利用轉拼核酶摘除細胞的製作方法

2023-05-05 12:04:36 2

專利名稱：利用轉拼核酶摘除細胞的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的轉拼核酶以及利用這些核酶摘除細胞的方法。
Ⅰ.Ⅰ組內含子具有催化活性的RNA分子稱為核酶或RNA酶(Cech，T.R.，Ann.Rev.Biochen′.59543-568(1990))。嗜熱四膜蟲(Tetrahy-mena thermophila)前體rRNA含有能夠催化其自身切割的內含子(核酶)。該核酶是一組結構上相關的Ⅰ組內含子中的一種。
修飾過的嗜熱四膜蟲內含子的拼接活性需要有鳥苷輔因子和二價陽離子(Mg++或Mn++)存在，並且是通過兩個連續的轉酯反應(

圖1)發生的。首先，游離的鳥苷與核酶結合且其3′羥基被置於攻擊5′拼接位點的磷原子的位置。鳥苷共價連接於內含子序列並釋放出5′外顯子。接著，新釋放出的5′外顯子的3′羥基與位於3′拼接位點的磷酸二酯鍵反應，從而產生連接的外顯子序列。然後，切除的內含子通過一系列的轉酯反應(涉及其3′羥基和內部序列)形成縮短了的環形分子。
從化學上講，這些連續反應是相似的並且都發生在單一活性位點。自拼反應的特徵在於交替RNA結構的形成，因為不同的RNA鏈均在高度保守的內含子周圍形成了類似的構象。拼接需要對準位於稱作「內部指導序列」(或IGS)的互補序列內含子一外顯子接點。
在5′拼接位點進行的首次切割需要在IGS和與拼接位點相鄰的序列之間形成鹼基配對的螺旋(P1)。該螺旋中UG「變位」鹼基對的存在可限定將在核酶的催化反應中破壞磷酸二酯鍵。該鍵斷裂後，部分P1螺旋被取代，且由於IGS和與3′拼接位點相鄰的序列之間的互補性而形成了新螺旋(P10)。不變的鳥苷殘基位於3′拼接位點處的磷酸二酯之前，如同P1序列中被取代的部分一樣。因此，外顯子的連接僅在新的外顯子序列取代了內含子序列之處以與第一次切割反應相反的方向發生。應當指出，緊接外顯子連接反應的內含子環化反應同樣也涉及5′序列與IGS的鹼基配對，而且反應是由內含子末端鳥苷殘基的3′羥基介導的(Been，M.D.et al.，「Selection of Circularization Sites In A Group I IVS RNA Requires Multiple Alignments of An Internal Template-Like Sequence，」Cell50951(1987))。
Ⅱ.催化活性為了更好地確定Ⅰ組內含子的結構和催化性質，已從嗜熱四膜蟲內含子「核心」中剝去外顯子序列。Cech，T.R，等(WO 88/04300)曾指出，嗜熱四膜蟲內含子核酶至少具有三種催化活性(1)脫磷酸活性，它能夠以序列特異性方式除去RNA3′末端的磷酸，(2)RNA聚合酶活性(核苷酸基轉移酶)，它能夠催化寡核糖核苷酸轉化為多核糖核苷酸，(3)序列特異性核糖核酸內切酶活性。
分離的核酶活性能夠與底物RAN進行相互轉移作用，且已對這類反應進行過鑑定。例如，當將平末端形式的內含子和對應於5′拼接點的序列一起保溫時，該位點受到類似於拼接第一步的鳥苷依賴性切割。底物與核糖核酸內切的內含子RNA進行鹼基配對，形成螺旋P1，且切割發生在第4-6位的UG鹼基對之後。通過系統發育比較和突變分析發現，只要維持了P1螺旋的鹼基配對，緊接5′拼接位點處保守尿嘧啶殘基的序列的性質對催化作用並不重要(Doudna，J.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA867402-7406(1989))。
選擇3′拼接位點所需的序列似乎主要位於內含子本身的結構內，它包括螺旋P9.0以及隨後的確定3′內含子邊界的鳥苷殘基。但是，如同突變分析所顯示的一樣，3′外顯子內的側翼序列是形成螺旋P10以及進行有效拼接所必需的(Suh，E.R.et al.，Mol.Cell.Biol.102960-2965(1990))。另外，利用平末端形式的內含子和「外部」指導序列以及已被5′鳥苷殘基延長的寡核苷酸，已將寡核苷酸轉移連接。在連接之前，通過在外部模板上形成類似於P10的螺旋而單獨對準對應於3′外顯子序列的底物寡核苷酸(Doudna，J.A.et al.，Nature339519-522(1989))。
通過將分散的「雜交」區操縱至核酶而將核酶的切割活性對準於特定的RNA，該雜交區能夠與所需的RNA特異雜交。例如，Ger-lach，W。L等(EP321 201)構建出一種含有與靶RNA互補的序列的核酶。通過增加該互被序列的長度可提高該序列對靶RNA的親和性。但是，該核酶的雜交區和切割區彼此整合。通過互補區與靶RNA雜交後，核糖酶的催化區切割該靶。它提示核酶將可在體內用於滅活或切割靶RNA，從而可用於例如治療由於外源宿主RNA的產生所引起的人體疾病。但是，由核酶指導的轉拼(與轉切相反)則未曾提到或揭示過。
已對各種天然存在的核酶的核糖核酸內切酶活性(切割活性)進行過廣泛研究。對這些核酶的結構和序列進行分析後發現，切割位點周圍的某些核苷酸非常保守，而其側翼序列則並非如此。這一情況導致人們設計出自然界尚未發現的新的核糖核酸內切酶活性。例如，Cech等人已構建出改變了底物序列特異性的新核酶(Cech，T.R.et al.，WO 88/04300;Koizumi，M.et al.，FEBS Lett.239295-288(1988);Haseloff，J.et al.，Nature 334585-591(1987);及Heus，H.A.et al.，Nucl Acids Res.181103-1108(1990))。根據自身切割植物類病毒和衛星RNA方面的早期研究(Buzayan，J.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838859-8862(1986))，已為能夠以高度序列特異性方式轉移切割其它RNA分子的核酶的設計建立了指南(Haseloff，J.et al.，Nature334585-591(1988))。但是，這些構建物並不能夠有效地催化針對轉拼的反應。
分離RNA上含有的外顯子的連接(即轉拼)在自然界發現於snRNP介導的以及自我催化的Ⅰ組和Ⅱ組內含子中。在錐蟲及Caenorhabditis eleqans mRNA中，共同的5′前導序列是由各自的基因上轉錄並被拼接到mRNA的3′部分(Agabian，N.，Cell611157-11600(1990);Hirsh，D.et al.，Mol.Biol.Rep.14115(1990))。這些小的「拼接前導」RNA(slRNA)由已融合至在哺乳動物snRNA拼接提取物中能夠從功能上取代U1 snRNA的序列的5′外顯子構成。
另外，Ⅰ組和Ⅱ組自拼內含子均能夠在人工系統中轉移連接外顯子(Been，M.D.et al.，Cell47207-216(1986);Galloway-salvo，J.L.et al.，J.Mol.Biol.211537-549(1990);Jacquier，A.et al.，Science2341099-1194(1986);和Jarrell，K.A.et al.，Mol.Cell Biol.82361-2366(1988))。Ⅱ組內含子的體內轉拼發生在葉綠體的拼接基因中(Kohchi，T.et al.，Nucl.Acids Res.1610025-10036(1988))，且Ⅰ組內含子的體內轉拼在大腸桿菌的人工拼接基因中得到顯示(Galloway-Salvo，J.L.et al.，J.Mol.Biol.211537-549(1990))。在後一情況下，含有Ⅰ組內含子的噬菌體T4胸苷酸合成酶基因(td)在連接內含子螺旋p6a的環處被斷開。已證實td基因片段的轉錄物經過體外轉拼拼營救發生機能障礙的大腸桿菌宿主細胞。已知的鹼基配對(p3、p6和p6a)和內含子片段之間可能的三級反應使得基因片段能夠正確裝配和加工。
在體外，四膜蟲核酶能夠催化單鏈寡核糖核苷酸底物的轉拼。其中有四個成分是必需的核酶、3′單鏈RNA、5′外顯子和GTP。在該反應中使用了縮短形式的四膜蟲核酶(L-21 Sca I IVS RNA(起始於內部指導序列並終止於U409)(Flanegan，J.B.et al.，J.Cell.Biochem.(Supp.)12 part D28(1988))。由GTP在5′拼接位點所進行的攻擊釋放5′外顯子，接著，該5′外顯子在3′拼接位點進行的轉酯反應中被核酶連接至3′外顯子。
