一種生薑的液體淺層快繁方法與流程

2024-03-27 20:07:05 1

本發明屬於植物組織培養
技術領域：
，具體涉及一種生薑的液體淺層快繁方法。
背景技術：
：生薑是姜科多年生單子葉草本植物，生產上多為１年生栽培，在我國廣泛栽培。生薑由於其營養豐富，藥用效果好，已成為重要的調味蔬菜和醫藥、化工及食品工業原料；加上其經濟價值高，耐貯運，近年來已成為我國主要的特產創匯蔬菜之一。由於生薑不開花或很少開花，在育種上很難利用有性繁殖，而只能靠少數品種長期無性繁殖，從而導致姜植株體內積累多種病毒，產量下降，品質退化，抗逆性下降。近年來，隨著生物技術的發展，植物組織培養技術也逐漸應用到了生薑的生產上，取得了良好的經濟效益。生薑脫毒後，植物長勢強，產量顯著提高，抗病性增強。採用生薑組培苗替代姜塊，可大大節省種姜用量，提高生薑的產量和品質，獲得更好的經濟效益。同時，使用組織培養可以克服生薑種質資源因為自然災害和病蟲害所導致的丟失，並可對植物品質進行改良，通過改變生薑染色體組成和基因結構，達到改良生薑品質的目的。技術實現要素：針對現有技術中存在的問題，本發明提供一種生薑的液體淺層快繁方法。本發明通過以下技術方案加以實現：所述的一種生薑的液體淺層快繁方法，其特徵在於包括以下步驟：1）材料熱處理：精選塊大、肉厚、色澤黃亮、芽眼飽滿、未腐爛的健壯姜塊，在自來水下洗淨泥土，用50%多菌靈500倍液浸泡30min消毒，然後用高溫滅菌後的細沙覆蓋，置於恆溫培養箱內催芽，培養條件為溫度36-38℃，空氣溼度為70-80%，整個過程不需要光照，姜芽長出後，取培養箱中催芽的姜，50℃超高溫處理5min用於接種；2）外植體消毒與接種：切取經熱處理後1-2cm的姜芽，自來水衝洗30min，然後置於70%的乙醇中浸泡30s，棄去乙醇，無菌水衝洗1次，再用10%NaClO消毒10-15min，棄去NaClO溶液，無菌水衝洗5次，瀝乾水後，取出在超淨工作檯上利用雙目解剖鏡剝取0.2-0.4mm的莖尖分生組織；3）初代培養：將莖尖分生組織接種到初代培養基內進行培養，所述的初代培養基為：MS培養基+2-3mg/L的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）+0.1-0.3mg/L的萘乙酸（NAA）+7g/L的瓊脂+30g/L的食用白糖，pH值範圍為5.5-5.8；配製好的培養基分裝在240mL的組培瓶中，每瓶25mL，121℃滅菌15min；4）繼代培養：選擇初代培養後苗高在3cm以上，且具有3-6個腋芽的外植體，接種於繼代培養基中培養，待外植體產生叢生芽後，從每個叢芽上選擇1株，用滅菌的剪刀，剪取芽基部0.5cm以上的植物材料，用酶聯免疫吸附法進行黃瓜花葉病毒和菸草花葉病毒檢測；然後用消毒後的解剖刀從無毒姜叢生芽切取帶兩個或兩個以上的芽，連帶基部切掉所有的根及0.5cm以上部分的莖段，轉接至初代培養基中使腋芽伸長，苗高4cm以上後再轉接至液體繼代培養基中繼續增殖，所述的繼代培養基為：MS培養基+10-30g/L的食用白糖+2-5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.1-0.5mg/L的萘乙酸+0.1-1.7g/L的抗氧化劑，pH值範圍為5.5-5.8；配製好的培養基分裝在240mL的組培瓶中，每瓶10mL，培養過程中培養基不得沒過培養材料，否則影響增殖，121℃滅菌15min；5）生根培養：選擇苗高3cm以上，具有3-6個腋芽的外植體，接種於液體生根培養基中培養，所述生根培養基為：MS培養基+5-20mg/L的食用白糖+0.1-0.4mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