一種發酵生產天然β－胡蘿蔔素的方法
2024-03-26 23:38:05
專利名稱：一種發酵生產天然β－胡蘿蔔素的方法
技術領域：
本發明涉及一種β-胡蘿蔔素的生產方法，更確切地說是涉及一種採用微生物菌種發酵生產天然β-胡蘿蔔素的方法。
在現有技術中，中國專利CN1193048A(申請號98111199.8，申請日1998年3月23日)公開了一種發酵生產β-胡蘿蔔素的方法，該方法採用將孢子接種在氣升式發酵罐中培養絲狀真菌發酵製備β-胡蘿蔔素，包括一級種子培養、二級種子培養及發酵等工序，其特點是將代謝產生β-胡蘿蔔素的微生物菌種在一定條件下培養形成大量孢子，用氣升式發酵罐作為培養種子和發酵的生物反應器，發酵培養產生β-胡蘿蔔素。但是產生β-胡蘿蔔素的菌種分正負兩種菌株，上述方法在種子培養過程中是分別在兩個反應器中先進行正、負菌株的一級種子培養和二級種子培養，然後將分別培養的正、負菌株的種子液在發酵工序中接入氣升式生物反應器中混合培養，最終發酵產生β-胡蘿蔔素。所以，上述方法在種子培養過程中就需用兩隻氣升式發酵罐分別培養正、負三孢布拉黴菌株，增加了設備投資，生產操作步驟也較繁複。
日本《食品と科學》1994年別冊報導了一種β-胡蘿蔔素的發酵方法，該方法正、負菌株先在27℃下斜面培養7天，正、負菌株再分別在2升三角燒瓶中26℃下搖床培養48小時，然後再將正、負菌株接入170升發酵罐中混合種子培養40小時，最終在800升發酵罐中發酵培養185小時，產生β-胡蘿蔔素。
另一方面，國內外目前通用的攪拌式發酵罐及種子罐的攪拌槳葉都是渦輪式槳葉，存在剪切力大而混合性能差的特點，易將絲狀真菌的菌絲打斷，造成菌絲體損傷，生物量減少，使發酵β-胡蘿蔔素的產量降低。另外，現有發酵罐中的上下層攪拌都為渦輪式槳葉，攪拌時缺少軸向混合，造成發酵液的混合不均勻，影響發酵水平。而中國專利CN1193048A採用的氣升式發酵罐。由於考慮空壓機送出壓縮空氣壓力可適當降低而減少空壓機電耗，而攪拌槳葉採用混合性能好而能耗低的寬葉推進式，故採用上、中層為寬葉推進式攪拌槳葉，下層為渦輪式攪拌槳葉的組合式攪拌槳葉的攪拌式發酵罐。
本發明的目的是將種子培養對正、負菌株分別在兩隻種子罐的分別培養，變為正、負菌株接入一隻種子罐中進行混合培養，這樣可以減少一半種子罐的數量，即簡化了種子製備工藝，減少了雜菌汙染的機會，又降低了設備投資。
本發明的另一個目的是將種子罐和發酵罐的攪拌槳葉改進為上、中層槳葉為寬葉推動式槳葉，下層槳葉為渦輪式槳葉的組合式槳葉，這樣降低了攪拌槳葉對菌絲體的剪切傷害，增加了氣液接觸。
本發明是這樣實現的。本發明的發酵生產天然β-胡蘿蔔素的方法，其生產步驟包括斜面培養、種子培養、發酵等工序，所述的種子培養是將正、負兩種菌株接入同一隻種子罐中進行混合培養。
本發明所述的方法，所述的種子培養包括一級種子培養或一級種子培養和二級種子培養或一級種子培養、二級種子培養和三級種子培養。
本發明所述的方法，在種子培養工序中，進行種子培養時接入的正菌株與負菌株的比例是1∶1～1∶200，較好的比例是1∶1～1∶20。
能夠生產天然β-胡蘿蔔素的微生物有多種，其中以三孢布拉黴菌(Blakeslea trispora)的性能最優，是國際上公認的實現工業化生產β-胡蘿蔔素的好菌種。三孢布拉黴菌屬於真菌界真菌門(Fungi)，接合菌亞門，毛黴目(Order Mucorales)，笄黴科(Family Choanephoraceae)，布氏笄黴屬(Genus Blakeslea)，三孢布氏笄黴(B.trispora Thaxter)。三孢布拉黴生長迅速，能產生發達的長菌絲，菌絲白色，為長管單細胞，沒有隔膜，細胞質內含多個細胞核，不產生假根，是單細胞低等真菌。生長過程表現為菌絲的延長和細胞核的裂殖增多及細胞質的增加。三孢布拉黴既能無性繁殖，也能有性繁殖。無性繁殖形成孢子囊和孢囊孢子；有性繁殖屬異宗配合，由來源不同的「+」、「-」菌的菌絲體相互接觸時，發生原生質和細胞核的結合，形成接合孢子，最後減數分裂形成單倍的營養體。
