愛格氏菌AUH‑JLD49s及其在3′‑去甲基‑牛蒡苷元轉化中的應用的製作方法
2024-03-28 21:22:05 1
本發明涉及細菌技術領域。
背景技術：
牛蒡（Arctium lappa L.）為菊科二年生根莖類藥食兩用植物，其根和莖葉可作為蔬菜食用，根、果實和種子還可入藥。牛蒡子為牛蒡的乾燥成熟果實，具有抗炎、抗癌、抗HIV、抗糖尿病等多種藥理作用。其中牛蒡苷（Arctiin）是中藥牛蒡子的主要活性成分（吉林師範大學學報, 2011, 11(4): 64-65）。牛蒡苷元（Arctigenin，簡稱AG）為牛蒡苷脫去葡萄糖的游離苷元形式。研究表明，牛蒡苷經酸水解可高效生成牛蒡苷元（中國現代中藥, 2012, 14(6): 43-45）。
牛蒡被人或其他動物攝入體內後，牛蒡中的主要活性成分牛蒡苷將被寄居在腸道的微生物菌群轉化為不同產物。根據日本學者Mitsuhiko Nose等1992年報導，小鼠腸道菌群可將底物牛蒡苷元轉化為3′-去甲基-牛蒡苷元（Planta Medicine, 1992, 58(6):520-523）；2003年，Masao Hattori研究小組將牛蒡苷與人糞便共培養，檢測到6種牛蒡苷的代謝產物，其中的代謝產物4即為本發明中的產物3′-去甲基-4′-去羥基-牛蒡苷元。然而，由於Masao Hattori等採用的是人糞便中的微生物菌群轉化，代謝產物4僅在某一特定時間內才能檢測到（即共培養25-125小時），代謝產物4的濃度在共培養約75小時左右達到最高值後又迅速下降。眾所周知，與單一菌株相比，利用糞樣菌群進行轉化時結果不穩定，轉化效果重現性差；另外，Masao Hattori等利用人糞樣菌群轉化牛蒡苷時，代謝產物種類多，代謝產物4等中間代謝產物僅能在某一特定時間段才能檢測到，很難對包括代謝產物4在內的中間代謝產物進行有效製備（Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2003, 51(4): 378-384）；2007年，Masao Hattori研究小組從人新鮮糞樣中分離得到一株真細菌屬菌株Eubacteriumsp. ARC-2，菌株ARC-2可將底物牛蒡苷元轉化為7種不同的去甲基產物（Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2007, 30(5):904-911）；2013年，本實驗室分離得到一株布勞特菌屬菌株Blautia sp. AUH-JLD56，該菌株能將底物牛蒡苷元高效轉化為3′-去甲基-牛蒡苷元一種產物（Journal Agricultural Food Chemistry, 2013, 61(49):12060-12065）。菌株AUH-JLD56及其轉化製備3′-去甲基-牛蒡苷元的方法於2013年申報國家發明專利，並於2015年被授權（ZL 201310368975.5）。本發明是以已授權發明專利的產物3′-去甲基-牛蒡苷元（ZL 201310368975.5）為底物，從人新鮮糞樣中分離得到一株能將3′-去甲基-牛蒡苷元特定轉化為3′-去甲基-4′-去羥基-牛蒡苷元（3′-DM-4′-DH-AG）的細菌菌株，並以該細菌菌株為生物酶源，通過微生物轉化法得到產物3′-去甲基-4′-去羥基-牛蒡苷元。
為尋找具有抗病毒活性的天然產物結構類似物，1996年德國學者Eich等以芳基二噻烷為起始物，利用化學方法合成一系列木脂素類化合物的結構類似物，其中包括本發明中的產物 3′-DM-4′-DH-AG。但化合物3′-DM-4′-DH-AG得率僅僅50%左右（Journal of Medicinal Chemistry, 1996, 39, 86-95）。上述化學合成中用到的催化劑雷尼鎳為致癌物，三苯基膦和丁基鋰為具有刺激性的危險性催化劑，迄今，國內外尚無任何公司利用化學方法生產或銷售3′-DM-4′-DH-AG。