野蠶1型乙醯膽鹼酯酶活性蛋白的製備方法及其用途的製作方法

2024-03-10 13:55:15

專利名稱：野蠶1型乙醯膽鹼酯酶活性蛋白的製備方法及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及鱗翅目l型乙醯膽鹼酯酶基因在昆蟲 細胞中的表達，以及表達產物的純化及在農藥篩選和檢測中的應用。
背景技術：
乙醯膽鹼酯酶(AChE; EC 3. 1.1.7)能催化神經傳遞物質乙醯膽鹼的水解反應，從而調 節神經突觸間隙的乙醯膽鹼水平和終止神經衝動傳遞，是動物神經系統中的關鍵酶之一
，。它由乙醯膽鹼酯酶基因(ace)編碼，是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用分子 靶標。自從第一個乙醯膽鹼酯酶基因從果蠅(&osop/n7a/ e7朋o卵"er )中克隆出來後 [Hall LM, Spierer P. The Ace locus of Z rasv9; 力iJa鵬7朋。卵ster: structural gene for acetylcholinesterase with an unusual 5， leader, EMB0 J". 1986; 5: 2949 - 2954], 多種昆蟲的乙醯膽鹼酯酶基因也相繼被報導。近年來發現，果蠅和家蠅只有一種乙醯膽鹼 酯酶基因，而許多昆蟲都有兩種類型的乙醯膽鹼酯酶基因；其中一種與果蠅和家蠅的乙醯 膽鹼酯酶基因序列很相似，現被稱為"2型乙醯膽鹼酯酶基因(ace力"，而另一種乙醯 膽鹼酯酶基因與果蠅和家蠅的乙醯膽鹼酯酶基因序列差異很大，這兩種乙醯膽鹼酯酶氨基 酸序列同源性在40%以下，其被稱為"l型乙醯膽鹼酯酶基因(acel)"。鱗翅目昆蟲 中包括棉鈴蟲Helicoverpa armigera[Brun-Barale GenBank AAY59530]、煙芽夜蛾H. assulta [LeeDW， Kim SS， Shin SW， Kim WT， Boo KS. Biochim Biophys Acta. 2006; 1760: 125-33.]小菜蛾7°/由^3 ^ZosteWa (Baek et al, 2005. Pesticide Biochemistry and Physiology 81: 164 - 175)、蘋果蠹蛾6>t//a ; o歷o/7e仏[Cassanelli， S., Reyes, M., Rault, M. ， Manicardi, G. C. and Sauphanor， B. 2006 Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (8)， 642-653]、家蠶5。/z76/7 yz7orJ' [Shang JY， Shao YM， Lang GJ， Zhang CX， Yuan G, Tang ZH. 2007. Insect Science, 6: 443-449.]等也先後報導是兩種乙醯膽鹼酯酶基因。鱗 翅目昆蟲是最大的害蟲類群，而1型乙醯膽鹼酯酶基因在兩種類型乙醯膽鹼酯酶基因中是 佔優勢基因，其l型乙醯膽鹼酯酶在農藥分子設計、新農藥品種和新農藥混劑開發的體外
3有效性篩選及農藥殘留檢測方面具有很大的應用價值和市場需求。但是用鱗翅目昆蟲頭部 乙醯膽鹼酯酶費錢費力。
因此，利用基因工程手段生產具有高度生物學活性的鱗翅目的1型AChE是許多工作 努力要實現的目標。但要表達生產出具有高活性純的鱗翅目的AChE並不容易、除我們曾 嘗試表達家蠶的AChE外，還沒有其它相關成功報導。但我們表達的家蠶的AChE存在 酶活性太低，在農藥分子設計、新農藥品種和新農藥混劑開發的體外有效性篩選及農藥殘 留檢測方面還無法使用的缺陷。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種製備野蠶(鱗翅目)l型乙醯膽鹼酯酶活性蛋白 的方法，採用該方法能製備高活性的鱗翅目l型乙醯膽鹼酯酶，並能將其用於新農藥品種 和新農藥混劑開發的體外有效性篩選及農藥殘留檢測等方面。
為了解決上述技術問題，本發明提供了一種野蠶l型乙醯膽鹼酯酶活性蛋白的製備方 法，包括以下步驟