.2-0.6mg/L的萘乙酸+0.4-2.0mg/L的多效唑+100g/L的土豆汁，pH值範圍為5.5-5.8；配製好的培養基分裝在240mL的組培瓶中，每瓶10mL；6）煉苗：將組培苗從培養室取出，放置於煉苗室中，溫度保持在22-29℃，溼度保持在70-75%，避免陽光直射；放置3-4d後，打開瓶蓋，讓幼苗逐漸適應外部環境，早晚用噴霧器對幼苗和室內進行噴霧，經過約1周的煉苗過程，即可移栽；7）移栽：把重量比為蛭石:珍珠巖=1:1的基質放到經過消毒的營養袋中，每個處理100袋。移栽時用鑷子把各組培苗從培養瓶中取出，分成單株，用清水衝洗乾淨根上殘留的培養液，要做到不傷根，用500倍多菌靈溶液浸泡20min，然後小心栽入營養袋中，澆足定根水，移栽後要用遮陽網遮蔭，常澆水和噴霧，溼度保持在75-85%，溫度22-25℃之間；每周施1次0.1%的尿素和0.2%KH2PO4，同時進行病蟲害防治。所述的一種生薑的液體淺層快繁方法，其特徵在於步驟3）初代培養的培養條件為：培養溫度25-30℃，光照時間為每天照射12-14h,光照強度為1200-1500Lx，培養時間為15-30d。所述的一種生薑的液體淺層快繁方法，其特徵在於步驟4）繼代培養的培養條件為：培養溫度25-30℃，光照時間為每天照射12-14h,光照強度為1200-1500Lx。所述的一種生薑的液體淺層快繁方法，其特徵在於步驟5）生根培養的培養條件為：培養溫度25-30℃，光照時間為每天照射12-14h,光照強度為1200-1500Lx。所述的一種生薑的液體淺層快繁方法，其特徵在於步驟4）中的抗氧化劑為0.5g/L的硫代硫酸鈉、0.1g/L的硫脲、0.5g/L的二硫蘇糖醇、0.5g/L的半胱氨酸、0.1g/L的抗壞血酸中的一種或多種。所述的一種生薑的液體淺層快繁方法，其特徵在於步驟5）中的生根培養基還包括有機添加物，所述有機添加物為100g/L的土豆汁、100g/L的玉米汁、100g/L的小麥麵粉、0.2g/L的水解酪蛋白、0.2g/L的酵母提取物中的任一種。本發明以生薑芽作為外植體進行培養，採用莖尖-熱處理脫毒技術，獲得脫毒脫菌生薑種苗，與傳統的只使用乙醇、HgCl2等消毒劑對外植體消毒方式相比，脫毒率高，成活率高。並採用優選的培養體系進行組織培養，大大節約成本，為生薑良種的快速繁殖提供技術參考。本發明中生薑的組織培養採用液體培養體系，無論是在生薑繼代還是生薑生根試驗中，具有相同激素水平的液態培養基增殖與生根在一定程度上均要優於固體培養基，同時液態培養基在很大程度上節省了大量人力和財力。此外，在本發明中，用食用白糖代替組織培養常用的蔗糖，同時採用液體培養體系，有利於生產成本的降低。具體實施方式以下結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明，並給出具體實施方式。實施例1：1）材料熱處理：精選塊大、肉厚、色澤黃亮、芽眼飽滿、未腐爛的健壯姜塊，在自來水下洗淨泥土，用50%多菌靈500倍液浸泡30min消毒，然後用高溫滅菌後的細沙覆蓋，置於恆溫培養箱內催芽，培養條件為溫度36-38℃，空氣溼度為70-80%，整個過程不需要光照，姜芽長出後，取培養箱中催芽的姜，50℃超高溫處理5min用於接種；2）外植體消毒與接種：切取經熱處理後1-2cm的姜芽，自來水衝洗30min，然後置於70%的乙醇中浸泡30s，棄去乙醇，無菌水衝洗1次，再用10%NaClO消毒10-15min，棄去NaClO溶液，無菌水衝洗5次，瀝乾水後，取出在超淨工作檯上利用雙目解剖鏡剝取0.2-0.4mm的莖尖分生組織；3）初代培養：將莖尖分生組織接種到121℃滅菌15min，每瓶20mL的初代培養基（MS培養基+2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.25mg/L的萘乙酸+7g/L的瓊脂+30g/L的食用白糖，pH5.6），25-30℃，光照12-14h/d,光照強度為1200-1500Lx，培養28d，出芽率為98.2%，且芽質量好，黃化現象少，採用熱處理消毒，芽的汙染率低，成活率達90%。