大腸桿菌表達的膜聯蛋白v或其衍生物的分離純化方法
2023-06-01 16:12:26 2
大腸桿菌表達的膜聯蛋白v或其衍生物的分離純化方法
【專利摘要】本發明公開了一種大腸桿菌表達的膜聯蛋白V或其衍生物的分離純化方法。該方法是對表達膜聯蛋白V或其衍生物的大腸桿菌菌體依次進行破菌工藝、粗提工藝以及精製工藝。破菌工藝為先進行反覆凍融破碎，再進行滲透壓衝擊破碎。精製工藝為先進行疏水層析，再進行陰離子交換層析；或者先進行陰離子交換層析，再進行疏水層析。陰離子交換層析採用的填料為結合有DEAE配基或者Q配基的瓊脂糖，或者為結合有DEAE配基或者Q配基的聚甲基丙烯酸酯。疏水層析採用的填料為結合有苯基或者丁基或者辛基的瓊脂糖，或者為結合有苯基或者丁基或者辛基的聚甲基丙烯酸酯。本發明的分離純化方法成本較低，得到的目標蛋白純度≥95%。
【專利說明】大腸桿菌表達的膜聯蛋白V或其衍生物的分離純化方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種分離純化方法，具體涉及一種大腸桿菌表達的膜聯蛋白V或其衍生物的分離純化方法。
【背景技術】
[0002]膜聯蛋白(Annexins)家族是一類鈣離子依賴的磷脂結合蛋白。膜聯蛋白V是膜聯蛋白家族中分布最廣泛、含量最豐富的成員之一。膜聯蛋白V具有多種重要的生理功能，如抗凝活性、鈣離子通道活性、抑制磷脂酶A2及磷脂酶C的活性等等。同時，膜聯蛋白V在細胞分泌調控和信號轉導過程中起著重要作用，它還對活化血小板及凋亡細胞有極高的親和力。
[0003]早期大腸桿菌表達的膜聯蛋白V的純化有以下三種:(1)肝素親和層析。(2)在鈣離子存在的條件下進行陽離子交換層析。(3)在粗提中先後加入鈣離子和EDTA，再結合其它方法進行純化。其中第一種方法採用的肝素親和層析柱價格昂貴，使用次數有限，導致生產成本較高，不適合工業化生產。第二種和第三種方法的純化效果不佳，得到的膜聯蛋白V的純度難以滿足生物製品的質量要求。
[0004]另外，對於細胞內或者多細胞生物組織中的各種生物大分子的分離純化，都需要事先將細胞和組織破碎，使生物大分子充分釋放到溶液中，並不丟失生物活性。目前，用於細胞破碎的方法包括機械破碎法和非機械破碎法。
[0005]機械破碎法是工業規模細胞破碎的主要手段，具有處理量大、破碎效率高、速度快等特點，但是對於設備要求較高，導致破碎成本較高。機械破碎法主要包括高速珠研磨破碎法、高壓勻漿破碎法、超聲波破碎法等。
[0006]非機械破碎法的優點是處理條件比較溫和，有利於目標生化物質的高活力釋放回收。但缺點是破碎效率較低、產物釋放速度較慢、處理時間較長。非機械破碎法又分為酶解破碎法、化學破碎法和物理破碎法。其中物理法包括滲透壓衝擊破碎法、反覆凍融破碎法等ο
[0007]酶解破碎法是非機械破碎法中效果相對最好的，但是由於需要採用酶試劑，因而成本仍然較高，而且後續純化還需要去除所加入的酶試劑，增加後續純化的壓力。
[0008]滲透壓衝擊破碎法的優點是條件較溫和，成本較低；缺點則是破碎效率低，一般運用於不具有細胞壁或者細胞壁較脆弱的菌種。反覆凍融破碎法的優點是成本較低，缺點則是破碎效率低，一般運用於細胞壁較脆弱的菌體。
[0009]大腸桿菌的細胞壁是由堅固的肽聚糖組成，因此傳統對於大腸桿菌菌體的破碎主要採用機械破碎法中的超聲波破碎法或者非機械破碎法中的酶解破碎法，它們的破碎效果雖然較好，但是成本較高。特別是超聲波破碎法在破碎菌體、釋放目標蛋白的同時，還容易釋放大量的雜蛋白，增加後續純化的壓力。
