鏈化合物和配體、及其製備方法

2024-04-01 11:35:05

專利名稱：鏈化合物和配體、及其製備方法
技術領域：
本發明涉及可以將寡糖等糖固定在表面細胞質基因組共振中所用的傳感晶片等蛋白質分析用支撐體上的鏈化合物，以及引入了該鏈化合物的配體、配體載體及其製備方法。
背景技術：
存在於生物體內的各種糖在維持生物的活動和生命的機理中起到重要的作用。為了精確地了解糖的這種機能，必須根據糖的複雜的結構而解析其機能。在糖的機能解析中所採用的方法是，使用已經明確其構造的寡糖，一部分一部分地再現糖的結構，由此揭示糖整體的結構與機能的關係。
作為上述解析糖的機能的方法，已知的有例如表面細胞質基因組共振法(以下記作SPR)。也就是，將含有模擬了糖的一部分的寡糖而形成的配體引入傳感晶片表面，使用引入該配體的傳感晶片，以確定與寡糖具有特異性相互作用的蛋白質等物質。由此，根據寡糖的結構可以對生物活性作出正確的評價。
另外，由於1分子寡糖的活性不會很高，在評價寡糖的生物活性時，必須將寡糖在傳感晶片上集合化。也就是，通過使用集合化的寡糖，解析其與蛋白質等物質之間的相互作用，由此可以評價寡糖的生物活性。
因此，如「日本專利公開公報2003-836969號(2003年3月19號公開)」(文獻1)、「日本化學會第79次春季年會-講演預稿集II、社團法人日本化學會、2001年3月15日，1042頁」(文獻2)中所公開的那樣，本發明者們已經得到了在分子內具有可固定於傳感晶片表面的部分和可引入寡糖的部分的鏈化合物，還得到了在該鏈化合物中引入1單元(分子)或2單元的寡糖而形成的配體。因而發現通過使用該配體，可以將寡糖集合化後導入至傳感晶片上。
然而，上述現有的配體雖然可以將寡糖的糖鏈2維地排列在傳感晶片的表面上，但是其存在的技術問題在於，很難以良好的再現性實現這種排列。
即，如上所述，使多個分子的寡糖在傳感晶片表面上集合化，以對寡糖的生物活性進行解析時，期望能夠使寡糖糖鏈的集合化狀態均等，以良好的再現性觀測寡糖和蛋白質之間的相互作用。特別是為了觀測寡糖的生物活性，必須使3單元～4單元的寡糖在傳感晶片的表面集合化，並將其再現性良好地2維排列在這些傳感晶片上。通過上述的這種排列，可以再現性良好地對寡糖的生物活性進行評價。
另外，上述現有的配體中，1個配體所具有的寡糖為1單元或2單元。換言之，相對於單個的鏈化合物，上述配體是由1個或2個寡糖結合而成的。因此，為了觀測寡糖的生物活性，當把上述配體排列在傳感晶片表面上時，必須通過提高配體濃度，使配體互相之間集合化，由此使3單位以上的寡糖在傳感器表面上集合化。
當通過這種方法使寡糖集合化時，難以實現將寡糖的糖鏈之間控制在規定的間隔從而再現性良好地排列寡糖。因此，上述現有的配體不能再現性良好地觀測寡糖的生物活性，有時可能難以進行糖的結構的解析和寡糖的生物活性的評價。
本發明是為了克服上述問題而完成的，旨在提供一種能夠再現性良好地將糖2維地排列在蛋白質分析用等支撐體上的新型鏈化合物，以及將該鏈化合物引入糖分子而得到的新型配體、配體載體及其製備方法。

發明內容
本發明者們為了解決上述問題而進行了積極的研究，結果發現，通過使用具有可以引入3單元或4單元糖分子的部位、且具有可以和蛋白質分析用支撐體相結合的部位的新型鏈化合物，其中該蛋白質分析用支撐體用於檢測和分離與糖分子具有特異性相互作用的蛋白質，由此可以再現性良好地將3單元或4單元糖分子2維排列在上述支撐體上，從而完成了本發明。
即，為了解決上述問題，本發明的鏈化合物的特徵在於，其具有如通式(1) (式中，n為1到6的整數)所示的結構。上述X的結構中，具有由3或4條末端具有芳香族胺基、且主鏈上可以有碳-氮鍵的烴衍生鏈而形成的多分支結構部分。
上述烴衍生鏈是指，在由碳和氫形成的烴鏈中，部分的碳和氫可以被其它的原子或取代基取代的烴鏈。即，上述烴衍生鏈包括在末端的芳香族胺基，並且構成烴鏈骨架結構的碳-碳鍵(C-C鍵)的一部分可以被碳-氮鍵(C-N鍵)、碳-氧鍵(C-O鍵)或醯胺鍵(CO-NH鍵)所取代。
在上述結構中，上述鏈化合物具有芳香族胺基，該部分可以方便地引入糖分子。由於各烴衍生鏈中含有上述芳香族胺基，因此可以將3單元或4單元的糖分子引入上述鏈化合物中。此外，上述鏈化合物還具有S-S鍵，該部分可以固定在上述蛋白質分析用支撐體上。
由此，通過上述鏈化合物，可以將3單元或4單元的糖分子集合化地引入到上述支撐體中。此外，由於將3單元或4單元的糖分子引入到1個鏈化合物中，可以再現性良好地將3單元或4單元的糖分子排列在上述支撐體上。由此，可以在上述支撐體表面上觀測糖分子和蛋白質之間的相互作用，同時可以再現性良好地評價糖分子的生物活性。
在具有上述通式(1)中所示結構的鏈化合物中，上述X優選具有通式(2)
(式中m1、m2、m3各自獨立地是1到6的整數)所示的結構。
上述鏈化合物的X由於具有3條上述的烴衍生鏈，因此通過該鏈化合物，可以在上述支撐體上引入3單元的糖分子。由此，通過控制上述支撐體表面上3單元的糖分子之間的間隔，可以再現性良好地實現糖分子的排列，因此可以再現性良好地評價糖分子的生物活性。
此外，在具有上述通式(1)中所示結構的鏈化合物中，上述X優選具有通式(3) (式中m4、m5、m6、m7、p1、p2各自獨立地是1到6的整數)所示的結構。
上述鏈化合物的X由於具有4條上述的烴衍生鏈，因此通過該鏈化合物，可以在上述支撐體上引入4單元的糖分子。由此，通過控制上述支撐體表面上4單元的糖分子之間的間隔，可以再現性良好地實現糖分子的排列，因此可以再現性良好地評價糖分子的生物活性。
此外，為了解決上述問題，本發明的配體的特徵在於其是通過將糖分子引入到上述任何一個鏈化合物的芳香族胺基上而形成的。
更具體而言，上述配體優選具有通式(4) (式中m1、m2、m3、n各自獨立地是1到6的整數)所示的結構。
或者上述配體優選具有通式(5) (式中m4、m5、m6、m7、n、p1、p2各自獨立地是1到6的整數)所示的結構。
通過使用上述的任何一個配體，可以將3單元(當使用具有通式(4)所示結構的配體時)或4單元(當使用具有通式(5)所示結構的配體時)的糖分子集合化地固定在上述蛋白質分析用支撐體表面。如此，由於一個配體具有3單元或4單元的糖分子，在支撐體表面上，上述配體互相之間沒有集合化，由於可以通過使用一個配體而使3單元或4單元的糖分子集合化，因此可以再現性良好地測定糖分子的生物活性。此外，在上述支撐體的表面上可以再現性良好地2維排列多個糖分子。因此，通過使用固定了本發明的配體的蛋白質分析用支撐體，可以再現性良好地評價糖分子的生物活性。
此外，為了解決上述問題，本發明的鏈化合物的製備方法的特徵在於包含下述工序將硫辛酸與具有3條或4條支鏈的胺化合物進行縮合反應的步驟，其中該支鏈的芳香族胺基末端被保護基團保護，和對上述芳香族胺基末端的保護基團進行脫保護的步驟。
通過上述方法，可以得到本發明的化合物，其具有S-S鍵和芳香族胺基，S-S鍵部分可以固定在上述蛋白質分析用支撐體上，芳香族胺基部分可以方便地引入糖分子。
此外，為了解決上述問題，本發明的配體的製備方法的特徵在於使用上述鏈化合物和糖分子，進行還原胺化反應。