1) 、將編碼具有野蠶l型乙醯膽鹼酯酶(去除32個C端胺基酸殘基)基因的核苷酸序列
可操作地連於表達調控序列，形成分泌非融合蛋白的野蠶(鱗翅目)1型乙醯膽鹼酯酶表達
pFastBac系歹喊體；
2) 、將上述步驟所得的表達載體轉入宿主昆蟲細胞，形成野蠶l型乙醯膽鹼酯酶的重 組細胞；
3) 、在適合分泌表達野蠶l型乙醯膽鹼酯酶多肽的條件下，培養上述步驟的重組細胞;
4) 、用procainamide親和層析柱分離出具有野蠶l型乙醯膽鹼酯酶蛋白活性的多肽。 作為本發明的製備方法的改進步驟3)的培養條件為昆蟲細胞培養溫度為26-28'C，
用無血清昆蟲細胞培養基培養。
作為本發明的製備方法的進一步改進所述步驟2)的宿主昆蟲細胞為粉紋夜蛾 Tn-5Bl-4宿主細胞。
作為本發明的製備方法的進一步改進步驟i)的編碼具有野蠶l型乙醯膽鹼酯酶的核 苷酸序列，包含編碼信號肽(以利於表達產物分泌到細胞外培養基中)和所有乙醯膽鹼酯 酶發揮完整功能的核苷酸序列，但去除了不利於表達產物分泌到細胞外的32個C端胺基酸 殘基的編碼核苷酸序列。
本發明還提供了上述方法製得的野蠶l型乙醯膽鹼酯酶活性蛋白的用途，用於農藥的有效性篩選和檢測。農藥為有機磷或氨基甲酸酯類殺蟲劑。
因此，本發明主要解決了以下幾個問題1、外源基因在昆蟲粉紋夜蛾Tn-5Bl-4細胞 中的表達技術，2、用procainamide親和層析柱乙醯膽鹼酯酶的純化技術，3、野蠶l型乙 醯膽鹼酯酶對有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的篩選檢測。
本發明所提供的製備這種野蠶1型乙醯膽鹼酯酶的表達系統，含野蠶1型乙醯膽鹼酯 酶核苷酸的重組載體，含重組載體的宿主細胞。
本發明所提供的一種農藥篩選檢測的新方法，利用上述從宿主細胞中表達出的野蠶1 型乙醯膽鹼酯酶活性蛋白，通過分離純化，得到了純度較高的活性蛋白。純度較高的活性 蛋白進行農藥篩選檢測的新方法。
在本發明中，應用分子生物學手段克隆了桑樹鱗翅目害蟲野蠶(5ow6;awam/fl〃'"") 浙江品系的1型乙醯膽鹼酯酶基因(GenBank登錄號FJ542315)，克隆之後，利用無血 清培養基在昆蟲細胞中快速穩定高效表達，表達的蛋白分泌到無血清培養基中，容易純化， 純化之後蛋白具有很高的酶活性，在農藥分子設計、新農藥品種和新農藥混劑開發的體外 有效性篩選及農藥殘留檢測方面具有廣泛用途。
本發明的優點
(1) 目前市場還缺乏主要害蟲類群鱗翅目酶源供應，用來自於敏感家蠅頭部的 粗提酶液，不能代表鱗翅目l型乙醯膽鹼酯酶，而從鱗翅目頭部提取的粗提酶液中還有夾 有2型乙醯膽鹼酯酶和許多其餘的雜蛋白，會干擾對酶活性的研究，所以使用純化的酶來 檢測效果要好得多。
(2) 此法應用基因工程手段，克隆到野蠶的1型乙醯膽鹼酯酶基因，利用 Bac-to-Bac杆狀病毒高效表達系統在昆蟲細胞中高效表達此外源基因，獲得大量表達蛋白， 易純化，經過純化後可以獲得大量的高活性蛋白。此方法只需要一次性構建載體，轉染進 細胞，獲得重組病毒之後就可以不斷地表達目的蛋白。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。 圖1為野蠶1型乙醯膽鹼酯酶基因在Tn-5Bl-4細胞中的表達和純化分析圖； M:標準分子量；Ll:分泌到培養基中1型乙醯膽鹼酯酶；L2: Tn-5Bl-4細胞中
1型乙醯膽鹼酯酶；L3:對照病毒感染細胞培養基；L4:對照病毒感染細胞；L5:純化
1型乙醯膽鹼酯酶。
具體實施例方式
在本發明的具體實施方案中，本發明中的"分離的"、"純化的"或"基本純的"DNA 是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來；還指該DNA或片 段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語"野蠶1型乙醯膽鹼酯酶蛋白(或多肽)編碼序列"指編碼具有野蠶 l型乙醯膽鹼酯酶蛋白(或多肽)的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與野蠶1型乙醯膽鹼酯酶相同功能的蛋白的序列的變異形 式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個核苷酸的缺失、插入和或取代，以及在5' 和/或3'端添加數個核苷酸。