4）繼代培養：選擇初代培養後苗高在3cm以上，且具有3-6個腋芽的外植體，接種於121℃滅菌15min，每瓶10mL的液體繼代培養基（MS培養基+15g/L的食用白糖+3mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.3mg/L的萘乙酸+0.5g/L硫代硫酸鈉+0.1g/L硫脲+0.5g/L二硫蘇糖醇+0.5g/L半胱氨酸+0.1g/L抗壞血酸，pH5.6）中，25-30℃，光照12-14h/d,光照強度為1200-1500Lx，培養30d，外植體產生叢生芽後，用滅菌的剪刀，剪取芽基部0.5cm以上的植物材料，用消毒後的解剖刀從無毒姜叢生芽切取帶兩個或兩個以上的芽，連帶基部切掉所有的根及0.5cm以上部分的莖段，轉接至初代培養基中使腋芽伸長，苗高4cm以上後再轉接至液體繼代培養基中繼續增殖，增殖倍數為6.58，材料的褐化率6.5%,褐化現象明顯降低。5）生根培養：選擇苗高3cm以上，具有3-6個腋芽的外植體，接種於121℃滅菌15min，每瓶10mL的液體生根培養基（MS培養基+10mg/L的食用白糖+0.2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.4mg/L的萘乙酸+1.6mg/L的多效唑+100g/L的土豆汁，pH5.6）中，25-30℃，光照12-14h/d，光照強度為1200-1500Lx，培養30d。出根數為8.3，根長為39.0mm，色白而粗，莖粗0.32cm，葉片大，肥厚，色濃綠。6）煉苗：將組培苗從培養室取出，放置於煉苗室中，溫度保持在22-29℃，溼度保持在70-75%，避免陽光直射；放置3-4d後，打開瓶蓋，讓幼苗逐漸適應外部環境，早晚用噴霧器對幼苗和室內進行噴霧，經過約1周的煉苗過程，即可移栽。7）移栽：把重量比為蛭石:珍珠巖=1:1的基質放到經過消毒的營養袋中，每個處理100袋。移栽時用鑷子把各組培苗從培養瓶中取出，分成單株，用清水衝洗乾淨根上殘留的培養液，要做到不傷根，用500倍多菌靈溶液浸泡20min，然後小心栽入營養袋中，澆足定根水，移栽後要用遮陽網遮蔭，常澆水和噴霧，溼度保持在75-85%，溫度22-25℃之間；每周施1次0.1%的尿素和0.2%KH2PO4，同時進行病蟲害防治，組培苗成活率達98%。實施例2：莖尖誘導出芽率在MS培養基中加入7g/L的瓊脂，30g/L的食用白糖，改變激素配比，在27±2℃，光照時間每天照射12-14h，光照強度為1200-1500Lx，培養25d後，觀察不同激素配比對出芽率的影響。表1不同激素配比對出芽率的影響從表1中我們可以看出，當激素6-BA濃度大於2mg/L後，誘導出芽率降低，而隨著激素NAA濃度的加大，誘導出芽率升高，最合適的激素配比為6-BA濃度2mg/L，NAA濃度0.25mg/L。實施例3：熱處理脫毒效果及初代培養成活率分別採用傳統HgCl2消毒和熱處理消毒的方法，誘導培養10天後分別檢測其汙染率，並在初代培養後檢測其成活率，對比二者的脫毒效果及對初代培養成活率的影響，結果見表2。從表2可以看出，經本發明熱處理消毒方法處理過的材料，汙染率低於傳統只經升汞消毒方法，且在初代培養中其成活率明顯高於經傳統消毒方法處理的材料，進一步說明，該發明熱處理消毒方法對莖尖的損傷較小，易於成活。