已有人提出在體內用核酶代替反義RNA對準和破壞特定的RNA(Gerlach，W.L.et al.，EP2，21，201;Cotten，M.，Trends Biotechnol.8174-178(1990);Cotten，M.et al.，EMBO J.83861-3866(1989);Sarver，N.et al.，Science 2471222-1225(1990))。例如，已有人提出，對於HIV-1感染期間所表達出的RNA具有核酸內切催化活性的核酶的表達可作為一種抵抗1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的可能治療方法(Sarver，N.et al.，Science 2471222-1225(1990);Cooper，M.，CDC AIDS Weck-ly，April 3，1989，page2;Rossi，J.J.，Abstract of Grant No.IROIAI29329 in Dialog's Federal Research in Progress File 265)。但是，這一想法並未獲得成功。
在為調查核酶作為治療1型人體免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的治療劑的替在應用而進行的研究中，hammerhead motif核酶(Hutchins，C.J.et al.，Nucl.Acids Res.143627(1986);Keese，P.et al.，in Viroids and Viroid-like Pathogens，J.S.Se-mancik，ed.，CRC Press，Boca Raton，FL，1987，PP1-47)所作用的是HIV-1 gag轉錄本。作用於gag的核酶在人細胞培養物中的表達導致HIV-1 gag RNA及抗原p24水平的下降(但不是完全喪失)(Sarver，N.et al.，Science 2471222-1225(1990))。因此，Sarver氏核酶的醫療效果受其低效所限，因為任何逃脫的致病RNA都會給宿主帶來問題。
在體內應用核酶的另一個問題是，為了在核提取物中發揮核酶的抑制功能需要有高比值的核酶/底物，而這一比值難以達到。Cot-ton等通過顯微注射法獲得了高比值的核酶/底物，它是將含有與強tRNA啟動子(聚合酶Ⅲ啟動子)可操縱連接的核酶產生基因的表達盒與含有核酶切割序列的底物RNA一起注射進蛙卵母細胞中(Cotton，M.et al.，EMBO J.83861-3866(1089))。但是，對於多細胞生物來說顯微注射不是一種合適的給藥方法。
抗編碼大腸桿菌β-半乳糖苷酶的mRNA的核酶體內活性已有報導(Chuat，J.-C.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1621025-1029(1989))。但是，這一活性只有當核酶和靶被轉染至細菌細胞內的同一分子上時才能觀察到。當作用於自具有β-半乳糖苷酶基因的靶部分的細菌F游離基因轉錄的mRNA時，核酶的活性無效。
因此，目前對核酶活性的技術應用僅限於利用核酶的切割活性以破壞靶RNA的活性。不幸的是，為了保證其效力這類應用常常需要完全破壞所有的靶RNA分子和/或需要相對高比值的核酶/底物，而這一高比值難得達到。更重要的是，現有技術中修飾過的核酶不能夠有效、定向地轉拼。
因此需要開發高度有效的核酶和核酶表達系統。尤其是，現有技術中沒有提到通過將新RNA序列轉拼至宿主RNA來破壞已有的RNA序列或改變已有RNA的編碼序列的有效方法。
鑑於設計新核酶的可能性以及對在體內改變高等真核生物遺傳特徵的有效方法的需要的認識，本發明人對利用核酶在體內改變天然RNA遺傳信息進行過研究。這些努力的結果是開發出高度有效的轉拼核酶並為其操作建立了指南。
按照本發明，首先提供了一種RNA或DNA分子，該分子編碼轉拼核酶，而該核酶能夠在體外或體內以高度精確的方式將新的3′外顯子序列有效地拼接至任何選定的靶RNA序列中，並且這種RNA或DNA分子在調節任何選定的靶RNA或3′外顯子序列的能力以及在加進了增強該核酶特異性的互短序列方面是新的。
按照本發明，也提供了一種編碼核酶的RNA或DNA分子，而為該核酶編碼的序列是一融合RNA，該融合RNA產生出可以使核酶與靶RNA雜交的第一RNA序列以及能夠轉位至靶RNA中去的第二RNA序列。且該第二RNA序列編碼出一種異源於靶RNA序列的RNA序列。
按照本發明，也提供了一種編碼核酶的RNA或DNA分子，而編碼該核酶的序列為上面所述的融合RNA，由融合RNA產生的第一RNA序列是一種使得該RNA分子與GAL4 RNA雜交的序列，且融合RNA的第二RNA序列提供白喉毒素A鏈(DTA)的編碼序列。
按照本發明，也提供了一種RNA或DNA分子，它編碼的是構象被破壞的本發明核酶(核酶原)，該核酶原由底物激活，即，該核酶原在與靶RNA發生特異性反應而被重新激活之前只有微不足道的或沒有自切或轉拼活性。
按照本發明，也提供了含有核酶或核酶原表達盒的RNA或DNA分子。該表達盒能夠穩定地插入至宿主基因組中，該表達盒產生能夠在宿主中起作用的啟動子序列，而該序列與本發明的核酶或核酶原序列可操縱地連接。
按照本發明，也提供了含有核酶或核酶原表達盒的RNA或DNA分子。該表達盒能夠穩定地插入至宿主基因組中，該核酶表達盒產生應答GAL4的啟動子序列，而該序列與本發明的核酶或核酶原序列可操縱地連接。
按照本發明，也提供了一種體外轉拼的方法，該方法包括以下步驟(1)在體外提供本發明的核酶或核酶原以及適合於該核酶的底物，(2)提供促進所需的該核酶或核酶原催化活性的體外反應條件，(3)使該核酶或核酶原與該底物在該條件下反應。
按照本發明，也提供了一種體內轉拼的方法，該方法包括以下步驟(1)將本發明的RNA或DNA分子提供給宿主細胞，(2)在該宿主細胞中表達由該分子所編碼的核酶或核酶原，(3)在該宿主細胞中表達該核酶或核酶原底物，(4)將該核酶或核酶原與該底物在該宿主細胞中反應。
按照本發明，也提供了一種滅活靶RNA活性的方法，該方法包括(1)提供本發明的核酶或核酶原，該核酶或核酶原對靶RNA具有催化活性，(2)提供該靶RNA，和(3)提供使該核酶或核酶原表達其作用於靶RNA的催化活性的條件。
按照本發明，也提供了一種在體內為宿主細胞提供所需遺傳序列的方法，該方法包括(1)為所需宿主細胞提供本發明的核酶或酶原，該核酶或核酶原在該宿主細胞中對靶RNA具有催化活性，(2)提供編碼該所需遺傳序列的該核酶或核酶原，(3)提供條件使得該核酶或核酶原將該所需的遺傳序列轉拼至靶RNA序列中。
按照本發明，也提供了一種摘除多細胞動物或植物細胞的方法，該方法包括將本發明的核酶或核酶原提供給任何宿主細胞(尤其是受精的胚胎宿主細胞)，該核酶或核酶原編碼對該宿主細胞有毒的基因序列，且該核酶或核酶原能夠在該宿主細胞中與所需的靶轉拼。
按照本發明，也提供了一種對農業上重要的植物種進行雄性或雌性不育處理的方法，該方法包括利用本發明的核酶或核酶原摘除受精所需的任何細胞。
按照本發明，也提供了一種對植物進行抗病原菌免疫的方法，該方法包括構建能夠表達本發明的植物病原菌特異性融合核酶或核酶原的轉基因植株，該核酶或核酶原能夠摘除被該病原體感染的任何宿主細胞。
按照本發明，也提供了一種轉化的、抗病原菌微生物，該微生物被本發明的核酶或核酶原所轉化，而該核酶或核酶原對該病原體所表達的核酸分子具有催化活性。
按照本發明，還提供了一種能夠將所需的核酶或核酶原活性傳遞給所需宿主的病毒病原體，該核酶或核酶原活性由本發明的核酶或核酶原傳遞。
圖1是Ⅰ組內含子的核酶拼接機制示意圖。
圖2是(A)嗜熱四膜蟲rRNA內含子;(B)本發明靶mRNA和轉拼核酶或核酶原的結構示意圖。
圖3(A)是CAT-LacZ α-肽轉拼核酶的設計圖;(B)是CAT-LacZ核酶的完整DNA編碼序列。
圖4表示黃瓜花葉病毒(CMV)RNA4轉拼核酶的序列。A病毒RNA靶序列;B寡核苷酸靶序列;CCMV RNA4-白喉毒素A鏈轉拼核酶。
圖5是黃瓜花葉病毒3/4序列的比較。
圖6(A)是Gal4-白喉毒素A(DTA)轉拼核酶的設計圖;(B)是具有異亮氨酸取代基的Gal4-DTA核酶的完整編碼序列。
圖7是用於表達Gal4蛋白的p-成分介導的「增強子-誘捕」法示意圖。
圖8表示了野生型DTA和DTA3′外顯子突變體的部分序列。
圖9是pGaTB和pGaTN的酶切圖譜。
圖10是pUAST的酶切圖譜。
圖11是表達Gal4-DTA轉拼核酶的果蠅胚表皮製品。
圖12表示了「核酶原」設計的基本原理。箭頭顯示核酶切割位點，「反義」區用黑色表示，輻射狀陰影表示催化區，淺陰影表示3′「外顯子」序列。在沒有靶mRNA的情況下，轉拼核酶可進行瞬時鹼基配對，並與異源序列(包括其自身)反應。另外，在「3′外顯子」連接區將發生剪切。所構建的無活性「核酶原」含有額外的自身互補序列，該序列引起核酶的催化中心誤疊。只有當與所需的靶mRNA進行鹼基配對並且幹擾二級結構接著被取代後，才會形成具有活性的核酶。
圖13顯示了CAT-LacZ轉拼核酶的序列及其估計的二級結構。核酶「核心」序列被塗成陰影(按照Cech，Gene 73259-271(1988))。其中顯示了未修飾核酶和核酶原1和2所作用的螺旋p8，它們分別具有13和18個核苷酸的互補於「反義」區(已標明)的序列。
