光學顯微成像系統及其成像方法與流程

2023-10-29 10:30:02

本發明涉及顯微成像技術領域，尤其涉及一種光學顯微成像系統及其成像方法。

背景技術：

顯微成像技術作為觀測微生物形態結構的有力手段之一，已在微生物檢測領域獲得廣泛關注和應用。對於光學顯微成像技術，按其工作原理的不同，可以分為傳統光學顯微成像、遠場生物螢光顯微成像和相差對比顯微成像。傳統光學顯微成像技術主要是利用光學透鏡對物體起到放大或者成像的作用，通過透鏡組合可以把物體放大近千倍。然而，光衍射效應的存在，限制了傳統光學顯微成像技術中透鏡無限放大的可能。遠場生物螢光顯微成像主要是通過螢光染料標記物體，利用短波長的光源去激發物體內部的標記，使其發射出螢光，從而提高物體在成像中的對比度，同時還提供了特異性標記，便於在大規模族群中的追蹤和識別。相差對比顯微成像是利用光學幹涉的原理，將入射光通過透明物體產生的光程差轉變為光強差，體現在ccd檢測器中，突出透明物體的內部細節，便於觀測物體內部的細微結構。

大多數微生物都是透明的，傳統顯微成像技術主要依賴其自身的透鏡，而透鏡對於透明的微小物體成像能力有限，所以成的像對比度差、不清晰，不利於觀測。採用螢光標記的方法，雖然可以提高成像解析度，但是操作繁瑣，耗時長，而且由這種方法導致光漂白和光毒性反應，對微生物或者活細胞造成無法恢復的損傷。相差對比顯微技術利用幹涉的原理，將相位差轉變為強度差，這種方法避免了螢光標記，在一定程度上保證了微生物樣品的完整性。由於只能拍攝強度圖像而得不到相位圖像，有一定的局限性。同時暈輪和漸暗效應的存在，穩定性差，使得所成圖像效果大大降低。

技術實現要素：

為了解決上述問題，本發明提出一種光學顯微成像系統及其成像方法，能夠提高圖像解析度，穩定性好。

本發明提出的具體技術方案為：提供一種光學顯微成像系統，所述光學顯微成像系統包括光源、依次遠離所述光源並設置於所述光源的出射光路上的第一擴束準直器、顯微鏡、分光器、第二擴束準直器及圖像獲取裝置，所述光源出射的光束依次經過所述第一擴束準直器、顯微鏡後形成具有樣品信息的樣品光，所述樣品光經過所述分光器分光後形成兩個光束，所述兩個光束經過所述第二擴束準直器後成像在所述圖像獲取裝置上。

進一步地，所述第一擴束準直器包括第一透鏡、第二透鏡及設置於所述第一透鏡與所述第二透鏡之間的第一濾波器，所述第二透鏡位於所述第一濾波器與所述顯微鏡之間，所述第一濾波器位於所述第一透鏡的後焦平面處，所述第一透鏡的後焦平面與所述第二透鏡的前焦平面重合。

進一步地，所述第二擴束準直器包括第三透鏡、第四透鏡及設置於所述第三透鏡與所述第四透鏡之間的第二濾波器，所述第四透鏡位於所述圖像獲取裝置與所述第二濾波器之間，所述圖像獲取裝置位於所述第四透鏡的後焦平面處，所述第二濾波器位於所述第三透鏡的後焦平面處，所述第三透鏡的後焦平面與所述第四透鏡的前焦平面重合。

進一步地，所述光學顯微成像系統還包括設置於所述光源的出射光路上的光闌，所述光闌位於所述顯微鏡與所述分光器之間。

進一步地，所述光學顯微成像系統還包括設置於所述光源的出射光路上的第三擴束準直器，所述第三擴束準直器位於所述分光器與所述第二擴束準直器之間。

進一步地，所述第三擴束準直器包括第五透鏡和第六透鏡，所述第五透鏡位於所述分光器與所述第六透鏡之間，所述分光器位於所述第五透鏡的前焦平面處，所述第五透鏡的後焦平面與所述第六透鏡的前焦平面重合。

