疏水－相互作用－層析或鉸鏈區修飾對於均質抗體溶液的製備的用途的製作方法

2023-10-11 23:33:14 1

>樣品片段#A.A#理論MW理論連接的MW觀察分子量還原的觀察分子量非還原的HuCC49ΔCH2PAPG1/G3PAPHuCC49ΔCH2PAPG1/G3PAP內切Lys-C片段29(H221-257)3711.7THTCPPCGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTK內切Lys-C片段29(H221-260)3976.9THTCPPCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTK內切Lys-C片段29(H221-231)1208.5THTCPPCPEPK內切Lys-C片段30(H232-275)4394.0SCDTPPPCPRCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTK胰蛋白酶片段39(H221-241)1971.8THTCPPCGGGSSGGGSGGQPR胰蛋白酶片段39(H221-244)2237.9THTCPPCPAPGGGSSGGGSGGQPR胰蛋白酶片段39(H221-231)1324.5THTCPPCPEPK胰蛋白酶片段40(H232-241)1187.5SCDTPPPCPR胰蛋白酶片段41(H242-259)1542.6CPAPGGGSSGGGSGGQPR7419.47949.82413.08782.0NANANANANA3711.53976.81208.94394.41972.62237.81325.11187.51542.97419.17949.72414.38782.6NANANANANA這些數據顯示，新的改造的合成鉸鏈區連接肽可用於優選促進形成A或B同種型。這些研究還揭示了位置242(Kabat編號系統)的半胱氨酸殘基在合成CH2結構域-缺失的抗體A型同種型中的重要性。因此，一個實施方案中，本發明的連接肽包含位於位置239或242中至少一個的半胱氨酸。用絲氨酸取代位置239或242的半胱氨酸(例如，利用顯示於SEQIDNO0，11，12，或13的連接肽)使得CH2結構域-缺失的抗體的生物合成移動到B型同種型。增加A型比例的連接肽的使用導致加工，產量和/或穩定性的有利的改善。這些合成鉸鏈區連接肽的使用有利於合成任何抗體同種型例如，IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4的CH2結構域缺失的抗體A型同種型，其基於所有四種人同種型CH3結構域的極高同源性。包括相同和保守的胺基酸殘基，IgG1CH3結構域與IgG2CH3有98.13％同源，與IgG3CH3有97.20％同源，與IgG4CH3有96.26％同源。實施例4從含有兩種同種型的單克隆抗體混合物純化A型和B型10mLddCC49上清用1MTrispH9.0滴定至終pH7.5。該物質經一系列Sol-Vac0.8μ和0.4μ的膜過濾。100mLXK50蛋白G柱用1xPBS以流速80ml/min預平衡。滴定的過濾的上清以80ml/min上樣到柱上。結合的蛋白利用兩倍柱體積的平衡緩衝液洗滌，然後用100mM甘氨酸、pH3.0洗脫。收集含有ddCC49峰的級分並立刻用1MTrispH9.0滴度至終pH7.0。TosoBiosep苯基5PW-HR柱用20mM磷酸鹽pH7.2；1M硫酸鹽預平衡。蛋白G洗脫物利用3.5M硫酸銨pH7.2母液滴定到1M硫酸銨並以濃度2mg/ml凝膠床上樣。結合的蛋白利用20mM磷酸鹽pH4或7.2硫酸銨洗脫以調節電導性至116.4mS/cm。自此條件洗脫的物質在非還原SDS-PAGE上的表觀分子量約120kD(A型)。餘下的結合的抗體用磷酸鹽緩衝液中中的還原硫酸銨物質線性梯度洗脫。後一種洗脫的抗體明顯缺乏重鏈之間的二硫鍵並且其分子量為約60kDa(B型)。圖15顯示HIC純化的層析圖。純化的A和B型分別顯示於圖16的泳道3和4。以上純化的物質均可通過將硫酸銨濃度調節為1M並將其重新上樣到清潔的苯基5PW-HR柱來再捕獲。結合的蛋白利用20mM磷酸鹽pH7.2洗脫並透析入1xPBS。實施例5.比較A型和B型的穩定性A和B型的生物活性(如在預試驗中測定的例如，利用直接結合或競爭研究)揭示A型和B型具有相似的生物活性。比較A型和B型的穩定性。純化的ddCC49分子通過配有YM30膜(Millipore)的Amicon濃縮儀濃縮到約5mg/ml。對於每個同種型，濃縮的物質等分成四個部分，每個級分被置於10K透析盒(Pierce，cat#66410)中16h，在以下緩衝液中透析1)10mM磷酸鈉，pH3；2)10mM乙酸鈉，pH5；3)10mM磷酸鈉，pH7；和4)10mM硼酸鈉，pH9。透析後，每種溶液的蛋白濃度調節到3mg/ml。除了純的A和B同種型溶液之外，混合每種pH的部分A和B溶液以產生含有50％每種同種型的混合物。總共產生12種配製劑(四種pH水平乘以3種抗體溶液)。過濾所述溶液並灌裝入具有灰色丁基塞子的3ml1型玻璃血清小瓶(WestPharmaceuticals)中。選擇三種溫度，2-8℃，20-25℃和38-42℃來保存蛋白以檢測穩定性。保存之前，從每種配製劑中取出500μl樣品用於物理和化學分子，這些0時間點數據用作對照。一旦保存，在以下時間取樣2周，1個月，2個月，3個月，並立即送檢。為了評估兩種同種型的物理和化學穩定性，採用以下方法在OD320測定濁度，非-還原SDS-PAGE，和大小排阻層析。於不同時間點對保存在2-8℃，20-25℃和38-42℃的樣品進行非-還原SDS-PAGE。在2-8℃保存時，A型和B型都相對穩定。然而，但在pH7和9配製時，A型和B型顯示降解，如小於原始主要帶(A型的為120kDa，B型的為60kDa)的帶的數目增加所示。注意到，具體對於保存在低溫和中間溫度的pH7和9的樣品而言，低於55kDa的帶的強度和數量在B型中高於A型。這表明在這些條件下A同種型比B同種型更穩定。然而，對於pH5並保存在20-25℃的A同種型而言並非如此。該樣品具有的片段似乎多於B同種型的。這看上去是由於微生物汙染(在下文詳述)導致的人工現象。在高保存溫度下，pH9時兩種形式都明顯降解，並且樣品的凝膠模式幾乎沒有差異。在該條件下，在凝膠頂部出現痕量的汙染帶，其表明形成了聚集物。由於聚集物可通過SDS溶解，所述聚集物利用本發明以下部分描述的方法研究。