圖14(1)顯示了活化的CAT-LacZ核酶，反義，具有螺旋p8和3′「外顯子」序列的核酶區;(2)(a)顯示了在修飾過的螺旋p8的序列與「反義」區之間進行了鹼基配對的無活性CAT-LacZ核酶原2;(b)與CAT mRNA鹼基配對以取代螺旋p1-「反義」配對並重新形成螺旋P1後具有活性的核酶原。
圖15顯示了CAT-LacZ核酶原轉錄本的穩定性。用EcoRI切割含有CAT-LacZ核酶和核酶原序列的質粒，並利用T7或SP6 RNA聚合酶及〔32p〕UTP進行轉錄。在7M尿素和25%的甲醯胺中通過5%聚丙烯醯胺凝膠電泳對放射性標記的轉錄本進行分級分離。核酶轉錄本受到深度水解(主要在「3′外顯子」連接處)。而核酶原則明顯地很少反應。
圖16顯示了CAT-LacZ核酶原的核糖核酸內切酶活性。用ScaI切割含有CAT-LacZ核酶和核酶原序列的質粒，並用T7或SP6 RNA聚合酶進行轉錄。在40mM Tris-HCl(PH7.5)、6mM MgCl2、2mM亞精胺、10mM NaCl、2mM GTP中將轉錄本與放射性標記的CAT RNA(由T7 RNA聚合酶自PuvⅡ切割的質粒轉錄)一起分別於37℃、45℃和50℃保溫30分鐘。然後在7M尿素和25%甲醯胺中通過5%聚丙烯醯胺凝膠電泳對產物進行分級分離，並放射自顯影。由RNA介導的173核苷酸CAT RNA的切割產生分別為76和97個核苷酸的5′和3′片段。
圖17顯示了用於核酶原設計的「野生型」和修飾過的螺旋p8，它具有圖示的可能的鹼基配對。與相應核酶原的「反義」部分互補的鹼基以黑體形式表示。在每一螺旋邊列出了互補鹼基的數目。螺旋由相應的核酶轉錄本的穩定性控制，如同通過體外轉錄過程中「3′外顯子」水解程度所測定的一樣。
圖18顯示了GAL4-DTA核酶原的穩定性。用XhoI使含有核酶和核酶原序列的質粒開環，並利用T7 RNA聚合酶進行轉錄。將轉錄本於50℃在40mM Tris-HCl(PH7.5)、6mM MgCl2、2mM亞精胺、10mM NaCl、1mM GTP中保溫60分鐘，然後在7M尿素及25%甲醯胺中通過5%聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分級分離，並進行放射自顯影。在上述條件下核酶轉錄本大量水解，而核酶原1水解較少，核酶原2則很穩定。
1、定義在以下的敘述中，使用了重組DNA(rDNA)技術領域所廣泛利用的各種術語。為了對本發明的說明書和權利要求書(包括這些術語的給定範圍)有一個清楚和一致的理解，下面對其進行定義。
核酶遺傳上具有催化活性的RNA分子。
轉拼一種遺傳操作形式，由此，第一多核苷酸的核酸序列被共同線性連接至或插入至第二核苷酸的序列中，並保留了這些多聚核苷酸之間的3′→5′磷酸二酯鍵。「定向」轉拼或「底物特異性」轉拼指需要特定RNA(即專用於拼接轉換序列的RNA)作為轉拼反應底物的轉拼反應。如果設計出針對於相應套RNA上出現的靶序列的核酶或核酶原，則定向轉拼可作用於一個以上的RNA。
靶RNA作為本發明核酶或核酶原催化活性底物的RNA分子。
表達盒為本發明核酶或核酶原的表達提供所需序列的遺傳序列。
穩定將序列「穩定地」插入基因組是指以導致該序列在該基因組的拷貝中遺傳的方式進行插入。
可操縱的連接指將一序列與另一序列相連以改變該序列功能的發揮的連接。例如，通過將核酶或核酶原編碼序列可操縱地連接於啟動子，就可將核酶或核酶原編碼序列的表達置於該啟動子的控制之下。如果啟動子功能的誘導導致核酶或核酶原編碼序列的轉錄且如果這兩個序列之間鍵合的性質沒有(1)導致移碼突變的引入(2)影響指導核酶表達的表達調節序列的能力，則可將這兩個核酸序列(如核酶或核酶原編碼序列及在編碼序列5′端的啟動子區序列)稱作被可操縱的連接。因此，如果啟動子能夠引起該核酸序列的合成，則啟動子區是與核酸序列可操縱地連接的。
Ⅱ.本發明核酶的操縱本發明的轉拼核酶、核酶原和方法首次提供了能夠定向轉拼至任何RNA序列，尤其是成熟(不含內含子)的mRNA中的核酶。這裡所述的與靶的互補性得到延長的轉拼核酶與現有技術中所述的得自嗜熱四膜蟲的核糖核酸內切酶活性極不相同。本發明核酶互補性的增加提高了它對靶的親和性和特異性，且該互補性並不是催化活性不可缺少的部分。另外，在無變性劑和含有高濃度Mg++的情況下切割有效而精確地發生。
這裡所述的設計轉拼核酶的準則是保守的，它基於Ⅰ組自拼內含子的突出性質，其目的是為任何定向轉拼核酶的設計提供一個總方案。因此，這裡所提出的準則並不限於嗜熱四膜蟲前mRNA的Ⅰ組內含子，本領域技術人員可根據這些準則和已有知識設計出具有其它的Ⅰ組內含子的本發明核酶。
在下面的嗜熱四膜蟲染色體外rDNA序列中，天然嗜熱四膜蟲核酶(內含子序列)位於53-465鹼基之間。
TGACGCAATT CAACCAAGCG CGGGTAAACG GCGGGAGTAA CTATGACTCTCTAAATAGCA ATATTTACCT TTGGAGGGAA AAGTTATCAG GCATGCACCTCCTAGCTAGT CTTTAAACCA ATAGATTGCA TCGGTTTAAA AGGCAAGACCGTCAAATTGC GGGAAAGGGG TCAACAGCCG TTCAGTACCA AGTCTCAGGGGAAACTTTGA CATGGCCTTG CAAAGGGTAT GGTAATAAGC TGACGGACATGGTCCTAACC ACGCAGCCAA GTCCTAAGTC AACAGATCTT CTGTTGATATGGATGCAGTT CACAGACTAA ATGTCGGTCG GGGAAGATGT ATTCTTCTCATAAGATATAG TCGGACCTCT CCTTAATGGG AGGTAGCGGA TGAATGGATGCAACACTGGA GCCGCTGGGA ACTAATTTGT ATGCGAAAGT ATATTGATTAGTTTTGGAGT ACTCGTAAGG TAGCCAAATG CCTCGTCATC TAATTAGTGACGCGCATGAA TGGATTA [SEQ ID NO.1](Kan，N.C. et al.，Nucl.Acids Res. 102809-2822(1982)).
如這裡所述，利用該內含子的催化核心對本發明的定向轉拼核酶進行操縱。利用已知方法可分離出內含子及其催化核心。內含子的催化核心(即平頭內含子)與全長內含子的不同僅在於它在ScaI位點被剪平，從而除去了內含子的最後5個核苷酸。該平頭內含子RNA可按已知技術製備或通過商業途徑以藥盒的形式得到，例如購自US Biochemical，Clevelend，OH的產品＃72000(RNAzymeTMTel 1.0kit)。該US Biochemical kit提供了核酶以及使用方法。可利用轉錄的Tet.1 cDNA作為如下所述的聚合酶鏈反應(PCR)突變的底物以產生合成的轉拼酶。
本發明核酶的底物特異性(即核酶「對準」作為底物的特定RNA的能力)是通過將特異於靶(底物)RNA的互補序列融合於核酶的5′末端而產生的。
本發明核酶的定向轉拼特異性(即利用靶RNA的序列轉拼所需外源序列的特異性)是通過在核酶的3′端產生新的3′外顯子而獲得的。下面提供了設計的詳情。
為了改變Ⅰ組內含子的結構和催化性質，用外顯子序列取代該內含子的側翼序列以使得僅保留了內含子的催化核心(核酶)。所產生的修飾過的核酶能夠與底物RNA進行轉拼反應。當將平末端形式的內含子(即催化「核心」，在ScaI位點處平切以除去內含子的最後5個核苷酸)與天然核酶5′拼接連接處相應的序列一起保溫時，該位點按與拼接第一步相同的方式進行鳥苷依賴性切割。
對本發明的核酶進行操縱需要考慮到以下四個準則。
首先，拼接位點必須選擇在靶RNA內。在最後的轉拼複合物中，只有P1雙螺旋的5′部分受靶RNA的作用。在緊接所需拼接位點的5′端僅需要唯一的一個保守殘基(尿嘧啶)，這是對靶RNA序列的唯一要求。對靶RNA沒有天然結構要求。所作用的可能是成熟的mRNA，並在細胞質中完成轉拼反應，而不是在細胞核中作用於前mRNA。從而避免了對細胞核中高濃度核酶的需要。
其次，在選定了特定的靶序列後，必須將補償序列更換加至核酶的5′部分，以在靶和核酶RNA之間形成合適的螺旋P1。所非常需要的是，螺旋P1應在預期的5′拼接位點處含有UG鹼基對並應位於從螺旋的底部開始的第4、第5(優選)或第6位(Doudna，J.A.，et al.，「RNA Structure，Not Sequence Determines The 5′Splice-Site Specificity of a Group I Intron，」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 867402-7406(1989)，在此引用以作參考))。對於天然嗜熱四膜蟲內含子，P1比預期的5′拼接位點延長3個鹼基對，並且在一優選實施方案中，它在本發明的轉拼核酶中被維持。為使轉拼有效，底物和核糖核酸內切內含子RNA必須進行鹼基配對的形成螺旋P1，並帶有所產生的變位UG鹼基對。靶RNA的切割發生在緊接UG鹼基對3′端的磷酸二酯鍵處。系統發育比較和突變分析表明，只要螺旋P1的鹼基配對得以維持，緊接5′拼接位點處保守尿嘧啶殘基的序列的性質對催化並不重要。