由於化合物3′-DM-4′-DH-AG資源匱乏，有關化合物3′-DM-4′-DH-AG生理活性方面報導極少。目前僅一篇文獻報導，當3′-DM-4′-DH-AG濃度為10-8摩爾/升（即10-2 微摩爾/升）時，產物3′-DM-4′-DH-AG能顯著促進人乳腺癌細胞株MCF-7的生長，而當濃度增大為10-7-10-5摩爾/升時，產物3′-DM-4′-DH-AG則對細胞株MCF-7的生長無明顯影響（Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2003, 51(4):378-384）。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是提供一種愛格氏菌（Eggerthella sp.）AUH-JLD49s及其在3′-去甲基-牛蒡苷元轉化中的應用，此菌株能將中藥牛蒡子中牛蒡苷元的一種轉化產物3′-去甲基-牛蒡苷元（3′-DMAG）轉化為3′-去甲基-4′-去羥基-牛蒡苷元（3′-DM-4′-DH-AG），解決了牛蒡苷元轉化產物3′-DM-4′-DH-AG資源缺乏的問題，對3′-DM-4′-DH-AG藥理活性及新藥研發具有極大的推動作用。
為解決上述技術問題，本發明所採取的技術方案是：
一種愛格氏菌AUH-JLD49s（Eggerthella sp.），保藏號為CGMCC No.13124。
愛格氏菌AUH-JLD49s（KX650621）是從人糞樣中分離得到的一株革蘭氏陰性嚴格厭氧細菌菌株，該菌株在厭氧工作站內能將3′-去甲基-牛蒡苷元（3′-DMAG）轉化為3′-去甲基-4′-去羥基-牛蒡苷元（3′-DM-4′-DH-AG）。有關3′-DM-4′-DH-AG微生物生物合成途徑如下所示：
本發明中的愛格氏菌Eggerthella sp.AUH-JLD49s菌株（簡稱AUH-JLD49s）已於2016年10月19日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC）保藏，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏號為CGMCC No.13124。
愛格氏菌Eggerthella sp.AUH-JLD49s菌的分類學特徵為：
菌落直徑1.0～2.0毫米，菌落邊緣整齊，中部有凸起，隨培養時間延長菌落黃色加深；在BHI培養基中菌體為杆狀，革蘭氏染色呈陰性。
本發明還提供了菌株AUH-JLD49s在3′-去甲基-牛蒡苷元轉化中的應用，包括下述步驟：
（1）菌株AUH-JLD49s的培養；
（2）底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品與菌株AUH-JLD49s共培養，將底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品轉化為3′-去甲基-4′-去羥基-牛蒡苷元；
（3）轉化產物的分離純化。
其中，菌株AUH-JLD49s的培養方法為：將低溫冷凍保存的菌株AUH-JLD49s融化並按15-20%體積比的接種量接種到盛有新鮮BHI液體培養基的試管中，在厭氧工作站內37℃下培養18-24小時；再以10-15%體積比的接種量將試管中的菌株AUH-JLD49s重新轉接到盛有新鮮BHI液體培養基中，繼續在厭氧工作站內培養18-24小時作為種子液。
底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品與菌株AUH-JLD49s共培養方法為：
將菌株AUH-JLD49s的種子液按10-15%體積比的接種量轉接到BHI液體培養基中培養，然後加入3′-去甲基-牛蒡苷元粗品，使得3′-去甲基-牛蒡苷元在培養基中的濃度不超過1.0毫摩爾/升，在厭氧工作站內培養2-3天，即可將底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品高效轉化為3′-去甲基-4′-去羥基-牛蒡苷元（3′-DM-4′-DH-AG）。
