馬鈴薯StICE1基因及其在提高植物抗逆性中的應用
2024-04-16 05:14:05 1
馬鈴薯stice1基因及其在提高植物抗逆性中的應用
技術領域
1.本發明涉及一種從馬鈴薯中克隆得到的新基因及其應用，特別涉及從馬鈴薯中克隆得到的stice1基因及其在提高植物抗逆性中的應用。本發明屬於生物技術領域。
背景技術：
2.馬鈴薯是全球第四大重要糧食作物，僅次於小麥、玉米與水稻，其具有生長周期短、適應性強、產量高，塊莖生長沒有限制等生產優勢，具有很大的增產潛力，對糧食增產、維護糧食安全方面發揮重大作用。低溫脅迫是限制馬鈴薯生產區域和產量的重要原因，目前生產上缺乏有效的選擇標準和育種途徑，使得馬鈴薯耐凍性優異新品種改良的進展趨於緩慢。
3.目前馬鈴薯生產上主要應用為四倍體馬鈴薯，因其基因組龐大，導致研究滯後，基因克隆進展遠遠落後於水稻、玉米等主要作物。我國馬鈴薯產區主要分布在陝、甘、寧、蒙、晉等西北及川、貴、雲、渝等西南高緯度、高海拔區域，其種植面積全國的65％左右。挖掘和利用抗寒冷優良基因對於馬鈴薯種質資源遺傳改良有著重要的理論意義和應用價值。我國現階段馬鈴薯新品種選育還是以傳統雜交育種為主，像分子標記育種、轉基因育種、分子設計育種等分子育種手段雖取得了一定的進展，但相對於世界馬鈴薯育種水平還有不足，嚴重限制了馬鈴薯遺傳育種的研究速度。
4.馬鈴薯生長極易受到低溫脅迫影響。當溫度低於5℃-7℃時，馬鈴薯植株就會停止生長；低於2℃時，馬鈴薯塊莖上的芽眼就會受到損傷，進而導致無法萌發；在-0.5℃至-0.8℃時幼苗細胞膜受到損傷，葉片出現萎蔫；在-2℃時發生凍害，細胞內出現結晶，細胞無法存活，植株死亡，成株在-4℃時整株能夠死亡。由此可見，寒冷嚴重影響馬鈴薯的經濟效益和產業發展規模。探明馬鈴薯的抗寒機制，選育馬鈴薯優異抗寒種質材料和品種在農業生產上具有巨大的應用價值和意義。
5.本發明通過克隆馬鈴薯中擬南芥atice1同源基因stice1，構建基因過表達載體以及敲除突變體，通過農桿菌介導的方法侵染轉化四倍體馬鈴薯以及二倍體馬鈴薯，經過組培篩選轉基因陽性植株。研究預期對轉化獲得的基因編輯陽性材料進行低溫條件處理下的表型實驗：通過測定突變體與對照植株形態學、細胞生物學、生理生化、分子生物學等指標的差異表現，確定stice1基因在響應逆境脅迫過程中的生理功能；通過晶片、測序等技術檢測stice1所調節的下遊靶基因表達情況，並通過qrt-pcr實驗進行驗證。
6.結果表明，stice1在冷脅迫、鹽脅迫信號級聯反應過程中起至關重要的作用。創製馬鈴薯stice1基因過表達、基因編輯敲除陽性株系是對分子輔助育種篩選優異抗逆馬鈴薯新品種的一個重要手段。本發明的提出為馬鈴薯抵禦非生物逆境脅迫的基礎研究以及開拓馬鈴薯在高寒冷涼生產應用範圍提供了理論依據以及技術手段。
技術實現要素：
7.本發明的目的之一在於提供一種從馬鈴薯中克隆得到的新基因stice1；
8.本發明的目的之二在於提供所述的新基因stice1在提高植物抗逆性中的應用。
9.為了達到上述目的，本發明採用了以下技術手段：
10.本發明發明人通過前期冷脅迫處理馬鈴薯四倍體品種底西芮材料進行rna-seq分析，獲得一些表達差異明顯的基因並進行克隆。其中成功獲得馬鈴薯stice1基因序列並與資料庫比對一致無突變。構建馬鈴薯stice1基因過表達載體，利用農桿菌介導馬鈴薯愈傷組織轉化體系，創製其過表達陽性植株。對篩選出的陽性植株進行分子檢測，並以底西芮作為野生型對照，觀測它們在4℃冷脅迫和鹽脅迫處理下的生長狀態及農藝性狀。結果表明，馬鈴薯stice1基因過表達陽性植株相對於野生型在冷脅迫或鹽脅迫環境下呈現較強的抵禦能力。
