藥用真菌雙向性固體發酵工程技術在雷公藤解毒持效中的應用的製作方法
2023-12-12 04:40:47
專利名稱：藥用真菌雙向性固體發酵工程技術在雷公藤解毒持效中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於中藥生物技術領域，特別是涉及藥用真菌雙向性固體發酵工程技術在雷公藤解毒持效中的應用。
背景技術：
雷公藤(Triptreygium wilfordii Hook.f.)為衛矛科(Celastraceae)雷公藤屬(Triptreygium Hook.f.)植物，藥用部位為根及莖。雷公藤對風溼性關節炎、紅斑狼瘡、腎炎、支氣管炎、重症肝炎、白血病、器官移植等疾病的療效顯著，是一種優良的免疫抑制劑和抗炎劑，但它又是著名的有毒植物，它的主要有效成分為二萜，含量最高的為雷公藤甲素(又名雷公藤內酯醇，triptolide)，雷公藤甲素的有效計量與中毒計量極為相近，其LD50為1.19+0.204mg/kg(口服)，屬於劇毒範圍。因此，臨床用藥極不安全，如何減小雷公藤的毒性又保持一定的療效(簡稱解毒持效)，保持安全用藥是當前極待解決的問題。
中國菌物學會莊毅教授在上世紀80年代起研究以藥用真菌「槐耳」為發酵菌種，以農副產品為營養基質上進行固體發酵，其藥用菌質稱「槐耳菌質」，並根據真菌使藥材發酵會引起其組織成分變化，導致性味功能改變的原理，在發酵基質中摻用一定量經特選的中藥材作為藥性基質，在一定條件下發酵後，獲得稱為「槐芪菌質」的藥性菌質，其有關各項免疫指標均明顯優於藥用菌質，從而提出了藥用真菌新型雙向固體發酵工程的理論與方法(參見抗癌新藥槐耳衝劑的研究.中國藥學雜誌.1998，33(5)，P273～275)。
不同種真菌分別去發酵同一種藥材，所產生的菌質的成分的性、效不同，而用同一種真菌分別發酵不同中藥材的後果也會不同。因此，不同真菌與不同藥材可交叉組合形成大量「發酵組合」，可得到大量不同性質、效用的「藥性菌質」。
藥用真菌新型雙向性固體發酵工程的理論基礎、發酵組合的設計、菌質的藥理篩選等內容可參見文獻(莊毅，藥用真菌新型(雙向型)固體發酵工程.中國食用菌.2002，21(4)3～6)。
藥用真菌新型(雙向性)固體發酵工程(簡稱雙向發酵)的關鍵是將發酵菌種和發酵基質所構成發酵組合內的基質部分，由以往僅用富含碳、氮等營養的農副產品(甘蔗渣、麥麩等)作為單向性的營養基質(其產品稱藥用菌質)，改變為採用具有一定活性成分的中藥材作為藥性基質，它既能提供真菌生長所需營養又會受真菌的酶的作用而被改變組織成分，從而產生新的性味功能，故具有雙向性，其產品稱藥性菌質，如兼用營養、藥性兩種基質則稱為全性基質，產品也稱藥性菌質。藥性菌質，有可能比該真菌或藥性基質本身或兩者簡單相加有更良好的藥效，主要表現在增效、擴大應用、解毒等方面(參見藥用真菌新型固體發酵工程與槐芪菌質的研製.中國藥學雜誌，2004，39(03)，P175～178)。
藥用真菌新型(雙向性)固體發酵工程為中藥研究開發開闢了一個新的領域，即菌物藥(參見莊毅.中藥的一個新領域.中藥新藥與臨床藥理.1992，3(2)49～51)。目前尚無文獻報導將藥用真菌新型(雙向性)固體發酵工程技術用於雷公藤處理，以實現雷公藤的解毒持效，從而提高雷公藤的應用範圍和開發前景。
發明內容
本發明的目的是提供藥用真菌雙向性固體發酵工程技術在雷公藤解毒持效中的應用。