表5A-表5C列出了保存在三種不同溫度的ddCC49的濁度數據。濁度測定了可溶和非-可溶聚集物，並且其基於這些顆粒散射的光的量。當存在時，聚集物將散射光並導致A320增加。如表5A-C所示，對於A和B同種型，保存在2-8℃的ddCC49分子的濁度隨pH的增加而增加，前者的濁度低於後者的濁度。該趨勢對於在更高溫度(20-25℃和38-40℃)保存少於一個月時間的樣品而言是正確的。保存時間達到3個月時，高pH和溫度的樣品的濁度明顯增加，A同種型與B同種型之間的差異減小。這些結果與SDS-PAGE的結果平行，表明兩種同種型在pH3和5都相對穩定(就不形成聚集物而言)，A同種型對於聚集的易感性低於B同種型。大小排阻層析(SEC)是顯示完整分子以及降解的產物(片段和可溶聚集物)的百分比的有效方法，並且高度可重複。在表5A-C中，保存在不同溫度的A-同種型，B-同種型和混合物的完整單體被列出。對於保存在2-8℃的樣品，很明顯A型的單體百分比高於B型的，A型與B型混合物的所述百分比在前述兩者之間。在該保存溫度，兩種形式在pH3，5和7相對穩定(pH5是最穩定的條件)，持續約三個月。然而，在pH9，B型單體的百分比明顯降低，而A型的僅僅降低很少。在升高的溫度下，所有樣品顯示單體百分比隨保存時間增加而明顯增加；A同種型的增加超過B同種型。然而，也有例外，在相似保存條件下，保存在室溫的A同種型的樣品顯示比B同種型或其混合物的降解更多。該特定A同種型小瓶的檢驗表明，來自SDS-PAGE的數據，樣品的SEC提示微生物汙染可能導致這一意料之外的結果。首先，SEC和SDS-PAGE結果表明該樣品的降解對片段化增加負主要責任，推定是由於微生物消化，否則預期聚集在一定程度上增加。其次，含有A和B同種型各50％的混合樣品顯示比B同種型更好的穩定性圖譜，表明更穩定的A同種型對單體的高百分比有貢獻。最後，保存在2-8℃和38-42℃、pH5的A同種型均顯示高於相似條件下的B同種型的單體百分比。因此，中間保存溫度應當產生相似的結果。由於樣品量有限，不能進行微生物汙染試驗。還注意到對於保存在高pH(9)和40℃的IDEC-159同種型，單體減少到約30％。在這些苛刻的條件下，兩種同種型之間的穩定性差異消失。SEC結果與利用SDS-PAGE的結果一致。兩個結果都表明，儘管兩同種型之間存在一些化學和物理性質差異，兩種同種型的降解機制以及副產物類似，或相同。總之，SEC結果表明A和B同種型具有約5的最佳pH，A同種型就在類似保存條件下保持高百分比完整單體而言，比B同種型更穩定。表6A.保存在2-8℃的ddCC49的單體百分比表6B.保存在20-25℃的ddCC49的單體百分比表6C.保存在38-42℃的ddCC49的單體百分比實施例7.A型和B型的製備純化IDEC-159(ddCC49)是針對表達於腫瘤表面的TAG-72抗原的CH2結構域缺失的單克隆抗體。IDEC-159含有兩種抗體同種型，稱為A型和B型。目前用於IDEC-159產物的細胞培養方法產生的A型與B型的比例為大約50∶50。A型同種型是重鏈FC部分中具有缺失的CH2區的抗體。除了具有缺失的CH2結構域，B型也缺乏跨Fc區的二硫鍵連接，並僅僅通過疏水反應和鹽橋連接。IDEC-159純化法中的第三步和最後的層析步驟被開發用於分離IDEC-159的兩個同種型。所述分離通過疏水反應層析(HIC)，利用苯基TSKgel5PW-HR吸附劑進行。由於B型的疏水性高於A型，其不可逆吸附於固定相，其中利用大約0.73M硫酸銨/20mM磷酸鈉，pH4.0-pH7.0作為流動相。A型在這些條件下與固定相的結合力較低，並由此可同步洗脫，即其與流過柱的級分一起離開柱子。A型的同步洗脫之後，從固定相去除硫酸銨可使得B型解吸附。以下方法用於分離IDEC-159的兩個同種型·所述柱利用≥3CV0.5NNaOH，以≤150cm/hr消毒。·所述柱利用≥5CV0.73M硫酸銨/20mM磷酸鈉，pH4.0，以≤150cm/hr平衡。·所述柱上樣於室溫TMAEFlowthrough，其被調節為包括0.43體積的2.5M硫酸銨/20mM磷酸鈉，pH4.0液體母液，5mg每ml樹脂。所述抗體在pH4.0，以≤100cm/hr上樣於所述柱。抗體的收集開始於流出物280nmO.D.達到10mAU時。·所述柱利用15CV0.73M硫酸銨/20mM磷酸鈉，pH4.0，以≤100cm/hr洗滌。在整個15CV洗滌持續抗體收集，流出物被廢棄。·所述柱利用≥5CVs20mM磷酸鈉，pH4.0，以≤100cm/hr剝離6.所述柱≥3CVs0.5NNaOH，以≤150cm/hr清洗。·所述柱用≥3CVs0.73M硫酸銨/20mM磷酸鈉，pH4.0，以≤150cm/hr洗滌。·所述柱保存在≥3CV20％乙醇，以≥150cm/hr。兩種形式在製備水平的分離(5L柱體積，總IDEC-159負載大約20g)顯示於圖17(圖A和B)。第一個峰包含A型的同步洗脫物，第二個峰顯示洗脫的B型，第三個峰含有雜質，其在清洗過程中從固定相去除。該方法在製備水平分離A型和B型的能力也通過SDSPAGE證實。如圖18所示，利用0.73M硫酸銨/20mM磷酸鈉，pH4.0同步洗脫的級分(泳道6-8)主要含有A型(雜質＞90％)。實施例8.單克隆抗體CC49的人源化對CC49抗體進行多種改變以產生人源化的CC49版本2(huCC49V2)。圖19顯示鼠CC49輕(圖19A)和重鏈(圖19B)可變區，LEN或21/28』CL，人源化的CC49，人源化的CC49V2(其與人源化的CC49相比包含一個位於輕中的胺基酸取代和兩個位於重鏈中的胺基酸取代，見加下劃線的胺基酸)的比對。為進一步降低人源化的CC49Mab的潛在免疫原性，檢驗存在所述抗體中的鼠殘基並將源自人受體序列LEN的人框架殘基用於輕鏈取代，21/28′CL用於重鏈取代。(SingerIIetal.，1993.OptimalHumanizationof1B4，anAnti-CD18MurineMonoclonalAntibody，isAchievedbyCorrectChoiceofHumanV-RegionFrameworkSequences.J.Immunol.1502844-2857.PadlanEA，1991.PossibleProcedureForReducingtheImmunogenicityofAntibodyVariableDomainsWhilePreservingTheirLigand-BindingProperties.MolecularImmunol.28489-498)。