複雜固態環境中微生物基因組dna的提取方法
2024-04-06 00:10:05 1
專利名稱：複雜固態環境中微生物基因組dna的提取方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物基因組DNA提取方法。特別是一種複雜固態環境中微生物基 因組DNA的提取方法。
背景技術：
近二十年來，科學家逐步利用分子生物學技術來研究微生物群落，這類方法能相對 便利的來研究微生物群落中的功能性種群，因為在現有的實驗室條件下分離培養這些微 生物是非常困難的。用於此類研究的分子生物學技術一般包括PCR， DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis),測序，寡核苷酸探針和FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)等。16S rRNA基因是這類研究中使用最有效最普遍的分子標記。這些分 子生物學方法的進展使我們能對未能培養的微生物進行一定的研究，有助於我們對來自 各種環境中的未知微生物群落進行分類學和生態學層面上的研究。當前，對於各種複雜固態環境中微生物的研究已經成問熱點，這類成分複雜的環境 包括沼氣池，垃圾填埋場，活性淤泥等。在複雜固態環境中，微生物群落是一個複雜 和未知的群體，並在這類環境中起了非常重要的作用，比如厭氧發酵產生沼氣，降解各 種廢棄物，降解有毒汙染物，代謝或富集重金屬等。了解其中的微生物多樣性及其群落 的結構有助於我們更深入的了解微生物的作用，從而能更好地來利用微生物，進一步可 以提高沼氣池，汙水處理池等的使用效率，幫助人類更好地走可持續發展的道路。當前，用於基因組DNA提取的方法很多，而直接從土壤等相對簡單的環境中提取微 生物DNA的方法也有不少。但這類複雜的固態環境中包含大量雜質，比如各種金屬離子 等無機物質，也包括腐殖質等各種有機物質，因此對DNA的提取造成了相當程度上的障 礙，並且影響到後續的分子生物學實驗。 發明內容本發明的目的在於填補現有技術中的空缺，提供一種可以迅速，簡便的直接提取復 雜固態環境中微生物基因組DNA的方法。本發明的目的通過以下方案實現一種複雜固態環境中微生物基因組DNA的提取方法，其特徵在於該方法的具體步驟a. 在樣品中加入玻璃珠或金剛砂、Extraction Buffer和溶菌酶，振蕩混勻；37"C水浴 後室溫下離心；吸取上清，加入SDS和蛋白酶K， 65。C水浴後室溫下離心；吸取上清， 再加入氯化鈉溶液和CTAB, 65。C水浴後離心； b.吸取上清，按常規提純方法對上清液進行純化分離，即得到微生物基因組DNA。 所述的步驟a中，按每1克樣品加入lml的Extraction Buffer, Extraction Buffer 的組成為:Tris-HCl (lOOmM， pH8.0)' EDTA (lOOraM' pH8. 0)， NaH2P04 (lOOmM)， NaCl (500mM)和1。/。的CTAB;按每1克樣品中加入20 50 y 1的SDS (10%)溶液；按每1克 樣品中加入！0 30iU蛋白酶K (20mg/ml)溶液；按每1ml上清液加入400 u 1的氯化鈉 (1M)溶液和100 ul的CTAB (10%)。本發明的優點是當前，對環境樣品中微生物多樣性的研究主要依賴於微生物DNA 的提取及後續的PCR等分子生物學手段的研究。因此必須建立一套能真實，全面反映環 境樣品中微生物多樣性的DNA提取方法，並使得到的基因組DNA能用於隨後的PCR， 酶切等分子生物學實驗中。本發明提供了一種能直接從複雜固態環境中提取DNA的方 法，並且得到的DNA能用於PCR等後續實驗。此方法是一種快捷，簡單的從複雜固態 環境中直接提取微生物基因組DNA的方法。此外，本方法不需要特別儀器，實驗成本較 低。
圖1是採用本發明方法從上海市崇明島長江口灘涂泥漿中提取得到的微生物基因組 DNA電泳圖。圖2是採用兩種方法提取的微生物基因組DNA電泳圖。其中，l和2為採用本發明方 法從沼氣池漿樣品提取微生物基因組DNA的電泳圖；3和4為採用一般方法提取 得到的微生物基因組DNA的電泳圖分別為。圖3為採用兩種方法提取的微生物基因組DNA的PCR產物電泳圖。其中1和2為採 用本發明方法提取的DNA作為模板；3和4為採用一般方法提取到的DNA作為 模板.具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用於說明本發明而 不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常 規條件，如分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)中所述條件，或按照製造廠商所建議的條件。所有試劑都是按《分子克隆實驗操作手冊(第三版)》 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)說明配製成質量/體積比濃度溶 液。