本發明的技術方案是將藥用真菌雙向性固體發酵工程技術運用到雷公藤解毒持效中，即通過選用一定的藥用真菌作為發酵菌種接種於雷公藤藥材(藥性基質)上，構成一組合理有效的發酵組合，在一定條件下進行雙向性固體發酵，將所獲藥性菌質即為解毒持效的雷公藤藥性菌質。其理論基礎是根據中藥材如被空氣中有害雜菌如青黴、毛黴、麴黴等真菌侵染後在一定條件下會發酵、黴變，這是基於這些真菌所進行生理活動，在酶的作用下會使藥材的組織成分發生變化，從而導致其性味功能的改變。
本發明所稱雙向性固體發酵是指真菌(發酵菌種)在含有特定中藥材的固體藥性基質上生長發酵時一方面會接受中藥材中特定成分對真菌本身產生影響，另一方面也會對特定中藥材的組織成分產生影響，其作用表現為雙向。即藥性基質在提供真菌所需碳、氮等營養物質促進菌體生長的同時，真菌的如酶也可分解藥材的組織成分，從而產生新的成分並具有新的性味功效，因此稱為「雙向發酵」。
本發明所稱的藥性菌質是指藥用真菌(發酵菌種)在含中藥材的藥性基質中生長發酵而獲得的菌質。
本發明所稱的藥性基質是指中藥材作為發酵基質。
本發明所稱的菌質是指真菌經固體發酵後的產物，包含菌體及次生代謝物質，這些次生代謝物質有的存在於菌體細胞內，有的分泌到細胞外存在於發酵後的基質內，所生長的大量真菌絲體與發酵後的基質間無法分離，故統稱為菌質。
本發明所稱的基質是指能提供真菌生長所必需成分的物質。其中只含有農副產品的基質稱為營養基質，只含有中藥材的基質稱為藥性基質，同時具有營養基質和藥性基質時稱為全性基質。
本發明的目的是通過下列措施來實現的藥用真菌雙向性固體發酵工程技術在雷公藤解毒持效中的應用。
所述的藥用真菌雙向性固體發酵工程技術在雷公藤解毒持效中的應用，該應用的具體方法是發酵基質雷公藤的處理；發酵菌種處理；將發酵菌種接種於發酵基質，在一定的發酵條件下進行雙向固體發酵；收集藥性菌質。
所述的藥用真菌雙向性固體發酵工程技術在雷公藤解毒持效中的應用，其中發酵基質處理方法是對發酵基質進行粉碎，加適量水，滅菌。
所述的藥用真菌雙向性固體發酵工程技術在雷公藤解毒持效中的應用，其中發酵菌種是靈芝、槐耳、雲芝、紅栓、硫磺菌或樹舌。
所述的藥用真菌雙向性固體發酵工程技術在雷公藤解毒持效中的應用，其中發酵菌種的處理是將發酵菌種進行活化並進行擴增培養；擴增培養的方法是採用液體培養液搖瓶培養或採用固體培養基培養。
所述的藥用真菌雙向性固體發酵工程技術在雷公藤解毒持效中的應用，其中發酵條件為溫度範圍為26-28℃，發酵基質含水量為按基質乾重加120-150％的水量，發酵天數為30-60天。
靈芝菌[Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.]、雲芝菌[Coriolus versicolor(L.exFr.)Quel.]、槐耳菌[Trametes robiniophila Murr.]、紅栓[Pycnoporus cinnabarirus(jacq)karst]、硫磺菌[Laetiporus sulphureus(Fr.)Murrill]、樹舌[Ganoderma applanatumm(Pers)Pat]。
本發明也可以對其他有毒中藥材進行解毒。
本發明的有益效果本發明可實現對雷公藤的解毒持效，從而提高雷公藤的應用範圍和開發前景。
本發明藥效學實驗結果
實驗藥物雷公藤原藥材清膏和藥性菌質清膏，由中國藥科大學提供，其中雷公藤原藥材清膏編號為CK1、CK2(CK1為雷公藤生藥未滅菌，CK2為雷公藤基質已滅菌(0天)，作為對照組)，雷公藤藥性菌質清膏編號為G1、G2、G3、G4、T1、T2、T3(編號中英文代表菌種，T代表槐耳菌，G代表靈芝菌，數字代表發酵天數(1為30天，2為40天，3為50天，4為60天)，發酵條件與實施例1、2中所用的發酵條件相對應，除了發酵天數不同外無其他差別)，分別配成20％的蒸餾水混懸液。
環磷醯胺，上海華聯製藥有限公司產品。
醋酸地塞米松片，天津藥業有限公司產品。
2，4，6-三硝基氯苯(PC)，上海華聯製藥有限公司產品。
都氏液(氰化高鐵血紅蛋白試劑)，南京建成生物工程研究所提供。
綿羊紅細胞(SRBC)，豚鼠血清，江寧衛生防疫站提供。
實驗動物ICR小鼠，雌雄各半，體重18-22g；豚鼠，雌雄兼用，體重300-350g，由中國藥科大學實驗動物中心提供。
一、免疫作用1、雷公藤藥性菌質對小鼠體液免疫抑制作用(對血清溶血素的影響)小鼠隨機分組，每組10隻，雌雄各半，陽性對照組給予環磷醯胺10mg/kg，其他給藥組分別給予雷公藤，劑量為其LD50/10，空白對照組給予同容積水，ig，每日一次，連續6天，第1天各組給藥30min後均ip綿羊紅細胞免疫。
免疫6天後，小鼠摘眼球取血，放置30min使血清充分滲出。以2000rpm離心10min，取血清25ul，再加975ul生理鹽水。
在上述血清製品0.5ml中加入4×108綿羊紅細胞0.25ml，冰浴中冷卻試管，向試管中加入補體(豚鼠血清製品)0.5ml。將試管移至37℃恆溫水浴中，保溫15min，隨即置入冰浴中5min以終止反應。以3000rpm離心10min，取其上清液。在上清液0.5ml中加入都氏液1.875ml，振搖，放置10min，於540nm比色。結果見表2。
表2 雷公藤藥性菌質對血清溶血素的影響(mean±SD)
與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
結果表明，環磷醯胺、CK1、G1、G3能顯著性抑制小鼠體液免疫功能，T3則顯著性增強小鼠體液免疫功能。
2、雷公藤藥性菌質對小鼠細胞免疫抑制作用(對2，4，6-三硝基氯苯(PC)誘導小鼠遲發性變態反應的影響)小鼠隨機分組，每組10隻，雌雄各半。各鼠腹部去毛，範圍3×3cm2左右，用微量進樣器取1％PC無水乙醇溶液100ul，均勻塗在去毛區致敏，30min後，陽性對照組給予醋酸地塞米松7.5mg/kg，其他各給藥組給雷公藤，劑量為LD50/10，空白對照組給予同容積水，ig，每日一次，連續6天。
致敏第7天，將1％PC橄欖油溶液30ul均勻塗抹於每鼠右耳(兩面)進行攻擊，抗原攻擊24h後，將小鼠脫臼處死，沿耳廓基線剪下左右耳殼，用打孔器於同一部位分別取下直徑8mm的耳片，以左右耳片重量之差/左耳重作為腫脹度。結果見表3。
表3 雷公藤藥性菌質對小鼠細胞免疫功能的影響(mean±SD)
與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
結果表明，醋酸地塞米松、CK2、G2、G4、T1、T3能顯著性抑制小鼠細胞免疫功能。
二、毒性實驗1、急毒實驗LD50預試驗小鼠隨機分組，每組10隻，雌雄各半，以受試物5g/kg為給藥劑量，每鼠灌胃0.5ml/20g的相同體積。每日觀察一次，記錄死亡數，連續7天。若動物無一死亡，且未出現任何因受試物引起的反應，則初步確定該受試藥物的LD50值大於5g/kg；若出現死亡或有藥物反應，則進行以下正式試驗。
正式試驗取小鼠隨機分組，每組10隻，雌雄各半，以該受試藥預試驗結果選擇適當的劑間比，各組小鼠灌胃0.5ml/20g體重的不同濃度的藥物，每日觀察一次，記錄死亡數，連續7天，最後計算出該受試藥的LD50值。結果見表4。
表4 雷公藤各提取物清膏急性毒性試驗結果