被認為對於保持結合位點的特異性和親和力重要的框架殘基僅僅顯示一些不同。在重鏈序列中，位置69(亮氨酸)和93(蘇氨酸)的預期包埋的殘基都用人殘基異亮氨酸和丙氨酸分別取代。輕鏈序列中，預期大部分保包埋在位置43的殘基(絲氨酸)用人殘基脯氨酸取代。製備結構域缺失的V2CC49抗體形式，連接肽被插入huCC49V2序列。圖13A(SEQIDNO28)顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的重鏈CH2結構域-缺失的huCC49V2的DNA序列。圖13B(SEQIDNO29)顯示輕鏈CH2結構域-缺失的huCC49V2的DNA序列。圖14A(SEQIDNO30)顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的重鏈CH2結構域-缺失的huCC49V2胺基酸序列。圖14B(SEQIDNO31)顯示輕鏈CH2結構域-缺失的huCC49V2的胺基酸序列。實施例9.包含新連接肽的抗體的增強的生物分布圖譜在競爭結合測定法中檢測各種形式的結構域缺失的抗體(具有或不具有連接肽)結合TAG-72抗原來源牛頜下粘蛋白的能力，所述檢測通過時間-分辨螢光免疫測定法利用Wallac1420MultilabelCounterVictorV(PerkinElmer)進行。競爭結合曲線顯示於圖20。評估HuCC49PAP(含有顯示於SEQIDNO14的連接肽)，HuCC49V2PAP(含有顯示於SEQIDNO14的連接肽)，HuCC49G1/G3PAP(含有顯示於SEQIDNO9的連接肽)，HuCC49V2G1/G3/PAP(含有顯示於SEQIDNO9的連接肽)，和對照親本HuCC49抗體。所有三種鉸鏈改造的抗體的結合活性不能區分或在對照親本CC49抗體的2-3倍之內。90Y-2-(p-異硫氰酸根合苄基)(p-SCN-Bz)-環己基二亞乙基三胺五乙酸配體(CHx-DTPA)偶聯的HuCC49V2PAP(含有顯示於SEQIDNO14的連接肽)和對照親本HuCC49抗體被洗脫並在患LS-174T人腫瘤異種移植物的無胸腺小鼠中比較其生物分布。90Y放射標記的抗體每克腫瘤或正常組織的百分比注射的劑量(％ID)在3和24小時測定並顯示於表7。表7.數據表示平均值+/-標準差。*與腫瘤中24hr時間點HuCC49相比，p＜0.05不成對t檢驗**與腎中24hr時間點HuCC49相比，p＜0.001不成對t檢驗令人吃驚地，在24小時時間點HuCC49V2PAP吸收在腫瘤中明顯高於對照HuCC49抗體(p＜0.05不成對t檢驗)，且反之在腎中腎(p＜0.01)低於對照HuCC49抗體。當比較這些抗體的腫瘤器官比時，對於除外血液的所有器官，HuCC49V2PAP導致較高的腫瘤器官比(圖21)。這些結果提示這些新鉸鏈賦予抗體結構變化，其對腫瘤定位有陽性作用(positiveeffect)並降低正常器官諸如腎的吸收。由此，當摻入治療性抗體時，這些新鉸鏈尤其有用。實施例10.包含新連接肽的抗體的增強的生物分布圖譜詳細的時間時程該實施例證實並延伸了實施例9所示的結果。利用預潤洗的AmiconCentricon30，抗體人CC49V2G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQIDNO9)和HuCC49(gly/ser)透析過濾並濃縮入低金屬5mM乙酸鈉緩衝液，pH5(LMB)。Centricon的離心在固定角度轉動體中，於5000xg、2-8℃進行。每種抗體通過加入50μlLMB到樣品池回收，簡單渦旋，然後在1000xg迴旋(back-spinning)10分。蛋白濃度利用UVSpec分析在280nm利用消光係數1.48測定。隨後利用LMB將每種抗體向下調節至10.5mg/ml。所述抗體利用1.0M硼酸(pH8.6，Chelex處理的且0.2μm過濾的)調節到～pH8.6。CHx-DTPA(溶於1.0M硼酸)隨後以3摩爾螯合物∶1摩爾抗體的摩爾比加入。加入的硼酸的量為抗體體積的十分之一。該混合物隨後被渦旋並在室溫保溫16-18小時。通過將混合物加入新的、預潤洗的Centricon30並透析過濾入締金屬5mM乙酸鈉，150mM氯化鈉，pH5作為每個預先的透濾來終止。每種抗體的濃度調至3mg/mL。雌性裸小鼠在右側大腿內側s.c.接種懸浮於HBSS(Biowhittaker，Cat#10-547F)中的的174T細胞。腫瘤大小在試驗開始前一天測定。腫瘤體積通過長度乘以寬度平方的一半[L×((W2)/2)]來計算。小鼠分組，使得平均腫瘤體積為～200mm3。在0時間，對42隻裸小鼠注入111In-標記的CH2結構域缺失的抗體。所述研究追蹤了抗體在7個時間點過程的分布，每個時間點包括6隻小鼠。通過將小鼠放置在重量配衡的(taredweight)紙上並擠壓膀胱來從每隻小鼠收集尿液。血液經由「眼放血」(大約200ul每隻小鼠)獲取。對於每隻獨立的小鼠，收集採集血樣以及尿樣過程中的任何糞便。血液收集後，通過斷頸處死小鼠。一次處死六隻小鼠中每一隻，並經由解剖收集其它樣品。每種樣品(除外皮膚)用3％福馬林洗滌，在紙巾上吸乾，並稱重。所有樣品利用重量配衡的紙稱重。樣品採集之後，將樣品置於硼矽酸鹽(borosilicate)檢驗管中並在gamma計數儀上計數，利用的衰減對照為1∶10稀釋的標記的抗體。與每個器官或組織相關的百分比放射活性相對於衰減對照(％注射的劑量/g組織或器官)計算，這些值顯示在圖22(CC49V2G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser])和23(HuCC49[gly/ser])中。實施例顯示包含該新連接肽的抗體分子在腎中的聚集減少，在血液中的聚集稍有減少，在腫瘤中的聚集明顯減少。該圖譜包含這些在體內穩定性增加以及效力和安全性增強的分子。實施例11.包含連接肽的抗體對還原劑的敏感性降低實施例證實結構域缺失的CC49G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQIDNO9)對穀胱苷肽(GSH)還原更穩定，如親本CC49，高於具有Gly-Ser鉸連結頭的結構域缺失的CC49。簡而言之，50ugddCC49(Gly-Ser)，ddCC49G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQIDNO9)或親本CC49在0，1，5或10mMGSH中、室溫保溫1小時。