通過上述方法，經過還原胺化反應，可以方便地向鏈化合物中引入糖分子，從而得到本發明的配體。
此外，為了解決上述問題，本發明的糖分子的引入方法的特徵在於，將含有上述配體的溶液和支撐體表面的金屬接觸。
通過上述的方法，上述配體(配體中包含的鏈化合物)的S-S鍵變為與上述支撐體表面的金屬形成的鍵，從而可以將上述配體固定在支撐體表面。因此，通過將含有配體的溶液和支撐體接觸這種簡便的方法，可以將與鏈化合物結合的糖分子排列在支撐體的表面上。
此外，為了解決上述的問題，本發明的配體載體的特徵在於，使上述配體在表面具有金屬的支撐體上固定化。
由上述的方法，通過硫-金屬鍵，由於可以將配體牢固地固定在支撐體表面上，可以提供使多個糖分子再現性良好地排列在支撐體表面上而形成的配體載體。因此，若使用上述配體載體，可以再現性良好地觀測配體中所含的糖分子和與該糖分子相互作用的蛋白質等物質之間的相互作用，從而可以定量地評價糖分子的生物活性。
通過以下記載的內容可以進一步充分地了解本發明的其它目的、特徵和優點。此外，通過下述的說明並參照附圖，可以了解到本發明的效益。


圖1顯示的是將本發明的配體固定化的配體引入晶片和rvWF結合，對該結合進行SPR測定的結果的圖。
圖2顯示的是將現有的配體固定化的配體引入晶片和rvWF結合，對該結合進行SPR測定的結果的圖。
具體實施例方式
下面對本發明進行詳細的說明，但是本發明並不限定於此。
本發明的鏈化合物位於SPR的傳感晶片和親和色譜法的載體等蛋白質分析用支撐體與寡糖等糖(以下記作糖分子)之間，用於使糖分子在上述支撐體上固定化。因此，上述鏈化合物在分子內必須具有可固定於上述支撐體上的部分和可以方便地引入糖分子的部分。
此外，對於上述SPR和親和色譜法，其目的是鑑別和分離與糖分子具有特異性相互作用的蛋白質等物質。因此，上述鏈化合物必須是與蛋白質等物質不具有非特異性相互作用的物質。
因此，如前述通式(1)所示，本發明的鏈化合物具有雙硫鍵(S-S鍵)，其作為可固定於上述支撐體上的部分。該雙硫鍵的硫(S)例如與塗敷在蛋白質分析用支撐體表面上的金(Au)結合，形成硫-金鍵(S-Au鍵)，可以牢固地與上述支撐體結合。
此外，為將多個糖分子2維排列在蛋白質分析用支撐體的表面上，同時控制各個糖分子的糖鏈之間的距離，上述鏈化合物具有包含多個胺基的多分支結構，作為可以方便地引入糖分子的部分。即，本發明的鏈化合物的多分支部分是具有前述通式(1)中X所示結構的部分，如前所述，該X具有包含3條或4條末端具有芳香族胺基、且同時在主鏈上可以有碳-氮鍵和醯胺鍵的烴衍生鏈的結構。另外，在上述通式(1)中，n只要是1到6的整數，則沒有特別的限定。
上述芳香族胺基的胺基(-NH2基)是通過與寡糖等糖分子的還原胺化反應，向上述鏈化合物中引入糖分子的反應基團。也就是說，由糖分子中的平衡而產生的醛基(-CHO基)或酮基(-CRO基，R為烴基)與上述鏈化合物所具有的胺基反應。接著，通過繼續還原由該反應形成的席夫鹼，可以容易地將糖分子引入到芳香族胺基中。
由此，前述通式(1)的X通過含有3條或4條如上述的烴衍生鏈，其具有了同時包含多個可引入糖分子的芳香族胺基的多分支型部分。由於在該多分支部分中所含的各芳香族胺基中，引入了寡糖等糖分子，通過具有前述通式(1)中所示結構的鏈化合物，可以再現性良好地將多個糖分子2維排列在蛋白質分析用支撐體的表面上。
具體而言，上述X如前述通式(2)中所示，3條烴衍生鏈通過在與芳香族胺基相反側的末端上與1個碳原子(C)結合，形成分支結構。即該碳原子與-NH-結合。由此，上述X形成具有3條烴衍生鏈的多分支部分，另外，在上述通式(2)中，m1、m2、m3隻要是1到6的整數，則沒有特別的限定，其可以是彼此不同的整數，也可以是部分或全部相同的整數。其中，從便於製造具有上述多分支部分的化合物的角度出發，上述m1～m3優選是彼此相同的整數，特別優選2。
或者也可以如前述通式(2)所示，上述X的2條烴衍生鏈各自在與芳香族胺基相反側的末端上具有和1個氮原子(N)結合的2分支的結構。這時，2條2分支結構中的上述氮原子通過-CO-CH2-，連接到1個氮原子(N)上形成分支結構。由此，上述X形成具有4條烴衍生鏈的作為多分支型部分的結構。另外，在上述通式(3)中，m4、m5、m6、m7隻要是1到6的整數，則沒有特別的限定，其可以是彼此不同的整數，也可以是一部分或全部相同的整數。其中，從便於製造具有上述多分支部分的化合物的角度出發，上述m4～m7優選是彼此相同的整數，特別優選2。此外，p1、p2隻要是1到6的整數，則沒有特別的限定，其可以是彼此不同的整數，也可以是部分或全部相同的整數。其中，從製備的方便性的角度出發，p1、p2優選是彼此相同的整數，特別優選1。
由此，上述X的結構中，具有在碳、氮等原子上形成結合了多條烴衍生鏈的分支結構的多分支型部分。另外，上述X中所含的多條烴衍生鏈雖然優選是全部相同的，但如果在末端具有芳香族胺基，則也可以是彼此不同的結構。
如上所示，具有通式(1)所示結構的鏈化合物具有可與蛋白質分析用支撐體結合的S-S鍵，和可與寡糖等糖分子結合的胺基。從而，由於通過例如S-Au鍵使上述鏈化合物固定在蛋白質分析用支撐體上，由上述鏈化合物，可以簡單且牢固地將糖分子與上述支撐體結合。
此外，上述鏈化合物具有多分支型部分，在該多分支型部分的各末端上具有芳香族胺基。因此，通過使用在上述鏈化合物中引入糖分子而形成的配體(見後述)，可以高效率地使糖分子在上述支撐體表面上集合化。此外，由於具有多分支型部分，當含有鏈化合物而形成的配體與支撐體表面結合時，可以再現性良好地2維排列多個糖分子。
進一步的，上述鏈化合物幾乎可以忽略其與蛋白質的非特異性相互作用的影響。由此，通過使用本發明的鏈化合物，可以再現性良好地評價糖分子的生物活性。
上述鏈化合物可以通過如下所示的製備方法進行製備。即，上述化合物可以通過，將硫辛酸與具有3條或4條支鏈的胺化合物進行縮合反應，其中該支鏈的芳香族胺基末端被保護基團保護，然後對上述芳香族胺基末端的保護基團進行脫保護而製備。
上述硫辛酸具有如下述通式(6)
所示的結構。
此外，上述胺化合物只要含有其芳香族胺基末端被保護基團保護的支鏈即可，沒有特別的限定，也可以含有相當於上述鏈化合物的多分支部分的結構。
因此，上述支鏈除了具有被保護基團保護的芳香族胺基末端以代替上述烴衍生鏈中所含的芳香族胺基以外，可以具有上述烴衍生鏈的結構。也就是，上述分支鏈在由碳和氫形成的烴鏈中，一部分的碳和氫可以被其它的原子或取代基取代。更具體而言，上述分支鏈在具有被保護基團保護的芳香族胺基末端的同時，以烴鏈為主要結構的碳-碳鍵(C-C鍵)的一部分可以被碳-氮鍵(C-N鍵)或碳-氧鍵(C-O鍵)取代。
此外，上述保護基團是指為了使芳香族胺基的胺基不參加上述縮合反應而引入的取代基。這種保護基團只要是在對仲胺基進行脫保護時不受其影響的基團，則沒有特別的限定。作為上述保護基團，可以列舉例如叔丁氧基羰基(-COO(CH3)3基；記作Boc基)、苄基、氨基甲酸烯丙酯基(-COOCH2CH＝CH2、Alloc基)等。
作為上述胺化合物，可以列舉例如，具有如下述通式(7)和下述通式(8)所示結構的化合物。