3′-去甲基-牛蒡苷元與3′-去甲基-牛蒡苷元粗品的質量百分比不低於90%。
直接發酵的底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品中3′-去甲基-牛蒡苷元的濃度為100-200毫摩爾/升。
轉化產物的分離純化採用下述方法：
用等體積的乙酸乙酯將步驟（2）中得到的培養物萃取2次，萃取液過濾後蒸乾，加入100%甲醇溶液，用製備柱在HPLC上進行分離製備3′-去甲基-4′-去羥基-牛蒡苷元（3′-DM-4′-DH-AG）。
其中，菌株AUH-JLD49s的分離培養包括下述步驟：
（1）人糞樣的採集與培養
用已滅菌的棉籤挑取新鮮糞便，放入1毫升新鮮BHI液體培養基中，置厭氧工作站內在37℃溫度下培養24小時，作為篩選特定功能微生物菌株的微生物菌群；
（2）分離培養AUH-JLD49s
①單菌落分離培養
用新鮮BHI液體培養基將事先在厭氧工作站內培養24小時的微生物菌群進行梯度稀釋，分別稀釋到濃度為10–1，10–2、10–3、10–4、10–5、10–6、10–7、10–8，再分別將100微升濃度分別為10–5、10–6、10–7、10–8的微生物菌群稀釋液均勻塗在預先備好的BHI固體培養基上，將塗有微生物菌群稀釋液的BHI固體培養基置於厭氧工作站內培養48小時後，分別從BHI固體培養基上挑取數十至數百個單菌落置BHI固體培養皿上，並對所挑取的單菌落進行隨機編號。
②單菌落轉化活性測定
將已編號的單菌落分別接種到盛有1毫升BHI液體培養基的試管內，加入0.1毫摩爾/升3′-去甲基-牛蒡苷元粗品，在厭氧工作站內培養2天，取100微升培養液並用1000微升乙酸乙酯進行萃取，萃取液蒸乾後加入100%甲醇，用HPLC進行檢測，最終確定出具有轉化底物3′-去甲基-牛蒡苷元功能的單菌落。
底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品的製備：
3′-去甲基-牛蒡苷元的製備同本實驗室獲得的已授權發明專利「布勞特菌AUH-JLD56及其在牛蒡苷元轉化中的應用」（ZL 201310368975.5）。與上述已授權國家發明專利不同的是，本發明中所用底物3′-去甲基-牛蒡苷元為已授權發明專利（ZL 201310368975.5）中未經過純化的3′-去甲基-牛蒡苷元粗品（即步驟（2）中得到的培養物）。因此，可省去發明專利（ZL 201310368975.5）中的代謝產物的分離純化步驟，節約時間和成本。
3′-去甲基-牛蒡苷元與3′-去甲基-牛蒡苷元粗品的質量百分比不低於90%。
本發明對得到的產物3′-DM-4′-DH-AG進行純化，並首次對其體外抗癌活性進行研究。結果表明，濃度為50-200微摩爾/升的產物3′-DM-4′-DH-AG對人結腸癌細胞株HCT116和人乳腺癌細胞株MDA-MB-231的生長均具有明顯的抑制作用，其中濃度為100微摩爾/升3′-DM-4′-DH-AG對HCT116和231的體外抑制率分別為41.67%和21.33%。隨著對產物3′-DM-4′-DH-AG生理功能研究的不斷深入，今後極有可能將3′-DM-4′-DH-AG開發為新型抗癌藥物。
採用上述技術方案所產生的有益效果在於：
本發明提供的菌株AUH-JLD49s能將中藥牛蒡子中牛蒡苷元的一種轉化產物3′-去甲基-牛蒡苷元轉化為3′-去甲基-4′-去羥基-牛蒡苷元，解決了牛蒡苷元轉化產物3′-去甲基-4′-去羥基-牛蒡苷元資源缺乏的問題，對牛蒡苷元藥理活性物質微生物代謝產物的研究及新藥研發具有極大的推動作用。
附圖說明
下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明；
圖1為本發明實施例1中菌株AUH-JLD49s轉化底物3′-去甲基-牛蒡苷元的高效液相色譜圖；
圖2為3′-去甲基-牛蒡苷元轉化產物的紫外吸收圖譜；