[0010]目前尚未發現採用兩種物理破碎法相結合對大腸桿菌菌體進行破碎的文獻報導。
【發明內容】
[0011]本發明的目的在於解決上述問題，提供一種成本較低、純化效果好的大腸桿菌表達的膜聯蛋白V或其衍生物的分離純化方法。
[0012]實現本發明目的的技術方案是:一種大腸桿菌表達的膜聯蛋白V或其衍生物的分離純化方法，對表達膜聯蛋白V或其衍生物的大腸桿菌菌體依次進行破菌工藝、粗提工藝以及精製工藝；所述精製工藝包括陰離子交換層析和疏水層析。該精製工藝可以先進行疏水層析，再進行陰離子交換層析。也可以先進行陰離子交換層析，再進行疏水層析。
[0013]所述的破菌工藝為:對大腸桿菌菌體先進行反覆凍融破碎，再進行滲透壓衝擊破碎，得到破菌液。所述的反覆凍融破碎是將大腸桿菌菌體先在-25V~-15°C的溫度下冷凍，然後在0°C~40°C的溫度下融化，接著重複前述冷凍和融化I~3次；所述的滲透壓衝擊破碎是將經過反覆凍融破碎後的大腸桿菌菌體與高滲溶液充分混合均勻，在0°C~40°C的溫度下靜置解凍；然後用水稀釋，並攪拌直至充分破碎。
[0014]所述粗提工藝為:向破菌工藝得到的破菌液中加入硫酸銨直至硫酸銨的飽和度為30%~50%，並調節溶液pH值為7.0~7.5，在環境溫度下靜置，離心收集上清液；向該上清液中再加入硫酸銨直至硫酸銨的飽和度為60%~80%，並調節溶液pH值為7.0~7.5，在環境溫度下靜置，離心收集沉澱；將得到的沉澱溶解、超濾得到粗提液。
[0015]所述的疏水層析為:向上一步得到的溶液中加入硫酸銨直至硫酸銨的濃度為
0.7mol/L~1.3mol/L,並調節溶液 的pH值為5.0~9.0，得到疏水層析上樣液；將該疏水層析上樣液上樣至已由緩衝液A平衡過的疏水層析柱中，收集穿透液；所述緩衝液A是pH值為5.0~9.0的氯化銨/硫酸銨混合溶液，其中氯化銨的濃度為30mmol/L~70mmol/L，硫酸銨的濃度為0.7mol/L~1.3mol/L。所述的疏水層析柱中的填料為結合有苯基或者丁基或者辛基的瓊脂糖(如:Phenyl Sepharose FF、Phenyl Sepharose High Performance>Capto Phenyl>Butyl Sepharose FF、Butyl Sepharose High Performance> Capto Butyl>Octyl Sepharose FF 或者 Octyl Sepharose High Performance),或者為結合有苯基或者丁基或者辛基的聚甲基丙烯酸酯(Toyopearl Phenyl 650M、Toyopearl Phenyl 650S、Toyopearl Butyl 650M> Toyopearl Butyl 650S> Toyopearl Octyl 650M 或者 ToyopearlOctyl 650S)。
[0016]所述的陰離子交換層析為:將上一步得到的溶液上樣至已由緩衝液B平衡過的陰離子交換層析柱中，然後再用緩衝液B進行洗滌，接著用緩衝液C進行洗脫，收集洗脫液；所述緩衝液B是pH值為5.0~8.0的氯化銨溶液，其中氯化銨的濃度為30mmol/L~70mmol/L ;所述緩衝液C是pH值為5.0~8.0的氯化銨/氯化鈉混合溶液，其中氯化銨的濃度為30mmol/L~70mmol/L,氯化鈉的濃度為0.05mol/L~0.5mol/L。所述的陰離子交換層析柱中的填料為結合有DEAE配基或者Q配基的瓊脂糖(如DEAE Sepharose FFXapto DEAE,Q Sepharose FF或者Capto Q)。或者為結合有DEAE配基或者Q配基的聚甲基丙烯酸酯(Toyopearl DEAE 650M 或者 Toyopearl Q 650M)。