第三，必須選擇3′拼接位點側翼的外顯子序列，並根據需要在核酶的5′部分進行調整以形成穩定的P10螺旋。儘管P10螺旋在某些情況下可以省卻，但它的存在可增強拼接，且在本發明核酶的優選實施方案中保留了P10螺旋(Suh，E.R.et al.，「Base pair-ing Betueen The 3′ Exon And An Internal Guide Sequence Increases 3′ Splice Site Specificity in theTetrahymena Self-Splicing rRNA Intron，」Mol.Cell.Biol.102960-2965(1990))。螺旋P1和P10沿嗜熱四膜蟲內含子內含子IGs重疊且緊接5′和3′拼接位點的第二和第三個殘基與IGS中的相同殘基互補(圖2)。雖然這一點可能有某些優越性，但許多天然Ⅰ組內含子並不受這一約束。因此，對3′外顯子序列的選擇主要是出於對實驗的考慮。這種考慮反映了在選擇拼接位點上的廣泛靈活性。例如，如果需要將兩種序列在某一特定位點進行連接，則該位點處的序列不能因轉拼而突變或發生其它變化。如果重疊序列不另外對所需拼接位點進行調節P1或P10均可被縮短。
選擇3′拼接位點所需要的序列似乎主要位於內含子(核酶)本身的結構中，其中包括螺旋P9.0和鄰接3′端的劃定3′內含子邊界的鳥苷殘基。P9.0完全包含在內含子序列中並幫助確定鄰接的3′拼接位點。為設計轉拼，P9.0螺旋及內含子中其餘的功能RNA成分未被改變。P9.0螺旋的結構特徵是已知的(Michael，F.et al.，「The Guanosine Binding Site of the Tetrahymona Ribozyme」Na-ture342391-395(1989))。但是，3′外顯子中的側翼序列是形成螺旋P10和有效拼接所必需的，如同突變分析所顯出的一樣。
第四，將互補序列區置於轉拼核酶的5′末端以增加其對靶RNA的親和性和特異性。如這裡所示，使用了約40個殘基的任意長度。只要不影響所需效果也可使用其它長度。
例如，由如下嗜熱四膜蟲自拼內含子開始
(在上圖以及整個申請文本的其它核酶圖中，「1」和「2」分別表示第1和第2拼接位點)。
(1)在選定的靶RNA內尿嘧啶殘基的相鄰處選擇「5′」位點。引起互補性的序列與引起P1螺旋形成的序列並不是緊密相連，而是分開的，例如被也引起P10形成的5個核苷酸所隔開;
(2)將與選定的RNA互補的序列融合至自拼Ⅰ組內含子的5′部分。核酶和靶RNA之間的鹼基配對導致螺旋P1的形成;
(3)將選定的「3′外顯子」融合至核酶的3′部分，並維持保守的螺旋P10;及
(4)如果需要增加對靶RNA的親和性，將延長序列互補性的部分融進核酶的5′部分以形成30-40個鹼基對。
所產生的轉拼核酶與其靶RNA的排列用下圖顯示。頂上行表示靶RNA序列。核酶序列在其下排列，在其下兩行5′和3′以及核酶的P1和P10的核苷酸雜交的區域內可看到一連續序列。
按照本發明所設計的轉拼核酶將轉拼幾乎任何RNA序列至任何RNA靶上。並不需要使該靶含有內含子序列或者使該核酶為靶序列中的內含子。例如，用於這一設計的方案可包括(1)鑑定所需的靶RNA，(2)對該所需的靶RNA或其一部分進行克隆和/或序列分析，(3)篩選轉拼至靶RNA中去的所需編碼序列，(4)利用這裡所述的準則構建能夠與該靶雜交的本發明核酶，(5)證實本發明的核酶將利用該靶作為所需特定轉拼反應的底物，(6)將核酶插入至所需宿主細胞中。
對靶RNA的選擇將反映出所需轉拼反應的目的。如果反應的目的是滅活特定的RNA，則該RNA必須在破壞由該RNA編碼的所有功能肽區的位置以及在不導致不需要的遺傳序列連續表達的位置被轉拼。如果存在一個以上的編碼該RNA的基因的等位基因，則所設計的核酶最好能夠在所有表達形式所共有的位點滅活靶RNA。或者，給細胞提供一個以上的核酶，而每一核酶被設計成滅活靶RNA的特定等位基因的形式。
當僅需要滅活靶RNA而不需要表達新的所需RNA序列時，並不需要由核酶代表的外源RNA產生能夠被宿主細胞翻譯的序列，且可利用含有翻譯終止密碼子的序列作為平末端內含子，例如在ScaI位點切平的內含子核酶。
如果轉拼反應的目的是為宿主細胞提供遺傳特性，則對靶RNA的選擇將反映出所需遺傳特性的表達方式。如果需要使遺傳特性被宿主連續表達，那麼靶RNA也應被連續表達。如果需要使遺傳特性僅在所需的生長、內分泌或環境條件下進行選擇性表達，那麼靶RNA也應在同樣條件下被選擇性地表達。
如果核酶的底物並不另外存在於宿主中，則不需要使核酶本身的表達專門限於在所需的生長、內分泌或環境條件下，因為核酶本身並不被宿主轉譯。因此，在發生轉拼行為之前由本發明核酶所代表的RNA編碼的序列並未在宿主中被翻譯，且該轉拼行為可被宿主中核酶底物的表達所控制。
如果需要的話，可對核酶的表達進行操縱，使其發生應答於誘導調節的靶表達的相同因素，或對核酶的表達進行操縱以產生另一水平的調節，使得轉拼行為的發生僅限於在某些條件下，在該條件下核酶和靶均在細胞中僅被不同因素所選擇性地誘導，而這些因素的結合則是不希望有的行為。這種調節將使得宿主細胞在核酶自身不被共同表達的條件下表達核酶靶。
與靶RNA雜交的核酶區的序列是由靶RNA的序列決定的。靶RNA的序列是在克隆編碼該RNA的序列之後或在對由該靶RNA編碼的多肽進行序列分析並由此推斷出編碼這種肽的RNA序列之後而確定的。可採用本領域已知的克隆技術對編碼靶RNA的序列進行克隆。
可被轉拼到靶RNA中的預期序列(在此稱為「轉拼序列」)的選擇可體現轉拼的意圖。如果期望一種不導致新的基因序列表達的轉拼行為，則轉拼序列不需要編碼可轉譯的蛋白質序列。如果期望一種確實可導致某一新的基因序列，特別是新的肽或蛋白質序列表達的轉拼行為，則轉拼序列可進一步提供轉譯終止密碼子，和RNA在宿主細胞內正確轉譯加工所必需的其它信息。如果期望轉拼行為的結果是產生一種特定的蛋白質產物，則在所產生的融合體中保持該胺基酸解讀密碼將是必不可少的。
對本發明核酶的特異性的鑑定和確證可通過檢測推斷核酶僅在預期的靶序列存在下催化預期的轉拼反應的能力來完成。如果存在的唯一RNA序列是該核酶不應對其敏感(或不太敏感)的非靶序列，則轉拼反應不應發生。可藉助於一種標記物進行這樣的定性，以便可更容易地監測正確(或不正確)的核酶活性。在多數情況下，體外檢測對抗其預期靶物的核酶，然後用它轉化宿主細胞以研究其體內作用就足夠了。
當需要除去宿主的RNA時，這樣的刪除應該是儘可能完全的。當需要給宿主細胞提供新的基因序列時，本發明的轉拼反應不需要是完全的。本發明的優點在於，根據從這樣的基因序列轉譯的肽的生物學活性，轉拼活動的效率實際上可以是相當低的，只要發生的轉拼可足以為預期的目的提供給宿主足夠的mRNA，從而編碼多肽即可。
本發明的核酶在宿主細胞中的轉錄發生在核酶基因引入到宿主細胞之後。如果不需要由宿主細胞穩定保持該核酶，這樣的核酶就可被化學合成或酶促合成並用機械方法，例如顯微注射、脂質體介導的轉染、電擊、或磷酸鈣沉澱提供給宿主。而當需要穩定保持編碼該核酶的基因時，可通過將該核酶的至少一個DNA拷貝穩定地插入宿主的染色體，或通過提供一種該核酶的DNA拷貝於一個由宿主細胞穩定地保持的質粒上而實現。
最好是將本發明的核酶插入宿主的染色體作為表達暗盒的一部分，該暗盒可提供轉錄調節成分，這些成分可控制核酶在宿主細胞中的轉錄。這樣的成分可包括，但不一定局限於，啟動子成分、增強子或UAS成分、和轉錄終止信號。不轉譯核酶時，多聚腺苷酸化不是必需的。然而，對於編碼被轉拼的成分的序列，可提供這樣的多聚腺苷酸化信號。
其編碼序列已插入宿主染色體的核酶的表達受與核酶編碼序列可操縱地連接的啟動子序列所控制。可指導核酶表達的啟動子可以是任何在宿主細胞中起作用的啟動子，原核啟動子是在原核細胞中所需要的，真核啟動子則是在真核細胞中所需要的。啟動子由分立的單元所組成，這些單元可指導啟動子在宿主細胞中的轉錄激活和/或阻遏。在核酶的啟動子中可使這樣的單元混合和相配以便為核酶在宿主中的適當表達提供條件。真核啟動子可以是任何可在真核細胞中發揮作用的啟動子，特別是任何具有RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、或Ⅲ特異性的啟動子。如果需在多種真核宿主細胞中表達核酶，則應選擇可在多種真核宿主細胞中發揮作用的啟動子，例如rRNA或tRNA啟動子，或被廣泛表達的mRNA的啟動子，例如肌動蛋白基因，或糖酵解基因的啟動子。如果只需在某一種細胞或組織類型中表達該核酶，則應選擇只在該細胞或組織類型中發揮作用的細胞特異性(或組織特異性)啟動子成分。