圖3為3′-去甲基-牛蒡苷元轉化產物的質譜圖；
圖4為厭氧菌株AUH-JLD49s對底物3′-去甲基-牛蒡苷元的轉化動態曲線圖；
圖5為厭氧菌株AUH-JLD49s對不同濃度底物3′-去甲基-牛蒡苷元轉化能力比較圖；
圖6為產物3′-去甲基-4′-去羥基-牛蒡苷元對人結腸癌細胞株HCT116和人乳腺癌細胞株MDA-MB-231的抑制率圖。
具體實施方式
實施例1
1.菌株AUH-JLD49s的分離培養
（1）人糞樣的採集與培養
用已滅菌的棉籤挑取人新鮮糞便，放入1毫升新鮮BHI液體培養基中，置厭氧工作站內在37℃溫度下培養24小時，作為篩選特定功能微生物菌株的微生物菌群。
（2）分離培養菌株AUH-JLD49s
①單菌落分離培養
用新鮮BHI液體培養基將事先在厭氧工作站內培養24小時的微生物菌群進行梯度稀釋，分別稀釋到濃度為10–1，10–2、10–3、10–4、10–5、10–6、10–7、10–8，再分別將100微升濃度分別為10–5、10–6、10–7、10–8的微生物菌群稀釋液均勻塗在預先備好的BHI固體培養基上，將塗有微生物菌群稀釋液的BHI固體培養基置於厭氧工作站內培養48小時後，分別從BHI固體培養基上挑取數十至數百個單菌落置BHI固體培養皿上，並對所挑取的單菌落進行隨機編號。
②單菌落轉化活性測定
將已編號的、培養在BHI固體培養基上的單菌落接種到盛有1毫升BHI液體培養基的試管內，再分別加入3′-去甲基-牛蒡苷元終濃度為0.1毫摩爾/升，在厭氧工作站內培養2天，取100微升培養液並用1000微升乙酸乙酯進行萃取，萃取液蒸乾後加入100%甲醇，用HPLC檢測有無產物生成。一旦某試管中培養物被檢測出有產物生成，便對菌株進行純化培養和菌種保藏，同時對產物進行純化和結構鑑定。
2.菌株AUH-JLD49s的純化培養、菌種鑑定與保藏
（1）單菌落的純化培養
將篩選出的單一功能微生物菌落在BHI固體培養基上劃線培養，長出單菌落後，再對長出的單菌落進行劃線，重複至少3次以上，確保長出的單菌落形態一致。將純化後的單菌落接種到1毫升BHI液體培養基中，培養24小時取菌液100微升，加入到盛有500微升事先已滅菌的脫脂奶粉的凍存管中，混勻後在其表面加2毫米厚事先已滅菌的液體石蠟，再將其保藏在-80℃的超低溫冰箱中，對低溫保藏的功能微生物菌株定期進行復壯培養和轉化活性測定。
（2）對分離出的特定功能微生物菌株進行菌種鑑定
以單一功能微生物菌株菌體總DNA為模板，以通用引物27F/1492R（27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）為引物對16S rDNA序列進行PCR擴增，PCR擴增產物送交上海生工生物工程有限公司進行DNA測序，測序結果經BLAST比對與GenBank資料庫其他菌株進行相似性分析，該單一功能微生物菌株的16S rDNA序列與緩慢愛格氏菌Eggerthella lenta的相似性高達99.8%，因此，將該轉化菌株初步確定為愛格氏菌屬菌株。將該功能微生物菌株命名為AUH-JLD49s，並將其16S rDNA序列上交NCBI基因庫，得到該菌株註冊號（Accession Number）KX650621。
3.菌株AUH-JLD49s在3′-去甲基-牛蒡苷元轉化中的應用
（1）菌株AUH-JLD49s的培養
將–80℃低溫保存的人腸道分離菌株AUH-JLD49s凍融後，按20%體積比的接種量接種到盛有新鮮BHI液體培養基的試管中，在厭氧工作站內37℃下培養18小時後試管中菌液呈均勻混濁。再以10%體積比的接種量將試管中已長混濁的菌株AUH-JLD49s重新轉接到盛有新鮮BHI液體培養基的玻璃試管中，繼續在厭氧工作站內培養24小時作為種子液。
（2）底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品與菌株AUH-JLD49s共培養
