一種淡水小龍蝦mt基因表達模式用於水體質量評價的方法
2024-01-24 22:12:15 1
一種淡水小龍蝦mt基因表達模式用於水體質量評價的方法
【專利摘要】本發明涉及一種淡水小龍蝦MT基因表達模式用於水體質量評價的方法，屬於環境生物【技術領域】。本發明利用淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因（MT基因）表達模式進行工業汙水的水體質量評價。本發明首次從淡水小龍蝦的肝胰腺組織中克隆到金屬硫蛋白基因（MT基因），通過工業汙水脅迫實驗證明該基因與淡水小龍蝦對抗水環境脅迫的生理反應相關，淡水小龍蝦受到汙水脅迫之後的金屬硫蛋白基因（MT基因）的表達模式能夠反映水體汙染的程度。因此，本發明對應用生物技術方法評價受汙染水體的質量以及存在的潛在生態毒理效應提供了一種全面、快速的技術手段，在環境保護方面具有較為廣泛的應用前景。
【專利說明】一種淡水小龍蝦MT基因表達模式用於水體質量評價的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種淡水小龍蝦MT基因表達模式用於水體質量評價的方法，屬於環境生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]隨著我國經濟快速發展的同時，從中央到地方的各級政府十分重視環境保護的問題。在解決經濟需要快速發展與環境保護問題日趨嚴重的矛盾的過程中，各級政府都制定了十分嚴格的規章制度和處理措施，尤其是將水體環境保護工作作為了首要任務。從歷年來頻繁出現的水體受汙染之後引起的重大環境與居民身體健康問題來看，水環境的保護工作刻不容緩。以頻繁出現的企業惡意排汙造成的水體汙染與當地居民癌症發生率激增的問題來看，各級環境保護部門對於所轄企業在生產過程中產生的汙水的監管與檢測，需要更為嚴格、科學、全面的檢測手段，對於汙水的處理需要更為科學的技術。
[0003]目前，在檢測相關企業在生產過程中產生的汙水是否達到相關排放標準，各級環保部門通常採用的檢測方法是化學檢測法。化學檢測方法主要是通過以標準物質作為參照，通過儀器的測定來確定被檢測水樣中的汙染物的種類與濃度。通過多次反覆測定，化學檢測法可以確定出被檢測水樣中存在的汙染物的種類與濃度，與相關排放標準比較之後，可以確定是否達到排放要求。但是，在這個檢測過程中，存在一個較大的化學與生物學問題，如果一個被檢測的水樣通過化學檢測法的結果來看，發現樣品中存在的多個汙染物的含量並沒有超過國家標準，說明已經達到了排放的要求。但是，從生物學的效應累加角度來看，水體中所有沒有超標的汙染物對於生物體的影響作用累加起來，就有可能會造成較為嚴重的後果，尤其是對於人的身體健康的影響。
[0004]淡水小龍蝦學名為克氏原螯蝦，在`我國南方和北方都有養殖，它是一個非常常見的甲殼類動物的模式生物，對於生物學試驗的研究結果具有一定的指示作用，因為淡水小龍蝦便於獲得，易於飼養，同時又具有代表意義，所以非常適合作為水體環境質量的指示生物。淡水小龍蝦MT基因的全稱是金屬硫蛋白基因，它在小龍蝦受到外界環境脅迫刺激的過程中，會通過調整自身的基因表達量來實現對抗環境脅迫的作用，來進行自身保護，它是一個非常好的能夠反映外界環境脅迫程度的指示基因。而淡水小龍蝦18S rRNA基因是動物體中的一個持家基因，不論在什麼條件的脅迫刺激作用下，18S rRNA基因的表達量不會受到影響。因此，通過將淡水小龍蝦MT基因的表達情況與18S rRNA基因進行比較，就可以獲得環境脅迫刺激作用下的淡水小龍蝦MT基因的相對表達量，來進一步反映環境的汙染情況。
[0005]長期以來，對於水體是否受到汙染，環境保護部門多採用化學檢測的方法，這種方法存在檢測手段單一，不能全面說明受汙染水體存在的潛在生物學安全問題，而且，這種方法不能夠從生物學角度來合理說明水體汙染的生態毒理效應。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在於提供一種快速、全面檢測水體質量的一種淡水小龍蝦MT基因表達模式用於水體質量評價的方法，該方法利用基因表達模式來定性評價水體汙染產生的生態毒理效應。
[0007]技術解決方案:
[0008]本發明採用MT基因的表達模式進行水體質量評價。
[0009]本發明的具體方法如下:
[0010]I)汙水水樣的預處理:對汙水原水進行稀釋，稀釋倍數為原水的5倍-10倍；
[0011]2)汙水脅迫刺激:將步驟(I)中稀釋後的汙水分成三組，將小龍蝦分別放入，同時進行平行試驗，小龍蝦的放入數量以保證每個取樣時候時間點都有活的小龍蝦；
[0012]3)模板製作:採用總RNA提取聯合cDNA反轉錄合成的方法製作cDNA樣品；