表2不同消毒方法對初代培養汙染率和成活率的影響消毒方法處理瓶數汙染率（%）成活率（%）傳統消毒方法100871熱處理消毒方法100690實施例4：激素配比對繼代培養增殖的影響表3激素配比對繼代培養增殖的影響將芽接種到不同的激素配比的繼代培養基中進行培養，增殖倍數見表3。從表可知，激素的濃度對繼代培養的增殖倍數有顯著的影響，隨著6-BA濃度的增大，其增殖倍數顯著上升，但是當增加到3mg/L時，其增值倍數達到最大，而後增加6-BA濃度，反而會抑制增殖；NAA濃度加大，會促進增殖，在0.3mg/L時達到最大值，而後開始下降，最佳的配比為6-BA濃度3mg/L，NAA濃度0.3mg/L，即8號培養基。實施例5：加入抗氧化劑對繼代培養過程中褐變的影響褐化是指在外植體誘導初分化或再分化過程中，自身組織從表面向培養基釋放褐色物質以至培養基逐漸變成褐色，外植體也隨之進一步變褐而死亡的現象。褐化嚴重影響外植體的分化，甚至導致培養的失敗，有效的抑制褐化對液體培養有著關鍵的作用。在培養液中加入抗氧化劑、胺基酸等能有效的抑制褐化。本實驗中加入了硫脲、二硫蘇糖醇、半胱氨酸、硫代硫酸鈉、抗壞血酸及其組合考察了對褐化的抑制作用，培養30d後觀察外植體生長情況，結果見表4。與對照相比，在培養基中添加抗氧化劑能明顯降低莖稈基部愈傷組織褐化率，4種抗氧化劑中，0.1g/L抗壞血酸較其餘3種抗氧化劑使用量小，且效果佳。而在培養基中添加抗壞血酸、硫代硫酸鈉、硫脲、二硫蘇糖醇的抗氧化劑組合成分，同時添加半胱氨酸，既能降低莖稈基部愈傷組織褐化率，又能大大提高叢生芽增值倍數，更有利於組培苗的繼代培養。表4抗氧化劑、胺基酸對培養過程中褐變的影響編號添加物材料褐化率增殖倍數0無32.5%4.1610.5g/L硫代硫酸鈉28.9%4.5720.1g/L硫脲29.2%4.3830.5g/L二硫蘇糖醇19.8%4.9740.1g/L抗壞血酸14.2%5.1150.5g/L半胱氨酸16.5%5.0660.5g/L硫代硫酸鈉+0.1g/L硫脲23.6%4.6570.5g/L半胱氨酸+0.5g/L二硫蘇糖醇12.5%5.3480.5g/L硫代硫酸鈉+0.1g/L硫脲+0.5g/L半胱氨酸+0.5g/L二硫蘇糖醇10.8%5.4990.5g/L硫代硫酸鈉+0.5g/L半胱氨酸+0.5g/L二硫蘇糖醇+0.1g/L抗壞血酸7.5%5.73100.5g/L硫代硫酸鈉+0.1g/L硫脲+0.5g/L二硫蘇糖醇+0.5g/L半胱氨酸+0.1g/L抗壞血酸6.5%6.50實施例6：培養體系類型對繼代培養增殖的影響以實施例3中的8號培養基為基礎，加入7g/L瓊脂，配製成固體培養基，培養溫度為27±2℃，光照時間每天照射12-14h，光照強度為1200-1500Lx，液體、固體培養體系均設置三組平行，培養28天觀察增值倍數，結果見表5。表5液體/固體培養體系繼代培養增殖率從表5我們可以看出，與固體培養基相比，液體培養體系對繼代培養的增殖幾乎沒有影響，且平均增值倍數較固體培養略高。因液體培養基更有利於生薑組培苗的吸收，故生長速度較快，增殖倍數較固體培養高。實施例7：糖濃度對繼代培養增殖的影響，結果見表6。碳源是植物組織培養不可缺少的物質，它不僅能夠給外植體提供能量，而且也能維持一定的滲透壓，且在組織培養各個階段所需要的糖濃度是不一樣的。表6糖濃度對繼代培養增殖倍數的影響糖濃度（g/L）出芽數（個）00.6103.9154.9204.8254.8304.6從表6中可看出，糖濃度在15g/L時，出芽數最多，糖濃度繼續升高，芽分化個數有所降低。實施例8：激素配比對生薑生根的影響表7激素配比對生薑生根的影響由表7可知，在培養基中加入外源激素很容易使生薑生根，只是在不同的培養基上生根根長、數量有所不同，在6-BA濃度0.2mg/L，NAA濃度0.4mg/L時生根數量最多，根長也較長，根色白而粗，雖然苗高並非最大值，但移栽後成活率較高。