在厭氧工作站內將上述事先培養好的菌株AUH-JLD49s的種子液按10%體積比的接種量轉接到盛有液體培養基的三角瓶內培養，同時加入3′-去甲基-牛蒡苷元的濃度為150毫摩爾/升的3′-去甲基-牛蒡苷元粗品，使得培養基中3′-去甲基-牛蒡苷元濃度為1.0毫摩爾/升，在厭氧工作站內培養3天，菌株AUH-JLD49s可將底物3′-DMAG轉化為3′-DM-4′-DH-AG。
（3）用HPLC檢測底物3′-去甲基-牛蒡苷元被菌株AUH-JLD49s的轉化情況
從上述三角瓶中取出培養物100微升至1.5毫升EP管中，加1000微升乙酸乙酯進行萃取，靜置離心後取出上層乙酸乙酯800微升，在離心濃縮儀中蒸乾後加入800微升100%甲醇溶液，經HPLC檢測底物轉化情況（見附圖1）。
（4）轉化產物的分離純化
經HPLC檢測如果底物轉化良好，用等體積的乙酸乙酯將三角瓶內培養物萃取2次，萃取液過濾後在旋轉蒸發儀上蒸乾，然後加入100%甲醇溶液，過孔徑為0.45微米的有機膜後用製備柱在HPLC上進行分離製備，用乾淨三角瓶收集代謝產物3′-DM-4′-DH-AG。
實施例2
菌株AUH-JLD49s的分離培養方法同實施例1，菌株AUH-JLD49s在3′-去甲基-牛蒡苷元轉化中的應用包括下述步驟：
（1）菌株AUH-JLD49s的培養
將–80℃低溫保存的人腸道分離菌株AUH-JLD49s凍融後，按15%體積比的接種量接種到盛有新鮮BHI液體培養基的試管中，在厭氧工作站內37℃下培養20小時後試管中菌液呈均勻混濁。再以15%體積比的接種量將試管中已長混濁的菌株AUH-JLD49s重新轉接到盛有新鮮BHI液體培養基的玻璃試管中，繼續在厭氧工作站內培養18小時作為種子液。
（2）底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品與菌株AUH-JLD49s共培養
在厭氧工作站內將上述事先培養好的菌株AUH-JLD49s的種子液按15%體積比的接種量轉接到盛有液體培養基的三角瓶內培養，同時加入3′-去甲基-牛蒡苷元的濃度為100毫摩爾/升的3′-去甲基-牛蒡苷元粗品，使得培養基中底物濃度為0.8毫摩爾/升，在厭氧工作站內培養2.5天，菌株AUH-JLD49s可將底物3′-DMAG轉化為3′-DM-4′-DH-AG。
（3）HPLC檢測底物3′-去甲基-牛蒡苷元被菌株AUH-JLD49s的轉化情況
從上述三角瓶中取出培養物100微升至1.5毫升EP管中，加1000微升乙酸乙酯進行萃取，靜置離心後取出上層乙酸乙酯800微升，在離心濃縮儀中蒸乾後加入800微升100%甲醇溶液，經HPLC檢測底物轉化情況。
（4）轉化產物的分離純化
經HPLC檢測如果底物轉化良好，用等體積的乙酸乙酯將三角瓶內培養物萃取2次，萃取液過濾後在旋轉蒸發儀上蒸乾，然後加入100%甲醇溶液，過孔徑為0.45微米的有機膜後用製備柱在HPLC上進行分離製備，用乾淨三角瓶收集代謝產物3′-DM-4′-DH-AG。
實施例3
菌株AUH-JLD49s的分離培養方法同實施例1，菌株AUH-JLD49s在3′-去甲基-牛蒡苷元轉化中的應用包括下述步驟：
（1）菌株AUH-JLD49s的培養
將–80℃低溫保存的人腸道分離菌株AUH-JLD49s凍融後，按18%體積比的接種量接種到盛有新鮮BHI液體培養基的試管中，在厭氧工作站內37℃下培養24小時後試管中菌液呈均勻混濁。再以13%體積比的接種量將試管中已長混濁的菌株AUH-JLD49s重新轉接到盛有新鮮BHI液體培養基的玻璃試管中，繼續在厭氧工作站內培養20小時作為種子液。
（2）底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品與菌株AUH-JLD49s共培養
在厭氧工作站內將上述事先培養好的菌株AUH-JLD49s的種子液按12%體積比的接種量轉接到盛有液體培養基的三角瓶內培養，同時加入3′-去甲基-牛蒡苷元的濃度為200毫摩爾/升的3′-去甲基-牛蒡苷元粗品，使得培養基中底物濃度為0.6毫摩爾/升，在厭氧工作站內培養2天，菌株AUH-JLD49s可將底物3′-DMAG轉化為3′-DM-4′-DH-AG。