轉拼反應無論是在體外還是在體內進行在化學上都是相同的。但在體內，由於輔助因子通常已存在於宿主細胞中，所以靶物和核糖酶的存在將足以導致轉拼。
本發明的轉拼核酶和方法可用於產生適用於靶細胞的基因修飾，和/或細胞死亡的基因活性。例如，本發明的轉拼反應可用於將具有毒性的蛋白質引入所需細胞，細胞的感受性將由靶RNA和支配核酶的表達的調控物的選擇來決定。例如，可操縱一種能使編碼某一毒性蛋白的FNA序列轉位的核酶，以便該核酶的表達將取決於可操縱連接的啟動子的特性。在一個非常優選的實施方案中，白喉毒素肽A是由轉位到宿主內預期靶物中的那部分核酶所編碼的。核酶和白喉毒素肽A鏈的有條件表達可導致宿主細胞的死亡。其它有用的肽毒素包括蓖麻毒素、外毒素A，和皰疹胸苷激酶(E-vans，G.A.，GenesDev.3259-263(1989))。此外，各種水解酶具有破壞細胞代謝的潛能。例如，真菌的核糖核酸酶可用於引起植物的雄性不育(Mariani，C.et al.，Nature 347737-741(1990)。由於靶RNA的有限表達可破壞特定的組織。再者，如果用病毒RNA作為靶物，則可操縱新形式的病毒抗性或治療。
可用本發明的核酶設計一種控制組織特異性基因表達和/或用於異位切除的二元系統。例如，可以使用利用P-成分增強子捕集載體以組織特異性和空間特異性方式表達酵母轉錄激活子GAL4果蠅品系。任何轉錄激活子都可用來代替GAL4，本發明並非只限於GAL4。可將一種編碼能夠轉拼DTA序列的融合核酶的基因置於GAL4-UAS啟動子的控制之下並以穩定遺傳的方式插入果蠅，這樣的核酶在無GAL4存在下不能在果蠅中得以表達。因此，遺傳上攜帶這一核酶構建物的果蠅宿主與以組織特異性方式表達GAL4的果蠅宿主雜交可導致子代隨機編碼，當GAL4表達被誘導時，顯示出與GAL4表達方式相似的細胞死亡方式。
此外，通過將核酶作為與GAL4 mRNA轉拼的對象，該核酶的拼接活性可鈍化GAL4的表達並可自我調節核酶的表達。
核酶原如上所述，轉拼核酶由三種融合序列成分所組成，即與靶RNA互補的5′「反義」區，基於自拼Ⅰ組內含子的催化區，和3′「外顯子」序列。5′區可與所選靶RNA進行鹼基配對，使之與Ⅰ組內含子的催化序列接近。Ⅰ組內含子的結構可提供一種適於催化靶RNA與3′「外顯子」序列精確拼接的化學環境。然而，在無合適的靶RNA存在下，該核酶序列仍能催化在3′「外顯子」連接處的切割(相似的水解可見於Ⅰ組自拼內含子(Zaug et al.，Science231470-475(1986))，並且可能能通過核酶與異源RNA序列(可包括它們自身)的瞬時鹼基配對催化不正常的拼接活動。這樣的副反應和不正常的拼接活動是多餘的，或許是有害的。例如，如果要將轉拼用於毒素在體內的條件釋放，則不正常的轉拼可能會導致有毒活性的不期望表達。在3′「外顯子」連接處的自發性切割會降低轉拼的效率。
為了有助於避免這些問題，已構建了核酶原形式的轉拼RNA，例如其中螺旋P8被破壞。構建的核酶原含有額外的自我互補序列，這些序列可導致核酶催化中心誤折。在預期靶RNA不存在時，核酶原是無活性的;只有在核酶和靶RNA進行鹼基配對一伴隨著對核酶內二級結構幹擾的取代之後才能形成活性形式。核酶原是指在靶RNA不存在下無催化活性的種類，從而可消除體外和體內多餘的自我切割、自拼和不正常的轉拼反應(圖12)。
這裡所述的核酶原是構象受到破壞的且因此成為無轉拼活性的形式。該核酶原具有很少的自我切割活性。它們只能通過與靶RNA特異地相互作用重新活化，因而是不大可能催化非預期靶RNA的轉拼的底物活化核酶。期望將轉拼核酶用於新基因活性在體內的釋放，在不希望的副反應或不正常拼接的程度上的任何減少都是可取的，而且可能是必需的。
儘管對於轉拼核酶原這裡已舉例說明了螺旋P8的破壞，但也可能已應用了催化活性所需的其它螺旋。
以這樣的方式，即只與預期的底物RNA進行鹼基配對可形成活性核酶，破壞催化上重要結構的構象的同樣方法可應用於其它核酶的設計。例如，「錘頭」型核糖核酸內切酶的環序列(Haseloff et al.，Nature334585-591(1988))可被擴展並使之與核酶的「反義」臂之一互補一與螺旋P8的以上修飾相似。只有在與所選的靶RNA進行鹼基配對，對二級結構的破壞被取代，和催化所需的幹環結構重新形成之後才會顯示出核糖核酸內切酶活性。這樣將有效地增強核酶對其靶物的特異性。
此外，核酶原的激活不需依賴於與底物本身進行鹼基配對。附加的鹼基配對或RNA與蛋白質間的相互作用可能是活性核酶複合物的形成所需的。這些額外組分的可得性將決定核酶的活性，並可被用來改變核酶的選擇性。
本發明的核酶或核酶原可被引入任何原核或真核宿主細胞，特別是植物或哺乳動物宿主細胞，尤其是人的細胞，既可是細胞培養物也可是活體細胞，所用的技術是本領域中已知的適合於上述宿主的方法。也可操縱本發明的核酶以破壞病毒。在一個優選的實施方案中，在病毒侵襲之前以一種遺傳上穩定的方式將本發明的核酶或核酶原提供給宿主細胞。合適病毒的感染，或潛伏性病毒在這種宿主細胞中的表達(導致宿主細胞中出現核酶或核酶原的靶RNA)，將通過可引起病毒感染細胞死亡的轉拼激發該核酶的催化活性和病毒RNA靶的破壞和/或毒素的產生。在另一個實施方案中，可操縱核酶或核酶原並包裝到病毒自身中。這樣的實施方案特別適用於為研究目的所用病毒的設計，其中設計出的核酶或核酶原可破壞特異性病毒RNA的功能，因而可在這種RNA不存在時研究病毒的功能。攜帶核酶的病毒也可用作轉染具有所需核酶或核酶原活性的宿主細胞的載體。
可利用本發明的核酶或核酶原在農學重要性物種中操縱雄性或雌性不育。例如，可通過將TA29或TA13 mRNA(菸草花葯特異性基因;Seurinck，J.et al.，Nucl.Acids Res.183403(1990))作為對象，用可將DTA3′外顯子轉拼到那些靶物中的本發明的核酶或核酶原操縱菸草的雄性不育。
可通過用本發明的核酶或核酶原對組織進行選擇性破壞或修飾控制農作物的形式。例如，可通過將種子貯存蛋白mRNA作為對象，用可將DTA3′外顯子轉拼到該靶物中的本發明的核酶或核酶原獲得無籽果實。
可通過病毒特異性核酶或核酶原的表達殺死感染細胞而保護轉基因植物抵抗感染。這將成為一種人工形式的「超敏反應」。例如，可用本發明的核酶或核酶原(可將DTA3′外顯子轉拼到靶物中)以黃瓜花葉病毒外殼蛋白mRNA作為對象。
經引入轉拼核酶或核酶原可使微生物群體變得耐受特異性病原體。例如，通過將細菌毒素基因或由本發明的核酶或核酶原所提供的3′外顯子編碼的水解酶作用於噬菌體RNA可使乾酪產生細菌耐受噬菌體感染。例如在噬菌體感染後通過引起過早溶菌現象而幹擾噬菌體複製。
可構建通過轉拼釋放有毒活性的病毒病原體。以這種方式，可以特定的細胞類型作為切除的對象，如進行癌症或病毒治療。例如，可通過攜帶DTA3′外顯子的本發明的核酶或核酶原以HIV mRNA作為對象進行病毒或脂質體釋放。
下列實施例只是為說明目的，不能看作是對本發明範圍的限制。
實施例1CAT-LacZ轉拼核酶的構建和定性Ⅰ.本發明核酶的PCR擴增和克隆按照上述指導路線，設計一種轉拼融合核酶，該酶可將大腸桿菌β-半乳糖苷酶(LacZ)mRNA的部分氨基末端編碼序列拼接到氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)mRNA中的某一位點上(圖3)。將側接嗜熱四膜蟲(T.thermophila)核酶核心和3′外顯子的新序列的各區域合成為寡核苷酸。然後通過連續聚合酶鏈反應，用合成連接寡核苷酸作為引物與核酶和β-半乳糖苷酶DNA模板一起裝配完整的核酶序列(儘管存在其它可利用的方法，但該方法是最便利的)。
為了構建一種能夠將β-半乳糖苷酶(LacZ)α-肽編碼序列拼接到氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)的5′編碼序列中的某一位點上的核酶，合成了三種寡核苷酸。
寡核苷酸15』－GGCCA AGCTT CTTTA CGATG CCATT GGGAT ATATCAACGG TGGTA TAAAC CCGTG GTTTT TAAAA GTTAT CAGGCATGCA CC-3』[SEQ ID NO.2]寡核苷酸25』－GATTA GTTTT GGAGT ACTCG TACGG ATTCA CGGCCGTCGT TTTAC AA－3』 TTTAC AA-3』[SEQ ID NO.3]寡核苷酸35』－GGCCG AATTC TTACA ATTTC CATTC AGGCT GCGCAACTGT TGG－3』 [SEQ ID NO.4]將寡核苷酸2和3(各200pmoles)與0.1μg PvuⅡ切割的pGEM4 DNA(含有LacZ α-肽序列)合併，以100μl的體積進行PCR擴增50mM KCl.