另外，上述通式(7)、(8)中的n、m1～m7、p1、p2各自獨立地是1到6的整數。關於這些胺化合物的合成方法，在後面的實施例中有詳細的描述。
通過上述硫辛酸和胺化合物的縮合反應，硫辛酸的羧基(-COO基)和胺化合物的胺基(-NH2)縮合，形成醯胺鍵。然後對芳香族胺基的保護基團進行脫保護，通過脫去保護基團而形成胺基，可以得到上述的鏈化合物。
下面，對於在上述鏈化合物的芳香族胺基上引入糖分子而形成的配體進行說明。在本發明的配體中，鏈化合物的胺基與通過糖分子中的平衡而產生的醛基或酮基反應，通過繼續還原由該反應形成的席夫鹼，可以將糖分子引入到芳香族胺基中。即，通過該還原胺化反應，上述鏈化合物和糖分子結合。
本發明的配體中所含的糖分子只要在其還原末端具有還原糖，則沒有特別的限定。可以列舉例如，葡萄糖、半乳糖、甘露糖等單糖類，結合的糖數為2糖～10糖的麥芽糖、乳糖，後述的硫酸化寡糖等寡糖類，將單糖類和寡糖類組合起來糖數為11以上的肝素、硫酸軟骨素、硫酸乙醯肝素等多糖類。
此外，作為上述寡糖類，還可以列舉，在已知具有抗血液凝固活性的硫酸化多糖肝素中，具有下述通式(9) 所示的特定部分的二糖結構(GlcNS6S-IdoA2S)的硫酸化寡糖、具有在該硫酸化寡糖的還原末端的羥基上引入葡萄糖而形成的如下述通式(10) 所示結構的寡糖。
另外，上述寡糖類和多糖類可以是由同樣的單糖分子形成的單一寡糖或單一多糖，也可以是由各種單糖分子及其衍生物形成的複合糖族，包含各種單糖分子及其衍生物、寡糖類的複合多糖類。此外，上述的任何一種糖分子都可以是從自然界中分離·精製而得到的各種天然的糖，也可以是人工合成的糖。
具體而言，本發明的配體具有如前述通式(4)所示的結構。具有該通式(4)所示結構的配體是在如前述通式(1)所示、且通式(1)中的X具有如前述通式(2)所示結構的鏈化合物中，引入具有如上述通式(10)所示結構的糖分子而形成的。通式(2)所示的X由於具有包含3條烴衍生鏈的結構，因此具有通式(4)所示結構的配體在上述鏈化合物中結合了3單元的糖分子。此外，在上述通式(4)中，m1～m3與通式(2)中的m1～m3一樣，只要是1到6的整數，則沒有特別的限定，其可以是彼此不同的整數，也可以是部分或全部相同的整數。另外，n只要是1到6的整數，則沒有特別的限定。
此外，本發明的其它的配體具有如前述通式(5)所示的結構。具有該通式(5)所示結構的配體是在如前述通式(1)所示、且通式(1)中的X具有如前述通式(3)所示結構的鏈化合物中，引入具有如上述通式(10)所示結構的糖分子而形成的。通式(3)所示的X由於具有包含4條烴衍生鏈的結構，因此具有通式(5)所示結構的配體在上述鏈化合物中結合了4單元的糖分子。此外，在上述通式(5)中，m4～m7與通式(2)中的m4～m7一樣，只要是1到6的整數，則沒有特別的限定，其可以是互相不同的整數，也可以是部分或全部相同的整數。另外，在上述通式(5)中，p1、p2與通式(3)中的p1、p2一樣，只要是1到6的整數，則沒有特別的限定，其可以是彼此不同的整數，也可以是部分或全部相同的整數。另外，n只要是1到6的整數，則沒有特別的限定。
由於上述的任一個配體都含有鏈化合物和糖分子，鏈化合物中的S-S鍵可以和蛋白質分析用支撐體表面的金屬以硫(S)-金屬鍵，例如硫-金(S-Au)鍵的形式結合。由此，通過該S-Au鍵，可以提供使3單元或4單元的糖分子集合化後固定在上述支撐體表面上而形成的配體載體。因而，通過使用上述配體，可以實現能將多個糖分子再現性良好地2維排列在例如蛋白質分析用支撐體表面上的配體載體，通過使用該配體載體，可以再現性良好地對糖分子的生物活性進行評價。另外，作為上述支撐體表面的金屬，除了上述Au以外，還可以使用Cu、Ag、Pt等金屬，但是優選Au。
還有，本發明還包含通過S-金屬鍵將配體在支撐體表面固定化而形成的配體載體。該配體載體不局限於蛋白質分析用的用途，也可以用於研究蛋白質以外的物質與糖分子之間的相互作用的分析用途。
上述配體載體通過將含有該配體的溶液與表面具有金屬膜的支撐體接觸，配體的S-S鍵的各S原子與支撐體表面的金屬以S-金屬鍵的形式結合，從而在支撐體表面上引入上述配體。具體地說，通過將蛋白質分析用的支撐體在上述配體溶液中浸漬一定的時間，或者向上述支撐體中注入配體溶液(配體溶液在支撐體表面上流動)，上述配體(配體中所含的鏈化合物)的S-S鍵與上述支撐體表面的金等結合而變為S-Au鍵，由此可以將上述配體固定在支撐體表面上。
作為配體溶液中使用的溶劑，沒有特別的限定，可以列舉例如，甲醇、水、二甲基乙醯胺(DMAc)及其混合溶劑。此外，浸漬時間為0.5小時～12小時即可，注入量為0.01mM～1mM即可。
如此，由於本發明的配體具有S-S鍵，可以簡單地在蛋白質分析用支撐體的表面上固定化，可以將糖分子簡單地引入到上述支撐體上。
另外，如上所述的向支撐體引入糖分子的方法也包含在本發明中。
本發明的配體載體可以用於對糖分子與例如蛋白質等其它物質的相互作用的分析中。具體而言，上述配體載體可以適用於SPR測定、親和色譜法等中。
例如，作為蛋白質分析，在進行SPR測定時，可以如下進行。即，在蒸鍍了金屬膜等金屬薄膜的支撐體上，使用將本發明的配體固定化而形成的配體載體，使該配體載體與蛋白質接觸，根據一般方法，若採用表面細胞質基因組共振裝置測定共振角度時，可以觀察該配體載體和蛋白質的結合作用。另外，作為用於SPR測定中的上述支撐體(傳感晶片)，可以使用例如，玻璃、塑料等，特別優選玻璃。此外，配體載體與蛋白質的接觸可以通過，例如將溶解了蛋白質的流態緩衝劑(running buffer)溶液流過該配體載體的表面而進行。作為該流態緩衝劑，可以列舉例如，磷酸緩衝溶液等。
本發明的配體載體由於具有上述配體，可以再現性良好地將多個糖分子2維排列在支撐體表面上。因而，可以再現性良好地觀測糖分子的生物活性，可以進行對糖分子的結構的解析，定量地評價糖分子的生物活性。
此外，作為本發明的配體載體，即引入了配體的傳感晶片可以用於例如下述的SPR測定中。也就是，使用將第1糖分子在支撐體表面上固定化而形成的第1傳感晶片和將末端結構與上述第1糖分子不同的第2糖分子在支撐體表面上固定化而形成的第2傳感晶片，比較用第1傳感晶片得到的SPR測定的檢測結果和用第2傳感晶片得到的SPR測定的檢測結果之差，可以觀測糖分子的相互作用。這些傳感晶片可以使用固定化的糖分子不同的配體。作為比較的糖分子，可以列舉乳糖和葡萄糖、麥芽糖和葡萄糖、曲二糖和葡萄糖等。其中，使用了2個傳感晶片，也可以使用多於該個數的、所引入的糖分子的種類不同的傳感晶片。另外，糖分子的末端是指沒有固定在傳感晶片上的那一側。
在上述SPR測定中，使用對第1糖分子具有特異性作用的蛋白質，規定測定條件，使其作用於上述2個傳感晶片，觀測兩者的共振角度。通過檢測兩者的共振角度之差，可以測定糖分子與蛋白質等的特異性的相互作用。
此外，觀測與糖分子的相互作用的物質不局限於蛋白質。
以上是同時測定2種傳感晶片的，但是也不局限於此，可以測定2種以上的傳感晶片，也可以不同時測定。此外，也可以使用至少在1個傳感晶片上沒有引入糖分子的傳感晶片。可以使用例如，只固定了鏈化合物的傳感晶片。