在本發明中，"基本純的"蛋白質或多肽是指其佔樣品總物質的至少20%，較佳地至 少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90%(按乾重或溼重計)。純度可以用任何合適的 方法進行測量，如用柱層折、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不 含天然狀態下的伴隨其的組分。
在本發明中，術語"野蠶1型乙醯膽鹼酯酶蛋白多肽"指具有野蠶1型乙醯膽鹼酯酶 蛋白活性的多肽。該術語還包括具有與野蠶1型乙醯蛋白膽鹼酯酶蛋白相同功能的序列的 變異形式例如胺基酸同源性>95的其它鱗翅目1型乙醯膽鹼酯酶等鱗翅目昆蟲1型乙醯膽 鹼酯酶蛋白。這些變異形式包括(但並不限於)若干個胺基酸的缺失、插入和/或取代， 以及在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相 似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添 加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括野蠶1型乙醯膽鹼酯酶 蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體，誘導突變體，在高或 低的嚴謹度條件下能與野蠶1型乙醯膽鹼酯酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白，以及利 用抗野蠶1型乙醯膽鹼酯酶多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
本發明還包括檢測家野蠶(鱗翅目)l型乙醯膽鹼酯酶核苷酸序列的方法，該樣品是 PCR擴增後的產物，其中PCR擴增引物對應於家野蠶(鱗翅目)l型乙醯膽鹼酯酶多肽的編 碼序列，並可位於該編碼序列的兩側或中間，引物長度一般為15——50個核苷酸。
本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發明中，術語"宿主細胞"包括Tn-5Bl-4細胞、Bm細胞等昆蟲細胞。另一方面，本發明還包括對野蠶l型乙醯膽鹼酯酶活性蛋白的純化，指將表達的野蠶 1型乙醯膽鹼酯酶從真核宿主細胞中和培養基分離純化出來，獲得大量純化活性蛋白，應 用於有機磷和氨基甲酸酯類農藥的篩選檢測。
本發明的活性蛋白製備可以通過本領域內技術人員已知的技術進行製備。 下面結合具體實例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不 用於限制本發明的範圍。
實施例1、野蠶1型乙醯膽鹼酯酶基因在昆蟲細胞中的表達和表達產物純化 在該實施例中，
RT-PCR反應中使用的5'寡核苷酸引物序列為
Bmmd-ace 1F 5 ，-AAGCTTATGCGCGTGGTGTTGGCAGC-3 ，，
3，端引物序列為Bmmd-flcelR (5，-CTCGAGTTAATTCGTACAATTCTTCGGC-3，)。
具體如下
SEQIDNO: 1的信息
(I) 序列特徵
(A) 長度26鹼基
(B) 類型:核酸
(C) 鏈性單鏈 (D)拓撲；線性
(II) 分子型寡核苷酸 (m)序列描述SEQIDNO: 1
5，-AAGCTTATGCGCGTGGTGTTGGCAGC隱3，。 SEQIDNO: 2的信息
(I) 序列特徵
(A) 長度28鹼基
(B) 類型核酸
(C) 鏈性單鏈 (D)拓撲；線性
(II) 分子型寡核苷酸
7(III)序列描述SEQIDNO: 2 (5，陽CTCGAGTTAATTCGTACAATTCTTCGGC-3，)
5'端引物含有HindlII酶切位點，3'端引物含有XhoI酶切位點。該對引物擴增出的野蠶 l型乙醯膽鹼酯酶基因序列，包含編碼信號肽的核苷酸序列，以利於表達產物分泌到培養 基中，包含了所有乙醯膽鹼酯酶的發揮完整功能的編碼序列，但去除了會將表達產物錨定 於細胞膜從而不利於表達產物分泌的32個C端胺基酸殘基 (SVSSLWPSRKALSFNVIATAALTGTSLFKYTI)的編碼核苷酸序列。