進一步地，所述光學顯微成像系統還包括設置於所述光源的出射光路上的光路調整器，所述光路調整器位於所述第三擴束準直器與所述第二擴束準直器之間。

進一步地，所述光路調整器包括第一反射鏡和第二反射鏡，所述第一反射鏡位於所述第三擴束準直器與所述第二反射鏡之間。

進一步地，所述光源為雷射器，和/或所述分光器為光柵，和/或所述圖像獲取裝置為ccd。

本發明還提供了一種如上所述的光學顯微成像系統的成像方法，所述成像方法包括：

開啟雷射器，所述圖像獲取裝置獲取第一幹涉圖；

將所述分光器移動預定距離，所述圖像獲取裝置獲取第二幹涉圖；

將所述第二幹涉圖像與所述第一幹涉圖像作差，獲得第三幹涉圖像；

提取所述第三幹涉圖像的相位信息，獲得相位圖。

本發明提供的光學顯微成像系統，光源出射的光束被所述分光器分光後形成兩個光束，所述兩個光束經過所述第二擴束準直器後發生幹涉並成像在所述圖像獲取裝置上，兩個光束經過了相同的光程，避免了噪聲的影響，通過第一擴束準直器、顯微鏡和第二擴束準直器對圖像進行放大，提高了圖像解析度。本發明提供的成像方法通過第二幹涉圖像與第一幹涉圖像作差得到第三幹涉圖像，這樣使得第三幹涉圖像中不包括直流分量，大大提高了信號功率譜的帶寬佔有量，避免了信號在空間傳播上的損失。

附圖說明

通過結合附圖進行的以下描述，本發明的實施例的上述和其它方面、特點和優點將變得更加清楚，附圖中：

圖1為光學顯微成像系統的結構示意圖；

圖2為光學顯微成像系統的成像方法的流程圖；

圖3a為第一幹涉圖像的示意圖；

圖3b為第二幹涉圖像的示意圖；

圖4a為第一幹涉圖像的功率譜圖；

圖4b為第三幹涉圖像的功率譜圖。

具體實施方式

以下，將參照附圖來詳細描述本發明的實施例。然而，可以以許多不同的形式來實施本發明，並且本發明不應該被解釋為局限於這裡闡述的具體實施例。相反，提供這些實施例是為了解釋本發明的原理及其實際應用，從而使本領域的其他技術人員能夠理解本發明的各種實施例和適合於特定預期應用的各種修改。

參照圖1，本實施例提供的光學顯微成像系統包括光源1、依次遠離光源1並設置於光源1的出射光路上的第一擴束準直器2、顯微鏡3、分光器4、第二擴束準直器5及圖像獲取裝置6。光源1出射的光束依次經過第一擴束準直器2、顯微鏡3後形成具有樣品信息的樣品光，樣品光經過分光器4分光後形成兩個光束，分別為信號光和參考光，信號光和參考光經過第二擴束準直器5後產生幹涉並成像在圖像獲取裝置6上。

顯微鏡3包括依次遠離光源1並設置於光源1的出射光路上的第三反射鏡31、聚光鏡32、物鏡33、第四反射鏡34及筒鏡35。其中，樣品放置於顯微鏡3的聚光鏡32與物鏡33之間。光源1發射的光束經過第一擴束準直器2後從第三反射鏡31反射至聚光鏡32，聚光鏡32將光線匯聚到樣品上，經過樣品後形成攜帶有樣品信號的樣品光，樣品光入射至物鏡33，樣品光被物鏡33放大後經第四反射鏡34反射至筒鏡35，從筒鏡35出射的樣品光再被分光器4分成兩個光束即信號光和參考光。

本實施例中的分光器4為光柵，光源1為雷射器，圖像獲取裝置6為電荷藕合器件圖像傳感器(charge-coupleddevice，ccd)。光柵能夠將樣品光分成兩個衍射光束即信號光和參考光。本實施例通過將雷射器作為光源1可以避免光暈，提高了分光器4分成的兩個光束的相干性，降低了空間噪聲的影響。

具體的，第一擴束準直器2包括第一透鏡21、第二透鏡22及設置於第一透鏡21與第二透鏡22之間的第一濾波器23。第二透鏡22位於第一濾波器23與顯微鏡3之間即第二透鏡22位於第一濾波器23與第三反射鏡31之間，第一濾波器23位於第一透鏡21的後焦平面處，第一透鏡21的後焦平面與第二透鏡22的前焦平面重合。本實施例中的第一濾波器23為針孔濾波器，第一濾波器23上設置有一個孔，該孔的孔徑d通過下式計算：

其中，λ表示的是光源1出射光束的波長，r表示的是光源1出射光束的半徑，f表示的是第一透鏡21的焦距。

光源1發射的光束經過第一透鏡21匯聚後入射至第一濾波器23，第一濾波器23對入射到其上的光束進行濾波即濾除雜散光，經過第一濾波器23濾波後的光束再經第二透鏡22進行光束擴展，擴展後的光束從第三反射鏡31入射至顯微鏡3中。可以根據實際需要改變第一透鏡21和第二透鏡22的焦距，從而獲得所需要的擴展光束。