若按照上述進行SPR測定，除了糖分子以外，可以使用至少2個具有同樣結構的配體的傳感器，因此所觀測到的該至少2個傳感器的相互作用之差是由糖分子引起的。因而，若採用上述測定方法，可以降低糖分子以外的部分和其它物質之間的非特異性相互作用，而觀測糖分子和其它物質之間的特異性的相互作用。
下面通過實施例和比較例，對本發明進行更詳細的說明，但是本發明不受其任何的限制。
通過下述的步驟，合成作為本發明的鏈化合物的、前述通式(1)中n為1，X具有如前述通式(2)所示，其中m1、m2、m3為2的結構的鏈化合物。
如下述通式(11)所示，在65-70℃的二甲氧基乙烷中，在氫氧化苄基三甲基銨的存在下，相對於硝基甲烷(化合物1)麥可加成3單位的丙烯酸叔丁酯，以91％的收率得到化合物3。然後在氫氣氛圍下(6kg/cm2)，在50℃的乙醇中，用雷尼鎳(Raney Ni)還原上述化合物3的硝基，以98％的收率得到化合物4。
然後在CH2Cl2中，在1.1當量的1-羥基-7-氮雜苯並三唑(式中記作HOAt)、1.1當量的水溶性碳二亞胺鹽酸鹽(式中記作WSCI·HCl)的存在下，在上述化合物4中縮合1.1當量的Z-甘氨酸，以85％的收率得到Z-甘氨酸體(化合物5)。
更具體而言，根據文獻(G.R.Newkome等，OPPI BRIEFS，28卷，495頁，1996)的方法，首先將硝基甲烷(12.2g，200mmol)溶解於50mL 1，2-二甲氧基乙烷中，加熱至65-70℃，加入40％氫氧化苄基三甲基銨-甲醇溶液(2mL)，製成硝基甲苯。然後將該硝基甲烷溶液的溫度升至75℃，緩慢滴加丙烯酸叔丁酯(90.8mL，620mmol)，溶液溫度保持在70-75℃，分4次每次滴加1mL的40％氫氧化苄基三甲基銨-甲醇溶液，攪拌2.5小時，得到硝基甲烷/丙烯酸叔丁酯反應溶液。通過傾析除去該硝基甲烷/丙烯酸叔丁酯反應溶液中的不溶物質，得到的殘渣溶於乙醚，通過用冰塊冷卻的10％鹽酸水溶液、飽和碳酸氫鈉水溶液和水各清洗2次，得到殘渣溶液。然後使用無水硫酸鈉作為乾燥劑，乾燥該殘渣溶液，用鈣鐵石除去該乾燥劑，減壓濃縮得到濃縮殘餘物。然後將濃縮殘渣溶解於乙醇進行重結晶，得到白色針狀結晶的化合物3(81.8g，91％)。
然後加入化合物3的結晶(10g，22.4mmol)和T-1雷尼鎳(6.0g)以及50mL無水乙醇，在6kg/cm2的氫氣氛圍下，在50℃下攪拌23小時後，用鈣鐵石濾去T-1雷尼鎳得到化合物3反應溶液，減壓濃縮該溶液。通過該化合物3反應溶液的減壓濃縮得到的濃縮殘渣用製備矽膠色譜法(溶劑氯仿/甲醇＝20/1)進行精製，得到白色固體的化合物4(產量9.2g，收率98％)。
更具體而言，將Z-甘氨酸(1.26g，6.62mol)、HOAt(0.90g，6.62mmol)、WSCI·HCl(1.27g，6.62mmol)溶於無水二氯甲烷(25mL)，製成Z-甘氨酸溶液，在0℃的溫度條件下，向該溶液中加入將化合物4(2.50g，6.02mmol)溶於無水二氯甲烷(2mL)溶液而形成的化合物4溶液，在氬氣氛圍下，在室溫下攪拌36小時，得到Z-甘氨酸/化合物4反應溶液。向該Z-甘氨酸/化合物4反應溶液中加入二氯甲烷和10％檸檬酸水溶液，用二氯甲烷進行萃取。萃取過程中的有機層用水、飽和碳酸氫鈉水溶液、以及水各清洗一次，使用無水硫酸鈉作為乾燥劑乾燥後，濾去該乾燥劑進行減壓濃縮。通過減壓濃縮得到的濃縮殘渣用製備矽膠色譜法(溶劑氯仿/甲醇＝20/1)進行精製，得到白色固體的化合物5(產量3.09g，收率85％)。
對製得的上述化合物5進行ESI-MS(正)測定(飛行時間型質譜分析計測定)，為m/z(質量/電荷比)629.4[(M+Na)+]。由此，可以確認化合物5的結構。
然後，如下述通式(12)中所示，在CH2Cl2/H2O＝10/1的混合溶劑中，用三氟乙酸(以下記做TFA)對上述化合物5的叔丁氧基羰基(-COOC(CH3)3基；通式(12)中的tBu)進行脫保護，以95％的收率得到化合物6。
然後，在4.5當量的五氟苯基二苯基磷酸酯(式中的FDPP)、11當量的二異丙基乙基胺(式中的DIPEA)和N，N-二甲基甲醯胺(DMF)的存在下，使上述化合物6與被Boc基保護的間苯二胺衍生物(化合物7，10當量)縮合，以99％的收率得到N-Boc胺衍生物(化合物8)。然後，在甲醇(圖中的MeOH)中，在Pd/C(活性炭負載鈀)的存在下進行接觸氫還原，對與化合物8縮合的上述Z-甘氨酸的苄氧基羰基(式中的Z基)進行脫保護，以79％的收率得到化合物9。
為了製得上述化合物6～9，如下具體地進行操作。
即，為了製得化合物6，將化合物5(2.98g，4.90mmol)溶於二氯甲烷(15mL)後，在-10℃下加入TFA(15mL)和水(1.5mL)後，在室溫下攪拌1.5小時，得到化合物5反應溶液。減壓濃縮該化合物5反應溶液後，在冰浴中向濃縮殘渣中加入10％氫氧化鈉水溶液，直至pH達到5，進而加入濃鹽酸直至pH達到2，析出白色固體。用水清洗所得的白色固體，得到白色固體的化合物6(產量2.04g，收率95％)。
對製得的上述化合物6進行ESI-MS(負)測定，為m/z 437.1[(M-H)-]。此外，進行核磁共振(1H-NMR、400MHz，d6-DMSO)的結果為δ＝7.34-7.14(6H，m)，5.00(1H，S)，3.55(2h，d，J＝5.9Hz)，3.33(3H，bs)，2.11(6H，m)，1.81(6H，m)。由此，可以確認化合物6的結構。
此外，為了製得化合物7，將間苯二胺(0.50g，4.62mmol)溶於甲醇(35mL)後，在0℃下加入(Boc)2O(1.06mL，4.62mmol)和三乙胺(0.65mL，4.65mmol)後，在室溫下攪拌24小時，進行減壓濃縮。通過該減壓濃縮得到的濃縮殘渣用製備矽膠色譜法(溶劑氯仿/丙酮＝10/1)進行精製，得到白色固體的化合物7(產量665mg，收率68％)。
對製得的上述化合物7進行ESI-MS(正)測定，為m/z 231.2[(M+Na)+]。此外，進行1H-NMR(400MHz，CD3Cl)的結果為δ＝7.02(1H，t，J＝8.0Hz)，6.95(1H，bs)，6.54(1H，dd，J＝2.0Hz，J＝8.0Hz)，6.41(1H，bs)，6.35(1H，dd，J＝2.2Hz，J＝7.9Hz)，3.66(2H，bs)，1.53，1.50(9H，s，s)。由此，可以確認化合物7的結構。
此外，為了製得化合物8，將上述化合物6(100mg，228μmol)、上述化合物7(475mg，2.28mmol)、FDPP(394mg，1.03mmol)和二異丙基乙基胺(447μL，2.57mmol)溶於無水二甲基甲醯胺(2mL)，在氬氣氛圍下，在室溫下攪拌29小時後，加入乙酸乙酯和水，通過乙酸乙酯萃取，有機層用0.5N鹽酸、水、飽和碳酸氫鈉水溶液、以及飽和食鹽水各清洗一次，使用無水硫酸鈉作為乾燥劑乾燥，得到乾燥反應溶液。從得到的乾燥反應溶液中濾去該乾燥劑進行減壓濃縮。通過該減壓濃縮得到的濃縮殘渣用製備矽膠色譜法(溶劑氯仿/丙酮＝3/1)進行精製，得到白色固體的化合物8(產量228mg，收率99％)。