11.在上述研究的基礎上，本發明提出了一種從馬鈴薯中克隆得到的基因，命名為stice1，所述的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
12.含有所述的基因的表達載體以及含有所述的表達載體的宿主細胞也在本發明的保護範圍之內。
13.進一步的，本發明還提出了所述的基因、所述的表達載體或所述的宿主細胞在提高植物抗逆性中的應用。
14.其中，優選的，所述的抗逆性包括抗冷脅迫以及抗鹽脅迫。
15.其中，優選的，所述的植物為馬鈴薯。
16.相較於現有技術，本發明的有益效果是：
17.馬鈴薯stice1基因是轉錄因子家族bhlh家族中的一個成員，在馬鈴薯抵禦非生物逆境脅迫的過程以及植株生長發育過程中起重要作用。對其進行功能研究，證明stice1在冷脅迫、鹽脅迫中起至關重要的作用。創製馬鈴薯stice1基因過表達陽性株系是對分子輔助育種篩選優異抗逆馬鈴薯新品種的一個重要手段。本發明的開展為馬鈴薯抵禦非生物逆境脅迫的基礎研究以及開拓馬鈴薯在高寒冷涼生產應用範圍提供了理論依據以及可行性方案。對馬鈴薯stice1基因進行深入研究並利用其功能在抗寒新品種分子育種中，期望能夠得到優異種質資源。
附圖說明
18.圖1為馬鈴薯stice1基因克隆電泳圖；
19.圖2為pmdc85載體圖；
20.圖3為底西芮農桿菌介導愈傷組織誘導轉化體系；
21.圖4為馬鈴薯stice1過表達陽性植株的獲得與鑑定；
22.圖5為馬鈴薯stice1過表達陽性植株4℃生長表型；
23.圖6為馬鈴薯stice1過表達陽性植株(oe2、oe8、oe16)與野生型des4℃處理生長差異比較；
24.圖7為馬鈴薯stice1過表達陽性植株(oe2、oe8、oe16)與野生型des鹽處理生長表型；
25.圖8為馬鈴薯stice1過表達陽性植株(oe2、oe8、oe16)與野生型des鹽脅迫處理生長差異比較。
具體實施方式
26.本發明將通過以下實施例作進一步說明。實施例僅表達了本發明的優選實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對本發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形、改進及替代，這些都屬於本發明的保護範圍。
27.實施例1馬鈴薯stice1基因序列比對及克隆
28.通過網站https://phytozome-next.jgi.doe.gov/資料庫分析馬鈴薯stice1基因序列，並以四倍體馬鈴薯品種底西芮作為模板對其進行克隆。底西芮，馬鈴薯品種，橢圓形，薯皮紅色，薯肉淺黃色，抗馬鈴薯x病毒病，中抗馬鈴薯y病毒病，由農業部從荷蘭引入。在世界上組培應用廣泛，被公認是馬鈴薯中的模式基因型。
29.在0.2mlpcr管中加樣體系(表1)；短暫離心，混勻樣品。反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，50～65℃(不同的引物組合需要摸索其最適退火溫度)退火30s，72℃延伸20s～5min(根據目的片段長度做相應的調整)，30～35個循環；72℃延伸5min。取5～10μl產物，用1％～2％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，克隆基因大小為1,593bp(圖1)，序列如seq id no.1所示。