從四齡野蠶幼蟲整體提取總RNA並按常規方法反轉錄成cDNA，PCR條件為94 °C 3 min，接下來31循環為94 。C變性30 sec， 53。C退火30 sec和72 °C延伸2 min，最後一步 72 'C延伸10 min。 PCR產物純化後克隆入pMD-18T載體(Takara公司產品)並測序列 確定。
引物上限制性內切酶酶切位點對應於轉移載體pFastbacl上的限制性內切酶酶切位 點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Gmr)， 一個噬菌體複製起點(Ori)、 一個病毒複製 起點(SV40)、 一個T7啟動子、 一個病毒啟動子(P-CMV)， 一個SV40啟動子、 一個SV40 加尾信號和相應的polyA順序、 一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。
用JWw/ /和歷"d III消化pFastBacl及插入片段，隨後用連結混合物轉化￡. co/Z TG1 菌株(Stratagene公司產品)，在含有Ampf和Gm的LB培養皿上篩選轉化子，補加Ampf 和Gmr的LB液體培養基中培養(O/N)含所需構建物的克隆，抽提質粒，測序驗證野蠶 1型乙醯膽鹼酯酶基因cDNA片段已正確插入了載體。隨後用重組質粒轉化co// DH10Bac菌株(Invitrogen公司產品)，在含有Amp\ Gmf、四環素的LB培養皿上37 'C培養和篩選轉化子，在補加Ampf、 Gn/、四環素的LB液體培養基中培養含所需構建物 的克隆，抽提質粒，經Sepharose2B柱純化，回收質粒-7(TC保存。
質粒轉染Tn-5Bl-4細胞是採用脂轉染法。轉染48小時後，收集細胞及細胞上清，含 重組病毒粒子的細胞上清用於下一輪感染。感染重組病毒的細胞用無血清培養基SF express medium (GIBCO公司產品)培養。培養96-120小時後收集培養細胞無血清培養基； 40g的硫酸銨，飽和度為40%，劇烈振蕩後放置4i:保存。4'C以4000rpm離心20min， 棄上清；用25mMPBpH7.0 + 0.02。/。NaN3懸浮沉澱；4°C以4000 rpin離心20 min，收集 上清，酶比活力測定。同時用0.45um的膜對上清過濾。4'C以1 mL/min速度把樣品注射 入procainamide親和層析柱；用25 mM PB pH 7.0將未結合於親和層析柱上的蛋白質洗脫
8下來；再用procainamide把親和層析柱上的蛋白質洗脫下來，最後對樣品進行部份收集， 每管收集5mL;測定每管樣品酶的比活力。最後將具有較高酶活力的各管樣品集中在一 起，並測定酶比活力。然後以25MmPBS(PH7. O)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最 後凍幹保存。用10X的SDS-PAGE膠進行電泳，鑑定表達蛋白的分子量大小約為73kDa， 具體如圖1所示。
實施例2、野蠶1型乙醯膽鹼酯酶酶活的測定
純化蛋白的活力測定採用Ellman方法[Ellman GL， Courtney KD, Andres V， Featherstone RM., 1961 Biochem. Pharmacol., 7: 88-95]。
反應液含180 pi (0.1 M)磷酸緩 衝液(pH8.0)禾卩碘化硫代乙醯膽鹼(ATC， acetylthiocholine iodide, 1 mM), DTNB (5, 5-dithio-bis 2-nitrobenzoic acid, 0.1 mM)及20^1酶。反應液在25。C下放置5 min,用Tecaa Genios多功能酶標儀在405 nm光波下測定OD,計算AChE酶活。酶對ATC的i^為5.1士0.6 (拜ol'U1) ， Fmax為57.5士1.2 0unol/mgprotein/min)。表明純化的蛋白具有很高的底物專 一性和單位酶活力。而我們已經報導家蠶同一基因表達產物的酶活^ax僅為30.5 nmo