第二擴束準直器5包括第三透鏡51、第四透鏡52及設置於第三透鏡51與第四透鏡52之間的第二濾波器53。第四透鏡52位於圖像獲取裝置6與第二濾波器53之間，圖像獲取裝置6位於第四透鏡52的後焦平面處，第二濾波器53位於第三透鏡51的後焦平面處，第三透鏡51的後焦平面與第四透鏡52的前焦平面重合。本實施例中的第二濾波器53為針孔濾波器，第二濾波器53上設置有兩個孔，一個大孔和一個小孔，大孔是為了保證信號光完整無損的通過並且只通過信號光，小孔起到對參考光進行濾波的作用，兩孔的距離即入射到第三透鏡51上的0級衍射光和1級衍射光之間的距離δx通過下式計算：

其中，f1表示的是第三透鏡51的焦距，λ表示是光源1出射光束的波長，λ表示分光器4的光柵周期。

通過第二濾波器53上小孔的參考光的亮斑的半徑ρ通過下式計算：

其中，f2表示的是第四透鏡52的焦距，d表示的是小孔的孔徑。

為了使得從第四透鏡52出射的光束能夠覆蓋圖像獲取裝置6的入射面，參考光的亮斑的半徑ρ需要滿足以下條件：

即小孔的孔徑d需要滿足以下條件：

其中，d表示的是圖像獲取裝置6的入射面的對角線長度。

分光器4將樣品光分成信號光和參考光，信號光和參考光分別入射至第三透鏡51並經過第三透鏡51匯聚後入射至第二濾波器53，第二濾波器53分別對入射到其上的兩個光束進行濾波，其中，信號光經過大孔後完整出射，參考光經過小孔過濾後形成均勻的球面波，經第二濾波器53濾波後的兩個光束再經第四透鏡52進行光束擴展，擴展後的兩個光束髮生幹涉並成像在圖像獲取裝置6上。

本實施例中的光學顯微成像系統還包括設置於光源1的出射光路上的光闌7，光闌7位於顯微鏡3與分光器4之間。光闌7可以控制從顯微鏡3中出射的光束的光斑大小。

光學顯微成像系統還包括設置於光源1的出射光路上的第三擴束準直器8，第三擴束準直器8位於分光器4與第二擴束準直器5之間。第三擴束準直器8包括第五透鏡81和第六透鏡82。第五透鏡81位於分光器4與第六透鏡82之間，分光器4位於第五透鏡81的前焦平面處，第五透鏡81的後焦平面與第六透鏡82的前焦平面重合。通過第三擴束準直器8可以對光束進行準直，減少像差的影響，以提升圖像解析度。

為了對整個光學顯微成像系統的光路進行調整，光學顯微成像系統還包括設置於光源1的出射光路上的光路調整器9，光路調整器9位於第三擴束準直器8與第二擴束準直器5之間。光路調整器9包括第一反射鏡91和第二反射鏡92，第一反射鏡91位於第六透鏡82與第二反射鏡92之間。第一反射鏡91將經過第六透鏡82的光束反射至第二反射鏡92，第二反射鏡92再將入射到其上的光束反射至第三透鏡51上。

本實施例還提供了一種如上所述的光學顯微成像系統的成像方法，所述成像方法包括：

步驟s1、開啟雷射器，圖像獲取裝置6獲取第一幹涉圖，如圖3a所示。其中，第一幹涉圖像是由兩個光束即信號光和參考光幹涉後形成，其中，兩個衍射光束會產生一個互相關函數分量，即功率譜圖中的直流分量，圖4a表示的是第一幹涉圖像的功率譜圖，功率譜圖中的中間部分為直流分量，從中可以看出直流分量佔了很大的帶寬。

步驟s2、將分光器4移動預定距離，圖像獲取裝置6獲取第二幹涉圖，如圖3b所示。

其中，本實施例中的分光器為光柵，經過分光器分光後的兩個光束即信號光和參考光的頻率為λ是光柵周期，即一個光柵周期對應2π。通過相移角度α便可以得到分光器4需要移動的預定距離x，其中，例如，第一幹涉圖像為相位為0°時的幹涉圖像，第二幹涉圖像為相位為π時的幹涉圖像，則分光器4需要移動的預定距離

步驟s3、將第二幹涉圖像與第一幹涉圖像作差，獲得第三幹涉圖像。圖4b表示的是第三幹涉圖像的功率譜圖，從中可以看出，通過將第二幹涉圖像與第一幹涉圖像作差可以去除直流分量，濾波器的濾波半徑變大，使得第三幹涉圖中的一級頻譜分量增加，在整個頻帶寬度不變的情況下，大大提高了一級頻譜的帶寬佔有量，一級頻譜分量攜帶的信息會更多，避免了信號在空間傳播上的損失。

步驟s4、提取第三幹涉圖像的相位信息，獲得相位圖。

以上所述僅是本申請的具體實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本申請原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本申請的保護範圍。