對製得的上述化合物8進行ESI-MS(正)測定，為m/z 1009.5[(M+H)+]。此外，進行1H-NMR(400MHz，CD3Cl)的結果為δ＝8.75(3H，s)，7.67(3H，s)，7.30-6.95(18H，m)，6.52(1H，bs)，5.04(2H，s)，3.71(2H，d，J＝5.0Hz)，2.23(6H，m)，1.97(6H，m)，1.47(27H，s)。由此，可以確認化合物8的結構。
此外，化合物9具體地可以如下得到。即，將化合物8(200mg，198μmol)溶解於甲醇(3mL)，加入10％Pd/C(62.3mg)，在氫氣氛圍下，在室溫下攪拌15小時後，濾去上述Pd/C，進行減壓濃縮。通過該減壓濃縮得到的濃縮殘渣用製備矽膠色譜法(溶劑氯仿/甲醇＝8/1)進行精製，得到白色固體的化合物9(產量136mg，收率78％)。
對製得的上述化合物9進行ESI-MS(正)測定，為m/z 875.5[(M+H)+]。由此，可以確認化合物9的結構。
進而，如下述通式(13)所示，在1.0當量的WSCI·HCl、1.0當量的1-羥基苯並三唑(通式(13)中，HOBt)和CH2Cl2中，使上述化合物9和1.0當量的硫辛酸(化合物10)縮合，以75％的收率得到硫辛酸衍生物(化合物11)。
在CH2Cl2中，在存在氯化三甲基甲矽烷(式中記做TMSCl)和苯酚(PhOH)的酸性條件下，對上述Boc基進行脫保護，得到化合物12(收率32％以上)，即含有3條具有芳香族胺基的烴衍生鏈的鏈化合物。
為了得到化合物11、12，具體地進行如下的操作。
即，為了得到化合物11，將化合物10(23.6mg，114mol)和HOBt(15.4mg，114mmol)溶解於無水二氯甲烷(2.3mL)，在0℃的溫度條件下，加入化合物9(2.50mg，6.02mmol)，在氬氣氛圍下，遮蔽光線在室溫下攪拌36小時後，加入10％檸檬酸水溶液，用氯仿萃取。有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液清洗，使用無水硫酸鈉作為乾燥劑乾燥。然後，濾去該乾燥劑進行減壓濃縮。濃縮殘渣用製備矽膠色譜法(溶劑氯仿/甲醇＝40/1)進行精製，得到白色固體的化合物11(產量91.0g，收率75％)。
對製得的上述化合物11進行ESI-MS(正)測定，為m/z 1085.5[(M+H)+]。此外，進行1H-NMR(400MHz，CD3Cl)的結果為δ＝9.01(3H，bs)，7.67(3H，s)，7.31(1H，bs)，7.27-7.00(12H，m)，3.71(2H，bs)，3.64-3.39(1H，m)，3.12-2.99(2H，m)，2.33(1H，m)，2.32(6H，m)，2.20(2H，m)，2.04(6H，m)，1.82-1.73(1H，m)，1.62-1.47(4H，m)，1.47(27H，s)，1.39-1.25(2H，m)。由此，可以確認化合物11的結構。
此外，為了製得化合物12，將氯化三甲基甲矽烷(0.25mL，2.64mmol)溶解於二氯甲烷(0.49mL)中，加入將苯酚(549mg，5.83mmol)溶解於二氯甲烷(1.46mL)中而形成的苯酚溶液，攪拌後進一步加入化合物11(34.7mg，32.6μmol)，在室溫下，遮蔽光線攪拌1.5小時，得到化合物11反應溶液。然後向該化合物11反應溶液中加入氯仿，有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液清洗，析出黃色固體。析出的黃色固體溶解於乙酸，冷卻至4℃，濾去凝聚的固體，得到白色固體的化合物12(產量7.9mg，收率32％)。
對製得的上述化合物12進行ESI-MS(正)測定，為m/z 736.6[(M+H)+]。此外，進行1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)的結果為δ＝9.57(3H，s)，7.97(1H，m)，6.87(6H，m)，6.67(3H，d，J＝7.7Hz)，6.21(3H，d，J＝7.7Hz)，4.98(6H，bs)，3.67(2H，d，J＝5.1Hz)，3.56(1H，m)，3.16-3.04(2H，m)，2.36(1H，m)，2.25(6H，m)，2.19-2.07(2H，m)，1.93(6H，m)，1.83(1H，m)，1.50(4H，m)，1.33(2H，m)。由此，可以確認化合物12的結構。

使用在實施例1中得到的鏈化合物12，通過下述的步驟合成具有前述通式(4)中m1、m2、m3為2、且n為1的結構的配體。
如下述通式(14)所示，將實施例1中得到的鏈化合物12和作為前述通式(10)所示的糖分子的化合物13(5當量)溶解於H2O/二甲基乙醯胺(式中為DMAc)/乙酸(AcOH)＝5/20/1的混合溶劑中，在pH3～4，37℃下，形成席夫鹼，將溶劑變為H2O/DMAc/AcOH＝20/5/24的混合體系，在pH3～4，37℃下，加入30當量的NaBH3CN進行還原胺化反應。然後用Sephadex G-50(アマ—シヤムバイオシステムズ公司製造)，通過凝膠過濾色譜法對得到的化合物進行精製，然後進行脫鹽處理，得到作為含有3單元糖分子的配體的化合物14。
更具體而言，為了製得化合物14，將實施例1中得到的鏈化合物12(0.5mg，655nmol)和化合物13(2.8mg，3μmol)溶解於水(25mL)、二甲基乙醯胺(100mμL)和乙酸(5μL)的混合溶劑中，於密封管中在37℃下加熱一晚，得到鏈化合物12/化合物13反應液。將NaBH3CN(2.7mg，39.2μmol)溶解於乙酸(20μL)中製成的NaBH3CN溶液加入到上述鏈化合物12/化合物13反應液中，在37℃下加熱3天後，減壓濃縮，用SephadexG-50(溶劑加入0.3M NaCl的PBS)進行凝膠過濾色譜法。對得到的目標餾分進行減壓濃縮，用Sephadex G-25(溶劑水)對濃縮殘渣進行脫鹽，將其溶解於水進行冷凍乾燥，得到白色粉末的化合物14(產量1.5mg，收率66％)。
得到的化合物14的質量為3291.28道爾頓(dalton)，由飛行時間型質譜分析計測定得到的m/z 1008.19的峰是以上述通式(14)中所示化合物14為3價離子[M-12Na+9H]3-的形式觀測到的。此外，進行1H-NMR(500MHz，D2O)的結果為δ＝7.20(3H，m)，6.82(6H，m)，6.64(3H，m)，5.35(3H，d，J＝3.5Hz)，5.13(3H，J＝2.5Hz)，4.51(3H，d，J＝2.4Hz)，4.29(6H，m)，4.18(6H，m)，4.06(6H，m)，3.97(9H，m)，3.87(3H，m)，3.82(3H，m)，3.78(6H，m)，3.68(9H，m)，3.56(9H，s)，3.34(6H，m)，3.24(3H，dd，J＝3.4，10.5Hz)，3.08(4H，m)，2.44(6H，m)，2.33(1H，m)，2.27(2H，t)，1.86(1H，m)，1.56-1.46(2H，m)，1.35-1.14(4H，m)。由此，可以確認化合物14的結構。
