是全人源的，具有高親和力和特異性，可以直接開發為人用的抗體藥物。
文檔編號A61K39/395GK101092457SQ200710028509
公開日2007年12月26日 申請日期2007年6月8日 優先權日2007年6月8日
發明者鄧寧, 向軍儉, 王宏, 唐勇, 湯偉佳, 關文答, 陶俊 申請人:暨南大學