實施例9：液體培養體系對生薑生根的影響在MS培養基中加入在6-BA（濃度0.2mg/L），NAA濃度（0.4mg/L），分別配製成液體培養基和固體培養基（加入7g/L的瓊脂），觀察其生根情況，每個做三組平行，結果見表8。生薑苗在液體培養基中的出根數高於固體培養基，根長和株高影響不明顯。且固體培養基在煉苗時需用水洗淨粘在根上的瓊脂，這會導致根的損傷，造成成活率下降。且液體培養基減少了瓊脂的用量，降低了培養基成本。表8液體培養體系對生薑生根的影響實施例10：白糖濃度對生薑生根的影響將繼代培養的生薑苗接種到不同糖濃度的生根培養基中培養，結果見表9。糖濃度在10g/L時，每株出根數最多，根最長。隨著糖濃度的增大，出根數和根長均下降。表9白糖濃度對生薑生根的影響白糖濃度（g/L）出根率（%）出根數（條/株）根長（mm）01001.670.2651006.8526.3101007.0029.5151006.6225.5201006.4825.2251006.3324.8實施例11：碳源的選擇對生薑脫毒苗繼代和生根的影響將初代培養基、繼代培養基和生根培養基中白糖均用蔗糖代替，其他操作及條件不變，結果見表10。選擇食用白糖或蔗糖作為碳源，在繼代培養的增殖倍數以及苗的生根方面幾乎沒有影響，而且白糖比蔗糖在價格上更佔有優勢，完全可以使用白糖來降低組培成本。表10食用白糖與蔗糖對生薑脫毒苗繼代和生根的比較實施例12：不同濃度的多效唑對生薑壯苗及生根的影響一定濃度的多效唑可抑制生薑苗的縱向生長，促進其橫向生長，莖加粗，葉片變寬加厚，起到壯苗的作用，同時可以促進根系發育生長，使苗易於移栽成活。在MS培養基+6-BA0.2mg/L+NAA0.4mg/L培養液中，分別加入0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/L多效唑，以不添加多效唑為對照實驗，觀察其對生薑壯苗及生根的影響，結果見表11。表11多效唑對生薑壯苗及生根的影響從表11我們可以看出，在0.4-2.0mg/L濃度梯度中，多效唑具有壯苗的作用，在1.6mg/L以下，多效唑具有促進根系發育的作用，綜合考慮，採用1.2-1.6mg/L濃度的多效唑有利於同時壯苗和促進生根。實施例13：不同有機添加物對生薑組培苗生根壯苗的影響，將不同類型的有機添加物加入生根培養基中，30d進行觀察，結果見表12。添加100g/L土豆汁的組培苗生長旺盛、深綠色，健壯度高，生根壯苗的效果最好。有機添加物汁液中含有胺基酸、激素、酶等有機物，其營養豐富，是複雜的營養混合物，可為植物生長提供一些生理活性物質，補充一些未知的微量成分。且添加天然有機物的培養基容易配製，成本低廉，對器官分化、細胞增殖有明顯的促進作用，可應用於生產中。表12有機添加物對生薑組培苗生根壯苗的影響實施例14：不同基質對生薑組培苗株高、根長和成活率的影響表13不同基質對生薑組培苗株高、根長和成活率的影響基質類型平均株高(cm)平均根長(cm)成活率(%)蛭石:珍珠巖=1:18.96.798珍珠巖8.06.188蛭石7.85.783移栽30d後不同基質對生薑組培苗的影響，結果見表13。成活率越高，移栽越成功。生薑試管苗移栽後的成活率在珍珠巖:蛭石=1:1的基質中最高為98%，且株高、根長高於珍珠巖和蛭石條件的生長狀態。正是由於不同基質具有不同的理化特性，才導致了生薑試管苗在移栽後生長的差異。蛭石主要起保水作用，其孔隙度大，保水能力強，而珍珠巖主要起通氣作用。因此，結合兩者的優點，蛭石:珍珠巖=1:1的基質最適於生薑試管苗的移栽生長。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp