蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因ldc及其編碼的蛋白與應用的製作方法
2024-02-27 14:26:15
專利名稱：蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因ldc及其編碼的蛋白與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，主要涉及通過合成蛇足石杉cDNA、PCR和重組表達技術獲得賴氨酸脫羧酶基因及其編碼產物，屬於藥用植物基因工程領域。
背景技術：
藥用植物有效成分(次生代謝產物)的形成是植物次生代謝途徑中特有基因群的產物。隨著植物功能基因組研究的廣泛與深入，獨具特色又有廣闊應用前景的藥用植物次生代謝合成相關功能基因的研究逐漸成為研究的熱點，這些基因的克隆將為解析藥用植物有效成分的生物合成途徑及其調控機制和解釋藥材品質的形成提供理論基礎，同時為利用生物技術提高目標成分含量或直接生產有效成分或中間體帶來廣闊的應用空間。蛇足石杉[Huperzia serrata(Thumb.)Trev.]是石松類石松科石松屬植物,作為傳統中草藥在我國民間已有上千年的用藥歷史，其所含石杉鹼甲次生代謝物是一類高效、低毒、可逆且具有選擇性的乙醯膽鹼酯酶(AchE)抑制劑，治療重症肌無力和早老年性痴呆療症效顯著，是新一代炙手可熱的治療老年痴呆的藥物。目前所知在蛇足石杉石松類生物鹼生物合成途徑中，賴氨酸脫羧酶(lysine decarboxylase,LDC)是蛇足石杉石杉鹼甲合成途徑的第一個酶，是植物次生代謝途徑的關鍵酶之一，對蛇足石杉具有非常重要的生理意義。因此賴氨酸脫羧酶基因的獲得，為用基因工程手段提高蛇足石杉有效部位的含量提供重要基礎。在本次發明被公布之前，尚未有任何公開或報導過本專利申請中所提及的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因及其胺基酸序列。
發明內容
本發明的目的在於提供一種蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因(LDC)。本發明的第二個目的是提供該基因編碼的蛋白質。本發明還提供了含有該基因的重組載體和宿主細胞。本發明的另一個目的在於提供該基因的應用。本發明所提供的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶(LDC)，為以下核苷酸序列之一:(I) SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.3 的 DNA 序列；(2)在嚴格條件下與SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3的DNA序列雜交且編碼具有蛇足石杉賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質分子的DNA分子；(3)編碼SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4所示胺基酸序列的核苷酸序列；(4)編碼對SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4經添加、取代、插入或缺失一個或多個胺基酸且具有蛇足石杉賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質的核苷酸序列。本發明所提供的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶(LDC)，其特徵在於，是以下胺基酸序列之具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4所示的胺基酸序列；SEQ ID N0.2和 SEQ ID N0.4經添加、取代、插入或缺失一個或多個胺基酸且具有蛇足石杉賴氨酸脫羧酶活性的序列；含有本發明的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因全序列或部分序列的重組載體，如原核類載體，真核類表達載體及RNAi載體均屬於本發明的保護範圍；含有本發明的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因全序列或部分序列的宿主細胞，如含有上述的重組載體的宿主細胞也屬於本發明的保護範圍；所述宿主細胞為有價值的活性材料。本發明的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因的應用，包括用所述的重組載體，如植物表達載體轉化植物細胞；或者用所述含有該基因的農桿菌與植物細胞共培養，得到轉基因的植物髮根系；或者用所述的髮根細胞再生植株；或者用所述的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因全序列或部分序列轉化獲得轉基因生物體。本發明技術方案中涉及的概念具體內容如下:所說的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因的DNA分子包括:編碼具有賴氨酸脫羧酶活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3中的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55°C條件下與SEQ IDN0.1和SEQID N0.3中從核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4所示的胺基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID N0.1中從核苷酸第1-639位和SEQ ID N0.3中從核苷酸第1-609位的核苷酸序列。本發明分離出的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因多肽包括:具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4序列的多肽。 本發明中術語「蛇足石杉賴氨酸脫羧酶(或多肽)」基因(LDC)指:編碼具有蛇足石杉賴氨酸脫羧酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1中第1-639位核苷酸序列及簡併序列，和SEQ ID N0.3中第1-609位核苷酸序列及簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQID N0.1序列編碼框第1-639位和SEQ ID N0.3序列編碼框第1_609位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3中核苷酸序列同源性低至約70%的簡併序列也能編碼出SEQ ID N0.2和和SEQ ID N0.4所述的序列。還包括能在中度嚴謹條件下，更佳的在高度嚴謹條件下與SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3中的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還包括與SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3中的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。還包括能編碼具有與天然的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶相同功能的蛋白的SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於):若干個(通常為，1-90個，較佳地，1-60個，更佳地1-20個，最佳地，1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5』和/或3』端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。本發明術語「蛇足石杉賴氨酸脫羧酶蛋白或多肽(LDC) 」指:具有蛇足石杉賴氨酸脫羧酶活性的SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4序列的多肽。該術語還包括具有與天然蛇足石杉賴氨酸脫羧酶相同功能的SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於):若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。有比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括蛇足石杉賴氨酸脫羧酶的活性片段和活性衍生物，還包括能夠可操作地連於信號肽、啟動子或者核糖體結合位點序列所組成的衍生物。本發明的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶多肽的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導變異體、在高或低的嚴謹條件下能與蛇足石杉賴氨酸脫羧酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用蛇足石杉賴氨酸脫羧酶多肽的血清獲得的多肽或蛋白。本發明中蛇足石杉賴氨酸脫羧酶保守性變異多肽指:與SEQ ID N0.2和SEQIDN0.4的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個胺基酸性質相似或相近的胺基酸所替代而形成的多肽。本發明還包括賴氨酸脫羧酶或多肽的類似物。這些類似物與天然蛇足石杉賴氨酸脫羧酶多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘導劑而產生隨機誘變，還可以通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。所述修飾(通常不改變一級結構)形式包括:體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化修飾的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。在生產本發明中的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶多肽時，可以將蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因的核苷酸序列可操作地連 於表達調控序列，從而形成蛇足石杉賴氨酸脫羧酶表達載體。