[0017]所述的膜聯蛋白V衍生物包括對膜聯蛋白V中的一個或者一個以上的胺基酸進行突變而得到的化合物，或者在膜聯蛋白V的N末端和/或C末端通過基因工程方法或者化學方法連接其它物質而得到的物質。
[0018]本發明具有的積極效果:(I)本發明在分離純化的精製過程中，對粗提液僅採用陰離子交換層析結合疏水層析，這樣不僅降低了生產成本，而且最終得到的目標蛋白純度^ 95%。(2)本發明的方法發現採用反覆凍融破碎法結合滲透壓衝擊破碎法對大腸桿菌菌體進行破碎，能夠取得較好的破碎效果(破壁率可達80%以上)，這樣一方面大大降低了破碎成本，另一方面還解決了機械破碎法容易釋放大量雜蛋白、酶解破碎法需要去除酶試劑等增加後續純化壓力的問題。
【具體實施方式】
[0019](實施例1)
本實施例為大腸桿菌表達的膜聯蛋白V的分離純化方法，具有以下步驟:
①破菌工藝:將發酵離心收集的100g表達膜聯蛋白V的大腸桿菌菌體先在-20°c的溫度下冷凍，然後在20°C的溫度下融化，接著重複前述冷凍和融化2次。將經過反覆凍融破碎後的大腸桿菌菌體與蔗糖高滲溶液(由65g蔗糖、lOmmol/L的乙二胺四乙酸二鈉以及IOOmL的水組成)充分混合均勻，在25°C的溫度下靜置解凍；然後用水稀釋至2L，並攪拌Ih直至充分破碎，離心收集上清液(即破菌液)，經光學顯微鏡檢查破壁率為85% (破壁率=破壁的細菌量/破壁前的細菌量X 100%)。
[0020]②粗提工藝:向步驟①的破菌工藝得到的破菌液中加入硫酸銨直至硫酸銨的飽和度為40%，並調節溶液pH值為7.0，在環境溫度下(251: ±5°C，下同)靜置，離心收集上清液；向該上清液中再加入硫酸銨直至硫酸銨的飽和度為70%，並調節溶液pH值為7.0，在環境溫度下靜置，離心收集沉澱。對所得到的沉澱進行溶解、超濾得到粗提液。
[0021]③疏水層析:向粗提工藝得到的粗提液中加入硫酸銨直至硫酸銨的濃度為Imol/L，並調節溶液的pH值為7.5，得到疏水層析上樣液；將該疏水層析上樣液上樣至已由緩衝液A平衡過的疏水層析柱中，收集穿透液；所述緩衝液A是pH值為7.5的氯化銨/硫酸銨混合溶液，其中氯化銨的濃度為50mmol/L，硫酸銨的濃度為lmol/L。疏水層析柱中的填料為 Phenyl Sepharose HP0`
[0022]④陰離子交換層析:將疏水層析收集的穿透液上樣至已由緩衝液B平衡過的陰離子交換層析柱中，然後用緩衝液B進行洗滌，接著再用緩衝液C進行洗脫，收集陰離子交換洗脫液；所述緩衝液B是pH值為5.5的氯化銨溶液，其中氯化銨的濃度為50mmol/L ;所述緩衝液C是pH值為5.5的氯化銨/氯化鈉混合溶液，其中氯化銨的濃度為50mmol/L，氯化鈉的濃度為0.lmol/L。陰離子交換層析柱中的填料為DEAE Sepharose FF。
[0023]上述收集到的陰離子交換洗脫液中，目標蛋白純度> 95%。
[0024](實施例2)
本實施例的步驟①和步驟②與實施例1相同，不同之處在於:
③陰離子交換層析:將粗提工藝得到的粗提液上樣至已由緩衝液B平衡過的陰離子交換層析柱中，然後用緩衝液B進行洗滌，接著再用緩衝液C進行洗脫，收集陰離子交換洗脫液；所述緩衝液B是pH值為6.0的氯化銨溶液，其中氯化銨的濃度為60mmol/L ;所述緩衝液C是pH值為6.0的氯化銨/氯化鈉混合溶液，其中氯化銨的濃度為60mmol/L，氯化鈉的濃度為0.lmol/L。陰離子交換層析柱中的填料為Q Sepharose FF。
[0025]④疏水層析:向步驟③得到的陰離子交換洗脫液中加入硫酸銨直至硫酸銨的濃度為lmol/L，並調節溶液的pH值為7.0，得到疏水層析上樣液；將該疏水層析上樣液上樣至已由緩衝液A平衡過的疏水層析柱中，收集穿透液；所述緩衝液A是pH值為7.0的氯化銨/硫酸銨混合溶液，其中氯化銨的濃度為60mmol/L，硫酸銨的濃度為lmol/L。疏水層析柱中的填料為 Toyopearl Phenyl 650S。
[0026]上述收集到的穿透液中，目標蛋白純度≥95%。
[0027](實施例3)
本實施例為大腸桿菌表達的膜聯蛋白V衍生物的分離純化方法，該膜聯蛋白V衍生物是通過基因工程方法在膜聯蛋白V的N末端連接Gly-Pro-Arg-Pro，同時在膜聯蛋白V的C末端連接水蛭素C端結構域而得到的蛋白質。分離純化方法具有以下步驟:
①破菌工藝:將發酵離心收集的100g表達上述膜聯蛋白V衍生物的大腸桿菌菌體先在_25°C的溫度下冷凍，然後在25°C的溫度下融化，接著重複前述冷凍和融化3次。將經過反覆凍融破碎後的大腸桿菌菌體與蔗糖高滲溶液(由65g蔗糖、lOmmol/L的乙二胺四乙酸二鈉以及IOOmL的水組成)充分混合均勻，在20°C的溫度下靜置解凍；然後用水稀釋至2L，並攪拌Ih直至充分破碎，離心收集上清液(即破菌液)，經光學顯微鏡檢查破壁率為83%。
[0028] ②粗提工藝:向步驟①的破菌工藝得到的破菌液中加入硫酸銨直至硫酸銨的飽和度為50%，並調節溶液pH值為7.5，在環境溫度下靜置，離心收集上清液；向該上清液中再加入硫酸銨直至硫酸銨的飽和度為80%，並調節溶液pH值為7.5，在環境溫度下靜置，離心收集沉澱。對所得到的沉澱進行溶解、超濾得到粗提液。
[0029]③疏水層析:向粗提工藝得到的粗提液中加入硫酸銨直至硫酸銨的濃度為
1.2mol/L，並調節溶液的pH值為8，得到疏水層析上樣液；將該疏水層析上樣液上樣至已由緩衝液A平衡過的疏水層析柱中，收集穿透液；所述緩衝液A是pH值為8的氯化銨/硫酸銨混合溶液，其中氯化銨的濃度為40mmol/L，硫酸銨的濃度為1.2mol/L。疏水層析柱中的填料為 Phenyl Sepharose HP。
[0030]④陰離子交換層析:將疏水層析收集的穿透液上樣至已由緩衝液B平衡過的陰離子交換層析柱中，然後用緩衝液B進行洗滌，接著再用緩衝液C進行洗脫，收集陰離子交換洗脫液；所述緩衝液B是pH值為5.0的氯化銨溶液，其中氯化銨的濃度為40mmol/L ;所述緩衝液C是pH值為5.0的氯化銨/氯化鈉混合溶液，其中氯化銨的濃度為40mmol/L，氯化鈉的濃度為0.2mol/L。陰離子交換層析柱中的填料為Toyopearl Q 650M。
[0031]上述收集到的陰離子交換洗脫液中，目標蛋白純度> 95%。
【權利要求】
1.一種大腸桿菌表達的膜聯蛋白V或其衍生物的分離純化方法，其特徵在於:對表達膜聯蛋白V或其衍生物的大腸桿菌菌體依次進行破菌工藝、粗提工藝以及精製工藝；所述精製工藝包括疏水層析和陰離子交換層析。