10mM Tris-HCl PH8.3，1.5mM MgCl2，0.4mM dNTPs0.1%明膠，和5U TaqI DNA聚合酶，
並於94℃下保溫1分鐘，50℃下保溫2分鐘，72℃下保溫2分鐘，這一保溫循環共進行30次。
質粒pGEM4可購自美國Promega公司(Madison WI，USA)。
用低膠凝溫度瓊脂糖電泳法純化210鹼基對的擴增產物，並用作第二輪PCR擴增的引物。
在第二輪PCR擴增之後，將2.0μg 210鹼基對的擴增產物、200pmoles寡核苷酸1和0.1μg含有嗜熱四膜蟲IVS的450鹼基對的片段混合併採用上述條件進行PCR擴增。用限制性核酸內切酶EcoRI和Hind Ⅲ消化所得到的660鹼基對的產物，並克隆到質粒載體pGEM4中。CAT-LacZ α-肽核酶DNA序列的完整序列用SEQ ID No.5表示，並示於圖3B。
用本領域中已知的技術(Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Guide，2nd edition，1989，Cold Spring Harbor Laboratory，Publishers)，將含有克隆序列的克隆載體轉化到細菌宿主XL1/Blue(Strategene，La Jolla;California)中並在那裡增殖。然而，任何能夠穩定維持該載體的細菌宿主均可使用，例如JM109。
為了進一步分析，可用本領域中公知的技術(Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Guide，2nd，edition，1989，Cold Spring Harbor Laboratory，Publishers)從宿主細胞中提取質粒。
Ⅱ.克隆核酶和靶RNA的體外轉錄採用標準方法，從細菌宿主中純化克隆序列並用不切割核酶序列的限制性核酸內切酶(例如，EcoRI)將質粒線性化，用T7RNA聚合酶進行轉錄，體積為100μl，含有5μg線性質粒DNA，40mM Tris-HCl PH7.5，6mM MgCl2，2mM亞精胺，10mM NaCl，10mM DTT，1mM NTPs(含有20μCi〔α-32P〕UTP，如果需要被標記的RNA轉錄本)，100U RNA酶，和50U T7RNA聚合酶，反應物在37℃下保溫2小時。
使用前用5%聚丙烯醯胺凝膠電泳法(TBE，7M尿素凝膠)純化RNA轉錄本。含有活性嗜熱四膜蟲IVA序列的RNA在轉錄期間經歷在3′內含子-外顯子連接處某種自發性切割。經電泳純化移出這些片段用於在後面的轉拼測定過程中清楚地進行分析。
Ⅲ.體外轉拼反應條件將靶物和/或轉拼核酶在下列條件下保溫0.1-0.5μg RNA組分(其用量取決於實驗的類型，通常核酶的量比靶物量多5倍)，30mM Tris-HCl PH7.5，100mM NaCl，2mM GTP，5mM MgCl2，體積為5μl，42℃下，60分鐘。
用95μl 0.1mM Na2EDTA，200mM NaCl稀釋反應物，並用乙醇沉澱，然後在5%含有TBE緩衝液，7M尿素和25%甲醯胺的聚丙烯醯胺凝膠上分析RNA，並放射自顯影。
Ⅳ.核酸內切酶解活性的測定核酶和靶物進行鹼基配對之後，轉拼的第一步是鳥苷介導的在預定5′拼接位點靶RNA的切割。退火和轉拼可在緩衝液如30mM Tris-HCl(PH7.5)，100mM NaCl，5mM MgCl2，2mM GTP中，在42℃下進行。由於3′拼接位點是這一反應所必需的，所以平末端轉拼核酶應表現得如同高度特異性核糖核酸內切酶一樣，為了測試這一活性，將上述CAT-LacZ α-肽轉拼核酶的縮短了的體外轉錄本(SEQ ID No.5和圖3)與CAT mRNA序列一起保溫，CAT-LacZ核酶暗盒在HindⅢ-EcoRI片段上。ScaI切割位點可標明3′拼接位點上遊5位鹼基。該核酶特異地在所期望的單一位點切割靶RNA以產生所期望大小的片段。
Ⅴ.轉拼反應為了確證CAT-LacZ α-肽核酶催化3′外顯子序列在5′拼接位點的連接的能力，將不同的形式與放射標記的CAT RNA一起保溫。核酶轉錄本由DNA模板合成，它在由核酶核心末端至外顯子序列之間的幾個位置被3′平切。與標記過的CAT一起保溫導致預期拼接產物的形成，這些產物的長度依3′外顯子序列的長度而異。
此外，一定比例的CAT-LacZ α-肽核酶分子在體外轉錄期間經歷了在3′拼接位點的自發性切割，與完整嗜熱四膜蟲內含子相似。這些切割形式(在鄰近3′拼接位點的鳥苷殘基處終止)也與CAT RNA一起保溫。在這種情況下，核酶自身可與CAT RNA的3′部分連接，以產生大小約為550個核苷酸的產物。這一反應與完整內含子的自我成環相似，同樣的連接反應見於其它轉拼反應。
Ⅵ.轉拼的精度將得自CAT-LacZ α-肽轉拼反應的產物逆轉錄，並通過聚合酶鏈反應，用兩種與預定拼接位點任一側上的序列互補的寡核苷酸通過聚合酶鏈反應進行擴增。將擴增的序列克隆並進行序列分析。各個重組體從拼接產物的預期序列來看都無變異。如對完整內含子的研究中所見，拼接似乎是相當精確的。
因此，以上研究表明按照本發明的指導路線設計的轉拼核酶能夠在體外精確、有效的轉拼。
實施例2提供植物病毒抗性的轉拼核酶的設計黃瓜花葉病毒(CMV)是一種有很多已知毒株的廣泛流行的病毒。在RNA3和亞基因組mRNA4所編碼的病毒外殼蛋白順反子的起始區域中顯示了病毒株的九條序列(SEQ ID Nos.7-25圖4(A)和圖5)。已選出兩個位點，它們保存在序列中，位於外殼蛋白的AUG起始密碼子的下遊。用於構建能夠將異亮氨酸突變型DTA轉拼到CMV外殼蛋白mRNA中的核酶的寡核苷酸示於圖4B且在下文中進行了討論。
以圖4C和4D中所示的轉拼核酶作用於圖4B中所示的CMV病毒序列，不但會導致CMV RNA分子的切割，而且會導致受感染的細胞中白喉毒素A-鏈的表達。可用本領域中已知的技術將圖4所示的轉拼暗盒轉化到任何CMV感性植物中，並使轉基因的子代受到CMV感染。應這樣設計核酶，即病毒感染是引發通過RNA轉拼產生毒素所必需的，因為核酶本身不被轉譯。由毒素的表達而造成的被感染細胞的局部死亡可限制病毒在顯示人為超敏反應的植物體內的複製和蔓延。
實施例3Gal4-白喉毒素A鏈轉拼核酶的構建和定性按照本發明和實施例1所述的方法，已設計出一種融合核酶，它是一種Gal4-白喉毒素A鏈轉拼核酶(圖6)(該核酶的序列用SEQ ID No.6表示)。GAL4-DTA核酶暗盒是SalI-XhoI片段。ScaI位點可標明3′拼接位點上遊的5位鹼基。這種酶能夠將白喉毒素A鏈的編碼序列拼接到GAL4 mRNA5′區的某一位點上。這種轉拼活性在體外(如上)和體內(見下)均有活性。成功設計GAL4-DTA核酶，和任何可轉拼編碼毒性產物的序列的轉拼核酶的主要標準在於不但有效和精確催化轉拼，而且毒性產物(如DTA)的表達不在無轉拼的情況下發生。
按照上述設計構建核酶的催化部分，然後分別在GAL4和DTA的5′編碼區選擇5′和3′拼接位點。3′外顯子序列相應於已用於在真核細胞中表達的DTA基因的3′外顯子序列，所不同的是刪除了第一個AUG密碼子和幾個近端胺基酸。原始白喉棒桿菌形式的DTA在這個5′區也不同，它是利用CUG密碼子啟動轉譯。原始DTA序列也含有一個後來不存在的信號肽前導序列。
這些核酶分子可經歷在3′拼接位點的自發性切割。假使DTA的毒性極強，任何釋放的3′外顯子序列都不產生毒性轉譯產物這一點是重要的。3′外顯子在13位含有一個碼組內蛋氨酸，設想它可能會產生一種平頭但有毒性的多肽。為了消除這種可能性，在兩個獨立的核酶構建中將野生型序列(Rz-DTAmet)該位置上的蛋氨酸改為異亮氨酸(Rz-DTAile)或亮氨酸(Rz-DTAleu)(圖6)。
實施例4本發明核酶的體內活性Ⅰ.簡介按本文所提供的指導路線設計的核酶的體內活性和這種核酶傳給宿主細胞新的基因活性的能力，用所述的Gal4-白喉毒素A鏈轉拼核酶(實施例3和圖6)將高毒性白喉毒素A產物傳給宿主細胞得到了證實。在該系統中，果蠅是選定的宿主，期望在果蠅宿主中以組織特異性方式控制本發明核糖酶的表達。
白喉毒素是由對B噬菌體為溶源性的白喉棒桿菌分泌的。該毒素以單個多肽形式產生，該多肽經蛋白水解產生A和B鏈。A鏈(DTA)含有很強的ADP核糖基酶活性，該活性對真核細胞轉譯延伸因子EF-2具有特異性。即使僅有該酶的幾個分子存在就足以在多種真核細胞中引起轉譯停止和最終死亡。B鏈允許毒素通過結合甘露糖殘基附著於細胞表面受體上在胞內釋放，被細胞內吞併經泡囊融合進入細胞質。
在B-鏈不存在時，A-鏈在胞外存在時毒性小得多。這一特性，和它的高毒性已提示了它在異位切除實驗中的用途。例如，用視蛋白啟動子引發在發育眼球中的表達，已在轉基因小鼠中表達了編碼DTA的序列。產生的小鼠雙目失明，眼球畸形(Breitman，M.L.，Science 2381563-1565(1987))。在其它研究中，進行了小鼠胰腺的切除(Palmiter，R.D.et al.，Cell 50435-443(1987))，Wert，S.E.et al.，Am.Rev.Respir.Dis.141(no.4，part2)A695(1990)描述了通過使用由人表面蛋白C基因(在Ⅱ型肺泡細胞中被表達)的啟動子和5′側翼序列和DTA基因組成的嵌合基因切除肺泡細胞。