（3）用HPLC檢測底物3′-去甲基-牛蒡苷元被菌株AUH-JLD49s的轉化情況
從上述三角瓶中取出培養物100微升至1.5毫升EP管中，加1000微升乙酸乙酯進行萃取，靜置離心後取出上層乙酸乙酯800微升，在離心濃縮儀中蒸乾後加入800微升100%甲醇溶液，經HPLC檢測底物轉化情況。
（4）轉化產物的分離純化
經HPLC檢測如果底物轉化良好，用等體積的乙酸乙酯將三角瓶內培養物萃取2次，萃取液過濾後在旋轉蒸發儀上蒸乾，然後加入100%甲醇溶液，過孔徑為0.45微米的有機膜後用製備柱在HPLC上進行分離製備，用乾淨三角瓶收集代謝產物3′-DM-4′-DH-AG。
對製備的代謝產物3′-DM-4′-DH-AG進行結構鑑定，鑑定方法及鑑定結果如下：
將收集的轉化產物峰蒸乾後，在分析型高效液相色譜儀上測定其純度，再分別測定代謝產物的紫外吸收譜、質譜、核磁共振氫譜和碳譜。結果表明，該轉化產物分別在228納米和278納米處有最大紫外吸收（見附圖2），質譜測定結果表明，該代謝產物分子量為342（見附圖3），這恰好與3′-DM-4′-DH-AG分子式C20H22O5相吻合。根據產物的紫外吸收圖譜和分子量可將其初步鑑定為3′-DM-4′-DH-AG。為進一步準確解析該代謝產物的化學結構，我們分別測定了純化後代謝產物的核磁共振氫譜（1H-NMR）和碳譜（13C-NMR）。通過譜圖解析，並與文獻報導中的3′-DM-4′-DH-AG的核磁共振氫譜和碳譜進行對比分析（Chemical andPharmaceutical Bulletin,2003, 51(4):378-384），最終將該代謝產物準確鑑定為3′-DM-4′-DH-AG。代謝產物的1H-NMR和13C-NMR結果如下：
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.41-2.55 (2H, m, H-3, Ha-7′′), 2.59-2.62 (2H, m, H-2, Hb-7′′), 2.91 (1H, dd, J=13.90, 6.80 Hz, Ha-7′), 2.98 (1H, dd, J=13.90, 5.30 Hz, Hb-7′), 3.82 (3H, s, -OCH3), 3.85 (3H, s, -OCH3), 3.90 (1H, dd, J=9.18, 7.72 Hz, Ha-4), 4.14 (1H, dd, J=8.70, 7.12 Hz, Hb-4), 6.48 (1H, d, J=2.18 Hz, H-2′′), 6.51-6.58 (1H, dd, J=7.99, 1.94 Hz, H-6′′), 6.62 (1H, t, J=2.18 Hz, H-2′), 6.68 (1H, br d, H-6′), 6.71 (1H, dd, H-4′), 6.82 (1H, d, J=7.99 Hz, H-5′′), 7.14 (1H, t, J=7.72 Hz, H-5′)。
13C NMR (CDCl3, 100MHz): δ 179.1 (C-1), 156.1 (C-3′), 149.0 (C-3′′), 147.8 (C-4′′), 139.4 (C-1′), 130.5 (C-1′′), 129.8 (C-5′), 121.5 (C-6′), 120.7 (C-6′′), 116.2 (C-2′), 114.0 (C-4′), 111.8 (C-2′′), 111.4 (C-5′′), 71.5 (C-4), -Me 55.9, -Me 55.8, 46.2 (C-2), 41.3 (C-3), 38.2 (C-7′′), 34.7 (C-7′)。
分析菌株AUH-JLD49s對底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品轉化動態和轉化能力，以及產物3′-去甲基-4′-去羥基-牛蒡苷元對人結腸癌細胞株HCT116和人乳腺癌細胞株MDA-MB-231的抑制作用：