本發明所述的方法，發酵生產β-胡蘿蔔素的菌株即為三孢布拉黴菌(Blakeslea trispora)，分正、負兩種菌株，保藏於上海化工研究院菌種保藏處，菌號為f5H，(正菌株)和f6R(負菌株)。
本發明所述的方法，所述的種子培養的培養基的組成為粕餅粉5～15％(重量)，玉米粉3～8％(重量)，維生素B13～10ppm，培養基pH6.5～7.5，種子培養溫度26～28℃，培養時間16～24小時。
本發明所述的方法，所述的發酵工序的培養基組成為澱粉5～8％(重量)，粕餅粉1.2～2.8％(重量)，植物油5.1～7.0％(重量)，磷酸二氫鉀0.04～0.09％(重量)，硫酸錳0.01～0.06％(重量)，維生素B13～10ppm，非離子表面活性劑烷基酚聚氧乙烯醚0.05～0.20％(重量)。培養溫度26～28℃，培養時間120～168小時。
本發明所述的方法，所述的種子培養或發酵工序中使用的種子罐或發酵罐的攪拌槳葉是上、中層為寬葉推進式攪拌槳葉，下層為渦輪式攪拌槳葉的組合式攪拌槳葉。
目前，國內外通用的攪拌槳葉型式一般上、下層槳葉均採用渦輪式攪拌槳葉，但渦輪式攪拌槳葉的剪切力大，易將絲狀真菌的菌絲體切斷，而三孢布拉黴菌絲在發酵長大過程中要儘量減少對菌絲體的剪切；另一方面，上、下層都是渦輪式攪拌槳葉，使發酵罐中的發酵液缺少軸向混合。因此，本發明的種子罐或發酵罐的攪拌槳葉均採用上、中層為寬葉推進式攪拌槳葉，下層為渦輪式攪拌槳葉的混合式攪拌槳葉，既可避免攪拌槳葉對菌絲體的過度剪切，又可防止發酵罐中發酵液上、下層短路，增加了氣液接觸時間，從而提高了種子罐或發酵罐的傳質性能和氣液接觸效率，使發酵液混合得更為均勻。
本發明的發酵生產天然β-胡蘿蔔素的方法與現有技術相比具有以下優點一、本發明的天然β-胡蘿蔔素的生產方法，在種子培養工序採用將正、負菌株在一隻種子罐中混合培養的方式，種子罐罐數可減少一半，簡化了操作工藝，降低了設備投資和操作費用及生產成本，而且減少了因設備多而造成染菌機會增加的缺點，發酵水平可達2.0克/升以上。二、本發明的種子罐或發酵罐的攪拌槳葉採用上、中層為寬葉推進式攪拌槳葉，下層為渦輪式攪拌槳葉的混合式攪拌槳葉，克服了現有發酵罐中攪拌槳葉對菌絲體的過度剪切，影響菌絲體生長，使發酵β-胡蘿蔔素產量降低的缺陷，而且本發明的混合式攪拌槳葉提高了發酵液的傳質性能和氣液接觸效率。
下面將通過本發明的具體實施例來進一步詳細闡述本發明，但實施例不是對本發明的限制。
實施例1(1)斜面培養斜面培養基的組成及配製方法如下去皮土豆20g，加水100mL，煮沸20分鐘，過濾，濾液補足100mL，加葡萄糖1.5g，蛋白腖1g，瓊脂2g，維生素B15ppm，pH自然，115℃滅菌20分鐘。
將保藏於上海化工研究院菌種保藏處，菌號為f5H(正菌株)、f6R(負菌株)的三孢布拉黴菌(Blakeslea trispora)正、負菌株砂土管菌種分別接種於斜面培養基上，在27℃條件下培養3天，即可接入種子液。
(2)一級種子培養種子培養基的組成為粕餅粉10％(重量)，玉米粉5.5％(重量)，維生素B15ppm，調節pH6.5～7.5，121℃滅菌30分鐘。