通過下述的步驟，合成作為本發明的鏈化合物的、前述通式(1)中n為1，X具有如前述通式(3)所示且其中m4、m5、m6、m7全為2、p1和p2為1的結構的鏈化合物。
如下述通式(15)中所示，在MeOH中加入2.3當量的三氟化硼·乙醚加成物(式中為BF3·OEt2)，在酸性條件下進行回流，酯化二元羧酸(化合物15)，以79％的收率得到酯化體(化合物16)。
然後，在1.1當量的HOBt、1.1當量的二環己基碳二亞胺(式中為DCC)和CH2Cl2中，將1.1當量的Z-甘氨酸與上述化合物16縮合，以94％的收率得到甘氨酸衍生物(化合物17)。
然後，在MeOH中加入2N的NaOH，在鹼性條件下水解化合物17的酯基，以98％的收率得到二元羧酸衍生物(化合物18)。
為了製得上述化合物16～19，如下具體地進行操作。
即，為了製得化合物16，將化合物15(亞氨基二乙酸；10.0g，75.1mmol)和BF3·OEt2(三氟化硼-乙醚螯合物；22mL，173mmol)溶於50mL無水甲醇中，在氬氣氛圍下回流5小時後，加入飽和碳酸氫鈉水溶液中和，用氯仿萃取。然後向水層中加入二乙胺，直至pH達到9，再用氯仿萃取，使用無水硫酸鈉作為乾燥劑乾燥後，濾去該乾燥劑進行減壓濃縮，得到黃色油狀物的化合物16(產量9.61g，收率79％)。
對製得的上述化合物16進行ESI-MS(正)測定，為m/z 162.1[(M+H)+]。此外，進行1H-NMR(400MHz，CD3Cl)的結果為δ＝3.74(6H，s)，3.48(4H，s)，2.00(1H，s)。由此，可以確認化合物16的結構。
此外，為了製得化合物17，將化合物16(1.00g，6.21mmol)和二環己基碳二亞胺(1.41g，6.83mmol)和HOBt(0.92g，6.83mmol)溶解於25mL無水二氯甲烷中，在氬氣氛圍下，在0℃下攪拌0.5小時後，加入Z-甘氨酸(1.42g，6.83mmol)，在室溫下攪拌5天。將通過攪拌析出的沉澱物濾去，濾液用氯仿萃取，有機層用1N的鹽酸和飽和碳酸氫鈉水溶液分別清洗2次，再用水清洗1次，使用無水硫酸鈉作為乾燥劑乾燥後，濾去該乾燥劑進行減壓濃縮。通過減壓濃縮得到的濃縮殘渣用製備矽膠色譜法(溶劑氯仿/丙酮＝2/1)進行精製，得到白色固體的化合物17(產量2.05g，收率94％)。
對製得的上述化合物17進行ESI-MS(正)測定，為m/z 375.1[(M+Na)+]。此外，進行1H-NMR(400MHz，CD3Cl)的結果為δ＝7.36(5H，m)，5.69(1H，bs t)，5.12(2H，s)，4.22，4.12(4H，s，s)，4.06(2H，d)，3.78，3.73(4H，s，s)。由此，可以確認化合物17的結構。
此外，為了得到化合物18，將化合物17(1.50g，4.26mmol)溶解於甲醇(20mL)中，加入2N的NaOH(9mL)，在0℃下攪拌2.5小時後，加入Dowex 50WX-8(H+型)中和直至pH達到6，濾去該Dowex 50WX-8進行減壓濃縮。在通過減壓濃縮得到的濃縮殘渣中加入水，濾去不溶物質後，進行減壓濃縮和冷凍乾燥，得到白色固體的化合物18(產量1.30g，收率98％)。
對製得的上述化合物18進行ESI-MS(負)測定，為m/z 321.1[(M-2H+Na)-]。此外，進行1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)的結果為δ＝7.32(5H，m)，7.21(1H，m)，5.01(2H，s)，3.93，3.84(4H，s，s)，3.72(2H，d，J＝5.4Hz)。由此，可以確認化合物18的結構。
然後，如下述通式(16)中所示，在2.5當量的FDPP、2.5當量的DIPEA、DMF中，將用Boc基保護芳香族胺基末端的化合物19(2.5當量)與上述化合物18反應，以60％的收率得到N-Boc胺衍生物(化合物20)。
然後，在MeOH中，在Pd/C存在下，進行接觸氫還原。對和化合物20縮合的上述Z-甘氨酸的Z-基進行脫保護，以92％的收率得到胺衍生物(化合物21)。
為了製得化合物19～21，具體地進行如下的操作。
即，為了製得化合物19，將4-氨基苯甲酸(3.33g，14.0mmol)和HOBt(1.93g，14.3mmol)在無水二氯甲烷(60mL)中懸濁，在氬氣氛圍下，在0℃下攪拌15分鐘後，加入將WSCI·HCl(2.87g，15.0mmol)溶於無水二氯甲烷(30mL)中而製成的WSCI·HCl溶液，攪拌50分鐘，製成4-氨基苯甲酸/HOBt反應溶液。將二乙胺(0.79mL，7.00mmol)加入到該4-氨基苯甲酸/HOBt反應溶液中，遮蔽光線在室溫下攪拌一晚，得到白色結晶。過濾得到該白色結晶後，用甲醇重結晶，得到白色結晶的化合物19。產量為3.53g(收率92.9％)。
對上述化合物19進行ESI-MS(正)測定，為m/z 542.4[(M+H)+]。此外，進行1H-NMR(400MHz，CD3Cl)的結果為δ＝7.77-7.74(4H，d，J＝8.7Hz)，7.50-7.48(4H，d，J＝8.6Hz)，3.70-3.66(4H，m，J＝5.2Hz)，3.34-3.28(4H，m，J＝5.6Hz)，1.53(18H，s)。由此，可以確認化合物19的結構。
此外，為了製得化合物20，將上述化合物18(50.0g，154μmol)、化合物19(209mg，386μmol)、FDPP(148mg，386μmol)溶於無水二甲基甲醯胺(3mL)後，加入二異丙基乙基胺(67.2μL，386μmol)，在氬氣氛圍下，在室溫下攪拌20小時後，製得化合物18/化合物19反應溶液。減壓濃縮該化合物18/化合物19反應溶液，得到的濃縮殘渣用氯仿萃取，有機層用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉水溶液清洗，使用無水硫酸鈉作為乾燥劑乾燥後，濾去該乾燥劑進行減壓濃縮。通過減壓濃縮得到的濃縮殘渣用製備矽膠色譜法(溶劑氯仿/甲醇＝10/1)進行精製，得到白色固體的化合物20(產量125mg，收率59％)。
對上述化合物20進行ESI-MS(正)測定，為m/z 1393.7[(M+Na)+]。此外，進行1H-NMR(400MHz，CD3Cl)的結果為δ＝7.88(1H，bs)，7.73-7.66(10H，m)，7.56(1H，bs)，7.38(4H，d，J＝8.4Hz)，7.34-7.29(6H，m)，7.17，7.05(2H，bs，bs)，5.35(1H，bs)，5.00(2H，s)，3.96(2H，bs)，3.64(4H，帶)，3.55(4H，帶)，3.51(6H，帶)，3.43，3.27，3.17(6H，bs，bs，bs)，1.50，1.49(36H，s，s)。由此，可以確認化合物20的結構。
此外，為了製得化合物21，將化合物20(103mg，74.4μmol)溶解於甲醇(3mL)，加入10％Pd/C(84mg)，在氫氣氛圍下，在室溫下攪拌47小時後，濾去上述Pd/C，進行減壓濃縮。得到白色固體的化合物21(產量84.9mg，收率92％)。
