一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠、其製法和用途的製作方法

2023-12-11 23:35:47 4

專利名稱：一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠、其製法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠(ILs-PAG)、其製法和用途，具體地說，所述離子液體-聚丙烯醯胺凝膠中的離子液體(ILs)為陽離子上烷基碳鏈碳原子數<4 的離子液體，屬於蛋白質分離分析技術領域。
背景技術：
自從人類基因組測序完成後，蛋白質組學研究得到了廣泛的關注。近幾年來，蛋白質組學研究廣泛應用於基礎生命科學、醫學分析和疾病標誌物研究等領域。完整的蛋白質組學分析包括樣品製備、蛋白質分離、蛋白質分析鑑定和表徵四個部分，其中蛋白質分離和分析技術是蛋白質組學研究的關鍵，制約著蛋白質組學研究的發展。從1967年shapizo提出十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)起， SDS-PAGE作為一種經典的蛋白質分離分析技術，廣泛應用於生物分離和蛋白質組學領域。 SDS-PAGE的基本原理是蛋白質與十二烷基硫酸鈉(SDQ結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS 複合物，能消除不同蛋白質分子之間的電荷差異，從而使得蛋白質分子在聚丙烯醯胺凝膠 (PAG)中的電泳遷移率不再受蛋白質原有電荷的影響，而主要取決於蛋白質分子質量的大小，其遷移率與蛋白質分子量的對數呈線性關係。SDS-PAGE的這種性質可以實現蛋白質的有效分離，並可以利用遷移距離和蛋白質分子量之間的關係對蛋白質進行定性研究。但是， 對於分子量相等或相近的不同蛋白質，SDS-PAGE並不能對其實現有效的分離和鑑定。離子液體，又稱室溫離子液體或室溫熔融鹽，是指在室溫或接近室溫下呈現液態的融鹽，通常由有機陽離子和無機陰離子構成。離子液體不但具有傳統有機溶劑的優勢，而且具有許多獨特的優點，如在室溫條件下蒸汽壓低、不可燃、穩定性好、溶解能力強和導電性高等。最重要的是，離子液體可以通過改變陽離子和陰離子的種類定向改變離子液體的理化性質，成為一種可設計的溶劑。通過在離子液體中的陽離子上引入一些具有特殊作用的功能基團，還可以設計出具有特殊功能的離子液體。正因如此，近幾十年來，離子液體廣泛應用於生物分離分析領域。已有成功利用離子液體改進蛋白質分離分析技術的相關方法報導。例如，文章 "Simultaneous separation of basic and acidic proteins using l-butyl-3-methyl imidazoliumbased ion liquid as dynamic coating and background electrolyte in capillary electrophoresis" (D0I 10.1002/elps. 200700746，2008，29，2356 2362)介紹的方法，利用1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽作為毛細管電泳電解質的添加劑，在14分鐘內成功基線分離五種不同性質的蛋白質。該方法中，離子液體可以動態塗覆在毛細管內壁表面，改變內壁的電荷性質，從而降低毛細管內壁對鹼性蛋白質的吸附作用。到目前為止，關於離子液體應用於改善SDS-PAGE以及其他凝膠分離技術的方法還沒有報導，而本發明正好解決了這一問題
發明內容
針對SDS-PAGE方法對分子量相等或相近的不同蛋白質分離度低的缺陷，本發明的目的之一在於提供一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠；具體地說，所述離子液體-聚丙烯醯胺凝膠中的離子液體為陽離子上的烷基碳鏈碳原子數< 4的離子液體。本發明的目的之二在於提供一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠的製備方法。本發明的目的之三在於提供一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠的用途，所述用途是將離子液體-聚丙烯醯胺凝膠用於電泳分析蛋白質，即離子液體-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(ILs-SDS-PAGE)。