將斜面培養的三孢布拉黴菌(Blakeslea trispora)正菌株或負菌株的菌絲或孢子洗脫液按「+」、「-」菌株比例1∶10接入已加入種子培養基的三角瓶中，在搖床上培養，培養溫度為26～28℃，搖床轉速230rpm，培養時間24小時。
(3)二級種子培養培養基組成同一級種子培養。將一級種子液接入二級種子罐，種子罐的容積為100L，二級種子培養在27℃下培養24小時，種子罐攪拌轉速250rpm，通風量1V/V·m。
(4)發酵發酵培養基組成為澱粉6.0％(重量)，粕餅粉1.4％(重量)，植物油6％(重量)，磷酸二氫鉀0.06％(重量)，曲拉通(Triton)0.12％(重量)，維生素B13ppm，硫酸錳0.03％(重量)。
將二級種子液接入發酵罐，發酵罐的容積為1m3，在溫度約27℃，發酵罐攪拌轉速為200rpm，通風量為1V/V·m下，經過120小時的發酵培養，β-胡蘿蔔素的發酵水平為1.877g/L。
種子罐或發酵罐的攪拌槳葉採用上、中層為寬葉推進式攪拌槳葉，下層為渦輪式攪拌槳葉的混合式攪拌槳。
實施例2(1)斜面培養同實施例1。
(2)一級種子培養除種子培養基的組成為粕餅粉5％(重量)，玉米粉3％(重量)，維生素B13ppm，接入「+」、「-」菌株比例是1∶20，培養時間16小時外，其它同實施例1。
(3)二級種子培養除培養基組成和培養時間同一級種子培養外，其它同實施例1。
(4)發酵
發酵培養基組成為澱粉5％(重量)，粕餅粉1.2％(重量)，植物油5.1％(重量)，磷酸二氫鉀0.04％(重量)，曲拉通(Triton)0.05％(重量)，維生素B15ppm，硫酸錳0.01％(重量)。
將二級種子培養液接入發酵罐，在溫度約27℃，發酵罐攪拌轉速為200rpm，通風量為1V/V·m下，經過144小時的發酵培養，β-胡蘿蔔素的發酵水平為1.92g/L。
實施例3(1)斜面培養同實施例1。
(2)一級種子培養除種子培養基的組成為粕餅粉15％(重量)，玉米粉8％(重量)，維生素B110ppm，接入「+」、「-」菌株比例是1∶1，培養時間20小時外，其它同實施例1。
(3)二級種子培養除培養基組成和培養時間同一級種子培養外，其它同實施例1。
(4)發酵發酵培養基組成為澱粉8％(重量)，粕餅粉2.8％(重量)，植物油7.0％(重量)，磷酸二氫鉀0.09％(重量)，曲拉通(Triton)0.20％(重量)，維生素B110ppm，硫酸錳0.06％(重量)。
將二級種子培養液接入發酵罐，在溫度約26～28℃，發酵罐攪拌轉速為200rpm，通風量為1V/V·m下，經過168小時的發酵培養，β-胡蘿蔔素的發酵水平為2.01g/L。
實施例4(1)斜面培養同實施例1。
(2)一級種子培養除種子培養基的組成為粕餅粉8％(重量)，玉米粉3％(重量)，維生素B15ppm，接入「+」、「-」菌株比例是1∶100外，其它同實施例1。
(3)發酵發酵培養基組成為澱粉4％(重量)，粕餅粉1.8％(重量)，植物油6.0％(重量)，磷酸二氫鉀0.06％(重量)，曲拉通(Triton)0.15％(重量)，維生素B15ppm，硫酸錳0.03％(重量)。
將一級種子培養液接入250mL三角瓶，內裝發酵液50mL，在搖床上培養，搖床轉速230rpm培養溫度約26～28℃，經過168小時的發酵培養，β-胡蘿蔔素的發酵水平為2.350g/L。
實施例5(1)斜面培養同實施例1。
(2)一級種子培養除種子培養基的組成為粕餅粉5％(重量)，玉米粉3％(重量)，維生素B15ppm，接入「+」、「-」菌株比例是1∶200外，其它同實施例1。