對製得的上述化合物21進行ESI-MS(正)測定，為m/z 630.5[(M+H+Na)2+]。由此，可以確認化合物21的結構。
進而，如下述通式(17)所示，在CH2Cl2/DMF＝4/1的混合溶劑中，在1.1當量的HOBt、1.0當量的WSCI·HCl的存在下，使上述化合物21和1.1當量的硫辛酸(化合物10)縮合，以75％的收率得到醯胺化合物(化合物22)。
進而，在CH2Cl2中，在存在TFA的酸性條件下，對上述Boc基進行脫保護，得到化合物23(收率91％以上)，即含有4條具有芳香族胺基的烴衍生鏈的鏈化合物。
為了得到化合物22、23，具體地進行如下的操作。
即，為了得到化合物22，將化合物10(12.8mg，62.2μmol)和HOBt(8.4mg，62.2μmol)溶解於無水二氯甲烷(10mL)，在氬氣氛圍下，在0℃下遮蔽光線攪拌，製成化合物10/HOBt反應溶液。然後將化合物21(70.0mg，56.5μmol)溶於二甲基甲醯胺(0.5mL)，滴加上述化合物10/HOBt反應溶液後，在室溫下攪拌19小時後，用乙酸乙酯萃取，得到萃取液。該萃取液的有機層用10％檸檬酸水溶液和飽和碳酸氫鈉水溶液各清洗1次，使用無水硫酸鈉作為乾燥劑乾燥後，濾去該乾燥劑進行減壓濃縮。通過減壓濃縮得到的濃縮殘渣用製備矽膠色譜法(溶劑氯仿/甲醇＝15/1)進行精製，得到白色固體的化合物22(產量60.8mg，收率75％)。
對製得的上述化合物22進行ESI-MS(正)測定，為m/z 735.3[(M+2Na)2+]。此外，進行1H-NMR(400MHz，CD3Cl)的結果為δ＝7.76-7.79(11H，m)，7.55(1H，bs)，7.42(4H，d，J＝8.6Hz)，7.35(5H，m)，7.13，7.00，6.97(3H，bs，bs，bs)，5.84(1H，bs)，4.04(2H，bs)，3.67(4H，帶)，3.55(4H，帶)，3.48(8H，帶)，3.41，3.29，3.22(6H，bs，bs，bs)，3.16-3.03(2H，m)，2.39(1H，m)，2.02(2H，m)，1.84(1H，m)，1.58-1.52(4H，m)，1.51，1.49(36H，s，s)，1.35(2H，m)。由此，可以確認化合物22的結構。
此外，為了製得化合物23，將化合物22(48.2mg，33.8μmol)溶解於二氯甲烷(1mL)中，加入三氟乙酸(2mL)，遮蔽光線在0℃下攪拌1小時後，進行減壓濃縮，得到的殘渣溶於甲醇，加入Dowex MarathonA(OH-型)中和。中和後，濾去該Dowex Marathon A，減壓濃縮，得到白色固體的化合物23(產量31.6mg，收率91％)。
對製得的上述化合物23進行ESI-MS(正)測定，為m/z 534.2[(M+2Na)2+]。由此，可以確認化合物23的結構。
使用在實施例3中得到的鏈化合物23，通過下述的步驟，合成具有前述通式(5)中m4、m5、m6、m7全為2、n為1且p1、p2為1的結構的配體。
如下述通式(18)所示，將實施例3中得到的鏈化合物23和作為下述通式(18)所示的糖分子的鏈化合物23(5當量)溶解於H2O/DMAc/AcOH＝5/20/1的混合溶劑中，在pH3～4，37℃下，形成席夫鹼(式中的亞胺型)，然後將溶劑變為H2O/DMAc/AcOH＝9/20/22的混合體系，在pH3～4，37℃下，加入64當量的NaBH3CN進行還原反應(式中的還原)。然後用Sephadex G-50，通過凝膠過濾色譜法對得到的化合物進行精製，再進行脫鹽處理，得到作為含有4單元糖分子的配體的化合物24。
為了製得化合物24，將鏈化合物23(0.5mg，488nmol)和化合物13(2.1mg，2.4μmol)溶解於水(25μL)、二甲基乙醯胺(100μL)和乙酸(5μL)的混合溶劑中，於密封管中在37℃下加熱3小時，得到鏈化合物23/化合物13反應液。將NaBH3CN(2.18mg，31.2μmol)溶解於乙酸(45μL)，加入到上述鏈化合物23/化合物13反應液中，在37℃下加熱3天後，減壓濃縮，用Sephadex G-50(1.6×80cm，PBS-0.3N NaCl)精製。對通過精製得到的目標餾分進行減壓濃縮，用Sephadex G-25(1.6×40cm，水)對濃縮殘渣進行脫鹽，對通過該脫鹽得到的餾分進行減壓濃縮，將其溶解於水進行冷凍乾燥，得到白色粉末的化合物24(產量1.0mg，收率47％)。
得到的化合物24的質量為4396.37道爾頓，由飛行時間型質譜分析計測定得到的m/z 1368.93的峰是以上述通式(18)中所示化合物24為3價離子[M-13Na+10H]3-的形式觀測到的。此外，質譜測定的結果為8＝7.70-7.55(8H，m)，6.78-6.64(8H，m)，5.34(4H，s)，5.20(8H，d，J＝3.3Hz)，5.15(4H，bs)，4.52(4H，bs)，4.29(8H，m)，4.19(8H，m)，4.05(4H，m)，3.99(4H，帶)，3.87-3.80(16H，帶)，3.73-3.66(24H，m)，3.87(3H，m)，3.57(12H，s)，3.49(4H，dd，J＝3.8，9.7)，3.39-3.34(14H，m)，3.26-3.19(12H，m)，2.60(1H，m)，2.21-2.13(2H，m)，1.77(1H，m)，1.50-1.13(4H，m)。由此，可以確認化合物24的結構。
使用在實施例2中得到的，具有在前述通式(4)中m1、m2、m3均為2、且n為1的結構的配體的化合物14，進行SPR測定。
即，通過在蒸鍍金屬膜的玻璃基板表面進行下述的操作，使配體(化合物14)固定化，觀測化合物14和作為肝素結合性蛋白質的重組[馮]維勒布蘭德因子(recombinant von Willebrand factor)(以下簡稱為rvWF)的結合過程。
(5-1配體引入晶片的製造)首先，把在13×20×0.7mm的玻璃基板上蒸鍍有50nm金薄膜的傳感晶片(日本レ-ザ-電子株式會社製造)放入UV臭氧清潔器(商品名NL-UV253，日本レ-ザ-電子株式會社)中，紫外線照射20分鐘，通過臭氧清潔傳感晶片的金表面。然後，將該傳感晶片安裝在培養池內的特氟隆(註冊商標)制培養池支架上，在該培養基內加入50mL 0.1mM的化合物14的甲醇溶液密封，在室溫下，使用Bio Dancer(商品名，NewBrunswick Scientific公司)，柔和地振蕩一晚。然後，用100μL甲醇清洗上述培養池6次，從特氟隆制培養池支架上拆下傳感晶片。接著將拆下的傳感器浸漬在充滿甲醇的皿中，平穩地振蕩以重複進行2次清洗操作，按照水、甲醇的順序與上述同樣地對傳感晶片進行清洗，得到配體引入晶片(配體載體)。風乾該配體引入晶片後，安裝到表面細胞質基因組共振裝置SPR670(商品名日本レ-ザ-電子株式會社)的傳感晶片盒(玻璃稜柱)中。