使用所述電泳方法電泳分離經SDS處理後的蛋白質，對分子量相等或相近的不同蛋白質可實現快速、簡便、綠色且高效的分離。為實現本發明的目的，採用的技術方案如下。一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠，所述凝膠由離子液體和聚丙烯醯胺凝膠配方共同組成，即一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠，主要包括單體、交聯劑、凝膠緩衝體系、催化劑和加速劑，其特徵在於還包括離子液體。其中，所述離子液體為陽離子上烷基碳鏈碳原子數< 4的離子液體，包括但不限於烷基碳鏈碳原子數< 4的咪唑類離子液體、吡啶類離子液體或吡咯烷類離子液體。所述離子液體的質量濃度範圍為0. 05 1. 0% (w/v)。所述聚丙烯醯胺凝膠配方為本領域在蛋白質分離分析中通用的聚丙烯醯胺凝膠配方，包括但不限於以下組分單體、交聯劑、凝膠緩衝體系、催化劑和加速劑；其中，各組分包括但不限於單體丙烯醯胺、交聯劑N，N』 -亞甲基雙丙烯醯胺、凝膠緩衝體系、催化劑過硫酸銨(APS)和加速劑N，N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)。其中所述凝膠緩衝體系為本領域在蛋白質分離分析中通用的聚丙烯醯胺凝膠緩衝體系中的一種，包括但不限於 Tris-HCl緩衝體系、硼砂-硼酸緩衝體系或磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩衝體系。各組分的質量濃度同為本領域在蛋白質分離分析中通用的聚丙烯醯胺凝膠配方各組分質量濃度，根據實際需要確定。本發明所述離子液體-聚丙烯醯胺凝膠的凝膠體系為連續凝膠體系或不連續凝膠體系，與本領域在蛋白質分離分析中通用的聚丙烯醯胺凝膠體系相同。包括但不限於連續凝膠體系的聚丙烯醯胺凝膠中的丙烯醯胺和N，N』 -亞甲基雙丙烯醯胺質量濃度為4 17% (w/v)，pH值為5. 8 8. 8 ；不連續凝膠體系中分離膠和濃縮膠中的丙烯醯胺和N， N』-亞甲基雙丙烯醯胺質量濃度為4 17% (w/v)，其中分離膠濃度大於濃縮膠濃度，pH值為 5. 8 8. 8。所述離子液體的質量濃度根據需分離的目的蛋白質的主要分子量和凝膠濃度決定。其中，所述蛋白質為本領域在蛋白質分離分析中SDS-PAGE所適用的蛋白質，包括但不限於蛋白質分子量Marker和分子量低於66. 2KDa的人血清蛋白質生物樣品。對於蛋白質分子量Marker，使用本發明提供的質量濃度範圍為0. 05 1. 0% (w/ ν)的烷基碳鏈碳原子數< 4的咪唑類離子液體、吡啶類離子液體或吡咯烷類離子液體製備的離子液體-聚丙烯醯胺凝膠，可成功分離。對於人血清樣品中分子量範圍在66.2 沈.OKDa的蛋白質，使用本發明提供的質量濃度範圍為0. 05 1. 0% (w/v)的烷基碳鏈碳原子數< 4的咪唑類離子液體、吡啶類離子液體或吡咯烷類離子液體-聚丙烯醯胺凝膠分離，與其平行對照實驗SDS-PAGE比較，提高了蛋白質的分離度，增加了分子量相近區域的清晰蛋白質條帶個數。其中，所述蛋白質的分離度和條帶個數隨著離子液體濃度增加而增加。優選使用質量濃度為1.0% (w/v)的吡啶類離子液體-聚丙烯醯胺凝膠，此時分離的蛋白質獲得最佳的分離條帶個數和分離度。對於人血清樣品中分子量範圍在26. 0 12. OKDa的蛋白質，使用質量濃度範圍為 0.3 1.0% (w/v)的烷基碳鏈碳原子數<4的咪唑類、吡啶類和吡咯烷類離子液體-聚丙烯醯胺凝膠分離，與其平行對照實驗SDS-PAGE比較，提高了蛋白質的分離度，可增加分子量相近區域的清晰蛋白質條帶個數。其中，蛋白質分離度和條帶個數隨著離子液體濃度增加而增加。優選使用質量濃度為1.0% (w/v)的吡啶類離子液體-聚丙烯醯胺凝膠，此時所分離蛋白質獲得最佳的分離條帶個數和分離度。一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠的製備方法，所述方法步驟如下先將離子液體、單體、交聯劑和凝膠緩衝體系混合得到混合溶液，再將催化劑和加速劑加入所述混合溶液混合均勻，凝固後，即可得到本發明所述的一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠。其中，所述離子液體為陽離子上烷基碳鏈碳原子數< 4的離子液體，包括但不限於烷基碳鏈碳原子數< 4的咪唑類離子液體、吡啶類離子液體或吡咯烷類離子液體。所述離子液體的質量濃度範圍為0. 05 1. 0% (w/v)。除離子液體外，本發明所述離子液體-聚丙烯醯胺凝膠的其他製備方法為本領域在蛋白質分離分析中通用的聚丙烯醯胺凝膠製備方法。包括但不限於先將適當比例的離子液體、單體、交聯劑和凝膠緩衝體系混合得到混合溶液，再將催化劑和加速劑加入所述混合溶液混合均勻，凝固後，即可得到本發明所述的一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠。包括但不限於先將適當比例的離子液體、單體丙烯醯胺、交聯劑N，N』 -亞甲基雙丙烯醯胺和凝膠緩衝體系混合得到混合溶液，再將催化劑過硫酸銨和加速劑N，N，N' ,N'-四甲基乙二胺加入所述混合溶液混合均勻，凝固後，即可得到本發明所述的一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠。其中所述凝膠緩衝體系為本領域在蛋白質分離分析中通用的聚丙烯醯胺凝膠緩衝體系中的一種，包括但不限於Tris-HCl緩衝體系、硼砂-硼酸緩衝體系或磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩衝體系。其中單體、交聯劑和凝膠緩衝體系、催化劑和加速劑的質量濃度同為本領域在蛋白質分離分析中通用的聚丙烯醯胺凝膠配方各組分質量濃度，根據實際需要確定。本發明所述離子液體-聚丙烯醯胺凝膠的凝膠體系為連續凝膠體系或不連續凝膠體系，與本領域在蛋白質分離分析中通用的聚丙烯醯胺凝膠體系相同。包括但不限於連續凝膠體系的聚丙烯醯胺凝膠中丙烯醯胺和N，N』 -亞甲基雙丙烯醯胺的質量濃度為4 17% (w/v)，pH值為5. 8 8. 8 ；不連續凝膠體系中分離膠和濃縮膠中的丙烯醯胺和N， N』-亞甲基雙丙烯醯胺質量濃度為4 17% (w/v)，其中分離膠濃度大於濃縮膠濃度，pH值為 5. 8 8. 8。所述離子液體的質量濃度根據需分離的目的蛋白質的主要分子量和凝膠濃度決定。其中，所述蛋白質為本領域在蛋白質分離分析中SDS-PAGE所適用的蛋白質，包括但不限於蛋白質分子量Marker和分子量低於66. 2KDa的人血清蛋白質生物樣品。對於蛋白質分子量Marker，使用本發明提供的質量濃度範圍為0. 05 1. 0% (w/ ν)的烷基碳鏈碳原子數< 4的咪唑類離子液體、吡啶類離子液體或吡咯烷類離子液體製備的離子液體-聚丙烯醯胺凝膠，可成功分離。對於人血清樣品中分子量範圍在66.2 沈.OKDa的蛋白質，使用本發明提供的質
6量濃度範圍為0. 05 1. 0% (w/v)的烷基碳鏈碳原子數< 4的咪唑類離子液體、吡啶類離子液體或吡咯烷類離子液體-聚丙烯醯胺凝膠分離，與其平行對照實驗SDS-PAGE比較，提高了蛋白質的分離度，增加了分子量相近區域的清晰蛋白質條帶個數。其中，所述蛋白質的分離度和條帶個數隨著離子液體濃度增加而增加。優選使用質量濃度為1.0% (w/v)的吡啶類離子液體-聚丙烯醯胺凝膠，此時分離的蛋白質獲得最佳的分離條帶個數和分離度。對於人血清樣品中分子量範圍在26. 0 12. OKDa的蛋白質，使用質量濃度範圍為 0. 3 1. 0% (w/v)的烷基碳鏈碳原子數1.45 1 ；連續凝膠體系中，樣品緩衝液緩衝體系的種類、 濃度和PH值與離子液體-聚丙烯醯胺凝膠體系的凝膠緩衝體系相同；在不連續凝膠體系中，樣品緩衝液緩衝體系的種類、濃度和PH值與離子液體-聚丙烯醯胺凝膠體系濃縮膠溶液的凝膠緩衝體系相同。(3)配製蛋白質電泳緩衝液並上樣組裝電泳儀，配製蛋白質電泳緩衝液並加入電泳槽中；倒入蛋白質電泳緩衝液沒過膠架玻璃板的短板，利用微量進樣器將經步驟(2)預處理後的蛋白質樣品注入孔道上樣。其中，蛋白質樣品的上樣體積優選為5 10 μ L。連續凝膠體系中，電泳緩衝液緩衝體系的種類、濃度和PH值與離子液體-聚丙烯醯胺凝膠體系的凝膠緩衝體系相同；在不連續凝膠體系中，電泳緩衝液緩衝體系的種類、濃度和PH值與離子液體-聚丙烯醯胺凝膠體系濃縮膠溶液的凝膠緩衝體系相同。(4)電泳接通電泳儀進行電泳。連續凝膠體系，採用恆壓電泳。不連續凝膠體系首先用低電壓進行濃縮，當溴酚藍到達分離膠和濃縮膠的分離界限，改用相對高的電壓進行電泳分離， 直至溴酚藍到達凝膠底端，電泳結束。