30.表1pcr反應體系
[0031][0032]
實施例2馬鈴薯stice1基因在提高植物抗逆性中的應用
[0033]
1、過表達與基因編輯敲除載體構建
[0034]
構建過表達載體：利用dnaman對馬鈴薯stice1基因序列進行分析比對，採用pmdc85作為目的載體。以馬鈴薯品種底西芮脫毒組培苗作為實驗材料，提取葉片總rna，反轉錄成cdna。以cdna作為模板，用pcr技術擴增目的片段，再將目的片段連接到t載體進行測序，確保沒有鹼基發生突變以用於下一步過表達載體的構建。選擇saci和asci作為酶切連接位點，最終將目的基因片段連接到過表達載體pmdc85上，得到的重組載體命名為pmdc85-stice1。
[0035]
構建載體所需要設計的引物如下表2：
[0036]
表2過表達與基因編輯敲除載體構建及檢測引物序列
[0037][0038]
[0039]
pmdc85載體圖如圖2所示。
[0040]
2、農桿菌介導馬鈴薯轉化愈傷組織
[0041]
目前，應用於植物轉基因較多的方法有基因槍轟擊法和農桿菌介導法。由於基因槍轟擊的隨機性，容易出現突變、丟失和引起基因沉默等不利於外源基因在宿主植物的穩定表達的缺點，而農桿菌介導法是一種天然的植物遺傳轉化系統，外源基因在轉基因植物中的拷貝數低、遺傳穩定，是最常用的轉基因技術。
[0042]
農桿菌介導法具有材料範圍廣，轉化率高，單拷貝比例高，轉化子穩定等特點。髮根農桿菌(agrobacteriumrhizogenes)含有ri質粒，能夠誘導被侵染的植物細胞產生毛髮狀根。其侵染植物是將其ri質粒上的t-dna插入到宿主植物基因組中，這一點與ti質粒相類似。轉移機制也類似，所不同的是vir區和t-dna區所含基因及其同源性不同。髮根農桿菌由於宿主植物損傷部位產生的酚類化合物而附著在植物的細胞壁上，vira的產物是一種跨膜蛋白，進一步激活virg的產物。t-dna區的tl區具有較高的穩定性，tr區具有與生長素合成有關的基因tmsl和tms2及農杆鹼或甘露鹼合成基因。tr區可進行改造，這樣ri通過農桿菌細胞膜特定「孔道」進入宿主植物細胞核，進而使t-dna整合到植物基因組中。t-dna整合進宿主細胞基因組，是轉化過程中最重要也最關鍵的步驟。t-dna在寄主細胞染色體上的整合是隨機的，但對轉錄活化區域有所偏好。t-dna通過與事先斷裂的寄主dna雙鏈(dsb)發生重組來完成整合，進而進行表達。
[0043]
經過前期摸索，目前採用的轉化體系如下：
[0044]
(1)將馬鈴薯四倍體品種底西芮幼苗進行擴繁培養，選擇生長周期為28天至42天長勢良好的無菌苗作為實驗材料。
[0045]
(2)分別剪取一定大小的馬鈴薯無菌苗的莖段和葉片，作為轉化的外植體。
[0046]
(3)外植體置於預培養基上，在25℃，16小時/8小時光照/暗條件下預培養，培養時間為2天。
[0047]
(4)將轉化pmdc85-stice1的農桿菌菌液用ms液體培養基稀釋到od
600
為0.5-0.6，外植體與菌液混合後浸染10分鐘。用濾紙吸乾外植體上的菌液，置於共培養基上，28℃黑暗條件下培養2天。
[0048]
(5)將莖段外植體轉移到愈傷誘導培養基上，25℃，16小時光照條件下培養。
[0049]
(6)待愈傷組織生成後，將莖段外植體轉移到芽誘導培養基上，每10天更換一次培養基，誘導芽的分化。
[0050]
(7)待誘導的芽生長到2至3釐米時，將其剪下置於生根培養基上(如圖3、圖4)。
