一種構建重組釀酒酵母發酵生產葡萄糖二酸的方法與流程
2024-03-27 21:45:05 1
本發明涉及一種構建重組釀酒酵母發酵生產葡萄糖二酸的方法，屬於生物工程技術領域。
背景技術：
d-葡糖二酸(d-glucaricacid)作為非常重要的有機酸已被廣泛研究，其在醫療和工業中有著廣泛的應用，比如降膽固醇、治療糖尿病、腫瘤治療等等，或可能用作聚合物前體，包括新型尼龍和高度分支聚酯。目前已經有利用產自葡萄糖的葡糖二酸製備羥基化尼龍的報導，羥基化尼龍是可生物降解的纖維。在美國太平洋西北國家實驗室、國家再生能源實驗室和美國能源部寫的一份報告中，葡糖二酸被認為是」topvalue-addedchemicalfrombiomass」。由於該有機酸的重要性，正越來越得到學術界和工業界的重視。
目前生產葡糖二酸的方法主要以化學法為主，即葡萄糖的化學氧化，採用硝酸作為溶劑和氧化劑，這是一個非選擇性、高成本的過程。化學法的主要問題是低得率，只有不到40％；需要高溫，會產生大量氧化反應副產物，不利於後續葡糖二酸的分離。雖然有研究發現催化劑五氧化二釩、4-乙醯氨基-2,2,6,6-四甲基-1-二苯哌酯等可以提高葡糖二酸的得率，但是這些催化劑太昂貴。生物法合成葡糖二酸相較於傳統的化學法，有著很多的優勢，比如更加環境友好，更大的實現低成本生產的可能性。生物法產葡糖二酸有很多種途徑。在合適的菌種中構建高效穩定的葡糖二酸合成途徑，應用於工業生產，取代傳統的化學途徑，將是非常有前景的研究領域。
麻省理工學院prather課題組研究了大腸桿菌代謝工程產有機酸，其在大腸桿菌中構建了合成葡糖二酸的代謝途徑，同時表達了三個酶，包括來自釀酒酵母的肌醇-1-磷酸合成酶ino1(myo-inositol-1-phosphate)、單磷酸肌醇磷酸酶inm1(inositolmonophosphate1-phosphatase)來自老鼠的肌醇磷酸氧化酶miox(myo-inositoloxygenase)和來自丁香假單胞菌的糖醛酸脫氫酶udh，利用大腸桿菌現有的pts途徑(phosphoenolpyruvate-dependentphosphotransferasesystem)，合成葡糖二酸，從葡萄糖到葡糖二酸的代謝途徑。最後經優化，最終葡糖二酸的產量為1g/l，miox是影響最終產量的最重要因素，是整合代謝流的限速步驟。主要原因是miox的不穩定性，在穩定期時，即使在沒有葡糖二酸的情況下，miox的活力也會迅速下降。
該課題組利用蛋白融合技術提高了miox的穩定性，同時利用定向進化提高了miox的活力。將sumo融合到miox的n-末端，使得葡糖二酸的產量提高了74％；雖然定向進化沒有改進miox，但是他們篩選到了一個長941bp的dna片段，它的表達可以提高肌醇的運輸量，並且使得葡糖二酸的產量提高65％。最後，他們改造的重組大腸桿菌可以把10.8g/l的肌醇轉化成4.85g/l的葡糖二酸。該課題組還利用腳手架蛋白提高miox的比活力，從而提高了葡糖二酸的產量，相較於沒有腳手架蛋白的對照，葡糖二酸產量提高了5倍。與之前報導的最高產量相比，提高了50％。該課題組在大腸桿菌代謝工程製備葡糖二酸的研究中取得了突破。
釀酒酵母相較於大腸桿菌，具有更高的工業應用價值，一方面前者的耐酸能力強於大腸桿菌，另一方面酵母本身可以作為單細胞蛋白用於飼料、食品等。釀酒酵母還具有其他優點，比如能夠耐受低溫、可低ph發酵、沒有噬菌體感染、適合大規模發酵、易分離、高抗逆性等。因而酵母已經廣泛用於產有機酸的研究，比如ρ-羥基苯甲酸、ρ-氨基苯甲酸、ρ-羥基苯丙烯酸、青蒿酸。而目前還沒有酵母代謝工程製備葡糖二酸研究的相關報導。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題在於提供一種產葡糖二酸的釀酒酵母工程菌株及構建方法。
本發明首先提供了一種重組釀酒酵母，首先敲除釀酒酵母by4741的opi基因，將來自釀酒酵母本身的肌醇-1-磷酸合成酶(ino1)和肌醇單磷酸酶(inm1)，以及來自擬南芥的肌醇加氧酶(miox)和來自丁香假單胞菌的糖醛酸脫氫酶(udh)通過組成型質粒py26-gpd-tef導入釀酒酵母，實現釀酒酵母由葡萄糖從頭合成葡萄糖二酸的途徑構建。
本發明還提供了構建所述重組釀酒酵母的方法，主要包括以下步驟：
(1)敲除釀酒酵母by4741的opi基因，得到釀酒酵母by4741opi1δ；