然而，用這種類型的方法，不可能維持或繁殖可能具有更嚴重，或致死性表型的轉化生物體。此外，目前未有用完整DTA序列對某些物種(如果蠅)進行轉化的報導。在這樣的轉化過程中DTA基因的滲漏表達可導致即刻死亡。
Ⅱ.果蠅系統已經發展了一種靶基因表達的一般方法。首先，該系統可使各個品系迅速產生，其中異位基因表達可涉及不同的組織或細胞類型利用增強子檢測劑技術(O′Kane，C.J.and Gehring，W.J.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9123-9127(1987);Bellen et al.，Genes and Development 31288-1300(1989);Bier et al.，Genes and Development 31273-1287(1989))以各種方式在胚胎、幼體和成體內表達轉錄激活子。第二，該方法可在不同的品系中從它的靶基因中分離出激活子，以確保各個親代品系都是活的在一個品系中，激活子蛋白存在，但沒有可激活的靶基因，在第二個品系中，靶基因是不活動的。當使這兩個品系雜交時，只在雜交的子代中激活靶基因，從而使顯性表型(包括致死性)可被方便地研究。
為了只異位表達令人感興趣的基因，需要一種在果蠅中沒有內源靶的轉錄激活子。一種來自酵母的激活子，Gal4能激活在果蠅中的轉錄，但轉錄只從具有Gal4結合位點(Fischer et al.，Nature 332853-865(1988))的啟動子開始。對於靶基因表達，以兩種方式將Gal4限制到特定的細胞或者用特徵化果蠅啟動子啟動Gal4轉錄，或者將無增強子的Gal4基因隨機整合到果蠅基因組中，使之在多種排列形式的基因組增強子的控制之下。為了測定通過Gal4的轉激活，使可表達Gal4的果蠅與其轉錄是由Gal4結合位點(Fischer et al.，Nature 332853-865(1988))啟動的帶有LacZ基因的果蠅雜交。β-半乳糖苷酶只在Gal4先被表達的那些細胞中表達。LacZ的組織特異性和細胞特異性轉激活已在Gal4被表達和各種方式被建立的品系中得到了證實。
用該系統，有可能1)將Gal4結合位點置於任何編碼序列上遊;2)只在Gal4被表達的細胞中激活該基因和3)觀察這種異常表達對發育的影響。在異位表達是致死性的情況下，這種方法可使兩個親代品系(一個表達Gal4，另一個攜帶不活動基因，在它的啟動子中具有Gal4結合位點)得以穩定地繁殖。然後在雜交的子代中研究這些表型。
Ⅲ.載體在這些研究中用作起始材料的載體包括1)pGATB和pGATN(圖9)這些載體可被用於克隆啟動子和無啟動子Gal4基因上遊的增強子。
構建載體，其中獨特的NotI或BamHI位點被插入Gal4編碼區的上遊。一旦將啟動子連接到Gal4編碼序列上，就可從pH-SREM載體骨架上切下該基因(Knipple and Marsella-Her-rick，Nucl.Acids Res.167748(1988))並將其移入P-成分載體。Ph2啟動子已被克隆(Mismer et al.，Genetics 120173-180(1988))到該載體中並已產生Gal4隻在單眼中被表達的果蠅。
2)pGawB這是一種在增強子檢測中使用的Gal4載體。
將無增強子的Gal4基因亞克隆到載體plwB(Wilson et al.，Genes and Development 31301-1313(1989))以產生pGawB。plwB先用HindⅢ消化以除去lacZ基因和P轉位酶基因的N末端。用P轉位酶基因的TATA盒之後的整個Gal4編碼區置換這些基因。
3)pUAST(圖10)這個質粒被用於克隆Gal UAS下遊的編碼序列。
在Gal4 USA(上遊激活序列)之後可亞克隆進基因的載體在P成分載體pCaSpeR3(C.Thummel，Univ.of Utah Medical Center，Salt Lake City，Utah，Personal communication)中被構建。插入了5個Gal4結合位點，接著是hsp70TATA盒和轉錄起始密碼子，多連接子，和SV40內含子和多聚腺苷酸化位點。基因或cDNA可被插入的獨特位點包括EcoRI，BglⅡ，NotI，XhoI，KpnI和XbaI。
Ⅳ.果蠅品系本文所述的用於定性在這些研究中所用的果蠅品系的遺傳學技術是本領域中眾所周知的(「Genetic Variations of Drosophila melanogaster，」D.Lindsley and E.H. Grell，eds)。
用攜帶△2-3的「跳躍起始子(jumpstarter)」品系調動p成分轉位子，△2-3是在可表達高水平的組成活性轉位酶的第三染色體上的缺陷性p成分(Robertson et al.，Genetics 118451-470(1988))。通常用於產生插入品系和製圖的三個原種保藏於果蠅貯存中心(the Drosophila Stock Center，Indiana University De-partment of Biology，Jordan Hall A503，Bloomington，Indiana47405)1yw;+/+;Sb P〔ry+，△2-3J/TM6，Ubx2w;+/+;TM3，Sb/CxD(保藏號3665)3w;Cyo/Sco;+/+(保藏號3666)其中三個染色體的遺傳學特徵用分號隔開。因此，例如，在品系1中，第一染色體(X染色體)是黃色和白色純合的(「yw」)，第二染色體是野生型(「+/+」)，第三染色體攜帶殘餘基因(「Sb」)，和P成分轉位子玫瑰色基因(「ry」)和△2-3，而第二三染色體攜帶平衡器倒位(「/TM6，Ubx)。
Ⅴ.產生Gal4表達模式的方法
A.用於分離轉化體的方案將構建物注射到由原種產生的胚胎中;
♀♀y w/y w;△2-3，Sb/TM6，Ubx X ♂♂y w/Y;△2-3，Sb/TM6，UbxFO;建立單個品系♀y w/y w;△2-3，Sb/TM6，Ubx X ♂y w/Y;+/+or♂y w/Y;△2-3，Sb/TM6，Ubx X ♀y w/y w;+/+F1;選擇〔w±〕和〔Sb±〕子代並建立原種♀y w/y w;+/TM6，Ubx X ♂ y w/y;+/+or♂y w/y;+/TM6，Ubx X ♀ y w/y w;+/+B.用於跳過無增強子Gal4插入體的方案1.從X-染色體跳躍♀♀ FM3/FM7，w;+/+ X ♂♂ y w/Y;△2-3，Sb/TM6，Ubx♀♀ FM7，w/P[Gal4，w+1
♂♂FM7/Y;△2-3，Sb/+♀♀ FM7，w/P[Gal4，w+];△2-3，Sb/+
♂♂ y w/Y;+/+♀ FM7，w/y w;△2-3，Sb/+ X ♂ y w/Y;+/+選擇〔W+〕和〔B〕子代並建立原種2.從∧2-3-染色體跳躍♀♀ y w/y w x ♂♂ y w/Y;P[Gal4，w+]，△2-3，Sb/+選擇〔w+〕和〔Sb+〕子代並建立原種。
C.染色體分離為了分析插入體的分離，使用兩個原種w;+/+;TM3，Sb/CxD和w;Cyo/Sco;+/+。
方法為了產生大量可以細胞特異性和組織特異性方式表達Gal4的品系，已構建了攜帶不同形式的Gal4基因的增強子檢測載體。兩個編碼全長度蛋白質或平末端蛋白質的基因已被克隆到玫瑰色(ry+)和白色(w+)P成分載體中(P成分載體為修飾形式的plArB和plwB;Wilson et al.，Genes and Development 31301-1313(1989))。用ry+或w+作為篩，已通過引入△2-3基因(Robertson et al.，Genetics 118461-470(1988))調動了這些載體。為了顯現Gal4的表達方式，使Gal4插入品系與攜帶在Gal4 UAS(Fischer et al.，Nature332853-865(1988))的控制下的lacZ基因的品系雜交。通過用X-半乳糖作為底物的酶測定法，或通過用抗β-半乳糖苷酶的單克隆抗體染色檢查由這些雜交產生的胚胎、幼體和成體中β-半乳糖苷酶的表達。由UAS-lacZ構建物編碼的β-半乳糖苷酶位於細胞質中。
已篩選出大約500個Gal4插入品系並且已鑑定了可用於激活特定組織中的基因的許多品系，例如鑑定了它們的表皮條紋，中胚層，中樞神經系統和外周神經系統。許多品系可在唾腺以及其它組織中表達β-半乳糖苷酶。在構建無增強子Gal4轉位子時有可能偶然產生位置依賴性唾腺增強子。
Ⅵ.樣品篩選品系號 未著色 唾腺 其它組織 %9 + - - 5.845 - + - 28.881 - + + 51.921 - - + 13.5156 100.0為了以特異性方式激活基因(X基因)，選擇Gal4插入品系，與攜帶在GAL UAS之後被克隆的X基因的品系雜交。