[0051]
3、馬鈴薯stice1基因過表達陽性株系逆境脅迫表型分析
[0052]
對突變體材料進行低溫脅迫以及鹽脅迫下的生長表型實驗，觀察馬鈴薯stice1過表達陽性植株與野生型品種底西芮在各個脅迫環境下幼苗的生長形態，比較它們之間的區別，初步確定stice1功能作用。
[0053]
3.1馬鈴薯陽性株系在冷脅迫處理下表型分析
[0054]
溫度是影響植物生長發育各個階段的重要因素，植物可以在一定的溫度範圍保持正常的生長狀態。低溫脅迫會使植物受到冷害和凍害，冷害是冰點以上低溫對植物的危害，相對的植物對冷害的適應能力稱為抗冷性植物受到冷害較直接的表現形式是，葉片失綠、萎蔫、死苗、籽粒空癟、表皮變色、局部壞死等。間接表現為膜透性增加選擇透性減弱、膜內
大量溶質外滲；吸水能力和蒸騰速率都明顯下降，水分代謝失調；原生質流動減慢或停止；葉綠體分解加速，葉綠素含量下降等。凍害是指植物受到冰點以下的低溫傷害，相對的植物對凍害的適應能力稱為抗凍性。植物受到凍害就比較嚴重了，如葉片的組織因細胞失去膨壓而變軟，顏色變為褐色，隨時可能死亡。凍害的機理表現為胞間結冰環境溫度隨時間緩慢下降，細胞間隙結冰，引起胞質水分虧缺；胞內結冰環境溫度驟然下降、質外體與共質體全都結冰，冰在形成過程中會對亞細胞精細結構的機械傷害。
[0055]
本發明將馬鈴薯stice1過表達陽性植株與野生型底西芮生長狀態一致的無菌組培苗含有側芽的莖段同時扦插到ms培養基上，放入4℃光照培養箱中進行培養。生長約60天時，對各自幼苗進行農藝性狀分析，馬鈴薯stice1過表達陽性植株相對於野生型具有明顯的抵禦冷害脅迫能力(如圖5)。
[0056]
將各個幼苗從ms培養基中取出，衝洗清理殘餘的培養基，測量野生型與各個陽性植株的農藝形狀指標，包括地上地下部分的長度、稱取整株幼苗的重量、統計側根數量與長度等(如圖6)。
[0057]
3.2馬鈴薯陽性株系在鹽脅迫處理下表型分析
[0058]
鹽脅迫是指土壤中鹽離子濃度過高從而對植株的生長發育產生脅迫，產生大量危害。
[0059]
(1)生理乾旱：土壤中可溶性鹽類過多，由於滲透勢增高而使土壤水勢降低，根據水從高水勢向低水勢流動的原理，根細胞的水勢必須低於周圍介質的水勢才能吸水，所以土壤鹽分愈多根吸水愈困難，甚至植株體內水分有外滲的危險。因而鹽害的通常表現實際上是旱害，尤其在大氣相對溼度低的情況下，隨蒸騰作用加強，鹽害更為嚴重，一般作物在溼季耐鹽性增強。
[0060]
(2)離子的毒害作用：在鹽分過多的土壤中植物生長不良的原因，不完全是生理乾旱或吸水困難，而是由於吸收某種鹽類過多而排斥了對另一些營養元素的吸收，產生了類似單鹽毒害的作用。
[0061]
(3)破壞正常代謝：鹽分過多對光合作用、呼吸作用和蛋白質代謝影響很大。鹽分過多會抑制葉綠素生物合成和各種酶的產生，尤其是影響葉綠素-蛋白複合體的形成。鹽分過多對呼吸的影響，多數情況下表現為呼吸作用降低，也有些植物增加鹽分具有提高呼吸的效應。
[0062]
本發明將馬鈴薯stice1過表達陽性植株與野生型底西芮生長狀態一致的無菌組培苗含有側芽的莖段同時扦插到含有100mmolnacl的ms培養基上，於溫室中進行培養。生長約60天時，對各自幼苗進行農藝性狀分析，馬鈴薯stice1過表達陽性植株相對於野生型具有明顯的抵禦鹽脅迫能力(如圖7)。
[0063]
將各個幼苗從ms培養基中取出，衝洗清理殘餘的培養基，測量野生型與各個陽性植株的農藝形狀指標，包括地上地下部分的長度、稱取整株幼苗的重量、統計側根數量與長度等(如圖8)。