(2)將編碼肌醇-1-磷酸合成酶、肌醇單磷酸酶的基因連接到質粒pmri-21，得到重組質粒pmri-gpd-tef-ino1-inm1，線性化後，轉化釀酒酵母by4741opi1δ，得到重組菌株by4741opi1δ-ino1-inm1；
(3)選擇組成型質粒py26-gpd-tef，在py26-gpd-tef的多克隆位點bglii/noti插入miox4片段，得到py26-miox4質粒，利用gibsonassembly組裝構建py26-miox4-udh；
(4)將py26-miox4-udh轉化釀酒酵母by4741opi1δ-ino1-inm1，得到重組菌組by4741opi1δ-ino1-inm/miox-udh。
其中，步驟(2)將序列如seqidno:5所示的質粒pmri-21和py26-ino1-inm1分別用bglii和sali雙酶切，凝膠電泳回收pmri-21質粒和ino1-gpd-tef-inm1片段，t4連接酶連接相應切口，得到重組質粒pmri-gpd-tef-ino1-inm1，用blpi單酶切質粒使之線性化，轉化釀酒酵母by4741opi1δ，得到得到重組菌株by4741opi1δ-ino1-inm1。
所述片段ino1來自釀酒酵母by4741基因組，如seqidno:1所示。
所述片段inm1來自釀酒酵母by4741基因組，如seqidno:2所示。
所述片段miox4來自擬南芥arabidopsisthaliana，經過密碼子優化，如seqidno:3所示，插入puc57質粒酶切位點bglii/noti，得到puc57-miox4。
所述片段udh來自丁香假單胞菌(pseudomonasputida)，經過密碼子優化後，如seqidno:4所示，插入puc57-miox4的ecori和sacii，得到puc57-miox4-udh。
本發明還提供了一種利用該重組酵母發酵生產葡糖二酸的方法，利用葡萄糖、蔗糖或者肌醇生產葡糖二酸。所述方法具體將重組菌種子液以1％-2％接種量接種到發酵培養基中，30℃、200rpm，培養72小時。所述發酵培養基，在本發明的一個實施案例中，其碳源為葡萄糖或肌醇。
所述方法，在本發明的一個實施案例中，具體是將種子液按照10％的接種量接種到含有50ml液體培養基的250ml的錐形瓶中，30℃、搖床轉速200rpm，培養72小時。
由於採用了上述的技術方案,本發明與現有技術相比，所取得的技術進步在於：本發明公開了一種全新的從頭合成d-葡萄糖二酸的釀酒酵母工程菌的構建方法。其優勢主要體現在以下幾個方面。
1、本發明構建的代謝途徑避免了化學氧化法的非選擇性、高能耗性和高成本性。通過工程菌的發酵培養，直接將廉價的葡萄糖轉化為高附加值的d-葡萄糖二酸，產量為10g/l，反應條件溫和、轉化率高、副產物少，可以極大地節約生產成本。
2、釀酒酵母相較於大腸桿菌，具有更高的工業應用價值，一方面前者的耐酸能力強於大腸桿菌，另一方面酵母本身可以作為單細胞蛋白用於飼料、食品等。釀酒酵母還具有其他優點，比如能夠耐受低溫、可低ph發酵、沒有噬菌體感染、適合大規模發酵、易分離、高抗逆性等。因而酵母已經廣泛用於產有機酸的研究，比如ρ-羥基苯甲酸、ρ-氨基苯甲酸、ρ-羥基苯丙烯酸、青蒿酸。而目前還沒有酵母代謝工程製備葡糖二酸研究的相關報導。
附圖說明
圖1質粒py26-miox4-udh的結構示意圖。
圖2質粒pmri-gpd-tef-ino1-inm1的結構示意圖。
圖3葡糖二酸質譜圖，a：發酵樣品，b：葡糖二酸標樣。
具體實施方式
葡糖二酸的檢測：液質聯用(lc-ms)，儀器島津離子阱飛行時間質譜儀。
實施例1by4741opi1δ釀酒酵母菌株的獲得。
以pug6質粒為模板，引物pug6f和pug6r擴增敲除框(含loxp-kan-loxp組件)，敲除框帶有opi1基因上下遊各50bp鹼基作為同源臂。用醋酸鋰化學轉化法轉化釀酒酵母by4741感受態，塗布g418抗性平板，2-3天後長出單菌落。用引物opi-1和opi-4菌落pcr驗證得到正確條帶，將正確菌株搖瓶培養至對數期，提取基因組驗證。以此菌株做感受態，轉化psh65質粒，半乳糖誘導cre切除kan，驗證切除正確後，在ypd液體培養基中連續傳代以丟失質粒psh65，獲得敲除opi1基因的菌株by4741opi1δ。
