超聲波穿孔-雷射光鑷細胞表面增強拉曼光譜分析方法
2023-12-11 18:08:47 1
超聲波穿孔-雷射光鑷細胞表面增強拉曼光譜分析方法
【專利摘要】一種基於超聲波穿孔效應並結合雷射光鑷表面增強拉曼光譜技術進行細胞判別的方法，是利用超聲波對細胞作用產生穿孔效應使細胞膜通透性瞬間增強將金屬納米粒子快速導入細胞作為SERS增強基底，並利用雷射光鑷技術捕獲活細胞同時進行表面增強拉曼光譜檢測，以SERS光譜的手段實現對癌細胞的病理檢測、篩選功能。本發明包括銀膠溶液製備；把高濃度銀膠注入活細胞並進行表面增強拉曼光譜測量；建立判別細胞為正常細胞或者癌症細胞表面增強拉曼光譜診斷識別模型。本發明具有簡單迅速，可靠性強，靈敏度高的特點，可推廣應用於多種癌變細胞的判別。
【專利說明】超聲波穿孔-雷射光鑷細胞表面增強拉曼光譜分析方法
【技術領域】
[0001]本發明是涉及一種利用超聲波穿孔效應並結合雷射光鑷表面增強拉曼光譜(SERS)技術分析細胞的方法。
【背景技術】
[0002]多種生物醫學技術已經被應用於定性、定量的去探測、篩選正常或病變細胞。比如現在的放射學、藥理學、組織學、細胞學以及分子學技術都可以應用在細胞的分析上。但是，這些技術都是具有破壞性的，同時它們的特異性不夠理想，並且很多時候要多種技術聯用才能進行有效的分析，而且還可能會受到細胞生物學手段的幹擾。我們現在急需一種技術手段能夠克服上述幾種細胞分析技術局限性，能夠在臨床診斷上容易實現精確癌細胞分析與篩選。
[0003]表面增強拉曼光譜(SERS)技術與常規拉曼光譜相比能夠使拉曼信號增強因子達到1014，在某些條件甚至能夠實現單分子檢測。同時，SERS技術還能夠在很大程度上抑制生物自體螢光背景的幹擾。因此，SERS技術已經被廣泛應用於生物醫學領域的研究。世界上已經有多個研究小組利用SERS光譜進行細胞研究，但要想檢測到細胞SERS光譜信號，就必須要通過某種特殊方法使金屬納米粒子導入細胞內部或使納米粒子與細胞能夠緊密吸附在一起，這樣才能檢測到細胞的SERS光譜信號。要使納米粒子進入細胞內部能夠進行SERS檢測，現在比較常用的辦法是把金屬納米粒子與細胞共同培養、孵育，經過長時間的培育(一般要24小時左右)，利用細胞的內吞效應，納米粒子就能夠被「吞」進細胞內部，從而實現細胞SERS光譜檢測分析，但這種方法非常耗費時間；第二種方法就是利用生物細胞的自主還原機制，將帶有金屬離子的溶液與細胞共同孵育，在細胞內部自發「長出」納米金屬顆粒，這種方法同樣需要長時間進行細胞培養，而且在細胞內部被還原出來的金屬納米顆粒形狀不規則；第三方法是利用電穿孔技術快速將金屬納米粒子導入到細胞內的輸送，但這種方法需要特殊的電穿孔設備、操作比較複雜、效率低，而且納米粒子在細胞中的分布很不均勻。
[0004]鑑於以上各種方法的不足之處，本發明專利提出利用超聲波聲孔效應將金屬納米粒子快速導入細胞，並將雷射光鑷拉曼光譜技術與這種超聲誘導技術相結合能夠檢測獲得高重現性的細胞SERS光譜，我們還進一步利用細胞SERS光譜進行癌細胞與正常細胞的篩選研究，獲得非常理想的判別效果。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種利用超聲波聲孔效應結合雷射光鑷表面增強拉曼光譜技術進行細胞分析的方法。