(5-2由配體引入晶片和蛋白質之間的疏水性相互作用引起的非特異性相互作用的研究)在上述得到的配體引入晶片上，在25℃的溫度條件下，以15μL/分鐘的流速，直到用上述表面細胞質基因組共振裝置測定的共振角度變化達到固定值，排出作為流態緩衝劑的磷酸緩衝溶液(PBS；pH7.4)。然後，將牛血清白蛋白(BSA)溶解於流態緩衝劑中配製成BSA溶液，將60μL該BSA溶液以15μL/分鐘的流速注入至配體引入晶片中，以使在SPR測定中作為蛋白質使用的BSA的濃度達到0.1mg/mL。
為了研究由流入上述BSA溶液的配體引入晶片表面的金和作為蛋白質的BSA之間的疏水性相互作用引起的非特異性相互作用，用表面細胞質基因組共振裝置測定時，基本沒有觀測到共鳴角度變化。由此，認為在使用引入化合物14而形成的配體引入晶片時，可以降低由蛋白質和配體引入晶片之間的非特異性相互作用產生的影響，因此可以定量地進行蛋白質和糖之間的結合相互作用的評價。
(5-3rvWF的解離常數的解析)除了在前述(5-1)中得到的配體引入晶片上使用rvWF溶液以代替上述(5-2)的BSA溶液以外，其餘按照與上述(5-2)同樣的步驟，將rvWF溶液注入至配體引入晶片表面。另外，配製rvWF溶液時，將rvWF溶解於上述流態緩衝劑中進行配製，以達到125nM～1600nM範圍的濃度。
改變上述rvWF溶液的濃度，將rvWF溶液注入至配體引入晶片表面，相對於rvWF溶液的注入時間(時間(秒))的經過，用表面細胞質基因組共振裝置測定研究基於化合物14和rvWF的結合所產生的響應(Response(RU；響應單位))。其結構如圖1所示。
另外，上述引入了rvWF的配體引入晶片可以通過在該配體引入晶片的表面上，以60μL/分鐘的流速流過10mM的NaOH達1分鐘以上進行再生，從而實現再利用。
此外，使用表面細胞質基因組共振裝置(SPR670)中附屬的軟體，根據作為配體的化合物14與rvWF的結合過程的觀測結果(圖1)，計算出解離常數(KD)、結合速度常數(Ka)、解離速度常數(Kd)的值。其結果如表1所示。
(表1)

根據文獻1中記載的步驟，製備含有1單元具有前述通式(10)所示結構的寡糖、具有下述通式(19)所示結構的配體的該化合物25。
然後，除了用上述化合物25代替前述化合物14以外，其餘按照和前述實施例5的(5-1)同樣的步驟，得到配體引入晶片。使用該配體引入晶片，按照和前述實施例5的(5-2)同樣的步驟，確認沒有發生由配體引入晶片和蛋白質之間的疏水性相互作用而引起的非特異性相互作用。然後，按照和前述實施例5的(5-3)同樣的步驟，將rvWF溶液注入至配體引入晶片表面，用表面細胞質基因組共振裝置測定伴隨著rvWF溶液的注入時間經過而產生的共振角度變化，研究化合物25和rvWF的結合過程。其結果如圖2所示。
此外，根據圖2，按照和前述實施例5的(5-3)同樣的步驟，計算出解離常數(KD)、結合速度常數(Ka)、解離速度常數(Kd)的值。其結果如表1所示。
如上述表1所示，可以看出，使用作為本實施例的配體的化合物14的配體引入晶片與使用化合物25的配體引入晶片相比，對於rvWF顯示出較高的親和性。由此可知，若使用本實施例的配體引入晶片，可以再現性良好地觀測糖分子的生物活性，上述配體引入晶片對於進行糖分子的結構解析和評價糖分子的生物活性是非常良好的。
另外，對於在本發明的最佳實施方式這部分內容中進行的具體實施方式
和實施例，嚴格地說，其是為了揭示本發明的技術內容而列舉的，本發明不應該被狹義地解釋為僅限於這些具體的示例，在本發明的宗旨和下面記載的權利要求的範圍內，可以進行各種變化而實施。
工業實用性如上所示，通過本發明，可以提供一種能夠將3單元或4單元的糖分子再現性良好地2維排列在蛋白質分析用等支撐體上的鏈化合物。此外，上述鏈化合物基本可以忽略由其和蛋白質之間的非特異性相互作用而產生的影響。
此外，本發明的配體是通過在上述鏈化合物中引入糖分子而形成的，由於可以使3單元或4單元的糖分子集合化，因此可以再現性良好地測定糖分子的生物活性。
因此，通過運用本發明的鏈化合物和配體，可以用於生物科技產業中，以檢測生物分子之間的相互作用。特別是可以用於採用晶片工藝和親和色譜柱的領域中。此外，也可以用於利用生物探測器和生物傳感器的領域，以及用於製藥領域和診斷·檢查等醫療技術中。
權利要求
1.一種鏈化合物，其特徵在於具有如通式(1) (式中，n為1到6的整數)所示的結構，上述X的結構中，具有由3或4條末端具有芳香族胺基、且主鏈上可以有碳-氮鍵的烴衍生鏈而形成的多分支結構部分。
2.權利要求1記載的鏈化合物，其特徵在於上述X具有通式(2) (式中m1、m2、m3各自獨立地是1到6的整數)所示的結構。
3.權利要求2記載的鏈化合物，其特徵在於在上述通式(2)中，m1、m2、m3全為2。
4.權利要求1記載的鏈化合物，其特徵在於上述X具有通式(3) (式中m4、m5、m6、m7、p1、p2各自獨立地是1到6的整數)所示的結構。
5.權利要求2記載的鏈化合物，其特徵在於在上述通式(3)中，m4、m5、m6、m7全為2，p1、p2均為1。
6.一種配體，其特徵在於其是通過在權利要求1至5中任一項記載的鏈化合物的芳香族胺基上引入糖分子而形成的。
7.權利要求6記載的配體，其特徵在於上述糖分子為選自單糖類、寡糖類、多糖類中的至少一種。
8.一種配體，其特徵在於具有通式(4) (式中m1、m2、m3、n各自獨立地是1到6的整數)所示的結構。
9.權利要求8記載的配體，其特徵在於在上述通式(4)中，m1、m2、m3全為2，n為1。
10.一種配體，其特徵在於具有通式(5) (式中m4、m5、m6、m7、n、p1、p2各自獨立地是1到6的整數)所示的結構。
11.權利要求10記載的配體，其特徵在於在上述通式(5)中，m4、m5、m6、m7全為2，n為1，p1、p2均為1。
12.一種鏈化合物的製備方法，其特徵在於包含下述工序將硫辛酸與具有3條或4條支鏈的胺化合物進行縮合反應的步驟，其中該支鏈的芳香族胺基末端被保護基團保護，和對上述芳香族胺基末端的保護基團進行脫保護的步驟。
13.一種鏈化合物的製備方法，其特徵在於使用權利要求1至5中任一項記載的鏈化合物和糖分子進行還原胺化反應。
14.一種將糖分子設置在支撐體表面上的糖分子的引入方法，其特徵在於將含有權利要求6至11中任何一項所記載的配體的溶液和表面具有金屬的支撐體接觸。
15.一種配體載體，其特徵在於使權利要求6至11中任何一項所記載的配體在表面具有金屬的支撐體上固定化。
16.權利要求15記載的配體載體，其特徵在於其用於表面細胞質基因組共振測定用的傳感晶片。
17.權利要求15記載的配體載體，其特徵在於其用於親和色譜法所用的柱中。
全文摘要
一種鏈化合物，其具有通式(1)，(式中，n為1到6的整數)所示的結構。上述X的結構中，具有由3或4條末端具有芳香族胺基且主鏈上可以有碳－氮鍵的烴衍生鏈而形成的多分支結構部分。此外，配體是通過將上述鏈化合物引入糖分子而形成的。
文檔編號C07K5/00GK1688598SQ0382453
公開日2005年10月26日 申請日期2003年9月8日 優先權日2002年9月9日
發明者隅田泰生, 荒野明男, 楠本正一, 麥可·索貝爾 申請人:獨立行政法人科學技術振興機構, 國立大學法人鹿兒島大學