在釀酒酵母中，從葡萄糖開始合成肌醇的生物合成與代謝途徑基本明晰。在肌醇的合成過程中，肌醇-1-磷酸合成酶是關鍵酶，該酶的編碼基因為ino1，是酵母中受控制最嚴格的基因之一。我們發現，肌醇-1-磷酸合成酶的表達受到其產物肌醇的反饋抑制，抑制過程通過阻遏因子opi1來完成。野生菌株中肌醇-1-磷酸合成酶只在對數期或缺少肌醇的情況下表達，我們對ino1基因啟動子的研究發現，其啟動子的上遊存在一些重複序列，稱作uasino元件，在轉錄過程中促進啟動子的表達，為上遊重複激活序列。uasino是對肌醇敏感的序列，當細胞內肌醇缺乏時，opi阻遏蛋白與複合物結合在內質網；如果肌醇過量表達，opi1基因表達的阻遏蛋白與複合物解離，由內質網釋放進入細胞核與uasino結合，酵母細胞中的肌醇-1-磷酸合成酶便受到阻遏，細胞中的肌醇合成停止。因此，要實現肌醇的過量積累，必須敲除opi1這個轉錄負調控基因。
實施例2重組菌株by4741opi1δ-ino1-inm1構建
選擇組成型質粒py26-gpd-tef質粒，用smai單酶切質粒，利用gibsonassembly組裝構建py26-ino1質粒；然後再用ecori單酶切質粒py26-ino1質粒，利用gibsonassembly組裝構建py26-ino1-inm1質粒。陽性克隆使用驗證引物py26f和py26r進行驗證，結果通過電泳條帶大小判斷。
將質粒pmri-21和py26-ino1-inm1分別用bglii和sali雙酶切，凝膠電泳回收pmri21質粒和ino1-gpd-tef-inm1片段，t4連接酶連接相應切口，得到重組質粒pmri-gpd-tef-ino1-inm1，用blpi單酶切質粒使之線性化，轉化釀酒酵母by4741opi1δ，塗布g418抗性平板，2-3天後長出單菌落。用引物inof和ino-a菌落pcr驗證得到正確條帶，將正確菌株搖瓶培養至對數期，提取基因組驗證。以此菌株做感受態，轉化psh65質粒，半乳糖誘導cre切除kan驗證切除正確後，在ypd液體培養基中連續傳代丟失質粒psh65，得到重組菌株by4741opi1δ-ino1-inm1。
實施例3重組菌組by4741opi1δ-ino1-inm/miox-udh的構建
片段miox4來自擬南芥arabidopsisthaliana，經過密碼子優化，如seqidno:3所示，插入puc57質粒酶切位點bglii/noti，得到puc57-miox4。片段udh來自丁香假單胞菌(pseudomonasputida)，經過密碼子優化後，如seqidno:4所示，插入puc57-miox4的ecori和sacii，得到puc57-miox4-udh。以puc57-miox4-udh為模板，分別以py26-miox4f/py26-miox4r和py26-udhf/py26-udhr為引物擴增得到miox4和udh基因，經過pcr產物純化試劑盒純化，用smai單酶切py26-gpd-tef質粒，經過凝膠試劑盒回收片段，利用gibsonassembly組裝構建py26-udh質粒；然後再用ecori單酶切質粒py26-udh質粒，利用gibsonassembly組裝構建py26-udh–miox4質粒，驗證引物為py26f和py26r。將構建質粒醋酸鋰轉化釀酒酵母by4741opi1δ-ino1-inm，塗布ura3缺陷平板，2-3天長出轉化子。菌落pcr驗證正確，得到重組菌組by4741opi1δ-ino1-inm/miox-udh。
表1為實施例1、2、3用到的引物
實施例4重組釀酒酵母發酵生產葡糖二酸
將重組酵母菌by4741opi1δ-ino1-inm/miox-udh發酵培養，單克隆接種於25mlypd培養基(酵母提取物10g/l、蛋白腖20g/l、葡萄糖20g/l)，30℃、200rpm培養24小時。按2％接種量接種於50mlypd(搖瓶容量250ml)，發酵培養基分為ypd和ypd-mi(ypd培養基添加60mm肌醇)。在發酵24小時、48小時時添加0.5％的葡萄糖，每隔12小時取樣1ml。培養結束後，將1ml發酵液在8000rpm離心5min，取上清過0.22um濾膜，通過lc-ms檢測，產量為10g/l。
雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。
sequencelisting
江南大學
一種構建重組釀酒酵母發酵生產葡萄糖二酸的方法
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釀酒酵母by4741
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