實施例1:使用本發明方法對上海市崇明島長江口灘涂泥漿中微生物基因組DNA的提取灘涂為沿海大潮高潮位與低潮位之間的潮浸地帶，而崇明島長江口灘涂不僅受到海 水浸潤，也受到長江江水的衝洗。因此，灘涂中積累了大量來自上遊長江攜帶下來的汙 染物，同時含有無機鹽類。在這種富含大量汙染物並屬鹽鹼地的環境下，多數植物難以 生長，只有在近陸地處有少數植物種類存在。使用本發明的方面可以成功提取到灘涂泥 漿中的微生物基因組DNA。本發明方法的提取過程稱取樣品0.84g，按以下步驟提取裝入2ml離心管，加金剛砂，再加入lml的 Extraction Buffer和50 n 1的溶菌酶(20mg/ml)。振蕩離心管3 min。將裝有樣品的離心管 放入水浴鍋內，37'C水浴20 min，其間取出離心管振蕩3次。室溫下離心3 min， 3000 Xg。吸取上清，移入新的L5ml的離心管，加入30iU的10% SDS， 20iil的蛋白酶K (20mg/ml)，混勻後65。C水浴10min。在室溫下離心5 min， 10000Xg。仔細吸取上清，並將上清液移入新的1.5ml的離心管，加入400iU的氯化鈉溶液 (1M)， 100ul的CTAB (10%), 65。C水浴20min。 4。C下離心5min， 12000Xg。再吸取上清，移入新的1.5ml的離心管，加入lml的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，顛倒混勻。4'C下離心5 min， 12000Xg。吸取上清，移入新的1.5ml的離心管，加入lml的氯仿:異戊醇 (24:1)，顛倒混勻。4"下離心5inin， 12000Xg。吸取上清，移入新的1.5ml的離心管，加入100ul的醋酸鈉(3M,pH5.2),和lml的異丙醇，顛倒混勻，-2(TC下放置30min。4。C下離心15min, 12000Xg。棄上清，加1ml70。/。的乙醇洗滌沉澱，4'C下離心5min， 12000Xg。棄上清，晾乾。 晾乾後往管中加50y 1純水溶解沉澱。取10u 1 DNA溶液用於瓊脂糖凝膠電泳檢測。瓊 脂糖凝膠電泳所用瓊脂糖濃度為1%的凝膠，含0.5yg/ml溴化乙錠，所用DNA分子量 標記(Marker)為北京鼎國生物技術有限責任公司的人DNA/EcoRI+HindIII，所用的電泳 緩衝也為TAE電泳緩衝液，以120V電壓電泳25分鐘。電泳結果見圖1。可見用本方法 提取得到的DNA片段主要集中在20kb左右的位置。實施例2:使用本發明所述的方法和一般方法對沼氣池漿樣品提取微生物基因組DNA的比較沼氣池主要是利用農餘產品，比如秸杆等廢棄生物質材料，垃圾以及有機廢棄物， 再加上人畜的糞便，混合使之在厭氧的條件下產生主要成分是甲烷的混合氣體。因此沼 氣池漿的成分相當複雜，含有鈣、錳、鉀、鐵、銅、鋅等多種金屬離子，並含有腐殖酸、 單糖、多糖、不飽和脂肪酸及某些抗生素等物質，對DNA的提取及後續PCR等分子生物 實驗造成了很大困難。使用本發明所述的方法對沼氣池漿樣品提取微生物基因組DNA比 使用一般方法提取的DNA質量要高。本發明方法的提取過程分別稱取池漿樣品l: 0.74g;和樣品2: 0.97g，按以下步驟提取裝入2ml離心管， 加金剛砂，再加入lml的Extraction Buffer和50 y 1的溶菌酶(20mg/ml)。振蕩離心管3 min。 將裝有樣品的離心管放入水浴鍋內，37。C水浴20min，其間取出離心管振蕩3次。室溫 下離心3min， 3000Xg。吸取上清，移入新的1.5ml的離心管，加入30 u 1的10% SDS， 20ul的蛋白酶K (20mg/ml)，混勻後65。C水浴10 min。在室溫下離心5 min， 10000Xg。仔細吸取上清，並將上清液移入新的1.5ml的離心管，加入40(^1的氯化鈉溶液 (1M)， lOOtU的CTAB (10%)， 65。C水浴20min。 4。C下離心5min， 12000Xg。再吸取上清，移入新的1.5ml的離心管，加入lml的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，顛倒混勻。4°C下離心5min， 12000Xg。吸取上清，移入新的1.5ml的離心管，加入lml的氯仿:異戊醇 (24:1)，顛倒混勻。4'C下離心5min, 12000Xg。吸取上清，移入新的1.5ml的離心管，加入100ul的醋酸鈉(3M,pH5.2),和lml的異丙醇，顛倒混勻，-2(TC下放置30 min。4。C下離心15 min， 12000Xg。棄上清，力n lml70。/。的乙醇洗滌沉澱，4'C下離心5min， 12000Xg。棄上清，晾乾。 晾乾後往管中加50ul純水溶解沉澱。取10nl DNA溶液用於瓊脂糖凝膠電泳檢測，其 餘放入-8(TC冰櫃凍存。