所用反應緩衝液包括100mMPBS，pH7.2或100mM乙酸鈉，100mMNaCl，pH4.5。GSH-處理的抗體與SDS一起加熱並上樣於4-20％梯度SDS-PAGE，非-還原凝膠。允許加樣的樣品在室溫以120Volts、90分遷移通過凝膠。蛋白用考馬斯藍染色，乾燥凝膠。凝膠顯示於圖24。如圖24所示，結構域缺失的CC49G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQIDNO9)對穀胱苷肽(GSH)還原更穩定，如親本CC49，高於具有Gly-Ser鉸連結頭的結構域缺失的CC49。此外，與100mMPBSpH7.2相比，100mM乙酸鈉pH4.5進一步保護結構域缺失的CC49G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQIDNO9)不受GSH還原。對還原劑的敏感性降低這一意料之外的觀察提示G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQIDNO9)鉸鏈設計使得可以採用利用還原劑的化學方法，諸如用於製備藥物偶聯物的那些(例如SPDP接頭)或將放射同位素(例如99MTc)連接於抗體的技術，同時保持抗體的物理完整性。對還原劑敏感性的這一優勢似乎不改變CH2-結構域缺失的構建體的藥物動力學優勢(見實施例10中的小鼠生物分布數據)。對還原劑敏感性降低也可從體內穩定性增加預測。實施例12.包含連接肽的抗-CD20抗體鉸鏈區連接肽G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQIDNO9)如實施例3所述被導入CH2結構域-缺失的C2B8抗體。C2B8是嵌合抗-CD20單克隆抗體，由分別融合於人重鏈和輕鏈恆定區的鼠重和輕鏈可變結構域組成。對鉸鏈區的正確修飾通過DNA分析確定。質粒DNA用於轉化CHODG44細胞以瞬時製備抗體蛋白。上清收集自產生含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的CH2結構域-缺失的C2B8抗體的細胞，培養上清中的抗體濃度通過免疫測定法測定。對來自瞬時(transient)細胞培養的大約3ng總抗體蛋白與CH2結構域-缺失的huCC49Mab進行比較，所述比較通過非-還原SDS-PAGE電泳然後通過Western印跡進行，其中利用抗-人IgGHRP偶聯的抗體以檢測CH2結構域缺失的huCC49A型和B型同種型。在這些條件下，A型作為單個120kDa同源二聚體遷移，B型作為60kDa雙體(doublet)遷移。顯示於SEQIDNO9的連接肽的摻入被發現基本增加產生的A型的比例。示例性結果顯示於圖27。該結果顯示G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈(SEQIDNO9)導致產生基本上所有A型CH2結構域-缺失的C2B8抗體而B型很少或不可檢出，證實了該鉸鏈可製備A型同種型的有用性可普遍用於各種特異性的抗體。實施例13.包含連接肽的抗-CD23抗體鉸鏈區連接肽G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQIDNO9)用於基本如實施例3所述構建CH2結構域-缺失的5E8(5E8ΔCH2)抗體。5E8是嵌合抗-CD23單克隆抗體，由分別融合於人重和輕鏈恆定結構域，的靈長類重和輕鏈可變結構域組成。對鉸鏈區的正確修飾通過DNA分析確定。5E8輕鏈和重鏈的核酸和胺基酸序列分別顯示於圖28和29。質粒DNA用於轉化CHODG44細胞以瞬時製備抗體蛋白。含有導入5E8ΔCH2抗體序列的G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQIDNO9)連接肽的細胞系(1A7)用於抗體製備。利用實施例4所述方法，製備並純化抗體。僅僅利用蛋白G柱純化的5E8ΔCH2G1/G3/Pro243Ala244Pro245抗體作為基本上單個峰純度≥97％洗脫而無需進一步HIC純化。還原的和非-還原的純化的蛋白樣品通過SDS-PAGE電泳分析。非還原條件下，預期A型作為單個120kDa異源二聚體遷移，B型作為60kDa雙體遷移。顯示於SEQIDNO9的連接肽的摻入被發現基本增加產生的A型的比例。示例性結果顯示於圖30。該結果顯示G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈(SEQIDNO9)導致產生基本上所有A型5E8ΔCH2抗體而B型很少或不可檢出，÷(見泳道2)，證實了該鉸鏈可製備A型同種型的有用性通常可用於各種特異性的抗體。5E8ΔCH2G1/G3/Pro243Ala244Pro245抗體通過大小排阻層析檢驗並作為單個峰洗脫，表明抗體產物沒有明顯聚集或分解。5E8ΔCH2G1/G3/Pro243Ala244Pro245抗體在FRET(螢光共振能量轉移(fluorescenceresonanceenergytransfer))競爭結合測定法中進一步檢測Cy5-標記的可溶CD23與Eu-標記的5E8IgG的結合，所述檢測利用Delphiafluorimeter(Wallac1420MultilabelCounterVictorV，PerkinElmer)。競爭結合曲線顯示於圖31。5E8ΔCH2G1/G3/Pro243Ala244Pro245(含有顯示於SEQIDNO9的連接肽)，和對照親本5E8IgG抗體被洗脫。鉸鏈改造的抗體的相對結合活性與對照親本5E8IgG抗體的相對結合活性不可區分。從這些結果明顯可見，將鉸鏈區(含有示於SEQIDNO9的連接肽)導入5E8ΔCH2抗體中導致A同種型的優選合成，同時保持完全結合活性，支持改造的鉸鏈的普遍有用性。實施例14.包含連接肽chB3F6抗體鉸鏈區連接肽G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQIDNO9)用於基本如實施例3所述構建CH2結構域-缺失的嵌合B3F6(chB3F6ΔCH2)抗體。chB3F6是嵌合抗-CRIPTO單克隆抗體，由分別融合於人重和輕鏈恆定結構域的鼠重和輕鏈可變結構域組成。鉸鏈區的正確修飾通過DNA分析確定。chB3F6輕鏈和重鏈的核酸和胺基酸序列分別顯示於圖32和33。