抗人重組鹼性成纖維生長因子的嵌合抗體及構建與用途的製作方法

2024-01-28 10:39:15

專利名稱：抗人重組鹼性成纖維生長因子的嵌合抗體及構建與用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種嵌合抗體及其編碼基因。
背景技術：
鹼性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一種多功能的生長因子，以多種亞型形式存在，現今研究的bFGF的生物學活性主要是針對Mr18000的亞型。bFGF的生物學效應，除對成纖維細胞和血管內皮細胞具有顯著的促增殖作用外，還參與腫瘤發生和發展，特別對腫瘤的浸潤和轉移具有重要作用。此外，bFGF還可能參與了矽肺的纖維化過程，研究證實，在矽肺形成的過程中，肺內的肥大細胞也可產生bFGF，而且bFGF陽性肥大細胞的分布與細胞外基質的沉積相匹配，即與纖維化的程度相關。抗bFGF單克隆抗體(mAb)還可抑制神經發生及惡性神經膠質瘤的分裂和生長，在腫瘤診斷上，用抗bFGFmAb檢測腫瘤患者血清或尿中bFGF的水平，輔助診斷腎、肺、腦、胃、膀胱、乳腺和胰腺等臟器的腫瘤；1997年Coppola G.用抗bFGFmAb對腫瘤進行體內診斷及治療的研究。發明人製備的抗rh-bFGF 1F11鼠mAb具有與rh-bFGF結合的活性和中和活性以及抑制bFGF刺激Balb/c3T3細胞生長的生物活性；用家兔矽肺實驗模型證實兔源抗bFGF抗體可明顯抑制其矽肺病理的形成。由於mAb的鼠源性限制了其在體內的治療，研製抗rh-bFGF人-鼠嵌合抗體，減少了抗bFGF抗體的鼠源性，為其體內治療的抗體藥物奠定基礎。因此，抗rh-bFGF人-鼠嵌合抗體，既可成為腫瘤治療的抗體靶向藥物，又可作為預防矽肺形成的抗體藥物。
長期以來，鼠源性mAb被廣泛地應用於科研、臨床診斷和治療，但由於鼠源性mAb可引起人抗鼠抗體(HAMA)反應，從而限制其在臨床中的應用。因此，進行鼠源性mAb的人源化改造實屬必要。目前，實現鼠源性mAb的人源化的方法，主要通過基因工程技術製備嵌合抗體和改型抗體；通過噬菌體展示抗體庫技術的強大篩選能力進行鏈替換，雖可將鼠源抗體的L、H鏈徹底人源化，但國內外眾多資料表明，前述的改型抗體及完全人源化抗體對於保留親本抗體的特異性及親和力的效果仍然極不理想。

發明內容
本發明的目的在於提供一種抗人重組鹼性成纖維生長因子嵌合抗體及其編碼基因。
本發明所述的一種抗人重組鹼性成纖維生長因子的嵌合抗體，包含(1)抗人重組鹼性成纖維生長因子(rh-bFGF)鼠源抗體的輕鏈(L鏈)可變區(V區)和人IgG1C的L鏈恆定區(C區)的L鏈；和(2)抗rh-bFGF鼠源抗體的重鏈(H鏈)V區和人IgG1C的H鏈C區的H鏈。
所述的L鏈V區含有如SEQ NO1列出的胺基酸序列。編碼所述的L鏈V區的胺基酸序列的DNA如下SEQ NO1VL基因M K L P V R LL V L M F W I P A S S S D1 ATGAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTGCTG ATGTTCTGGA TTCCTGCTTC CAGCAGTGAT-----------------------------------------------------------------V L M T Q T PL S L P V S L G D Q A S I61GTTTTGATGA CCCAAACTCC ACTCTCCCTG CCTGTCAGTC TTGGAGATCA AGCCTCCATCS C R S S Q SI V H S N G N T Y L E W Y121TCTTGCAGAT CTAGTCAGAG CATTGTACAT AGTAATGGAA ACACCTATTT AGAATGGTACL Q K P G Q SP K L L I Y K V S N R F S181CTGCAGAAAC CAGGCCAGTC TCCAAAGCTC CTGATCTACA AAGTTTCCAA CCGATTTTCTG V P D R F SG S G S G T D F T L K I S241GGGGTCCCAG ACAGGTTCAG TGGCAGTGGA TCAGGGACAG ATTTCACACT CAAGATCAGCR V E A E D LG V Y Y C F Q G S H V P Y301AGAGTGGAGG CTGAGGATCT GGGAGTTTAT TACTGCTTTC AAGGTTCACA TGTTCCGTACT F G GG T KL E I K R A D A A P T V361 ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GCTGGAAATA AAACGGGCTG ATGCTGCACC AACTGTAT所述的H鏈V區含有如SEQ NO2列出的胺基酸序列。編碼所述的H鏈V區的胺基酸序列的DNASEQ NO2VH基因M G C S W V M L F LV A T A T G V H S Q1 ATGGGATGCA GCTGGGTCAT GCTCTTTTTG GTAGCAACAG CAACAGGTGT CCACTCCCAG-----------------------------------------------------------------V Q L Q Q S G A E LV K P G A S V K L S61GTCCAACTGC AGCAGTCTGG GGCTGAACTG GTGAAGCCTG GGGCTTCAGT GAAGTTGTCCC K A S G Y T F T SY Y M Y W V K Q R P121TGCAAGGCTT CTGGCTACAC CTTCACCAGC TACTATATGT ACTGGGTGAA GCAGAGGCCTG Q G L E W I G E IN P S N G G T N F N181GGACAAGGCC TTGAGTGGAT TGGAGAGATT AATCCTAGCA ATGGTGGTAC TAACTTCAATE K F K S K A T L TV D K S S S T A Y M241 GAGAAGTTCA AGAGCAAGGC CACACTGACT GTAGACAAAT CCTCCAGCAC AGCCTACATGQ L S S L T S E D SA V Y Y C A S Q T A301CAGCTCAGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCGGTCTATT ACTGTGCAAG CCAGACAGCTR A T W F A Y W G QG S L V T V S A A S361 CGGGCTACGT GGTTTGCTTA CTGGGGCCAA GGGAGTCTGG TCACTGTCTC TGCAGCCTCCT K G P421 ACCAAGGGCC CA
所列的SEQ NO1和SEQ NO2的序列表中，用點式下劃線標記的序列是前導肽序列，用下劃線標記的序列是框架區序列，斜體序列是高變區序列。
本發明應用一套設計的引物從自主構建並培養的抗rh-bFGF鼠mAb雜交瘤細胞株中克隆出了抗rh-bFGF抗體的輕鏈、重鏈的可變區基因。用生物軟體VNTI8.0分析序列的結果表明，VH基因與Kabat資料庫中的鼠源VH基因進行同源性比較具有較高的同源性，且保守區序列與資料庫中VH基因高度一致。VL基因與Kabat資料庫中的鼠源VL基因進行同源性比較具有較高的同源性，且保守區序列與資料庫中VL基因高度一致，證實本發明人通過PCR技術從抗rh-bFGF鼠mAb雜交瘤細胞株中正確克隆出了抗rh-bFGF抗體的輕鏈、重鏈的可變區基因。
包含編碼SEQ NO1和SEQ NO2序列的DNA的表達載體，如pEF-dhfr1a或基因工程常用的其他表達載體。
所述的DNA載體轉化的宿主細胞，如CHO-dhfr-細胞或基因工程常用的其他表達細胞。
嵌合抗體真核表達的關鍵在於其表達的產量。為了實現嵌合抗體在真核細胞中的高表達，本研究採用了CHO-dhfr-細胞和攜帶dhfr基因的載體表達系統。該系統的優點是在不含有H(次黃嘌呤)、T(胸腺嘧啶)的選擇培養基中，只有轉化有攜帶dhfr基因的質粒pEF-dhfr1a的細胞才能存活，可方便的篩選出穩定表達外源基因的陽性細胞克隆。隨後向培養液中加入並逐漸增加MTX，可逐漸增強dhfr及外源目的基因的表達，從而大大增加了嵌和抗體的產量。
本發明的另一目的在於提供一種生產抗人重組鹼性成纖維生長因子的嵌合抗體，包括以下步驟培養如前所述的宿主細胞，回收所表達的抗體。
本發明首次從抗rh-bFGF鼠mAb 1F11雜交瘤細胞株中克隆出VL和VH基因及人lgG1的C區基因，將V區基因和C區基因融合成完整的L鏈和H鏈基因，再與表達載體連接並轉化CHO-dhfr-細胞，最後在真核細胞中成功地表達了抗rh-bFGF的人-鼠嵌合抗體。
本發明的另一目的在於提供含如前所述的嵌合抗體為活性成分的藥物組合物。
所述的嵌合抗體可用於製備預防矽肺形成的抗體藥物和腫瘤血管抑制治療的抗體靶向藥物。
與現有的抗rh-bFG改型抗體及完全人源化抗體相比，本發明所述的嵌合抗體更能夠較為理想地保留親本抗體的特異性及親和力。因而，從臨床應用的實際出發，嵌合抗體比改型抗體及完全人源化抗體更具有應用價值。已有研究證明，本發明所述的嵌合抗體在臨床包括腫瘤等疾病的治療中已取得較好的效果。美國FDA近年批准的抗體類生物製劑中，嵌合抗體佔有較重要的位置。本發明所述的抗rh-bFGF人-鼠嵌合抗體可作為預防矽肺形成的抗體藥物和腫瘤血管抑制治療的抗體靶向藥物，本研究為其臨床應用的研究奠定重要的基礎。進一步的工作將通過MTX增加嵌合抗體的表達量，或通過弱化載體DHFR基因來提高嵌合抗體的表達量，篩選高表達的細胞株，進行抗體功能和相關活性與穩定性的研究。


圖1是mAb 1F11VL基因PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析圖；圖中1是DL2000 Marker，2是Negative control(負對照)，3、5、7為Positiveresults(正結果)，4、6為Negative results(負結果)。
圖2是mAb 1F11VH基因PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析圖；圖中17是DL2000 Marker，2、5、6、7為Positive results(正結果)，1、3、4及8-16為Negative results(負結果)。
圖3是重組質粒pEF-dhfr1aL的酶切及PCR擴增鑑定圖；圖中1為DL15000 marker，2為plasmid pEF-dhfr1aL，3為pEF-dhfr1aL/EcoRI，4為pEF-dhfr1aL/EcoRl+SaII，5PCR擴增產物；6為DL2000 marker。
圖4是重組質粒pEF-dhff1aH的酶切及PCR擴增鑑定圖；圖中1為DL15000 marker，2為pEF-dhfr1a/EcoRI，3為質粒pEF-dhfr1aH，4為pEF-dhfr1aH/EcoRI+NotI，5為PCR擴增產物；6為DL2000 marker。
圖5是純化嵌合抗體的SDS-PAGE分析圖；圖中1為Protein marker，2為嵌合抗體的純化產物，3為IgG1。
具體實施例方式
本實施例所選用的分泌抗rh-bFGF鼠mAb 1F11雜交瘤細胞株為發明人所構建並保存。CHO-dhfr-細胞、質粒pMDHC、pMDLC及表達載體pEF-dhfr1a，均由軍事醫學科學院微生物流行病研究所應用分子生物學實驗室提供。ExTaq DNA聚合酶購自TaKaRa公司。質粒提取試劑盒購自Omega公司。內切酶購自Promega公司。Trizol試劑盒，細胞培養和轉染試劑，購自GibcoBRL公司。所用抗體均購自Sigma公司。
本實施例中，VL代表L鏈V區，VH代表H鏈V區，CL代表L鏈C區，CH代表H鏈C區。
(一)引物的設計與合成擴增VL基因上遊引物LL15′-GGGGCTAGCCACAATGGAGACAG ACACACTCCTGCTAT-3′；LL25′-GGGGCTAGCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG-3′；LL35′-GGGGCTAGCCACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA-3′；LL45′-GGGGCTAGCCACCATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKGT-3′；LL55′-GGGGCTAGCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTTG-3′；劃線處NheI的酶切位點；擴增VL基因下遊引物KC5′-TGGATGGT GGGAAGATGG-3′；JCK5′-GACAGATGGTGCAGCCACAGTCCGTTTTATTTCCAGCTTAGTC CC-3′；擴增VH基因上遊引物VHL15′-GGGGCTAGCCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATS CTCTT-3′；VHL25′-GGGGCTAGCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3′；VHL35′-GGGGCTAGCCACCATGGCTGCCTTGGGGCTGCTGTTCT-3′；VHL45′-GGGGCTAGCCACCATGATRGTGTTRAGTCTTYTGTRCCTG-3′；劃線處NheI的酶切位點；擴增VH基因下遊引物JCH15′-TGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCATGGTCCC-3′；JCH25′-TGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCC-3′；JCH35′-TGGGCCCTTGGTGGAGGCTGCAGAGACAGTGACCAGACTCCC-3′；JCH45′-TGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTCCC-3′；擴增人IgG1C區基因擴增引物擴增CL基因上遊引物HuCK55′-ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC-3′；擴增CL基因下遊引物HuCK35′-GGGGTCGACCT ATTAACACTCTCCCCTGTTG-3′；劃線處為SaII酶切位點。擴增CH基因上遊引物HuCH55′-GCCTC CACCAAGGGCCCATCGGTC-3′；擴增CH基因因下遊引物HuCH35′-GGGGCGGCCGCACTC ACCTGAGGAGACTGGTGAG-3′；劃線處為NotI酶切位點。
(二)mAb V區基因的克隆及序列測定從雜交瘤細胞1F11中提取總RNA，進行RT-PCR擴增，擴增產物回收純化，純化後的產物插入載體pMD-T中，分別取VH及VL基因的各2個克隆菌株送TaKaRa公司進行測序。
(三)人IgG1C區基因的克隆及序列測定以質粒pMDHC為模板，PCR擴增CH基因，以質粒pMDLC為模板，PCR擴增CL基因，擴增產物回收純化，純化後的產物插入載體pGEM-T中，分別取CH及CL基因的各2個克隆菌株送TaKaRa公司進行測序。
(四)mAb 1F11 VL和VH基因的克隆和序列讀定用VL基因的5個上遊引物和3個下遊引物及VH基因的4個上遊引物和4個下遊引物，從雜交瘤細胞1F11的總RNA中，用RT-PCR分別擴增出VL和VH基因片段，其中，VL的3個引物對LL1-KC、LL3-KC及LL5-KC，擴增出400bp左右的基因片段，其瓊脂糖凝膠電泳分析如圖1所示；VH的4個引物對VHL1-JCH2、VHL1-JCH3、VHL1-JCH4及VHL2-JCH3，擴增出420bp左右的基因片段，其瓊脂糖凝膠電泳分析如圖2所示。將PCR產物連接到載體pMD-T中，進行序列測定，測序後，經與Kabat資料庫的數據比較及用生物軟體VNTl8.0分析，可確定只有LL5-KC引物擴增出的418bp的VL基因片段和VHL1-JCH3引物擴增出的432bp的VH基因片段是正確的，VL基因的序列為336bp，其前方有57bp的前導肽序列，Vκ屬於VKII家族；VH基因的序列為357bp，其前有57bp的前導肽序列，VH屬於VHIIB。
(五)人-鼠嵌合抗體表達質粒的構建VL、CL與VH、CH基因經過融合PCR，形成完整的嵌合輕鏈基因VLCL和完整的嵌合重鏈基因VHCH。將VLCL基因用NheI/Sa/I雙酶切後，克隆到XbaI/Sa/I雙酶切的表達載體pEF-dhfr1a上，構建L鍊表達載體pEF-dhfr1aL，基因VHCH用NheI/NotI雙酶切後，連接到XbaI/NotI雙酶切的表達載體pEF-dhfr1a上，即可得到H鍊表達載體pEF-dhfr1aH。
L鍊表達載體pEF-dhfr1aL和H鍊表達載體pEF-dhfr1aH都以EF1-α為啟動子，並有篩選基因dhfr(二氫葉酸還原酶)，在CHO-dhfr-細胞中，可通過撤去培養基中的次黃嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)進行選擇陽性克隆，還可用MTX加壓篩選表達量高的單克隆細胞株。L鏈及H鍊表達質粒的PCR產物及酶切鑑定如圖3和圖4所示。
(六)CHO細胞的轉染和陽性克隆的加壓篩選接種1×105個CHO-dhfr-細胞於24孔細胞培養板中，用含100mL/L透析胎牛血清、0.03mmol/L次黃嘌呤(H)、0.003mmol/L胸腺嘧啶脫氧核苷(T)及1×105U/L青鏈黴素的IMDM培養基，於50mL/LCO2、37℃培養36h。採用Lipofect AMINETM2000試劑轉化。轉化後的細胞先採用不含H、T的選擇培養基培養進行篩選，待克隆形成後，再逐次採用含1×10-8mol/L及1×10-7mol/L的MTX的選擇培養基進行篩選。
(七)表達產物的ELISA檢測以2mg/L羊抗人IgG Fc按每孔100μL的量包被酶標板，依次加入轉化細胞的培養上清、羊抗人IgG Fc-HRP孵育，顯色後，讀取A490的值。對於陽性克隆，再加HRP-羊抗人κC抗體孵育，顯色後，讀取A490的值。挑選雙陽性反應的克隆，以2mg/L的rh-bFGF包被酶標板，每孔100μL。依次加入雙陽性反應克隆的細胞培養上清及羊抗人IgG Fc-HRP孵育，顯色後，讀取A490的值。
嵌合抗體基因的表達產物C區的ELISA檢測各取1μg L、H鏈嵌合抗體基因表達載體，轉化CHO-dhfr-細胞。約10d後，可見克隆生長，計數共約185個克隆。以2mg/L羊抗人IgG Fc抗體包被酶標板，依次加入185個克隆的培養上清及羊抗人IgG Fc抗體-HRP，根據A490的值，得到表達H鏈的陽性克隆為120個，其中高表達克隆為50個；再以2mg/L的羊抗人IgG Fc抗體包被酶標板，依次加入H鏈高表達的50個克隆的培養上清及HRP-羊抗人κC抗體，根據A490的值，得到表達L、H鏈的陽性克隆為32個，其中高表達的克隆為15個；在15個L、H鏈高表達的陽性克隆中，有的克隆L鍊表達量遠高於H鏈的表達量，而有的克隆恰相反，考慮到一個克隆中L、H鏈的表達量的匹配性，只得到5個較好的克隆株(I-67、I-348、I-786、VII-572、VII-863)，5個克隆中，在檢測表達的H鏈時，讀取的A490的值，分別為0.845、1.052、0.981、0.758及0.936，明顯高於陰性對照的A490值(0.068)；在檢測表達的L鏈時，讀取的A490的值，分別為1.120、1.357、1.268、0.926及1.184，也明顯高於陰性對照的A490值(0.072)，以上結果說明，嵌合抗體的C區得到了表達，並且其C區是人源的。
嵌合抗體的活性檢測以2mg/L rh-bFGF包被酶標板，加5株雜交瘤細胞(I-67、I-348、I-786、VII-572、VII-863)的混合培養上清，羊抗人IgGFc-HRP抗體為二抗(因為檢測的一抗Fc部分為人源的)，以mAb1F11作為陽性對照，羊抗鼠IgG-HRP抗體為二抗(因為檢測的一抗為鼠源的)，顯色後，讀取A490的值。樣品孔、陽性孔及陰性孔分別為0.312、0.378及0.065，結果表明表達的嵌合抗體與抗原有結合活性。
(八)嵌合抗體的純化收集轉化細胞的無血清培養上清約100mL，用400g/L飽和硫酸銨溶液沉澱過夜，以12000g離心30min，棄上清，加0.1mol/L磷酸鹽緩衝液溶解沉澱，並裝入透析袋中對0.1mol/L磷酸鹽溶液透析48h。以0.45μm的濾膜過濾後，超濾濃縮至10mL。並用Protein A親和層析柱，從2mL正常人血清中純化人源IgG1作為對照。
(九)嵌合抗體的SDS-PAGE分析分別取純化的嵌合抗體和對照樣品人源性IgG1後，進行還原性SDS-PAGE，用考瑪斯亮藍R-250染色。
將陽性細胞克隆用1×10-7mol/L的MTX的選擇培養基培養，待細胞長滿培養瓶後，改成無血清培養基，培養10d後，用400g/L的飽和硫酸銨溶液沉澱後，透析，再用超濾柱濃縮到10mL，進行還原SDS-PAGE，分析結果如圖5所示，在還原SDS-PAGE後顯示兩條帶，1條Mr為50000(重鏈)，另1條Mr為29000(輕鏈)。
(十)序列表(用Patent-In Version 3.2生成)SEQUENCE LISTINGSEQNO1-DNA110暨南大學120抗人重組鹼性成纖維生長因子的嵌合抗體及構建與用途130
1412004-03-081601170PatentIn version 3.22101211418212DNA213小鼠
4001atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120tcttgcagat ctagtcagag cattgtacat agtaatggaa acacctattt agaatggtac 180ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcaca tgttccgtac 360acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtat 418SEQUENCE LISTINGSEQNO1-PRO110暨南大學120抗人重組鹼性成纖維生長因子的嵌合抗體及構建與用途130
1412004-03-081601170PatentIn version 3.22101211139212PRT213小鼠4001Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala1 5 10 15Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile35 40 45Val His Ser Asn Gly Asn Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro50 55 60Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser65 70 75 80Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys100 105 110Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu115 120 125Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val130 135SEQUENCE LISTINGSEQNO2-DNA110暨南大學120抗人重組鹼性成纖維生長因子的嵌合抗體及構建與用途130
1412004-03-081601170PatentIn version 3.22101211432212DNA213小鼠
4001atgggatgca gctgggtcat gctctttttg gtagcaacag caacaggtgt ccactcccag 60gtccaactgc agcagtctgg ggctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagttgtcc 120tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc tactatatgt actgggtgaa gcagaggcct 180ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca atggtggtac taacttcaat 240gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag ccagacagct 360cgggctacgt ggtttgctta ctggggccaa gggagtctgg tcactgtctc tgcagcctcc 420accaagggcc ca432SEQUENCE LISTINGSEQNO2-PRO110暨南大學120抗人重組鹼性成纖維生長因子的嵌合抗體及構建與用途130
1412004-03-081601170PatentIn version 3.22101211144212PRT213小鼠4001Met Gly Cys Ser Trp Val Met Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly TyT Thr Phe35 40 45Thr Ser Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn65 70 75 80Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Ser Gln Thr Ala Arg Ala Thr Trp Phe Ala Tyr Trp115 120 125Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro130 135 140
權利要求
1.一種抗人重組鹼性成纖維生長因子的嵌合抗體，其特徵在於包含(1)抗人重組鹼性成纖維生長因子(rh-bFGF)鼠源抗體的輕鏈(L鏈)可變區(V區)和人IgG1C的L鏈恆定區(C區)的L鏈；和(2)抗rh-bFGF鼠源抗體的重鏈(H鏈)V區和人IgG1C的H鏈C區的H鏈。
2.根據權利要求1所述的嵌合抗體，其特徵在於所述的L鏈V區含有如SEQ NO1列出的胺基酸序列，SEQ NO1胺基酸序列如下M K L PV R LL V LM F W IP A SS S DV L M TQ T PL S LP V S LG D QA S IS C R SS Q SI V HS N G NT Y LE W YL Q K PG Q SP K LL I Y KV S NR F SG V P DR F SG S GS G T DF T LK I SR V E AE D LG V YY C F QG S HV P YT F G GG T KL E IK R A D A A PT V。
3.根據權利要求1所述的嵌合抗體，其特徵在於所述的H鏈V區含有如SEQ NO2列出的胺基酸序列，SEQ NO2胺基酸序列如下M G C SW V ML F LV A T AT G VH S QV Q L QQ S GA E LV K P GA S VK L SC K A SG Y TF T SY Y M YW V KQ R PG Q G LE W IG E IN P S NG G TN F NE K F KS K AT L TV D K SS S TA Y MQ L S SL T SE D SA V Y YC A SQ T AR A T WF A YW G QG S L VT V SA A ST K G P。
4.編碼如權利要求2所述的L鏈V區的胺基酸序列的DNA。
5.編碼如權利要求3所述的H鏈V區的胺基酸序列的DNA。
6.包含如權利要求4或5所述的DNA的表達載體。
7.用權利要求6所述的DNA載體轉化的宿主細胞。
8.一種生產抗人重組鹼性成纖維生長因子的嵌合抗體的方法，其特徵在於，包括以下步驟培養用包含如權利要求7所述的宿主細胞，回收所表達的抗體。
9.含如權利要求1所述的嵌合抗體為活性成分的藥物組合物。
10.如權利要求1所述的嵌合抗體用於製備預防矽肺形成的抗體藥物和腫瘤血管抑制治療的抗體靶向藥物的用途。
全文摘要
本發明公開了一種抗人重組鹼性成纖維生長因子嵌合抗體及其編碼基因。本發明所述的一種抗人重組鹼性成纖維生長因子的嵌合抗體，包含抗人重組鹼性成纖維生長因子(rh－bFGF)鼠源抗體的輕鏈(L鏈)可變區(V區)和人IgG1C的L鏈恆定區(C區)的L鏈；和抗rh－bFGF鼠源抗體的重鏈(H鏈)V區和人IgG1C的H鏈C區的H鏈。本發明所述的嵌合抗體可用於製備預防矽肺形成的抗體藥物和腫瘤血管抑制治療的抗體靶向藥物。
文檔編號C07K19/00GK1560082SQ20041001558
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月8日 優先權日2004年3月8日
發明者向軍儉, 鄧寧, 李洪慶, 楊紅宇 申請人:暨南大學