結論雷公藤藥性菌質與雷公藤原藥材相比，毒性降低，但具有較強的體液免疫和細胞免疫抑制作用。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。
實施例1發酵基質雷公藤(藥性基質)的處理雷公藤帶皮的根曬乾或60-80℃烘乾劈成段，用切片機切成厚度1-2mm藥材片，粉碎機粉碎成小米至綠豆大顆粒，按每瓶180g裝於固體發酵瓶，加入適量水分(按基質乾重加130％的水量)，蓋瓶塞，121℃滅菌2小時。
發酵菌種準備取靈芝菌接種PDA培養基28℃進行活化培養，過夜。製作菌種培養液，成分為葡萄糖30g，KH2PO42.25g，酵母粉7.5g，MgSO41.125g，CaCO33.75g，維生素B10.15g，水1500ml。成分充分溶解後分別裝入500ml三角瓶中，每瓶250ml，121℃滅菌30分鐘。取活化後的菌絲體無菌操作接種培養液，130轉/分搖床，28℃搖培約一周，使之產生大量菌球，得菌球液(即搖培後所獲得的液體菌種)。
固體發酵無菌操作，每個固體發酵瓶內接種菌球液8-10ml，27±1℃發酵室內進行發酵，據設定的不同發酵周期(分別設定30天、40天、50天、60天，獲得的藥性菌質經提取製備的清膏對應為G1、G2、G3、G4)進行發酵，形成藥性菌質。
菌質後處理將瓶內藥性基質雷公藤定期發酵後形成的溼藥性菌質稱重，用60℃電熱烘乾，保存備用。
成分提取將所獲得的藥性菌質分別用40％乙醇提取，製備成清膏(即G1、G2、G3、G4)進行毒性、藥效試驗(詳見本發明有益效果部分)。
實施例2發酵基質雷公藤(藥性基質)的處理雷公藤帶皮的根曬乾或60-80℃烘乾劈成段，用切片機切成厚度1-2mm藥材片，粉碎機粉碎成小米至綠豆大顆粒，按每瓶180g裝於固體發酵瓶，加入適量水分(按基質乾重加130％的水量)，蓋瓶塞，121℃滅菌2小時。
發酵菌種準備取槐耳菌接種PDA培養基28℃進行活化培養，過夜。製作菌種培養液，成分為葡萄糖30g，KH2PO42.25g，酵母粉7.5g，MgSO41.125g，CaCO33.75g，維生素B10.15g，水1500ml。成分充分溶解後分別裝入500ml三角瓶中，每瓶250ml，121℃滅菌30分鐘。取活化後的菌絲體無菌操作接種培養液，130轉/分搖床，28℃搖培約一周，使之產生大量菌球，得菌球液(即搖培後所獲得的液體菌種)。
固體發酵無菌操作，每個固體發酵瓶內接種菌球液8-10ml，27±1℃發酵室內進行發酵，據設定的不同發酵周期(分別設定30天、40天、50天，獲得的藥性菌質經提取製備的清膏對應為T1、T2、T3)進行發酵，形成藥性菌質。
菌質後處理將瓶內藥性基質雷公藤定期發酵後形成的溼藥性菌質稱重，用60℃電熱烘乾，保存備用。
成分提取將所獲得的藥性菌質分別用40％乙醇提取，製備成清膏(即T1、T2、T3)進行毒性、藥效試驗(詳見本發明有益效果部分)。
實施例3發酵基質雷公藤(藥性基質)的處理雷公藤帶皮的根曬乾或60-80℃烘乾劈成段，用切片機切成厚度1-2mm藥材片，粉碎機粉碎成小米至綠豆大顆粒，按每瓶180g裝於固體發酵瓶，加入適量水分(按基質乾重加120％的水量)，蓋瓶塞，121℃滅菌2小時。
發酵菌種準備取雲芝菌接種PDA培養基28℃進行活化培養，過夜。製作菌種培養液，成分為葡萄糖30g，KH2PO42.25g，酵母粉7.5g，MgSO41.125g，CaCO33.75g，維生素B10.15g，水1500ml。成分充分溶解後分別裝入500ml三角瓶中，每瓶250ml，121℃滅菌30分鐘。取活化後的菌絲體無菌操作接種培養液，130轉/分搖床，28℃搖培約一周，使之產生大量菌球，得菌球液(即搖培後所獲得的液體菌種)。