(3)發酵發酵培養基組成為澱粉10％(重量)，粕餅粉2.2％(重量)，植物油6.5％(重量)，磷酸二氫鉀0.06％(重量)，曲拉通(Triton)0.10％(重量)，維生素B15ppm，硫酸錳0.03％(重量)。
將一級種子培養液接入5L發酵罐中，內裝發酵液2.5L，在溫度約26～28℃，攪拌轉速300～600rpm，通風量1V/V·m下，經過120小時的發酵培養，β-胡蘿蔔素的發酵水平為2.184g/L。
權利要求
1.一種發酵生產天然β-胡蘿蔔素的方法，生產步驟包括斜面培養、種子培養、發酵工序，其特徵在於所述的種子培養是將正、負兩種菌株接入同一隻種子罐中進行混合培養。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的種子培養包括一級種子培養或一級種子培養和二級種子培養或一級種子培養、二級種子培養和三級種子培養。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的種子培養工序中，接入的正、負菌株的比例是1∶1～1∶200。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述的種子培養工序中，接入的正、負菌株的比例是1∶1～1∶20。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於產生β-胡蘿蔔素的菌株是一種絲狀真菌三孢布拉黴菌(Blakeslea trispora)，分正、負兩種菌株，保藏於上海化工研究院菌種保藏處，菌號為f5H，(正菌株)，f6R(負菌株)。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的種子培養基的組成為粕餅粉5～15％(重量)，玉米粉3～8％(重量)，維生素B13～10ppm，培養基pH6.5～7.5，種子培養溫度26～28℃，培養時間16～24小時。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的發酵工序的培養基組成為澱粉4～10％(重量)，粕餅粉1.2～2.8％(重量)，植物油5.1～7.0％(重量)，磷酸二氫鉀0.04～0.09％(重量)，非離子表面活性劑烷基酚聚氧乙烯醚0.05～0.20％(重量)，維生素B13～10ppm，硫酸錳0.01～0.06％(重量)，培養溫度26～28℃，培養時間120～168小時。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的種子培養或發酵工序中使用的種子罐或發酵罐的攪拌槳葉是上、中層為寬葉推進式攪拌槳葉，下層為渦輪式攪拌槳葉的組合式攪拌槳葉。
全文摘要
一種發酵生產天然β－胡蘿蔔素的方法,該方法包括斜面培養、種子培養及發酵工序,其特點是將絲狀真菌的正、負菌株接入同一隻種子罐中進行混合種子培養,另外種子罐和發酵罐的攪拌槳葉採用上、中層為寬葉推進式,下層為渦輪式的組合式攪拌槳葉。本發明簡化了操作工藝,降低了設備投資和生產成本,減少了染菌機率,對攪拌槳葉的改進,提高了發酵液的傳質性能和氣液接觸效率,更適合菌絲體的生長,發酵水平可達2.0克/升以上。
文檔編號C12P23/00GK1331343SQ00116698
公開日2002年1月16日 申請日期2000年6月22日 優先權日2000年6月22日
發明者童海寶, 蔡揚, 徐靜安, 任徵, 楊曄, 費利江, 何炳林, 馬強 申請人:上海化工研究院