所述「可操作地連於」指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA ;如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，「可操作地連於」意味著相鄰，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。本發明中宿主細胞為原核細胞或真核細胞。常用的原核宿主細胞包括大腸桿菌；常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、菸草細胞和其他植物細胞。本發明還可用Northern印跡法技術分析蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因產物的表達，即分析蛇足石杉賴氨酸脫羧酶的RNA轉錄物在細胞中的存在和數量。此外，本發明可用作探針的核酸分子通常具有蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因核苷酸編碼序列的8-100個連續核苷酸，較佳地具有15-50個連續核苷酸。該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼蛇足石杉賴氨酸脫羧酶的核酸分子。本發明涉及檢測樣品中是否存在蛇足石杉賴氨酸脫羧酶核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然後檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增後的產物，其中PCR擴增引物對應於蛇足石杉賴氨酸脫羧酶核苷酸編碼序列，並可位於該編碼序列兩側或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。此外，根據本發明的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶核苷酸序列和胺基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質的同源性基礎上，篩選蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因或同源蛋白。本發明的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶的基因家族的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。一旦獲得了有關序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。除了用重組法產生之外，本發明的蛋白片段還可用固相技術，通過直接合成肽而加以生產。在體外合成蛋白可以用手工或自動進行。可以分別化學合成本發明蛋白的各片段，然後用化學方法加以連接以產生全長的分子。利用本發明的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶，通過各種常規篩選方法，可篩選出與蛇足石杉賴氨酸脫羧酶發生相互作用的物質，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。本發明提供的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因是首次從蛇足石杉中克隆製備的，填補了我國藥用植物蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因的空白。賴氨酸脫羧酶是蛇足石杉中石杉鹼甲生物合成途徑的第一個酶，即入口酶，是植物次生代謝途徑的關鍵酶之一，故通過賴氨酸脫羧酶基因的轉基因技術將會提高石杉鹼甲等石松生物鹼類物質的含量。蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因可通過轉基因技術用於提高蛇足石杉石杉鹼甲含量的研究和產業化，尤其可用於中藥材蛇足石杉品質的改良，對提高蛇足石杉石松類生物鹼產量具有較好的促進作用，具有很好的應用前景。
圖1:蛇足石杉cDNA的PCR擴增電泳圖；圖2:大腸桿菌重組表達載體pET_32a(+)/LDC構建圖；圖3:重組賴氨 酸脫羧酶表達SDS-PAGE圖；M，蛋白質分子量標準；1、2、3，重組菌[pET-32a(+)/LDCl]破壁後的上清液和沉澱及全菌；4、5、6，重組菌[pET_32a(+)/LDC2]破壁後的上清液和沉澱及全菌；ct，空載體重組菌；圖4:重組賴氨酸脫羧酶的純化SDS-PAGE圖；M，蛋白質分子量標準；LDC1:純化的重組蛋白LDCl ；LDC2:純化的重組蛋白LDC2 ；圖5:重組賴氨酸脫羧酶活性TCL檢測圖；1，屍胺標準品；2、3，重組蛋白LDCl和LDC2 ;4、5，滅活的重組蛋白LDCl和LDC2 ;6、7，不添加賴氨酸底物；8，空載體重組菌液；9，賴氨酸標準品。Cad，屍胺。