固體發酵無菌操作，每個固體發酵瓶內接種菌球液8-10ml，27±1℃發酵室內進行發酵，據設定的不同發酵周期(30-60d)進行發酵，形成藥性菌質。
菌質後處理將瓶內藥性基質雷公藤定期發酵後形成的溼藥性菌質稱重，用60℃電熱烘乾，保存備用。
成分提取將獲得的藥性菌質分別用稀醇(40％乙醇)提取，製備成清膏進行化學、毒性、藥效試驗。
實施例4發酵基質雷公藤(藥性基質)的處理雷公藤帶皮的根曬乾或60-80℃烘乾劈成段，用切片機切成厚度1-2mm藥材片，粉碎機粉碎成小米至綠豆大顆粒，按每瓶180g裝於固體發酵瓶，加入適量水分(按基質乾重加150％的水量)，蓋瓶塞，121℃滅菌2小時。
發酵菌種準備取樹舌菌接種PDA培養基28℃進行活化培養，過夜。製作菌種培養液，成分為葡萄糖30g，KH2PO42.25g，酵母粉7.5g，MgSO41.125g，CaCO33.75g，維生素B10.15g，水1500ml。成分充分溶解後分別裝入500ml三角瓶中，每瓶250ml，121℃滅菌30分鐘。取活化後的菌絲體無菌操作接種培養液，130轉/分搖床，28℃搖培約一周，使之產生大量菌球，得菌球液(即搖培後所獲得的液體菌種)。
固體發酵無菌操作，每個固體發酵瓶內接種菌球液8-10ml，27±1℃發酵室內進行發酵，據設定的不同發酵周期(30-60d)進行發酵，形成藥性菌質。
菌質後處理將瓶內藥性基質雷公藤定期發酵後形成的溼藥性菌質稱重，用60℃電熱烘乾，保存備用。
成分提取將獲得的藥性菌質分別用稀醇(40％乙醇)提取，製備成清膏進行化學、毒性、藥效試驗。
權利要求
1.藥用真菌雙向性固體發酵工程技術在雷公藤解毒持效中的應用。
2.根據權利要求1所述的藥用真菌雙向性固體發酵工程技術在雷公藤解毒持效中的應用，其特徵在於該應用的具體方法是發酵基質雷公藤的處理；發酵菌種處理；將發酵菌種接種於發酵基質，在一定的發酵條件下進行雙向固體發酵；收集藥性菌質。
3.根據權利要求2所述的藥用真菌雙向性固體發酵工程技術在雷公藤解毒持效中的應用，其特徵在於發酵基質處理方法是對發酵基質進行粉碎，加適量水，滅菌。
4.根據權利要求2所述的藥用真菌雙向性固體發酵工程技術在雷公藤解毒持效中的應用，其特徵在於發酵菌種是靈芝、槐耳、雲芝、紅栓、硫磺菌或樹舌。
5.根據權利要求2所述的藥用真菌雙向性固體發酵工程技術在雷公藤解毒持效中的應用，其特徵在於發酵菌種的處理是將發酵菌種進行活化並進行擴增培養。
6.根據權利要求5所述的藥用真菌雙向性固體發酵工程技術在雷公藤解毒持效中的應用，其特徵在於發酵菌種擴增培養的方法是採用液體培養液搖瓶培養或採用固體培養基培養。
7.根據權利要求2所述的藥用真菌雙向性固體發酵工程技術在雷公藤解毒持效中的應用，其特徵在於發酵條件為溫度範圍為26-28℃，發酵基質含水量為按基質乾重加120-150％的水量，發酵天數為30-60天。
全文摘要
本發明公開了藥用真菌雙向性固體發酵工程技術在雷公藤解毒持效中的應用。該應用的具體方法是發酵基質雷公藤的處理；發酵菌種處理；將發酵菌種接種於發酵基質，在一定的發酵條件下進行雙向固體發酵；收集藥性菌質。本發明可實現對雷公藤的解毒持效，從而提高雷公藤的應用範圍和開發前景。
文檔編號C12N1/14GK1911262SQ20051004136
公開日2007年2月14日 申請日期2005年8月8日 優先權日2005年8月8日
發明者莊毅 申請人:莊毅