其中，連續凝膠體系中，電壓為80 200V ；不連續凝膠體系中，濃縮膠的電壓一般為80 140V，分離膠的電壓為100 160V。(5)染色和脫色電泳結束後，將凝膠從玻璃板上剝下，用水清洗後，進行染色，染色完成後進行脫色處理，直至去掉背景底色。優選在水中將凝膠從玻璃板上剝下，以防止凝膠破裂。其中染色為本領域在蛋白質分離分析中所適用的染色技術，包括但不限於考馬斯亮藍R250染色法、考馬斯亮藍G250染色法或銀染法。所述離子液體的質量濃度根據需分離的目的蛋白質的主要分子量和凝膠濃度決定。其中，所述蛋白質為本領域在蛋白質分離分析中SDS-PAGE所適用的蛋白質，包括但不限於蛋白質分子量Marker和分子量低於66. 2KDa的人血清蛋白質生物樣品。對於蛋白質分子量Marker，使用本發明提供的質量濃度範圍為0. 05 1. 0% (w/ ν)的烷基碳鏈碳原子數< 4的咪唑類離子液體、吡啶類離子液體或吡咯烷類離子液體製備的離子液體-聚丙烯醯胺凝膠進行離子液體-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳，可成功分離。對於人血清樣品中分子量範圍在66.2 沈.OKDa的蛋白質，使用本發明提供的質量濃度範圍為0. 05 1. 0% (w/v)的烷基碳鏈碳原子數< 4的咪唑類離子液體、吡啶類離子液體或吡咯烷類離子液體-聚丙烯醯胺凝膠進行離子液體-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳，與其平行對照實驗SDS-PAGE比較，提高了蛋白質的分離度，增加了分子量相近區域的清晰蛋白質條帶個數。其中，所述蛋白質的分離度和條帶個數隨著離子液體濃度增加而增加。優選使用質量濃度為1.0% (w/v)的吡啶類離子液體-聚丙烯醯胺凝膠，此時分離的蛋白質獲得最佳的分離條帶個數和分離度。對於人血清樣品中分子量範圍在26. 0 12. OKDa的蛋白質，使用質量濃度範圍為 0.3 1.0% (w/v)的烷基碳鏈碳原子數<4的咪唑類、吡啶類和吡咯烷類離子液體-聚丙烯醯胺凝膠進行離子液體-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳，與其平行對照實驗 SDS-PAGE比較，提高了蛋白質的分離度，可增加分子量相近區域的清晰蛋白質條帶個數。其中，蛋白質分離度和條帶個數隨著離子液體濃度增加而增加。優選使用質量濃度為1.0% (w/v)的吡啶類離子液體-聚丙烯醯胺凝膠，此時所分離的蛋白質獲得最佳的分離條帶個數和分離度。
有益效果1.簡單、快速、高效和重現性好。本發明在聚丙烯醯胺凝膠配方基礎上添加陽離子上烷基碳鏈碳原子數< 4的離子液體，製備得到一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠；在 SDS-PAGE方法的基礎上，利用離子液體對SDS-PAGE的方法進行改進，使用離子液體_十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳來分離蛋白質，具有簡單、快速、高效和重現性好的優點。SDS-PAGE是經典的蛋白質分離分析技術，方法成熟，簡單易操作，廣泛應用於蛋白質研究的各個領域。利用離子液體改進SDS-PAGE的離子液體-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳同樣簡單易操作，並且相對於SDS-PAGE，離子液體-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離蛋白質具有更高的分離度；2.制膠過程不易產生氣泡。由於本發明中的離子液體-聚丙烯醯胺凝膠不添加 SDS，減少了因SDS形成的氣泡，方便將凝膠溶液轉移到膠架的玻璃板中，也減少了凝膠凝固過程中氣泡的產生，使電泳環境更加穩定；3.對蛋白質的選擇性分離。SDS-PAGE對於相等或相近分子量的不同蛋白質，並不能實現有效分離。利用本發明提供的離子液體-聚丙烯醯胺凝膠，由於離子液體-聚丙烯醯胺凝膠中具有的離子液體可以與蛋白質相互作用，從而影響蛋白質的遷移速率，實現分子量相近蛋白質的分離；採用本發明提供的離子液體-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳，可以實現對於相等或相近分子量的不同蛋白質的較好選擇性分離，尤其對分子量低於66. 