[0013]4)實時螢光定量PCR技術確定MT基因的表達模式:以步驟(3)製備的cDNA樣品作為模板進行實時螢光定量PCR，過程中使用的淡水小龍蝦MT基因擴增引物為MT-qRT-F引物:5'_gagtgtgccgagggcgggt_3'，MT_qRT_R 引物:5'_gcagggcttggagcaggtc_3'，擴增作為內參的淡水小龍蝦18S rRNA基因的引物是18S_qRT_F引物:5'-tcttcttagagggattagcgg-3', 18S_qRT_R 引物:5'_aaggggattgaacgggtta_3',具體擴增程序的反應條件為:95°C預變性3min,之後為反覆進行的40個循環,每個循環設置為:95°C變性30s，59°C退火30s，從55°C _95°C按照每秒升高0.5°C的進度進行退火，獲得反應過程對應的溶解曲線，並且進行Ct值讀數；
[0014]5)定性評價淡水小龍蝦MT基因的表達模式與水樣汙染程度之間的關係:對步驟
(4)溶解曲線讀取的Ct值數據進行分析，數據分析的具體方法為:數據的計算形式為其中每一個時間點的ACt=(MT基因平均Ct值-18S rRNA基因平均Ct值)，之後利用excell數據分析工具，以脅迫時間作為橫坐標，以2-Λ Ct值作為縱坐標來繪製柱形圖，最後要以正常組淡水小龍蝦的值作為參照，採用T檢驗的數據分析方法分析其他各個取樣時間點的數值與正常組淡水小龍蝦的數值之間的顯著性差異，當淡水小龍蝦MT基因的最高相對表達量對應的數值與正常組淡水小龍蝦的2_Aet數值之間存在顯著性差異的時候，確定為重度汙染，當淡水小龍蝦MT基因的最高相對表達量對應的2_δμ數值與正常組淡水小龍蝦的?似數值之間存在極顯著差異的時候，確定為嚴重汙染。
[0015]本發明的優點:
[0016]本發明採用基因表達模式的方法評價水體汙染的情況，能夠深入反映水體汙染存在的潛在生態安全問題，技術操作簡單，便於環保部門從事水體質量檢測的相關人員使用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1為汙水脅迫刺激後淡水小龍蝦MT基因的表達模式圖。
【具體實施方式】
[0018]實施例1:
[0019]某金屬冶選尾礦庫滲漏汙水的水體質量評價與潛在生態毒理效應分析
[0020]圖1中，縱坐標數值為2_"et，橫坐標數值為時間，*表示此數值與正常對照組相比，
差異顯著。[0021]I)水樣預處理:取某金屬冶選尾礦庫滲漏汙水(原水)5L-10L備用，用蒸餾水稀釋5倍之後平均分為3份(作為3組平行試驗)，獲得3組水樣；
[0022]2)汙水脅迫刺激小龍蝦:將體重為20g_30g的淡水小龍蝦放入步驟(I)中的3組水樣之中，每組水樣飼養小龍蝦30隻，取樣時間點為脅迫刺激之後的6h、12h、24h、48h、72h，注意:每次取樣的小龍蝦必須為活的小龍蝦，死亡的小龍蝦不作為研究對象，同時，沒有經過汙水脅迫刺激的小龍蝦作為正常對照組；
[0023]3)總RNA的提取與cDNA的反轉錄合成:將正常對照組的小龍蝦，脅迫刺激之後的6h、12h、24h、48h、72h時間點上採集的小龍蝦在超淨工作檯中無菌條件下摘取肝臟組織，每一隻小龍蝦的肝臟取樣量為30mg-50mg，每一個時間點的3隻小龍蝦的肝臟混合在一起進行肝臟總RNA的提取，總RNA的提取利用上海生工生物工程有限公司生產的Total RNAExtractor (Trizol)動物總RNA快速抽提試劑盒進行；cDNA的反轉錄合成採用上海生工生物工程有限公司生產的一步法RT-PCR擴增試劑盒(M-MuLV)進行，獲得各個取樣時間點淡水小龍蝦肝臟的cDNA樣品，合成的各個cDNA樣品要求存放在_80°C冰箱之中；[0024]4)實時螢光定量PCR技術確定MT基因的表達模式:以步驟(3)中製備的正常小龍蝦肝臟和脅迫刺激後各個時間點的小龍蝦肝臟cDNA樣品作為模板，以淡水小龍蝦18S rRNA基因作為參照，進行淡水小龍蝦的MT基因表達模式的實時螢光定量PCR分析，實時螢光定量PCR過程中，擴增MT基因的引物序列為MT-qRT-F引物:5'-gagtgtgccgagggcgggt-3', MT-qRT-R 引物:5'-gcagggcttggagcaggtc-3',擴增 18SrRNA基因的引物序列為 18S_qRT_F 引物:5'-tcttcttagagggattagcgg-3', 18S_qRT_R 引物:5' -aaggggattgaacgggtta-3',實時突光定量PCR分析過程中使用的儀器是美國Bio-Rad公司製造的real-time thermal cycler,使用的試劑盒是寶生物工程(大連)有限公司生產的SYBR