1、菌株AUH-JLD49s對底物3′-去甲基-牛蒡苷元的轉化動態
為了解菌株AUH-JLD49s轉化底物3′-去甲基-牛蒡苷元的速度，以便確定最佳轉化時間，我們對菌株AUH-JLD49s轉化底物3′-去甲基-牛蒡苷元的轉化動態進行了測定，具體方法如下：
將事先培養好的種子液（培養方法同上所述）按10%體積比的接種量接種到盛有100毫升液體培養基的250毫升三角瓶內培養，同時加入3′-去甲基-牛蒡苷元的濃度為150毫摩爾/升的3′-去甲基-牛蒡苷元粗品0.4毫升，在厭氧工作站內培養0小時、3小時、6小時、9小時、12小時、15小時、18小時、21小時、24小時後分別取培養物100微升，用1000微升的乙酸乙酯萃取，取萃取液800微升，萃取液蒸乾後加入100微升100%甲醇溶液，並用HPLC檢測底物被轉化情況，根據不同培養時間底物和產物濃度繪製菌株轉化動態（見圖4），由圖4可知，底物加入12小時後即有84.7%左右產物3′-DM-4′-DH-AG被生成，繼續培養15小時後，所加入的底物牛蒡苷元有96.8%被轉化為3′-DM-4′-DH-AG，第24小時產物量基本不再上升。
2、菌株AUH-JLD49s對不同濃度底物3′-去甲基-牛蒡苷元轉化能力測定
將菌株AUH-JLD49s分別與不同濃度的3′-去甲基-牛蒡苷元在厭氧工作站內共同培養3天，然後用等體積乙酸乙酯對培養物進行萃取，萃取液蒸乾後加入100%甲醇溶液，並用HPLC檢測底物3′-去甲基-牛蒡苷元粗品被轉化情況。結果表明，當底物3′-去甲基-牛蒡苷元濃度為不超過1.0毫摩爾/升時，菌株AUH-JLD49s對不同濃度的底物3′-去甲基-牛蒡苷元平均轉化率（轉化率=產物濃度/（剩餘底物濃度+產物濃度）×100%）均為90%以上，如菌株AUH-JLD49s對濃度分別為0.4毫摩爾/升、0.6毫摩爾/升、0.8毫摩爾/升和1.0毫摩爾/升的平均轉化率分別為97.4%、93.3%、90.3%和90.0%；當底物濃度增至1.2毫摩爾/升時，菌株AUH-JLD49s對底物毫摩爾/升的轉化效率有所降低，平均轉化率為84.7%；而當所加入的底物濃度為1.6毫摩爾/升時，菌株AUH-JLD49s對底物毫摩爾/升轉化能力急劇下降，平均轉化率僅為18.0%（見附圖5）。
3、產物3′-去甲基-4′-去羥基-牛蒡苷元對人結腸癌細胞株HCT116和人乳腺癌細胞株MDA-MB-231的抑制率
取對數生長期的各腫瘤細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，然後用RPMI-1640培養基製成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×104個/毫升，將細胞懸液接種於96孔培養板中，每孔100微升，待細胞貼壁後各組分別加入50微摩爾/升、100微摩爾/升、200微摩爾/升的3′-去甲基-4′-去羥基-牛蒡苷元和空白培養液及陽性對照劑，各設3個復孔。將培養板置於CO2培養箱中，37℃培養24小時後向各培養孔加入MTT 20微升/孔，孵育4小時後（懸浮細胞需經離心），小心吸棄上清培養液，每孔加入100微升DMSO，振蕩器上振蕩10分鐘，充分溶解甲瓚（Formazan）結晶，酶標儀檢測各孔吸光度A值，測定波長為570納米，計算抑制率IR=（1-用藥組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。結果表明，濃度為50-200微摩爾/升的產物3′-DM-4′-DH-AG對人結腸癌細胞株HCT116和人乳腺癌細胞株MDA-MB-231的生長均具有明顯的抑制作用，其中濃度為100微摩爾/升3′-DM-4′-DH-AG對HCT116和231的體外抑制率分別為41.67%和21.33%（見附圖6）。