2KDa的人血清蛋白質具有高效的選擇性分離。4.安全性。離子液體安全無汙染，被稱為綠色溶劑，不會對人體和環境產生危害；5.普適性。本發明提供的離子液體-聚丙烯醯胺凝膠以及對應建立的離子液體-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳方法，可以直接應用於蛋白質分離，還適用於聚丙烯醯胺凝膠電泳方法的改進，有望成為蛋白質組學及蛋白質分離分析的重要技術；6.防止凝膠破裂。在本發明提供的離子液體-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳方法步驟( 中，在水中將離子液體-聚丙烯醯胺凝膠從玻璃板上剝下，可以防止凝膠破裂；7.防止漏液。在本發明提供的離子液體-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳方法步驟(1)中組裝制膠架時，用凡士林密封制膠架玻璃板的兩邊和底部，可以防止漏液。


圖1為離子液體-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離蛋白質的方法示意圖。圖2為實施例1製備得到的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽質量濃度為0. 05% (w/v)、0· 1 % (w/v)、0· 2 % (w/v)、0· 3 % (w/v)、0· 6 % (w/v)和 1· 0 % (w/v)的 1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽-聚丙烯醯胺凝膠ac2mim]BF4-PAG)電泳分離蛋白質分子量 Marker的電泳圖。圖3為實施實例1製備得到的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽質量濃度為0.05% (w/v)、0· 1% (w/v)、0· 2% (w/v)、0· 3% (w/v)、0· 6% (w/v)和 1· 0% (w/v)的 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽-聚丙烯醯胺凝膠([C4mim]BF4-PAG)電泳分離蛋白質分子量Marker的電泳圖。
圖4為實施例2製備得到的溴化N- 丁基-3-甲基吡啶質量濃度為0. 05% (w/v) 的溴化N-丁基-3-甲基吡啶-聚丙烯醯胺凝膠([C4mpd] Br-PAG)、溴化N-丁基-3-甲基吡咯烷質量濃度為0.05% (w/v)的溴化N-丁基-3-甲基吡咯烷-聚丙烯醯胺凝膠([C4Hiprd] Br-PAG)和溴化1- 丁基-3-甲基咪唑質量濃度為0. 05% (w/v)的溴化1- 丁基-3-甲基咪唑-聚丙烯醯胺凝膠([C4mim]Br-PAG)分離十倍稀釋的人血清的電泳圖和其平行對照實驗 SDS-PAGE分離十倍稀釋的人血清的電泳圖。圖5為實施例2製備得到的溴化N- 丁基-3-甲基吡啶質量濃度為0. 3%的溴化 N- 丁基-3-甲基吡啶-聚丙烯醯胺凝膠([C4mpd]Br-PAG)、溴化N- 丁基-3-甲基吡咯烷質量濃度為0.3%的溴化N-丁基-3-甲基吡咯烷-聚丙烯醯胺凝膠([C4Hiprd] Br-PAG)和溴化1- 丁基-3-甲基咪唑質量濃度為0. 3%的溴化1- 丁基-3-甲基咪唑-聚丙烯醯胺凝膠 ([C4mim]Br-PAG)分離十倍稀釋人血清的電泳圖和其平行對照實驗SDS-PAGE分離十倍稀釋人血清的電泳圖。圖6為實施例2製備得到的溴化N-丁基-3-甲基吡啶質量濃度為1.0%的溴化 N- 丁基-3-甲基吡啶-聚丙烯醯胺凝膠([C4mpd]Br-PAG)、溴化N- 丁基-3-甲基吡咯烷質量濃度為1.0%的溴化N-丁基-3-甲基吡咯烷-聚丙烯醯胺凝膠([C4Hiprd] Br-PAG)和溴化1- 丁基-3-甲基咪唑質量濃度為1. 0%的溴化1- 丁基-3-甲基咪唑-聚丙烯醯胺凝膠 ([C4mim]Br-PAG)分離十倍稀釋人血清的電泳圖和其平行對照實驗SDS-PAGE分離十倍稀釋人血清的電泳圖。
具體實施例方式為了充分說明本發明的特性以及實施本發明的方式，下面給出實施例。實施例1分別製備1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽質量濃度為0. 05% (w/v)、0. 1% (w/ ν)、0· 2% (w/v)、0· 3% (w/v)、0· 6% (w/v) ^P 1.0% (w/v)的 1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽-聚丙烯醯胺凝膠([C2mim]BF4-PAG)和1_ 丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽質量濃度為 0. 05% (w/v)、0· 1% (w/v)、0· 2% (w/v)、0· 3% (w/v)、0· 6% (w/v)和 1· 0% (w/v)的 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽-聚丙烯醯胺凝膠([C4mim]BF4-PAG),使用所述凝膠分別對蛋白質分子量Marker進行離子液體-十二烷基硫酸鈉_聚丙烯醯胺凝膠電泳分離。方法如圖1所示。所述凝膠的製備方法及電泳方法如下(1)製備離子液體-聚丙烯醯胺凝膠分別製備1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽質量濃度為0. 05% (w/v)、0. 1% (w/ ν)、0· 2% (w/v)、0· 3% (w/v)、0· 6% (w/v) ^P 1.0% (w/v)的 1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽-聚丙烯醯胺凝膠([C2mim]BF4-PAG)和1_ 丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽質量濃度為 0. 05% (w/v)、0· 1% (w/v)、0· 2% (w/v)、0· 3% (w/v)、0· 6% (w/v)和 1· 0% (w/v)的 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽-聚丙烯醯胺凝膠([C4mim]BF4-PAG)，其中分離膠中丙烯醯胺和N，N』-亞甲基雙丙烯醯胺的質量濃度為14% (w/v)，濃縮膠中丙烯醯胺和N，N』-亞甲基雙丙烯醯胺的質量濃度為5. 0% (w/v)。組裝制膠架使用10X7. 2X0. Icm的制膠玻璃板， 首先將玻璃板兩塊洗淨吹乾，用適量的凡士林密封玻璃板的兩邊和底部，防止漏液。配製分離膠不同的IOmL容量瓶中分別加入如表1所示質量的離子液體、1. 46g丙烯醯胺、40mg N，N，-亞甲基雙丙烯醯胺和454mg Tris-base，加水至&iiL，用6mM的HCl調pH值至8. 8， 用水定容至IOmL ；混合均勻後，轉移至離心管中，加入100 μ L當天配製的10%過硫酸銨和 5yL的Ν，Ν，Ν' ,N'-四甲基乙二胺，振蕩混合20s，混合均勻後超聲脫氣10s，得到分離膠溶液；將5mL分離膠溶液注入玻璃板，水封凝固，等到分離膠凝固後，將上層水倒掉，並用濾紙吸乾；配製濃縮膠在不同的IOmL容量瓶中分別加入如表1所示質量的離子液體、486mg 丙烯醯胺、14mgN，N，-亞甲基雙丙烯醯胺和151mg Tris-base，加水至大約8mL，用6mM的 HCl調pH值至6. 8，用水定容至IOmL ；混合均勻後，轉移至離心管中，加入50 μ L當天配製的10%過硫酸銨和5 μ L的N，N，N' ,N'-四甲基乙二胺，振蕩混合20s，混合均勻後超聲脫氣10s，得到濃縮膠溶液，將濃縮膠溶液注入玻璃板，之後將梳子插入玻璃板中，直至凝膠凝固，將梳子拔出，形成進樣孔，電泳用離子液體-聚丙烯醯胺凝膠製備完成。表1加入離子液體的質量
權利要求
1.一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠，主要包括單體、交聯劑、凝膠緩衝體系、催化劑和加速劑，其特徵在於還包括離子液體；其中，所述離子液體為陽離子上烷基碳鏈碳原子數 (4的離子液體，所述離子液體的質量濃度為0. 05 1. 0% (w/v)。
2.根據權利要求1所述的一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠，其特徵在於所述陽離子上烷基碳鏈碳原子數< 4的離子液體為陽離子上烷基碳鏈碳原子數< 4的咪唑類離子液體、吡啶類離子液體或吡咯烷類離子液體其中之一。