/mg.pro/min (Shangeta1,2007)，重組野蠶l型乙醯膽鹼酯酶是家蠶的AChEl的近2000倍。 實例3、農藥乙醯膽鹼酯酶抑制中濃度的測定
乙醯膽鹼酯酶活性的測定，參考ZhuKY和Clark JM (Pestic Biochem Physiol 1995, 51: 57-67)方法。總體積200nL反應體系中含有1(^L酶，10pL碘化硫代乙醯膽鹼和180pL磷 酸緩衝液(含有DTNB)，在酶標板加樣孔中依次加入酶液、不同濃度的碘化硫代乙醯膽鹼 溶液和顯色液，採用酶標儀進行測量，在405nm，每隔30'讀一次光密度，共記錄10個 值，重複三次。抑制中濃度的測定是將酶液與以不同濃度稀釋的殺蟲劑液混勻於酶標板加 樣孔中，25。C下放置5min，領!l定乙醯膽鹼酯酶的剩餘活力。計算方法為，以乙醯膽鹼酯 酶活力抑制率的機率值為縱座標，以殺蟲劑(對氧磷)濃度對數為橫座標，得一直線並計 算求得線性回歸方程，取機率值為5求得抑制酶50%活力時的殺蟲劑濃度對數，反對數即 得抑制中濃度(150)。測定結果為殘殺威、滅多威、克百威敵敵畏和對氧磷等殺蟲劑對純 化的重組乙醯膽鹼酯酶酶液的抑制中濃度分別為1.6 ±0.08、 0.15 ±0.01、 13.1 ±0.65、 0.3 ± 0.02和0.01 ± 0.001 (1(T4M)。
最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明 不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直 接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
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權利要求
1、一種野蠶1型乙醯膽鹼酯酶活性蛋白的製備方法，其特徵在於包括以下步驟1)、將編碼具有野蠶1型乙醯膽鹼酯酶並去除32個C端胺基酸殘基的基因的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成分泌非融合蛋白的野蠶1型乙醯膽鹼酯酶表達pFasBac系列載體；2)、將上述步驟所得的表達載體轉入宿主昆蟲細胞，形成野蠶1型乙醯膽鹼酯酶的重組細胞；3)、在適合分泌表達野蠶1型乙醯膽鹼酯酶多肽的條件下，培養上述步驟的重組細胞；4)、用procainamide親和層析柱分離出具有野蠶1型乙醯膽鹼酯酶蛋白活性的多肽。
2、 根據權利要求l所述的野蠶l型乙醯膽鹼酯酶活性蛋白的製備方法，其特徵在於，所述 步驟3)的培養條件為昆蟲細胞培養溫度為26-28'C，用無血清昆蟲細胞培養基培養。
3、 根據權利要求2所述的野蠶1型乙醯膽鹼酯酶活性蛋白的製備方法，其特徵在於，所述 步驟2)的宿主昆蟲細胞為粉紋夜蛾Tn-5B14宿主細胞。
4、 如權利要求l、 2或3所述方法製得的野蠶1型乙醯膽鹼酯酶活性蛋白的用途，用於農藥 的有效性篩選和檢測。
5、 根據權利要求4所述的野蠶1型乙醯膽鹼酯酶活性蛋白的用途，其特徵在於所述農藥 為有機磷或氨基甲酸酯類殺蟲劑。
全文摘要
本發明公開了一種野蠶1型乙醯膽鹼酯酶活性蛋白的製備方法，包括以下步驟1)將編碼具有野蠶1型乙醯膽鹼酯酶並去除32個C端胺基酸殘基的基因的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成分泌非融合蛋白的野蠶1型乙醯膽鹼酯酶表達pFasBac系列載體；2)將表達載體轉入宿主昆蟲細胞，形成野蠶1型乙醯膽鹼酯酶的重組細胞；3)在適合分泌表達野蠶1型乙醯膽鹼酯酶多肽的條件下，培養上述重組細胞；4)用procainamide親和層析柱分離出具有野蠶1型乙醯膽鹼酯酶蛋白活性的多肽。該野蠶1型乙醯膽鹼酯酶活性蛋白可用於農藥的有效性篩選和檢測。
文檔編號C12N15/55GK101487014SQ20091009534
公開日2009年7月22日 申請日期2009年1月8日 優先權日2009年1月8日
發明者張傳溪, 郎國竣 申請人:浙江大學