Premix EX TaqCPerfect Real time染料法實時螢光定量試劑盒)，實時螢光定量PCR具體擴增程序的反應條件為:95°C預變性3min，之後為反覆進行的40個循環，每個循環設置為:95°C變性30s，59°C退火30s，從55°C _95°C按照每秒升高0.5°C的進度進行螢光數值讀取，獲得反應過程對應的溶解曲線，並且讀取Ct值，數據的處理方式採用2_Λα，其中每一個時間點的ACt= (MT基因平均Ct值-18S rRNA基因平均Ct值)，之後，以脅迫時間作為橫坐標數值，以每一個時間點對應的2_Λα值作為縱坐標數值，用excel繪圖工具來繪製柱形圖，顯著性差異的分析採用常規的T檢驗的數據分析法；
[0025]5)定性評價淡水小龍蝦MT基因的表達模式與水樣汙染程度之間的關係:在獲得步驟(4)中繪製的excel柱形圖之後，以正常組淡水小龍蝦的2_唚值作為參照，採用T檢驗的數據分析方法分析其他各個取樣時間點的數值與正常組淡水小龍蝦的2_Aet數值之間的顯著性差異，當淡水小龍蝦MT基因的最高相對表達量對應的2_Λα數值與正常組淡水小龍蝦的數值之間存在顯著性差異的時候，確定為中度汙染，當淡水小龍蝦MT基因的最高相對表達量對應的?似數值與正常組淡水小龍蝦的2_Aet數值之間存在極顯著差異的時候，確定為嚴重汙染。
[0026]本次實驗中各個取樣時間點對應的2_"et數值以及相對於正常對照組(Oh對照組)的變化情況見下表1，分別顯示了取樣時間、各個取樣時間點對應的淡水小龍蝦MT基因相對表達量的2_ΛΜ數值，以及相對於正常對照組(Oh對照組)淡水小龍蝦的2_Λα數值的變化情況，其中，淡水小龍蝦MT基因最高相對表達量出現在汙水脅迫刺激之後的24h，上升倍數為4.771倍，而且與對照組相比較存在顯著差異，可以確定屬於中度汙染，可以判定為存在較為嚴重的生態毒理效應，結果如圖1。
[0027]表I各個取樣時間點對應的2_δμ數值以及變化情況
【權利要求】
1.一種淡水小龍蝦MT基因表達模式用於水體質量評價的方法，其特徵在於，採用MT基因表達模式進行水體質量評價。
2.根據權利要求1所述的一種淡水小龍蝦MT基因表達模式用於水體質量評價的方法，其特徵在於，包含以下步驟: 1)汙水水樣的預處理:對汙水水樣進行稀釋，稀釋倍數為汙水水樣的5倍-10倍； 2)汙水脅迫刺激:將步驟(I)中稀釋後的汙水分成三組，將小龍蝦分別放入進行脅迫刺激，同時進行平行試驗，小龍蝦的放入數量要保證每個取樣時間點都有活的小龍蝦可取； 3)模板制製備:採用總RNA提取與cDNA的反轉錄合成聯合的方法來製備cDNA； 4)實時螢光定量PCR技術確定MT基因的表達模式:以步驟(3)製備的cDNA作為模板進行實時螢光定量PCR，過程中使用的淡水小龍蝦MT基因擴增引物為MT-qRT-F引物:5'-gagtgtgccgagggcgggt-3', MT-qRT-R 引物:5'-gcagggcttggagcaggtc-3'，擴增作為內參的淡水小龍奸18S rRNA基因的引物是18S_qRT_F引物:5'-tcttcttagagggattagcgg-3',18S-qRT-R引物:5'_aaggggattgaacgggtta_3',具體擴增程序的反應條件為:95°C預變性3min，之後為反覆進行的40個循環，每個循環設置為:95°C變性30s，59°C退火30s，從55°C _95°C按照每秒升高0.5°C的進度進行退火，獲得反應過程對應的溶解曲線，並且進行Ct值讀數； 5)定性評價淡水小龍蝦MT基因的表達模式與水樣汙染程度之間的關係:對步驟(4)溶解曲線讀取的Ct值數據進行分析，數據分析的具體方法為:數據的計算形式為2_Aet，其中每一個時間點的ACt= (MT基因平均Ct值-18S rRNA基因平均Ct值)，之後利用excell數據分析工具，以脅迫時間作為橫坐標，以2_Λα值作為縱坐標來繪製柱形圖，最後要以正常組淡水小龍蝦的值作為參照，採用T檢驗的數據分析方法分析其他各個取樣時間點的2-"ct數值與正常組淡水小龍蝦的數值之間的顯著性差異，當淡水小龍蝦MT基因的最高相對表達量對應的數值與正常組淡水小龍蝦的數值之間存在顯著性差異的時候，確定為中度汙染，當淡水小龍蝦MT基因的最高相對表達量對應的2_δμ數值與正常組淡水小龍蝦的?似數值之間存在極顯著差異的時候，確定為嚴重汙染。
【文檔編號】G01N21/64GK103451297SQ201310403798
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月6日 優先權日:2013年9月6日
【發明者】杜志強, 張雪峰, 王建英 申請人:內蒙古科技大學