Bmp膠原框架法提取工藝的製作方法

2023-12-10 15:55:27 4

專利名稱：：Bmp膠原框架法提取工藝的製作方法
技術領域：
：BMP是唯一能夠單獨誘導骨組織形成的局部骨生長因子，它在骨缺損修復中，其作用幾乎與自體骨的效果相似，在一定條件下，能誘導未分化的間充質細胞向骨系細胞轉化，促進骨細胞的生長增殖。但由於BMP在骨組織中的含量很少(約lmg/kg溼骨)，且單獨使用在體內很快擴散，容易被蛋白酶所分解吸收，因而不能在局部發揮持續刺激和誘導成骨的作用，其誘導活性難以得到充分的發揮。因此，BMP必須與載體交聯形成活性骨移植材料才能發揮其生理活性作用。骨內自身含有的BMP是一種非膠原蛋白，是骨明膠的降解產物。BMP平均分子量在18.5i0.5KD,有報導30KD區帶也有誘導活性，並發現誘導植入部位的間充質細胞向成骨細胞方向轉化，從而加速骨的生長。一般認為BMP無種屬特異性，來源於人、猴、牛、鼠等的BMP在結構上具有同源性，可跨越種屬誘導宿主間葉組織細胞分化成骨。BMP作用是軟骨內化骨和膜內化骨，即誘導間充質細胞分化為骨細胞至成骨。低等動物的BMP仍能在髙等動物體內誘導成骨。動物和人骨提取的BMP均為一混合多肽成分，分子量多集中在14、18、22、30KD,誘導成骨量與BMP劑量成正相關，BMP活性單位的定量尚無統一理想方法。BMP不溶於水而溶於髙濃度鹽溶液中，可與骨基質膠原和羥基磷灰石結合。BMP己在骨折癒合，骨缺損修復等領域內顯示出潛在價值。自從Urist在脫鈣骨基質中發現BMP提出骨誘導理論以來,有關BMP的研究工作取得了很大進展。迄今為l匕通過基因重組技術分離和克隆出的BMP家族成員(BMPS)已經超過40種,並且這一數量在不斷增加。在動物的生長發育過程中，BMPs及其受體幾乎遍及所有的組織器官，功能已涉及到胚胎學、發育學、進化學、基因學和病理學等多個學科。但BMP的骨誘導作用仍是其最基本和最重要的作用，在矯形外科有廣闊的應用前景。二、
背景技術：
——BMP的提取BMP是一種生物活性蛋白，對濃度、pH、溫度等多種條件比較敏感其提取過程是一系列的生物化學反應過程或物理變化過程。加快反應速度便可縮短提取時間，所以增大現有條件下反應物之間的分子碰撞機會可提髙反應速度。1.製作原理BMP是一類能從多種動物骨皮質中分離出來的低分子量酸性多肽，可以誘導未分化的間充質細胞不可逆地分化為軟骨和骨組織，從而導致新骨形成I型膠原，常可提高材料的生物活性,促進細胞粘附。改進提取工藝，從動物骨中提取儘可能多的具良好活性的BMP是極重要的一項工作。1)骨粒的粒度對BMP的產量及活性有重要影響。文獻介紹的骨粒度範圍較大，但多在1252000um。BMP的生物活性與其計量存在著正比關係，計量過小則易被很快吸收而不能對靶細胞形成足夠刺激。2)膠原降解為明膠與BMP:明膠是膠原降解的產物，骨幹骨通過氯仿甲醇等步驟的連續處理之後，即成為不溶性骨基質明膠。把它植入同種的肌肉組織內，或用它誘導體外培養的肌肉生長物時，就能產生新骨和軟骨。目前認為，骨基質明膠的生物誘導活性是由於含有BMP之故。2.BMP的提取步驟及方法採用化學方法，即用CaCh—尿素無機和有機溶劑混合物從脫鈣骨皮質明膠中提取出，在鹽酸胍和凝膠柱分步沉澱而製取的。這一過程是很麻煩的過程。雖然在移植骨基質內BMP含量甚微，但是為完成臨床的初步實驗能達到足夠的有效量。如1973年Urist所述，表1總結了BMP的提取步驟和用不同方法分離的聯合的蛋白質以及列表觀察各種蛋白部分植入後新骨形成的結果。表ltableseeoriginaldocumentpage4
發明內容1.製作原理從膠原降解到明膠及其降解產物，是一連續解膠原分子之間和分子內部的交聯鍵的過程，這些交聯鍵都是分子間鍵，解交聯可以有各種方法。一般製作法先將大塊骨打碎，變成骨粒，其優點是在處理上很容易將骨架(骨的編織結構)散開，用化學試劑(如EDTA、LiCl、鹽酸胍、尿素等)，將BMP從這些混合物中抽提出來。本發明用偏光顯微鏡和測分子量的跟蹤方法，監測解交聯的程度。閒為無論用何法解交聯，如果解交聯劑濃度大、時間長，最終都會導致膠原全部降解至胺基酸(膠原的特性)，我們採用正交實驗找出最佳條件。偏光顯微鏡可以觀察到骨的編織結構、骨膠原、骨明膠及其降解的片段。如果骨膠原己降解到明膠階段，骨塊均已散開，同時測定的分子量已有18KD出現，即說明BMP已經存在於明膠及其降解的混合液中。用離心法將較大的分子沉出，上清經超濾濃縮、乾燥、研碎，即為BMP粉劑。這部分的產量很低，為了增強臨床療效，可以應用較大的劑量。本發明所用的解交聯劑是用酸法。2.本發明的特點1)從骨膠原降解為骨明膠及其降解產物生成階段，是解交聯鍵的過程，其解開的程度完全與使用方法的試劑化學性質強弱和時間的長短有關。可以有幾種方法(鹼法、酸法、鹽鹼法和酶法)，一般採用鹽鹼法(CaC2、NaCl)。本發明主要用的解交聯法是酸法。2)從骨膠原降解為骨明膠及其降解產物生成階段是在偏光顯微鏡監控下，測定其分離產物分子量，以確定是否已降解到B附，以保證其產品質量。3)提取的BMP可以根據臨床需要，可以增減用量。3.本工藝解決的技術關鍵1)將Urist方法l、2步驟骨不經粉碎，在大塊骨階段，經脫脂、脫鈣、除免疫處理生成骨膠原框架。2)膠原框架粉碎至要求的粒度1252000ym。3)用酸、酶法解交聯，使骨膠原降解至明膠和其降解產物。4)用高濃度鹽溶解、低濃度鹽(冷水)透析、離心。反覆-50次。5)使用的試劑對人體均無明顯毒性，經清洗、透析後基本清除。4、工藝流程監控1)脫脂步驟水溶劑萃取，用偏光顯微鏡監控。2)骨膠原降解至明膠和其降解產物步驟。本發明用偏光顯微鏡法和測定分子量監控。3)BMP粗製品，用測分子量監控。具體實施例方式實施例一活性骨與載體骨在成骨作用中的比較BMP是活性物質，加入到載體內，使骨移植物的誘導活性增加或從無到有，這些巳有大量的實驗證明。為了進一步證明本發明所製作的BMP是否具有同樣的功能，特設計本試驗。[方法]小鼠肌囊試驗。分組三組BMP對照組、骨載體組、活性骨組。[實驗結果]tableseeoriginaldocumentpage5[結論活性骨組(BMP)具有誘導骨成骨的能力。五、結論1、經皮質骨塊~^膠原框架-^粉碎-^明膠~^BMP提取、分離、乾燥，四步完成BMP的提取工藝。2、本專利BMP的提取工藝特點是將脫脂、脫鈣、除免疫(大塊骨)與BMP提取(骨粒)步驟分開，免除生成物及試劑的相互幹擾，和不易清除乾淨。3、BMP的提取工藝流程監控①在去脂步驟，用偏光顯微鏡監控。②骨膠原降解至明膠、及明膠降解產物，用偏光顯微鏡監控。③BMP的生成，用測分子量的方法監控。權利要求1、一種BMP膠原框架法提取工藝，包括下述步驟(1)在大塊骨階段，經脫脂、脫鈣、除免疫處理生成骨膠原框架，隨後再粉碎；(2)通過解交聯法使異種骨降解為骨膠原絲和明膠及明膠降解產物，在偏光顯微鏡嚴密監控下進行；(3)骨膠原絲和明膠及明膠降解產物，離心，上清超濾，濃縮、乾燥，獲得粗製BMP粉；包裝、消毒。2、根據權利要求l:(1)根據權利要求1(1)本發明在大塊骨階段，經脫脂、脫鈣、除免疫處理生成骨膠原框架，隨後再粉碎；(2)根據權利要求1(2)本發明的解交聯的方法，主要用酸法，時間在1分鐘120小時；(3)根據權利要求1(2)本發明用偏光顯微鏡監控解交聯的程度；並用測分子量的跟蹤方法，證實和監測解交聯的程度；用正交實驗找出最佳條件；(4)根據權利要求l(3)用離心法將較大的分子沉出，上清經超濾濃縮、乾燥、粉碎，即為BMP粉劑。全文摘要BMP膠原框架法提取工藝是在Urist的方法製作的基礎上，在關鍵步驟上加以改進，並通過偏光顯微鏡和測定分子量監測BMP的產品質量。本發明的特點1.在大塊骨階段，經脫脂、脫鈣、除免疫處理生成骨膠原框架，隨後再粉碎。2.從骨膠原骨到明膠和其降解產物生成階段，本發明應用的解交聯劑是酸，中和後，用水洗幾次既可清除。本階段在偏光顯微鏡監控下，其分離產物測定分子量，以確定是否已降解到BMP。3.用離心法將較大的分子沉出，上清經超濾濃縮、乾燥、研碎，即為BMP粉劑。提取的BMP可以根據臨床需要，可以增減用量。文檔編號C07K4/00GK101376672SQ20071014755公開日2009年3月4日申請日期2007年8月27日優先權日2007年8月27日發明者李永嵐,由王,王維民申請人:王由;李永嵐;王維民