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施例1、蛇足石杉cDNA的合成1、蛇足石杉總RNA的提取與檢測取蛇足石杉(Huperzia serrata)嫩葉2g,在研缽中用液氮快速研磨成粉末，快速轉移至 65°C 預熱的 IOmL 提取緩衝液中[CTAB (W/V) 2 %，Tris-HCl (pH8.0) IOOmmoI/L，EDTA25mmol/L, NaC12.0mol/L，PVP402 %，亞精胺 0.5g/L，巰基乙醇 2% ]，充分振蕩混勻；用等體積氯仿抽提2次，7500g離心15min。上清液加入1/4體積的IOM LiCl,混合後放置 4 °C 沉澱過夜；7500g 離心 20min,沉澱用 500 u L SSTE[SDS0.5 %, NaClImoI/L,Tris-HCl (pH8.0) 10mmol/L, EDTAlmmol/L],在 65°C溶解 5min。用等體積氯仿抽提，13000g離心5min，上清液加入2倍體積無水乙醇，_70°C放置2h，4°C 13000g離心20min，沉澱室溫乾燥IOmin後溶於100 u L DEPC處理的水中，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用Eppendorf核酸定量儀測定A260、A280比值和濃度。置於_80°C冰箱備用。2、反轉錄合成cDNA米用mRNA純化試劑盒(PolyATractmRNA isolation system III,Promega公司)分離mRNA後,採用TaKaRa公司提供的PrimeScript反轉錄試劑盒,合成蛇足石杉mRNA第一互補鏈DNA。實施例2、賴氨酸脫羧酶基因的克隆從NCBI中搜索賴氨酸脫羧酶基因相關的核苷酸序列和EST序列，通過比對分析，利用vector NTI軟體設計一對擴增引物LDC-F (ATGGAAGCGTTCATT GATCCG)和LDC-R(TTATACCAGACGITCAATCTCCC)。以蛇足石杉的cDNA為模板，按照以下體系[IOXEx PCRbuffer5.0uL, dNTP ( 2.5mM) 4.0 y L，引物 LDC-F 和 LDC-R(IOpmol)各 1.0y L, Ex Taq 聚合Bl0.25 u L，cDNA4.0uL,補加ddH20至終體積50.0uL]擴增LDC基因；反應程序:94°C預變性 5min ;94°C變性 30s，52°C退火 30s，72。。延伸 lmin,30 個循環；72°C終延伸 10min,4°C保存。擴增結果於I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。利用TaKaRa公司的Agarose Gel DNAFragment Recovery Kit Ver.2.0純化PCR產物,然後克隆至pMD 19-T載體，篩選陽性克隆子提取質粒送TaKaRa公司測序，獲得蛇足石杉賴氨酸脫羧酶相關基因序列。利用VectorNTI軟體分析，發現兩序列均具有完整開放閱讀框，長度分別為639bp和609bp，分別可編碼212個和202個胺基酸，將兩基因分別命名為LDCl和LDC2。實施例3、賴氨酸脫羧酶基因的原核表達1、原核表達載體的構建[45]分另Ij以T載體中的LDCl和LDC2為模板，利用引物Pl(CATGCCATGGAAGCGTTCATTGATCCG)和 P2(CCGCTCGAGTTATACCAGACGTTCAATCTC)進行 PCR反應，擴增產物經電泳檢測和純化後，用限制性內切酶Nco I和Xho I於37°C酶切2h，採用回收試劑盒(Takara公司，中國)純化酶切產物；同時利用Nco I和Xho I在37°C酶切pET-32a(+)載體2h，利用試劑盒回收大片段。將回收的兩個片段混合，在DNA連接酶作用下於16°C反應12h，連接產物利用CaCl2法轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，在氨苄和氯黴素抗性平板上進行抗性篩選，並對克隆子進行全菌PCR檢測，將陽性克隆子接入LB液體培養基中培養，提取重組質粒，進行Nco I和Xho I雙酶切分析，瓊脂糖凝膠電泳鑑定完全酶切後存在兩個片段，表明表達載體構建成功。分別命名為:pET-32a(+) /LDCl 和 pET_32a (+)/LDC2 (圖 2)。2、賴氨酸脫羧酶基因的表達將篩選獲得的陽性克隆子接種到含有氨苄青黴素(終濃度100 U g/mL)和氯黴素(終濃度170 u g/mL)的LB液體培養基中，37°C 150r/min培養3_4h後利用分光光度計檢測菌體密度，0D_約為1.0時添加IPTG (終濃度260 u g/mL)誘導表達，繼續培養4h，取ImL菌液於1.5mL離心管中，離心收集菌體，用ImL的PBS(50mM pH7.0)洗滌和重懸菌體，重懸菌液分2份，其中一份加入2 ii L溶菌酶(lOOmg/mL)，室溫靜置IOmin後在液氮中反覆凍融3次，12000rpm離心IOmin,分別收集上清液和沉澱。分別在上清、沉澱、全菌中加入等體積的2Xloading buffer,沸水浴3min,短暫離心後使用12%的SDS-PAGE電泳檢測分析(圖3)。由圖3可知，與空載體重組菌株[pET-32a(+)]比較，重組菌[pET_32a(+)/LDC1]和重組菌[pET-32a(+)/LDC2]均多出一條蛋白條帶，表明LDCl和LDC2基因均獲得表達；重組菌經過破壁處理分成上清液和沉澱兩部分，其中上清部分目的蛋白表達量低於沉澱部分，表明LDCl和LDC2可溶性表達量比較低(見圖3中的泳道I和4)。