一般方法的提取過程分別稱取池漿樣品3: 0.78g;和樣品4: 0.94g，按以下步驟提取放入研缽中，倒入適量的液氮，立即研磨；力Q 1 ml提取緩衝液(O.l mol/L磷酸鹽[pH = 8.0 ]， 0.1mol/L EDTA [pH 8.0 ], 0.1 mol/L Tris-HC1 [pH 8.0 ]， 1.5 mol/L NaCl， 1.0 % CTAB)和 5(Hil蛋白酶K(10g/L)，置於離心管中，振蕩3min;加入0.5 ml 20 % SDS ，輕輕混勻， 65'C水浴加熱1 h，每隔15 30min輕輕搖勻1; 5 OOOXg,離心10min,將上清液轉入 新的離心管中；用與上清液等量的三氯甲垸於離心管中混勻，5000Xg，離心20min;收 集上清液,並加入2.5倍體積的異丙醇；4 'C下12 OOOXg離心20 min，棄上清液，加lml 70%的乙醇洗滌沉澱，4'C下離心5min， 12000Xg。棄上清，晾乾。晾乾後往管中加50 lU純水溶解沉澱。取10yl DNA溶液用於瓊脂糖凝膠電泳檢測，其餘放入-80。C冰櫃凍 存。瓊脂糖凝膠電泳所用瓊脂糖濃度為1%的凝膠，含0.5ug/ml溴化乙錠，所用DNA 分子量標記(Marker)為北京鼎國生物技術有限責任公司的X DNA/EeoRI+Hindffl，所用 的電泳緩衝也為TAE電泳緩衝液，以120V電壓電泳25分鐘。電泳結果見圖2，用本方法提取的樣品標記為l和2;用一般方法提取的樣品標記為3和4。可見用本方法提取得到的DNA片段主要集中在20kb左右的位置，基因組片段在此大小範圍中可以滿足 後續PCR等研究；而一般方法提取得到的DNA片段在電泳圖上呈彌散條帶，說明DNA 斷裂情況嚴重，且片段長度較小，不利後續研究。實施例3:對DNA樣品(使用本發明所述的方法和一般方法對沼氣池漿樣品提取微 生物基因組DNA)進行PCR擴增16S rRNA基因，結果顯示使用本發明提取到的DNA 樣品能順利進行PCR擴增，而一般方法得到的無法進行PCR擴增。取實施例2中提取得到的DNA樣品，進行PCR擴增。PCR的反應體系為50 y 1: 10 Xbuffer: 5 U 1， lOmM dNTP: 1 u 1， 10mM primer P0: 2.5 U 1， 10mM pri而P6: 2.5 u 1， Taq 酶(2U/ul) : lul， DNA: 0.5 ul， ddH20: 37.5 lU。其中引物的序列為P0， 5，-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'， P6: 5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3， (Weisburg et aL， 1991)，增擴目的片段為16SrRNA基因的全長，1.5kb左右。PCR參數設計如下 起始變性5分鐘，95°C; 30個循環(變性30秒，95'C;退火30秒，55'C;延伸50秒， 72'C);最後延伸7分鐘，72°C。瓊脂糖凝膠電泳檢測，所用DNA分子量標記(Marker) 為北京天為時代科技有限公司的100bpladder。電泳結果見圖3，可見使用本方法提取獲 得的DNA產物能擴增出目的條帶；而一般方法提取得到的DNA不能擴增出目的條帶。
權利要求
1.一種複雜固態環境中微生物基因組DNA的提取方法，其特徵在於該方法的具體步驟為a.在樣品中加入玻璃珠或金剛砂、Extraction Buffer和溶菌酶，振蕩混勻；37℃水浴後室溫下離心；吸取上清，加入SDS和蛋白酶K，65℃水浴後室溫下離心；吸取上清，再加入氯化鈉溶液和CTAB，65℃水浴後離心；b.吸取上清，按常規提純方法對上清液進行純化分離，即得到微生物基因組DNA；所述的步驟a中，按每1克樣品加入1ml的Extraction Buffer，Extraction Buffer的組成為Tris-HCl(100mM，pH 8.0)，EDTA(100mM，pH 8.0)，NaH2PO4(100mM)，NaCl(500mM)和1％的CTAB；按每1克樣品中加入20～50μl的10％的SDS溶液；按每1克樣品中加入10～30μl濃度為20mg/ml的蛋白酶K溶液；按每1ml上清液加入400μl的濃度為1M的氯化鈉溶液和100μl的濃度為10％的CTAB。
全文摘要
本發明提供了一種在複雜固態環境中直接提取微生物基因組DNA的方法。該方法的具體步驟為首先在樣品中加入Extraction Buffer然後進行細菌的破碎，隨後在高離子濃度下使用CTAB除去蛋白質和有機類大分子物質，最後按常規方法從溶液中抽提DNA；本發明方法快捷方便，得到的DNA可供後續PCR等分子實驗操作使用。
文檔編號C12N15/10GK101333523SQ200810041438
公開日2008年12月31日 申請日期2008年8月7日 優先權日2008年8月7日
發明者宋任濤, 張蔭雷, 佳 濮, 袁軼偉, 許政暟, 賀其其, 馬中良 申請人:上海大學