它是利用高能超聲波作用瞬間產生聲孔效應，使細胞周圍的微小氣泡發生劇烈收縮、膨脹並最終崩滅，與此同時這些發生劇烈變化的氣泡與細胞發生熱作用和機械作用在細胞膜上產生穿孔效應，在細胞膜表面產生可逆性孔狀結構，使細胞膜通透性瞬間大大增強；同時金屬納米粒子在超聲波作用下形成單分散且處於高速運動狀態，這樣就可通過細胞膜表面短暫瞬間產生的小孔將金屬納米粒子快速導入細胞內部作為SERS增強基底，並利用雷射光鑷技術捕獲細胞同時進行表面增強拉曼光譜檢測，最後對獲得的細胞SERS光譜數據進行多變量統計分析(PCA-LDA)處理，通過散點圖中的診斷方程可以判別細胞為癌症或者正常細胞。我們以鼻咽癌細胞和正常鼻咽細胞為模型對癌症或者正常細胞的進行判別分析。在測量過程中利用雷射光鑷技術能夠維持細胞處於生理活性狀態下進行SERS光譜測試。本發明所述的整個處理過程時間僅僅需要10分鐘，操作簡單、快速、可靠性強；能夠使金屬納米粒子非常高效地導入細胞中，並且金屬納米粒子分布比較均勻，能夠獲得重現性非常好的細胞SERS光譜。對正常和癌症細胞的雷射光鑷SERS光譜判別、分析結論可為醫生對病人的診斷提供快速、客觀的評價標準。可將此方法拓展、應用於其它多種癌症細胞與正常細胞的判別分析。
[0006]為實現本發明的目的採用的技術方案是:
(1)取硝酸銀粉末溶於200ml的去離子水中加熱至沸騰，再滴入檸檬酸三鈉溶液製成含有銀納米粒子的銀膠溶液備用；
(2)將胰酶消化下來的活性細胞用RPMI1640細胞培養液製成單細胞懸浮液備用；
(3)將銀膠溶液和單細胞懸浮液混合併利用超聲波穿孔效應將銀納米粒子快速導入細
胞；
(4)在維持生理環境下對單細胞進行雷射光鑷表面增強拉曼光譜檢測；
(5)建立細胞表面增強拉曼光譜資料庫，利用多變量統計分析獲得不同種類細胞的表面增強拉曼光譜對應的散點圖；
(6)利用建立細胞表面增強拉曼光譜資料庫，對未診斷細胞進行判別。
[0007]所述的銀膠溶液的製備過程是:取36mg硝酸銀粉末溶於200ml的去離子水中，快速攪拌並加熱至沸騰，再滴入5ml濃度為1%檸檬酸三鈉溶液，繼續攪拌加熱I小時，製備獲得含有銀納米粒子的銀膠溶液，並放在室溫下避光封存備用；
所述的單細胞懸浮液的製備過程是:將胰酶消化下來的活性細胞用RPMI1640細胞培養液製成單細胞懸浮液，然後通過血球計數板計算細胞的數目，控制細胞密度為IO5?IO6個/ml。
[0008]所述的利用超聲波穿孔效應將銀納米粒子快速導入細胞內部過程是:取預製備的好的銀膠溶液I ml進行離心，棄上清液後加入0.5ml的細胞培養液，與預製備好的活性單細胞懸浮液按1:1的比例放入離心管中，利用200ul的移液槍通過多次抽吸的方式使它們混合均勻，製成活性單細胞銀膠混合液；將離心管放入超聲池中，通過調節超聲波的功率、頻率，超聲池的溫度、超聲時間參數，將離心管中的活性單細胞銀膠混合液超聲作用；將超聲作用過的活性單細胞銀膠混合液與PBS緩衝液混合併進行低速離心、清洗三次，將沒有進入細胞內部的銀納米顆粒清洗乾淨，並將清洗過的細胞重新懸浮在RPMI1640細胞培養液中備用。
[0009]所述的超聲波的功率為:200W?400W。
[0010]所述的超聲波的頻率為:25HZ、40HZ或59HZ ；
所述的超聲池的溫度為:室溫?60°C ；
所述的超聲時間為:lmin?30min。
[0011]所述的在維持生理環境下對單細胞進行雷射光鑷表面增強拉曼光譜檢測過程是採用美國Thorlabs公司生產的附帶有拉曼光譜模塊的雷射光鑷系統(型號:0TKB)，利用該雷射光鑷系統捕獲RPMI1640細胞培養液中活性單細胞，同時利用波長為785nm的半導體雷射器作為激發光進行細胞SERS光譜檢測。為獲得高重現性SERS光譜，在保證能夠捕獲住細胞的條件下儘量降低激發光功率進行細胞SERS光譜測試，可獲得高重現性細胞SERS光譜。
[0012]所述的建立細胞表面增強拉曼光譜資料庫模型，其過程是:對細胞性質進行判別必須由一個診斷模型來實現，而這一模型是通過定標過程來建立的。為保證數據具有統計意義，需要採集足夠多確診病例的細胞SERS光譜，建立定標光譜資料庫。在此基礎上，使用主元素分析方法和線性判別分析算法，建立由細胞SERS光譜參數構成的診斷方程。我們首先需對細胞SERS光譜進行扣螢光和強度歸一化處理，把整條譜線數據輸入SPSS軟體進行主成分(PCA)分析，接著利用獨立變量T檢驗得到具有顯著性差異的PCA得分，並利用具有顯著性差異的PCA得分畫出帶有診斷方程的散點圖，並且進一步利用線性判別分析(LDA)得出統計結果。
[0013]所述的利用已建立細胞表面增強拉曼光譜資料庫模型，對未診斷細胞進行判別，其過程是:對未診斷細胞按照技術方案所述的方法製成所需的活性單細胞銀膠混合液，並在維持生理環境下對單細胞進行雷射光鑷表面增強拉曼光譜檢測SERS光譜，將光譜導入已經建立好的細胞表面增強拉曼光譜資料庫，利用多變量統計分析獲得未診斷細胞的表面增強拉曼光譜對應的散點圖，根據分布在散點圖中診斷方程兩邊的區域來判別細胞。
[0014]本發明優勢在於採用超聲穿孔效應使金屬納米粒子能夠快速進入細胞，具有納米粒子導入效率高、金屬納米粒子在細胞內部分布較均勻的特點，同時與雷射光鑷技術相結合能保證細胞活性，能夠檢測獲得高重現性細胞SERS光譜；並且用此細胞SERS光譜數據建立診斷模型，可用於對鼻咽癌細胞的判別。也可將此方法拓展應用於食道癌、皮膚癌等多種癌症細胞的判別分析。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1是本發明對63個NP69正常細胞在超聲穿孔作用下細胞SERS光譜平均譜，影陰部分代表細胞SERS光譜的標準偏差。
[0016]圖2是本發明對67個C666鼻咽癌細胞在超聲穿孔作用下細胞SERS光譜平均譜，影陰部分代表細胞SERS光譜的標準偏差。
[0017]圖3是本發明對67個C666細胞與63個NP69細胞SERS光譜PCA得分PCl與PC2
二維散點圖。
[0018]圖4是本發明對67個C666細胞與63個NP69細胞SERS光譜PCA得分PCl、PC2和PC3三維散點圖。
【具體實施方式】
[0019]本發明的具體技術細節針對正常鼻咽細胞NP69、高分化鼻咽鱗狀細胞癌C666兩種類型細胞進行實施闡述如下:
實施例1
1、取36mg的固體硝酸銀溶於200ml的去離子水中，快速攪拌並加熱至沸騰，再滴入5ml的1%檸檬酸三鈉，繼續攪拌加熱I小時，得到銀溶膠溶液，並放在室溫下避光密封保存以備後續超聲誘導步驟使用；把用胰酶剛消化完的兩種活性細胞NP69、C666分別用市售的RPMI1640細胞培養液製成單細胞懸浮液，然後通過血球計數板計算細胞的數目，控制細胞密度為IO6個/ml。
[0020]2、取上述製備好的銀膠溶液IOml進行離心，棄上清液後，平均分成兩組，每組分別加入2.5ml的細胞培養液混勻；每組分別取0.5ml銀溶膠與NP69、C666細胞懸浮液按1:1的比例分別放入各自的EP管中，利用200ul的移液槍通過多次抽吸的方式使銀溶膠懸浮液和細胞懸浮液混合均勻，製成單細胞銀膠混合液；
3、將裝有銀溶膠和細胞懸浮液的離心管放入超聲池中，通過調節超聲池的超聲波功率為200W、超聲波頻率為25HZ、超聲池溫度30°C、超聲時間lmin，使得離心管中的混合液處於最佳的超聲條件下超聲作用。
[0021]4、將超聲作用過的細胞與PBS緩衝液混合併進行低速離心，清洗三次，將沒有進入細胞內部的金屬納米顆粒清洗乾淨，並將清洗過的細胞重新懸浮在培養液中備用。
[0022]5、將清洗過的細胞懸浮液注入雷射光鑷拉曼探測系統的樣品池中，在細胞培養液的環境中進行光鑷SERS光譜檢測，激發光波長為785nm的半導體雷射器。測試條件為100倍Nikon油鏡。
[0023]6、將已經確定的正常鼻咽細胞和鼻咽癌細胞SERS光譜建立定標光譜資料庫，並將所有細胞SERS譜線輸入到SPSS軟體進行PCA分析，下面是應用PCA分析的具體計算過程:
(1)首先把63個正常NP69鼻咽細胞和67個C666鼻咽癌細胞SERS光譜利用多項式擬合消除螢光背景；
(2)為減小實驗誤差影響，把已經消除螢光背景的正常與鼻咽癌細胞SERS光譜進行面積歸一化處理；
(3)利用SPSS軟體把經過(I)、(2)處理過的正常與鼻咽癌細胞SERS光譜進行PCA分
析；
(4)在此基礎上利用SPSS中的T檢驗法，選擇最有顯著性差異的三個PCA得分來進一步進行LDA分析；
利用T檢驗獲得三個最有顯著性差異的PCA得分並畫出散點圖分布。
[0024]本發明通過獨立變量T檢驗確認PCA分析後主成分1、主成分2以及主成分4這三個主成分具有顯著性差異。我們進一步畫出主成分I與主成分4帶有診斷方程的二維散點圖，如附圖3所示。診斷方程為y=_2.73x-0.43，這條診斷方程線能夠將鼻咽癌細胞點集分布與正常細胞點集分布有效分隔起來。如果利用兩類細胞SERS光譜PCA分析中具有顯著性差異的主成分1、主成分2以及主成分4進一步畫出三維散點圖，如圖4所示，可以發現代表正常鼻咽細胞和代表鼻咽癌細胞的數據點分布在兩個相互獨立的空間，彼此之間沒有任何重疊，區分效果非常明顯。進一步利用後續的LDA分析得出統計結果，本發明對定標光譜集中的癌症細胞識別的特異性和靈敏度都達到100%。正常與鼻咽癌細胞SERS光譜PCA得分散點圖分布即是本發明的測量結果，也可為醫生診斷提供重要參考依據。
[0025]實施例2
1、取36mg的固體硝酸銀溶於200ml的去離子水中，快速攪拌並加熱至沸騰，再滴入5ml的1%檸檬酸三鈉，繼續攪拌加熱I小時，得到銀溶膠溶液，並放在室溫下避光密封保存以備後續超聲誘導步驟使用；把用胰酶剛消化完的兩種活性細胞NP69、C666分別用市售的RPMI1640細胞培養液製成單細胞懸浮液，然後通過血球計數板計算細胞的數目，控制細胞密度為IO6個/ml。
[0026]2、取上述製備好的銀膠溶液IOml進行離心，棄上清液後，平均分成兩組，每組分別加入2.5ml的細胞培養液混勻；每組分別取0.5ml銀溶膠與NP69、C666細胞懸浮液按1:1的比例分別放入各自的EP管中，利用200ul的移液槍通過多次抽吸的方式使銀溶膠懸浮液和細胞懸浮液混合均勻，製成單細胞銀膠混合液；
3、將裝有銀溶膠和細胞懸浮液的離心管放入超聲池中，通過調節超聲池的超聲波功率為250W、超聲波頻率為40HZ、超聲池溫度24°C、超聲時間20min，使得離心管中的混合液處於最佳的超聲條件下進行超聲作用。
[0027]4、將超聲作用過的細胞與PBS緩衝液混合併進行低速離心，清洗三次，將沒有進入細胞內部的金屬納米顆粒清洗乾淨，並將清洗過的細胞重新懸浮在培養液中備用。
[0028]5、將清洗過的細胞懸浮液注入雷射光鑷拉曼探測系統的樣品池中，在細胞培養液的環境中進行光鑷SERS光譜檢測，激發光波長為785nm的半導體雷射器。測試用的物鏡為100倍Nikon油鏡。
[0029]6、將已經確定的正常鼻咽細胞和鼻咽癌細胞SERS光譜建立定標光譜資料庫，並將所有細胞SERS譜線輸入到SPSS軟體進行PCA分析，下面是應用PCA分析的具體計算過程:
(1)1)1首先把120個正常NP69鼻咽細胞和130個C666鼻咽癌細胞SERS光譜利用多項式擬合消除螢光背景；
(2)為減小實驗誤差影響，把已經消除螢光背景的正常與鼻咽癌細胞SERS光譜進行面積歸一化處理；
(3)利用SPSS軟體把經過(I)、(2)處理過的正常與鼻咽癌細胞SERS光譜進行PCA分
析；
(4)在此基礎上利用SPSS中的T檢驗法，選擇最有顯著性差異的三個PCA得分來進一步進行LDA分析；
(5)利用T檢驗獲得三個最有顯著性差異的PCA得分並畫出散點圖分布。
[0030]本發明通過獨立變量T檢驗確認PCA分析後主成分1、主成分2以及主成分4這三個主成分具有顯著性差異。我們進一步畫出主成分I與主成分4帶有診斷方程的二維散點圖。這條診斷方程線能夠將鼻咽癌細胞點集分布與正常細胞點集分布有效分隔起來。如果利用兩類細胞SERS光譜PCA分析中具有顯著性差異的主成分1、主成分2以及主成分4進一步畫出三維散點圖，可以發現代表正常鼻咽細胞和代表鼻咽癌細胞的數據點分布在兩個相互獨立的空間，彼此之間沒有任何重疊，區分效果非常明顯。進一步利用後續的LDA分析得出統計結果，本發明對定標光譜集中的癌症細胞識別的特異性和靈敏度幾乎都達到100%。正常與鼻咽癌細胞SERS光譜PCA得分散點圖分布即是本發明的測量結果，也可為醫生診斷提供重要參考依據。
【權利要求】
1.一種超聲波穿孔-雷射光鑷細胞表面增強拉曼光譜分析方法，其特徵在於該方法由以下步驟組成: (I)取硝酸銀粉末溶於200ml的去離子水中加熱至沸騰，再滴入檸檬酸三鈉溶液製成含有銀納米粒子的銀膠溶液備用； (2)將胰酶消化下來的活性細胞用RPMI1640細胞培養液製成單細胞懸浮液備用； (3)將銀膠溶液和單細胞懸浮液混合併利用超聲波穿孔效應將銀納米粒子快速導入細胞； (4)在維持生理環境下對單細胞進行雷射光鑷表面增強拉曼光譜檢測； (5)建立細胞表面增強拉曼光譜資料庫，利用多變量統計分析獲得不同種類細胞的表面增強拉曼光譜對應的散點圖； (6)利用已建立細胞表面增強拉曼光譜資料庫，對未診斷細胞進行判別。
2.如權利要求1所述的一種超聲波穿孔-雷射光鑷細胞表面增強拉曼光譜分析方法，其特徵在於所述的利用超聲波穿孔效應將銀納米粒子快速導入細胞內部過程是:取預製備好的銀膠溶液I ml進行離心，棄上清液後加入0.5ml的細胞培養液，與預製備好的活性單細胞懸浮液按1:1的比例放入離心管中，利用200ul的移液槍通過多次抽吸的方式使它們混合均勻，製成活性單細胞銀膠混合液；將離心管放入超聲池中，通過調節超聲波的功率、頻率，超聲池的溫度、超聲時間參數，將離心管中的活性單細胞銀膠混合液進行超聲作用；將超聲作用過的活性單細胞銀膠混合液與PBS緩衝液混合併進行低速離心、清洗三次，將沒有進入細胞內部的銀納米顆粒清洗乾淨，並將清洗過的細胞重新懸浮在RPMI1640細胞培養液中備用。
3.如權利要求1所述的一種超聲波穿孔-雷射光鑷細胞表面增強拉曼光譜分析方法，其特徵在於所述的超聲波，其功率為200W~400W。
4.如權利要求1所述的一種超聲波穿孔-雷射光鑷細胞表面增強拉曼光譜分析方法，其特徵在於所述的超聲波的頻率為:25HZ、40HZ或59HZ。
5.如權利要求1所述的一種超聲波穿孔-雷射光鑷細胞表面增強拉曼光譜分析方法，其特徵在於所述的超聲池溫度為:室溫~60°C連續可調。
6.如權利要求1所述的一種超聲波穿孔-雷射光鑷細胞表面增強拉曼光譜分析方法，其特徵在於所述超聲時間為Imin~30min連續可調。
7.如權利要求1所述的一種超聲波穿孔-雷射光鑷細胞表面增強拉曼光譜分析方法，其特徵在於所述建立細胞表面增強拉曼光譜資料庫模型，其過程是: (1)通過定標過程來建立診斷模型； (2)採集確診病例的細胞SERS光譜，建立定標光譜資料庫； (3)使用主元素分析方法和線性判別分析算法，建立由細胞SERS光譜參數構成的診斷方程； (4)利用具有顯著性差異的PCA得分畫出帶有診斷方程的散點圖，並且進一步利用線性判別分析得出統計結果。
8.如權利要求7所述的一種超聲波穿孔-雷射光鑷細胞表面增強拉曼光譜分析方法，其特徵在於所述的建立診斷方程是首先需對細胞SERS光譜進行扣螢光和強度歸一化處理，把整條譜線數據輸入SPSS軟體進行主成分分析，接著利用獨立變量T檢驗得到具有顯著性差異的PCA得分，並利用具有顯著性差異的PCA得分畫出帶有診斷方程的散點圖。
9.如權利要求1所述的一種超聲波穿孔-雷射光鑷細胞表面增強拉曼光譜分析方法，其特徵在於所述的利用已建立細胞表面增強拉曼光譜資料庫模型，對未診斷細胞進行判另O，其過程是:對未診斷細胞按照技術方案所述的方法製成所需的活性單細胞銀膠混合液，並在維持生理環境下對單細胞進行雷射光鑷表面增強拉曼光譜檢測，將光譜導入已經建立好的細胞表面增強拉曼光譜資料庫模型，利用多變量統計分析獲得未診斷細胞的表面增強拉曼光譜對應的散點圖，根據 分布在散點圖中診斷方程兩邊的區域來判別細胞。
【文檔編號】G01N21/65GK103512874SQ201310432508
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月22日 優先權日:2013年9月22日
【發明者】馮尚源, 黃少華, 林居強, 陳冠楠, 黃祖芳, 李永增, 陳榮 申請人:福建師範大學