實施例4、重組賴氨酸脫羧酶的純化和活性鑑定1、重組賴氨酸脫羧酶的純化大量培養 重組菌株，經IPTG誘導表達，收集菌體，PBS反覆洗滌3次，使用N1-NTASefinoseTM Resin蛋白純化試劑盒(上海生工)中的binding buffer重懸菌體,溶菌酶酶解，冰浴超聲破碎細胞，12000rpm離心30min收集上清；根據融合蛋白上的His-Tag採用N1-NTA純化柱純化重組賴氨酸脫羧酶，分管收集純化液，12%的SDS-PAGE電泳檢測純化效果(圖4泳道LDCl和LDC2)。2、重組賴氨酸脫羧酶活性鑑定在磷酸鉀緩衝液(100mM，pH8.0)中配製酶反應體系，使各試劑終濃度分別為:磷酸吡哆醛(PALP)0.20mM、賴氨酸10.0mM、重組賴氨酸脫羧酶1.00mg/mL。將反應體系置於37°C水浴鍋中至反應混合液出現渾濁時停止反應。薄層層析(TLC)檢測:向反應液中加入I滴濃鹽酸，然後加入少量氯仿劇烈震蕩混勻，IOOOOrpm離心IOmin棄去不溶物，氮吹儀40°C吹乾，乾燥後的殘渣用IM的HCl溶解，取溶解液利用丹磺醯氯進行衍生反應；同時對賴氨酸和屍胺標準品進行丹磺醯氯衍生。經過衍生後萃取濃縮衍生物進行TLC檢測，採用全自動點樣儀(CAMAG ATS4)點樣、全自動展開儀(CAMAGADC2)展開(展開劑為氯仿、乙醚、三乙胺，配比為8: I: 2)，然後使用TLCVisualizer (CAMAG)進行檢測成像。由圖可知，重組蛋白LDCl和LDC2均能催化賴氨酸脫羧基生成屍胺(圖5中泳道2和3);水煮滅活的重組蛋白(圖5中泳道4和5)和不加底物賴氨酸的反應體系(圖5中泳道6和7)以及空載體重組菌液反應體系(圖5中泳道8)中均不產生屍胺。結果表明重組蛋白LDCl和LDC2均具有賴氨酸脫羧酶活性，更證明我們從蛇足石杉中克隆的兩個基因LDCl和LDC2是賴氨酸脫羧酶基因。應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬於本發明所附權利要求的保護範圍。
權利要求
1.一種蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因LDC，其特徵在於，它是下列核苷酸序列之一:(1)SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.3 的 DNA 序列； (2)在嚴格條件下與SEQID N0.1和SEQ ID N0.3的DNA序列雜交且編碼具有 蛇足石杉賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質分子的DNA分子； (3)編碼SEQID N0.2和SEQ ID N0.4所示胺基酸序列的核苷酸序列； (4)編碼對SEQID N0.2和SEQ ID N0.4經添加、取代、插入或缺失一個或多個胺基酸且具有蛇足石杉賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質的核苷酸序列。
2.權利要求1所述的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因LDC編碼蛋白，其特徵在於，是以下胺基酸序列之一: (1)具有SEQID N0.2和S EQ ID N0.4所示的胺基酸序列； (2)SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4經添加、取代、插入或缺失一個或多個胺基酸 且具有蛇足石杉賴氨酸脫羧酶活性的序列。
3.重組載體，其特徵在於:含有權利要求1所述的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因全部或部分序列。
4.宿主細胞，其特徵在於:含有權利要求1所述的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因全部或部分序列。
5.權利要求1所述的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因LDC和權利要求2所述的胺基酸序列在蛇足石杉育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因LDC及其編碼的蛋白與應用，該基因為首次從蛇足石杉的cDNA中獲得，填補了我國傳統中藥材蛇足石杉中分子克隆出賴氨酸脫羧酶基因的空白。本發明所提供的賴氨酸脫羧酶基因具有SEQ ID NO.1和SEQID NO.3所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或者缺失一個或多個核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因編碼的蛋白質具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或者添加、取代、插入或者缺失一個或多個胺基酸的同源序列。本發明提供的賴氨酸脫羧酶基因有可能通過生物技術提高蛇足石杉中生物鹼類活性成分石杉鹼甲的含量，或者進行品種選育，具有較好的應用前景。
文檔編號A01H5/00GK103184227SQ201310051788
公開日2013年7月3日 申請日期2013年2月2日 優先權日2013年2月2日
發明者彭清忠, 杜次, 朱越, 李菁 申請人:吉首大學