質粒DNA用於轉化CHODG44細胞以瞬時製備抗體蛋白。含有導入chB3F6ΔCH2抗體序列的G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQIDNO9)連接肽的細胞系(3C7)用於抗體製備。利用實施例4所述方法，製備並純化抗體。僅僅利用蛋白G柱純化的5E8ΔCH2G1/G3/Pro243Ala244Pro245抗體作為基本上單個峰純度≥97％洗脫而無需進一步HIC純化。還原的和非-還原的純化的蛋白樣品通過SDS-PAGE電泳分析。非還原條件下，預期A型作為單個120kDa異源二聚體遷移，B型作為60kDa雙體遷移。顯示於SEQIDNO9的連接肽的摻入基本增加產生的A型的比例。示例性結果顯示於圖34。該結果顯示G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈(SEQIDNO9)導致產生基本上所有A型5E8ΔCH2抗體而B型很少或不可檢出，證實了該鉸鏈可製備A型同種型的有用性可普遍用於各種特異性的抗體。5E8ΔCH2G1/G3/Pro243Ala244Pro245抗體通過大小排阻層析檢驗並作為93-98％的單個峰洗脫，表明抗體產物沒有明顯聚集或分解。ChB3F6CH2G1/G3/Pro243Ala244Pro245抗體在流式細胞術競爭結合測定法中進一步檢測，所述檢測利用結合於GEO腫瘤細胞的FITC-標記的B3F6IgG作為CRIPTO抗原的來源。競爭結合曲線顯示於圖35。ChB3F6ΔCH2G1/G3/Pro243Ala244Pro245(含有顯示於SEQIDNO9的連接肽)，和對照親本5E8IgG抗體被洗脫。鉸鏈改造的抗體的相對結合活性與對照親本chB3F6IgG抗體的相對結合活性不可區分。從這些結果明顯可見，在chB3F6ΔCH2抗體中導入鉸鏈區(含有的示於SEQIDNO9連接肽)導致A同種型的優選合成，同時保持完全結合活性，進一步支持改造的鉸鏈的普遍有用性。等同物本領域技術人員利用不超過常規試驗將認識到，或能確定本發明具體實施方案的許多等同物。所述等同物意圖包含在以下權利要求中。序列表序列表SEQIDNO1GGGSSGGGSGSEQIDNO2EPKSCDKTHTSEQIDNO3CPPCPSEQIDNO4APELLGGPSEQIDNO5ELKTPLGDTTHTSEQIDNO6CPRCPEPKSCDTPPPCPRCPSEQIDNO7EPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSGSEQIDNO8EPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGSEQIDNO9EPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPAPGGGSSGGGSGSEQIDNO10EPKSCDKTHTSPPCPGGGSSGGGSGSEQIDNO11EPKSCDKTHTSPPCPAPGGGSSGGGSGSEQIDNO12EPKSCDKTHTCPPSPGGGSSGGGSGSEQIDNO13EPKSCDKTHTCPPSPAPGGGSSGGGSGSEQIDNO14EPKSCDKTHTCPPCPAPGGGSSGGGSGSEOIDNO15EPKSCDKTHTCPPCPGGGSSGGGSGSEQIDNO16CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGGTGAAACCTGGGGCTTCCGTGAAGATTTCCTGCAAGGCAAGCGGCTACACCTTCACTGATCACGCAATCCACTGGGTGAAACAGAATCCTGGACAGCGCCTGGAGTGGATTGGATATTTCTCTCCCGGAAACGATGATTTTAAGTACAATGAGAGGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCTGCCAGCACTGCCTACGTGGAGCTCTCCAGCCTGAGATCCGAGGATACTGCAGTGTACTTCTGCACAAGATCCCTGAATATGGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGGAGGTGGCTCGAGTGGAGGCGGATCCGGAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDNO17GACATCGTGATGAGCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGTGACTCTGAATTGCAAGTCCAGCCAGTCCCTGCTCTATAGCGGAAATCAGAAGAACTATCTCGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGAGCCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCGCTAGGGAATCCGGCGTGCCTGATCGCTTCAGCGGCAGCGGATCTGGGACAGACTTCACTCTGACAATCAGCAGCGTGCAGGCAGAAGACGTGGCAGTCTATTATTGTCAGCAGTATTATAGCTATCCCCTCACATTCGGCGCTGGCACCAAGCTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGASEQIDNO18QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQNPGQRLEWIGYFSPGNDDFKYNERFKGKATLTADTSASTAYVELSSLRSEDTAVYFCTRSLNMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO19DIVMSQSPDSLAVSLGERVTLNCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASARESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQIDNO20CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGGTGAAACCTGGGGCTTCCGTGAAGATTTCCTGCAAGGCAAGCGGCTACACCTTCACTGATCACGCAATCCACTGGGTGAAACAGAATCCTGGACAGCGCCTGGAGTGGATTGGATATTTCTCTCCCGGAAACGATGATTTTAAGTACAATGAGAGGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCTGCCAGCACTGCCTACGTGGAGCTCTCCAGCCTGAGATCCGAGGATACTGCAGTGTACTTCTGCACAAGATCCCTGAATATGGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGT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NQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASARESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKSEQIDNO32QVQLQQSDAELVKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQNPEQGLEWIGYFSPGNDDFKYNERFKGKATLTADKSSSTAYVQLNSLTSEDSAVYFCTRSLNMAYWGQGTSVTVSSSEQIDNO33QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYGSGSNYWGQGTLVTVSSSEQIDNO34QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQNPGQRLEWIGYFSPGNDDFKYNERFKGKATLTADTSASTAYVELSSLRSEDTAVYFCTRSLNMAYWGQGTLVTVSSSEQIDNO35QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQNPGQRLEWIGYFSPGNDDFKYNERFKGKATITADTSASTAYVELSSLRSEDTAVYFCARSLNMAYWGQGTLVTVSSSEQIDNO36IGKTISKKAKSEQIDNO37CPEPKSCDTPPPCPRSEQIDNO38GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGCGGCTTGGCAAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCCGGGTTCAGGTTCACCTTCAATAACTACTACATGGACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGCAGGGGCTGGAGTGGGTCTCACGTATTAGTAGTAGTGGTGATCCCACATGGTACGCAGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGAGAACGCCAAGAACACACTGTTTCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTCTATTACTGTGCGAGCTTGACTACAGGGTCTGACTCCTGGGGCCAGGGAGTCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAGCACCTGGAGGTGGCTCGAGTGGAGGCGGTTCCGGAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAASEQIDNO39GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGGGACAGAGTCACCATCACTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGGTATTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGTTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCGTCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCGACTTATTACTGTCTACAGGTTTATAGTACCCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTSEQIDNO40EVQLVESGGGLAKPGGSLRLSCAASGFRFTFNNYYMDWVRQAPGQGLEWVSRISSSGDPTWYADSVKGRFTISRENAKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCASLTTGSDSWGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO41DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRYYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTVSSLQPEDFATYYCLQVYSTPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQIDNO42CAGGTCCAACTGCAGCAGGTTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGAATGATCCTAGCAACGGTCGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCATCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTTCAAGGGGCCCTAATTACTTCTATTCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAGCACCTGGAGGTGGCTCGAGTGGAGGCGGTTCCGGAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTSEQIDNO43GATTTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATeAAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTCATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTSEQIDNO44QVQLQQVGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWIHWVKQRPGQGLEWIGENDPSNGRTNYNEKFKNKATLTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCSRGPNYFYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSEQIDNO45DFLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQIDNO46CAGGTACAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAACAGACACCTGGTCGGGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTTATCCCGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCGACTTACTACGGCGGTGACTGGTACTTCAATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCTGCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAGCACCTGGAGGTGGCTCGAGTGGAGGCGGTTCCGGAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDNO47QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*SEQIDNO48CAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGATCGTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACTTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGACTAGTAACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGASEQIDNO49QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*SEQIDNO50ESKYGPPSEQIDNO51CPSCPSEQIDNO52APEFLGGPSEQIDNO53ESKYGPPCPSCPEPKSCDTPPPCPRCPAP權利要求1.組合物，其包含具有至少兩個結合位點和至少兩條多肽鏈的多肽二聚體，其中所述至少兩條多肽鏈包含至少一個重鏈部分和合成連接肽，其中超過50％的所述多肽二聚體包含經由至少一個鏈間二硫鍵連接的多肽鏈。2.權利要求1的組合物，其中超過90％的多肽二聚體經由至少一個鏈間二硫鍵連接。3.權利要求1的組合物，其中所述多肽鏈包含經由連接肽與VL，VH或CH1基因融合的CH3結構域。4.權利要求1的組合物，其中所述多肽鏈缺乏所有或部分CH2結構域。5.權利要求1的組合物，其中所述多肽二聚體經由兩個或更多個鏈間二硫鍵連接。6.權利要求1的組合物，其中所述重鏈部分源自選自IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4組成的組的抗體同種型。7.權利要求6的組合物，其中所述重鏈部分包含源自選自γ1鉸鏈，γ2鉸鏈，γ3鉸鏈或γ4鉸鏈組成的組的鉸鏈區的胺基酸序列。8.權利要求7的組合物，其中所述重鏈部分包含嵌合鉸鏈。9.權利要求1的組合物，其中所述合成連接肽包含至少部分IgG1鉸鏈結構域，至少部分IgG3鉸鏈結構域。10.權利要求1的組合物，其中所述結合位點獨立選自抗原結合位點，受體的配體結合部分，以及配體的受體結合部分組成的組。11.權利要求1的組合物，其中所述多肽二聚體包含四條多肽鏈，其中兩條多肽鏈包含至少一個重鏈部分和合成連接肽。12.組合物，其包含具有至少兩個結合位點和至少兩條多肽鏈的多肽二聚體，其中所述至少兩條多肽鏈包含至少一個重鏈部分和合成連接肽，其中超過約50％的多肽二聚體包含經由至少一個鏈間二硫鍵連接的多肽鏈，其中所述連接肽包含位於Kabat編號系統位置243的脯氨酸殘基。13.權利要求12的組合物，其中超過90％的多肽二聚體經由至少一個鏈間二硫鍵連接。14.權利要求12的組合物，其中所述合成連接肽還包含位於Kabat編號系統的位置239或242的半胱氨酸。15.權利要求12的組合物，其中至少一條多肽鏈包含經由連接肽連接於VL，VH或CH1結構域的CH3結構域。16.權利要求12的組合物，其中所述合成連接肽還包含位於Kabat編號系統的位置244的丙氨酸殘基和位置245的脯氨酸殘基。17.治療可從利用結合分子的療法獲益的受試者的方法，包括將權利要求1或11的組合物給予所述受試者，以使得所述治療發生。18.權利要求17的方法，其中所述受試者患有癌症。19.權利要求17的方法，其中所述受試者患有淋巴瘤。20.權利要求17的方法，其中所述受試者患有自身免疫疾病或病症。21.權利要求17的方法，其中所述受試者患有炎性疾病或病症。22.權利要求12的組合物，其中所述結合位點獨立選自抗原結合位點，受體的配體結合部分，和配體的受體結合部分組成的組。23.核酸分子，其包含編碼權利要求1或12的多肽鏈的核苷酸序列。24.宿主細胞，其包含權利要求23的核酸分子。25.權利要求12的組合物，其中所述多肽二聚體包含四條多肽鏈，其中兩條多肽鏈包含至少一個重鏈部分和合成連接肽。26.