3.根據權利要求1所述的一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠，其特徵在於所述離子液體的質量濃度為0. 3 1. 0% (w/v)時用於分離分子量範圍在26. 0 12. OKDa的蛋白質。
4.根據權利要求1所述的一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠，其特徵在於所述離子液體為陽離子上烷基碳鏈碳原子數< 4的吡啶類離子液體，質量濃度為1. 0% (w/v)。
5.一種如權利要求1 4所述的離子液體-聚丙烯醯胺凝膠的製備方法，其特徵在於 先將離子液體、單體、交聯劑和凝膠緩衝體系混合得到混合溶液，再將催化劑和加速劑加入所述混合溶液混合均勻，凝固後，即可得到本發明所述的一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠。
6.一種如權利要求1 4所述的離子液體-聚丙烯醯胺凝膠的用途，其特徵在於所述用途是將離子液體-聚丙烯醯胺凝膠用於電泳分析蛋白質，即離子液體-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳，所述電泳方法步驟如下(1)製備一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠； O) SDS預處理蛋白質樣品；(3)配製蛋白質電泳緩衝液並上樣；(4)電泳；(5)染色和脫色；具體地說，所述電泳方法主要包括(1)製備離子液體-聚丙烯醯胺凝膠組裝玻璃板制膠架，先將離子液體、單體、交聯劑和凝膠緩衝體系混合得到混合溶液， 再將催化劑和加速劑加入所述混合溶液混合均勻後得離子液體-聚丙烯醯胺凝膠溶液，將所述凝膠溶液注入膠架的玻璃板中，之後將梳子插入玻璃板中的凝膠溶液中，直至凝膠凝固，將梳子拔出，形成進樣孔；(2)預處理蛋白質樣品在蛋白質樣品中加入樣品緩衝溶液，混合均勻後加熱，然後冷卻，得到預處理蛋白質樣品 ；(3)配製蛋白質電泳緩衝液並上樣組裝電泳儀，配製蛋白質電泳緩衝液並加入電泳槽中；倒入蛋白質電泳緩衝液沒過膠架玻璃板的短板，利用微量進樣器將預處理後蛋白質樣品注入孔道上樣；(4)電泳接通電泳儀進行電泳；(5)染色和脫色電泳結束後，將凝膠從玻璃板上剝下，用水清洗，進行染色，染色完成後進行脫色處理， 直至去掉背景底色。
7.根據權利要求6所述的一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠的用途，其特徵在於步驟(1)中組裝制膠架時用凡士林密封制膠架玻璃板的兩邊和底部。
8.根據權利要求6所述的一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠的用途，其特徵在於步驟(2)中蛋白質樣品中加入樣品緩衝溶液，混合均勻後，在95°C水浴加熱5min，室溫下冷卻； 蛋白質樣品的質量濃度為0. 1 0. 5mg/mL。
9.根據權利要求6所述的一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠的用途，其特徵在於步驟(3)中蛋白質樣品的上樣體積為5 10μ L。
10.根據權利要求6所述的一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠的用途，其特徵在於步驟 (5)中電泳結束後，在水中將凝膠從玻璃板上剝下。
全文摘要
本發明涉及一種離子液體-聚丙烯醯胺凝膠、其製法和用途，屬於蛋白質分離分析技術領域。所述離子液體-聚丙烯醯胺凝膠包括單體、交聯劑、凝膠緩衝體系、催化劑和加速劑，還包括離子液體；所述離子液體為陽離子上烷基碳鏈碳原子數≤4的離子液體，質量濃度為0.05～1.0％(w/v)。將離子液體、單體、交聯劑和凝膠緩衝體系混合後再將催化劑和加速劑加入混合均勻，凝固後即可得到所述離子液體-聚丙烯醯胺凝膠。離子液體-聚丙烯醯胺凝膠用於電泳分離蛋白質，即離子液體-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離經SDS處理後的蛋白質，尤其是對分子量相等或相近的不同蛋白質，可實現快速、簡便、綠色且高效的分離。
文檔編號C08F220/56GK102229688SQ20111009279
公開日2011年11月2日 申請日期2011年4月13日 優先權日2011年4月13日
發明者屈鋒, 張濤, 蓋青青 申請人:北京理工大學