2.根據權利要求1所述的大腸桿菌表達的膜聯蛋白V或其衍生物的分離純化方法，其特徵在於:所述的破菌工藝為:對大腸桿菌菌體先進行反覆凍融破碎，再進行滲透壓衝擊破碎，得到破菌液。
3.根據權利要求2所述的大腸桿菌表達的膜聯蛋白V或其衍生物的分離純化方法，其特徵在於:所述的反覆凍融破碎是將大腸桿菌菌體先在-25V~_15°C的溫度下冷凍，然後在(TC~40°C的溫度下融化，接著重複前述冷凍和融化I~3次；所述的滲透壓衝擊破碎是將經過反覆凍融破碎後的大腸桿菌菌體與高滲溶液充分混合均勻，在0°C~40°C的溫度下靜置解凍；然後用水稀釋，並攪拌直至充分破碎。
4.根據權利要求1所述的大腸桿菌表達的膜聯蛋白V或其衍生物的分離純化方法，其特徵在於:所述粗提工藝為:向破菌工藝得到的破菌液中加入硫酸銨直至硫酸銨的飽和度為30%~50%，並調節溶液pH值為7.0~7.5，在環境溫度下靜置，離心收集上清液；向該上清液中再加入硫酸銨直至硫酸銨的飽和度為60%~80%，並調節溶液pH值為7.0~7.5，在環境溫度下靜置，離心收集沉澱；將得到的沉澱溶解、超濾得到粗提液。
5.根據權利要求1所述的大腸桿菌表達的膜聯蛋白V或其衍生物的分離純化方法，其特徵在於:所述的疏水層析為:向上一步得到的溶液中加入硫酸銨直至硫酸銨的濃度為0.7mol/L~1.3mol/L,並調節溶液的pH值為5.0~9.0，得到疏水層析上樣液；將該疏水層析上樣液上樣至已由緩衝液A平衡過的疏水層析柱中，收集穿透液；所述緩衝液A是pH值為5.0~9.0的氯化銨/硫酸銨混合溶液，其中氯化銨的濃度為30mmol/L~70mmol/L，硫酸銨的濃度為0.7mol/L~1.3mol/L。
6.根據權利要求5所述的大腸桿菌表達的膜聯蛋白V或其衍生物的分離純化方法，其特徵在於:所述的疏水層析柱中的填料`為結合有苯基或者丁基或者辛基的瓊脂糖，或者為結合有苯基或者丁基或者辛基的聚甲基丙烯酸酯。
7.根據權利要求1所述的大腸桿菌表達的膜聯蛋白V或其衍生物的分離純化方法，其特徵在於:所述的陰離子交換層析為:將上一步得到的溶液上樣至已由緩衝液B平衡過的陰離子交換層析柱中，然後再用緩衝液B進行洗滌，接著用緩衝液C進行洗脫，收集洗脫液；所述緩衝液B是pH值為5.0~8.0的氯化銨溶液，其中氯化銨的濃度為30mmol/L~70mmol/L ;所述緩衝液C是pH值為5.0~8.0的氯化銨/氯化鈉混合溶液，其中氯化銨的濃度為30mmol/L~70mmol/L,氯化鈉的濃度為0.05mol/L~0.5mol/L。
8.根據權利要求7所述的大腸桿菌表達的膜聯蛋白V或其衍生物的分離純化方法，其特徵在於:所述的陰離子交換層析柱中的填料為結合有DEAE配基或者Q配基的瓊脂糖，或者為結合有DEAE配基或者Q配基的聚甲基丙烯酸酯。
9.根據權利要求1至8之一所述的大腸桿菌表達的膜聯蛋白V或其衍生物的分離純化方法，其特徵在於:所述的膜聯蛋白V衍生物包括對膜聯蛋白V中的一個或者一個以上的胺基酸進行突變而得到的化合物，或者在膜聯蛋白V的N末端和/或C末端通過基因工程方法或者化學方法連接其它物質而得到的蛋白質。
【文檔編號】C07K1/36GK103665140SQ201310708043
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月20日 優先權日:2013年12月20日
【發明者】張筍華, 潘偉忠, 于洋, 劉軍, 韋利軍 申請人:常州千紅生化製藥股份有限公司