連接肽，其包含選自SEQIDNO8-15，和53組成的組的胺基酸序列。27.連接肽，其由選自SEQIDNO8-15，和53組成的組的胺基酸序列組成。28.編碼多肽鏈的核酸分子，其中所述核酸分子包含選自SEQIDNO16，20，21，38，42，46和47組成的組的核苷酸序列。29.編碼多肽鏈的核酸分子，其中所述核酸分子包含選自SEQIDNO24和25組成的組的核苷酸序列。30.結構域缺失的抗體分子，其包含選自SEQIDNO18，22，23，40，和44組成的組的胺基酸序列。31.結構域缺失的抗體分子，其包含選自SEQIDNO26和27組成的組的胺基酸序列。32.抗體分子，其包含胺基酸序列SEQIDNO31。33.抗體分子，其包含胺基酸序列SEQIDNO35。34.分離第一種和第二種多肽二聚物的方法，其中所述第一種多肽二聚體包含至少兩個結合位點和至少兩條多肽鏈，其中所述至少兩條多肽鏈包含重鏈部分，其中所述第一種多肽二聚體包含經由至少一個二硫鍵連接的多肽鏈，其中第二種多肽二聚體包含至少兩個結合位點和至少兩條多肽鏈，其中所述至少兩條多肽鏈包含重鏈部分，其中第二種多肽二聚體包含不經由至少一個二硫鍵連接的多肽，所述方法包括以下步驟i)使包含第一種和第二種多肽二聚體的混合物與基於疏水反應分離所述多肽二聚體的介質接觸，所述接觸在允許第二種多肽二聚體與所述介質結合的條件下進行；和ii)收集第一種多肽二聚體由此分離第一種和第二種多肽二聚體。35.權利要求34的方法，其中所述收集步驟包括使所述介質與大約中性pH的、電導性大約120mS/cm的溶液接觸。36.權利要求34的方法，其中所述電導性為大約116mS/cm。37.權利要求36的方法，還包含在步驟ii)之前使所述介質與大約中性pH的、電導性大約140mS/cm的溶液接觸，使得第一種和第二種多肽二聚體與所述介質結合。38.權利要求34的方法，其中所述多肽鏈包含經由合成連接肽連接於VL，VH或CH1結構域的CH3結構域。39.權利要求34的方法，其中第一種和第二種多肽二聚體的重鏈部分源自選自IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4組成的組的抗體同種型。40.權利要求34的方法，其中所述重鏈部分包含源自鉸鏈區的胺基酸序列，所述鉸鏈區選自γ1鉸鏈，γ2鉸鏈，γ3鉸鏈，和γ4鉸鏈組成的組。41.權利要求34的方法，其中所述結合位點獨立選自抗原結合位點，受體的配體結合部分，和配體的受體結合部分組成的組。42.權利要求41的方法，其中多肽二聚體的至少一個結合位點包含抗體的至少一個CDR，所述抗體選自2B8，Lym1，Lym2，LL2，Her2，B1，MB1，BH3，B4，B72.3，CC49，和5E10組成的組。43.權利要求41的方法，其中多肽二聚體的至少一個結合位點包含配體的受體結合部分。44.權利要求41的方法，其中多肽二聚體的至少一個結合位點包含受體的配體結合部分。45.組合物，其包含通過權利要求34的方法製備的第一種多肽二聚體。46.治療可從利用結合分子的治療獲益的受試者的方法，包含將權利要求45的組合物給予受試者，以使得治療發生。47.權利要求34的方法，其中所述多肽二聚體包含四條多肽鏈，其中兩條所述多肽鏈包含至少一個重鏈部分。48.分離第一種正確摺疊的抗體分子與第二種正確摺疊的抗體分子的方法，其中所述第一種和第二種抗體分子分別包含四條多肽鏈，其中至少兩條鏈包含至少一個重鏈部分，至少兩條鏈包含至少一個輕鏈部分，所述方法包括以下步驟i)使包含第一種和第二種抗體分子的混合物與可基於疏水反應分離抗體分子的介質接觸；ii)使所述介質與電導性大約120mS/cm且大約中性pH的溶液接觸，使得所述第一種抗體分子不結合所述介質且所述第二種抗體分子結合所述基質，由此分離所述的第一種和第二種抗體分子。49.組合物，包含通過權利要求48的方法製備的第一種多肽。50.增加細胞產生的第一種多肽二聚體的量相對於第二種多肽二聚體的量的方法，其中所述第一種和第二種多肽二聚體包含至少兩個結合位點和至少兩條多肽鏈，所述至少兩條多肽鏈包含重鏈部分，其中所述第一種二聚體包含經由至少一個二硫鍵連接的多肽鏈，所述第二種二聚體包含不經由至少一個二硫鍵連接的多肽鏈，所述方法包括以下步驟改造所述多肽鏈以包括合成連接肽，使得細胞產生的第一種多肽二聚體的量相對於第二種多肽二聚體的量而言是增加的。51.通過權利要求50的方法製備的組合物。52.權利要求50的組合物，其中所述多肽二聚體包含四條多肽鏈，其中兩條多肽鏈包含至少一個重鏈部分和合成連接肽。53.包含合成連接肽的多肽，其包含胺基酸序列SEQIDNO37，其中所述多肽不是天然存在的IgG3分子。54.權利要求53的多肽，其中所述多肽是IgG4分子。55.權利要求54的多肽，其中所述多肽結合VLA-4。56.增加細胞產生的IgG4分子群體中包含經由至少一個二硫鍵連接的多肽鏈的二聚體的量的方法，包括以下步驟使得細胞表達包含合成連接肽的IgG4分子，使得IgG4分子群體中包含經由至少一個二硫鍵連接的多肽鏈的二聚體的量增加。57.組合物，其包含具有至少兩個結合位點和至少兩條多肽鏈的多肽二聚體，其中所述至少兩條多肽鏈包含至少一個重鏈部分並缺乏所有或部分CH2結構域，其中超過50％的多肽二聚體包含經由至少一個鏈間二硫鍵連接的多肽鏈。58.權利要求57的組合物，其中所述多肽二聚體包含四條多肽鏈，其中兩條所述多肽鏈包含至少一個重鏈部分。全文摘要本發明描述了從包含兩種類型的多肽二聚體的混合物分離或優選合成經由至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體與不經由至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體的方法。這些形式可利用疏水反應層析相互分離。此外，本發明涉及導致經由至少一個鏈間二硫鍵連接或不經由至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體的優先生物合成的連接肽。本發明還涉及組合物，其中大部分二聚體經由至少一個鏈間二硫鍵連接或不經由至少一個鏈間二硫鍵連接。本發明還涉及新的結合分子，例如，其包含本發明的連接肽。文檔編號C07K16/00GK1842539SQ200480024576公開日2006年10月4日申請日期2004年6月28日優先權日2003年6月27日發明者加裡·R·布拉斯拉夫斯基,斯科特·格拉澤,楊祖宏,珍妮弗·霍普,保羅·欽申請人:比奧根艾迪克Ma公司