Ⅶ.對無核酶的GAL4/UAS系統的概述Gal4/UAS系統是一個用於控制基因活化的兩部分系統。該方法是多方面適用的，可以是組織特異性的並且不會顯示基礎水平的表達，也許如本文所述，UAS-DTA構建物例外。可用該方法異位表達特徵化的基因，表達否則對生物體將是致死性的被修飾的基因和表達來自其它物種的基因以研究它們對果蠅發育的影響。由於該方法使產生顯性，功能獲得性突變成為可能，所以上位顯性試驗和對可見或致死表型的增強子或抑制基因的篩選可得以進行。Gal4系統也允許有毒產物表達，便於研究細胞特異性和組織特異性切除的後果。
Ⅷ.含有本發明的DTA核酶的Gal4表達果蠅的應用將攜帶編碼DTA蛋白質的序列的融合核酶的表達置於pUAST(圖10)中的GAL4UAS(上遊激活序列)的控制之下。如上所述，用上述被修飾的P成分增強子捕集載體，構建了大量穩定的果蠅品系，每個品系都可在發育的果蠅中以特異性時空方式表達酵母轉錄激活子。任何在GAL4上遊激活子序列(UAS)控制下的基因都可單獨被轉化並維持，然後在特定的果蠅組織中通過與可表達GAL4的品系(圖7)雜交被誘導。然而，在不進一步修飾的情況下利用GAL4系統表達DTA本身是不可能的，因為通過DTA的滲漏表達產生UAS-DTA轉化體是困難的。
已發現該二元系統用作通過轉拼核酶(圖6)條件性表達DTA的工具克服了這些問題。在可表達GAL4的那些細胞中，GAL4蛋白質可提供核酶轉錄所必需的活性，而GAL4 mRNA可提供DTA產生所必需的靶。
可得用本領域中已知的技術，給果蠅胚胎注射如上所述的置於UAS啟動子控制之下的核酶序列。注射了Rz-DTAmet構建物的胚胎不能存活，而正常的轉化果蠅得自注射了Rz-DTAile和Rz-DTAleu的胚胎。這一結果表明內部AUG密碼子確實成為注射後的有毒產物轉譯的啟動密碼子。該密碼子與在DTA序列中所提出的NAD+結合位點相鄰，並與遠緣外毒素A(來自銅綠假單胞菌的另一種EF-2特異性ADP-核糖基酶)中所保留的序列相鄰。
含有在GAL4 UAS控制下的Rz-DTAile和Rz-DTAleu的轉基因果蠅與可以特定的表達方式產生GAL4的果蠅雜交。例如，在一個特徵化品系1J3品系中，將GAL4基因插在毛髮基因附近，並反映它的表達方式。在胚胎發生過程中在偶數編號腹節的表皮條紋中產生毛髮基因產物。當將UAS啟動的LacZ基因引入1J3(其中GAL4以與毛髮基因產物相同的方式表達)時，發現β-半乳糖苷酶局限在偶數編號條紋中。當含有Rz-DTAleu基因的果蠅與這種GAL4表達品系雜交時，產生正常子代。然而，當含有Rz-DTAile的果蠅與GAL4表達品系雜交時，在胚胎發生中子代的發育受到抑制。顏色較深的條帶在胚胎的表皮上明顯可見，這與潛在細胞的死亡是一致的。當檢查表層製備時，偶數編號的小齒狀突起條帶被破壞或消失，特別是第4，6和8條紋的小齒狀突起條帶(圖11)。當含有Rz-DTAile的果蠅與含有不同的GAL4表達基因的果蠅雜交時，觀察到細胞死亡的其它特異性方式。
設計實施例5核酶原的設計作為一種核酶原的設計試驗，修飾了前面描述的CAT-LacZ轉拼核酶。系統發育比較和突變分析(參見Cech，Ann Rev.Biochem.59543-568(1990))已表明Ⅰ組自拼內含子的核心區被高度保留，它對活性是重要的(圖8)。為了構建轉拼核酶原，緊接在該區旁的螺旋P8被破壞。在最初的實驗中，將新序列的13或18個核苷酸引入螺旋P8的5′股和環，分別產生核酶原1和2。額外的核苷酸與核酶的5′「反義」部分互補，同時調整側翼序列以保留(1)在P8鹼基處的真實序列，和(2)在P8內可能的鹼基配對的程度(圖13)。插入到螺旋P8中的序列與核酶原的5′「反義」區的自我互補程度可期望在新生轉錄本中優先於螺旋P8形成這種新螺旋，也可期望這一更替螺旋的形成破壞核酶的催化核心內側面二級或許三級相互作用。因此，核酶原的誤折會使它失去催化活性(圖14)。然而，核酶原與預期靶RNA的鹼基配對可替代P8「反義」鹼基配對，隔絕該「反義」序列並允許P8螺旋和活性催化區的重新形成。P8「反義」螺旋的置換可產生更大數目的鹼基對和允許催化區的適當摺疊，因此應是很受歡迎的。
CAT-LacZ核酶原用如上所討論的PCR誘變構建相應於兩個CAT-LacZ核酶原的克隆序列，並通過體外轉錄產生RNA。據觀察CAT-LacZ轉拼核酶在轉錄期間經歷3′拼接處的切割，這是由內含子序列催化的水解造成的。相似的水解見於未修飾的嗜熱四膜蟲內含子的體外轉錄。相比之下，不同的CAT-LacZ核酶原的轉錄本較穩定，在同樣條件下幾乎無明顯的切割(圖15)。這表明核酶原是無活性的，若催化序列誤折，便可期望核酶原失活。測試了平末端形式的核酶原針對CAT RNA的特異核糖核酸內切酶活性。由在ScaI位點被平切的模板轉錄CAT-LacZ核酶原，以刪除3′拼接序列和LacZ序列。刪除3′拼接位點後，核酶和核酶原都是穩定的。平末端的核酶原與CAT RNA一起保溫導致了靶RNA的特異性切割，從而產生預期大小的片段(圖16)。在37°，45°和50°下可看出特異的切割活性。
也構建了GAL4-DTA轉拼核酶的核酶原形式(圖17)。將含20個核苷酸的區域(與「反義」區互補)插入螺旋P8的5′股和環。這兩種核酶原在修飾的螺旋P8中可能的鹼基配對程度不同，GAL4-DTA核酶原1具有較長的幹，在環中有較少(3個)可及的鹼基。GAL4-DTA核酶原2的螺旋P8更類似於CAT-LacZ核酶原2的螺旋P8，具有較大的環(14個鹼基)，環中含有與「反義」區互補的序列。GAL4-DTA核酶原的轉錄本比未修飾的核酶的轉錄本穩定。特別是，核酶原2在可導致核酶形式的基本完全的自我切割的條件下保溫(50℃下30分鐘，10mM MgCl2，2mM GTP，見圖18)之後大體上是完整的。
上面已對本發明作了充分的描述，本領域的技術人員在不影響本發明或其任何實施方案的精神和範圍的情況下，可在很寬和等同的條件，參數等範圍內完成本發明。
權利要求
1.一種多核苷酸分子，該分子編碼轉拼核酶，該核酶的序列為融合RNA，該融合RNA的序列包括(1)第一RNA序列，該第一RNA序列足以使該核酶與靶RNA雜交，(2)第二RNA序列，由於該核酶轉拼活性的結果，該第二RNA序列能夠被共線性地轉染至靶RNA中；其中該多核苷酸分子的表達與轉錄激活子蛋白的表達進行了可操縱地連接，且其中所說的第一RNA序列是與編碼所說轉錄激活子蛋白的RNA雜交的序列。
2.根據權利要求1所述的多核苷酸分子，其中所說的轉錄激活子是GAL4。
3.根據權利要求1所述的多核苷酸分子，其中所說的第二RNA序列包括編碼對宿主細胞有毒的肽的序列。
4.根據權利要求3所述的多核苷酸分子，其中所說的肽是DTA肽。
5.根據權利要求4所述的多核苷酸分子，其中所說的DTA肽是突變肽序列。
6.根據權利要求5所述的多核苷酸分子，其中所說的突變肽序列包括由SEQ ID No.40編碼的胺基酸。
7.根據權利要求5所述的多核苷酸分子，其中所說的突變肽序列包括由SEQ ID No.41編碼的胺基酸。
8.根據權利要求1所述的多核苷酸分子，其中所說的第一RNA序列是與GAL4雜交的序列，且其中所說的第二RNA序列是編碼DTA肽的序列。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的多核苷酸分子，其中所說的分子是RNA。
10.根據權利要求1-8中任一項所述的多核苷酸分子，其中所說的分子是DNA。
11.一種包含核酶表達盒的多核苷酸分子，該盒能穩定地插入至宿主基因組中，且該盒包括能夠在宿主中發揮功能且與權利要求1-9任一項的多核苷酸的編碼序列可操縱地連接的啟動子序列。
12.一種包含權利要求11多核苷酸分子的宿主細胞。
13.根據權利要求12所述的宿主細胞，其中所說的宿主細胞是病毒細胞。
14.根據權利要求12所述的宿主細胞，其中所說的宿主細胞是原核植物細胞。
15.根據權利要求12所述的宿主細胞，其中所說的宿主細胞是真核生物細胞。
16.根據權利要求15所述的宿主細胞，其中所說的真核生物細胞是植物細胞。
17.根據權利要求15所述的宿主細胞，其中所說的真核生物細胞是動物細胞。
18.根據權利要求17所述的宿主細胞，其中所說的動物是果蠅。
19.根據權利要求17所述的宿主細胞，其中所說的動物是哺乳動物。
20.根據權利要求19所述的宿主細胞，其中所說的動物是人。
21.一種用於體外轉拼的方法，該方法包括以下步驟(1)向轉拼反應混合物中提供權利要求9的多核苷酸分子，該多核苷酸分子包括能夠與第二多核苷酸雜交的序列;(2)向該反應混合物中提供所說的第二多核苷酸;(3)在所說的條件下催化所說的第二多核苷酸的轉拼。
22.一種用於體內轉拼的方法，該方法包括以下步驟(1)為宿主細胞提供權利要求9的多核苷酸;(2)在所說的宿主細胞中表達由所說分子編碼的所說的核酶;(3)在所說的宿主細胞中表達所說核酶的底物;(4)在所說的宿主細胞中用該底物催化該核酶的轉拼。
23.一種滅活靶RNA活性的方法，該方法包括(1)向轉拼反應混合物中提供權利要求9的多核苷酸，所說的核酶對靶RNA具有催化活性，該催化活性導致該靶RNA功能的失活;(2)向該混合物中提供所說的靶RNA;(3)提供條件，使得該多核苷酸表達該催化活性。
24.一種在體內為宿主細胞提供所需遺傳序列的方法，該方法包括(1)為該宿主細胞提供權利要求9的多核苷酸，該多核苷酸序列在該宿主細胞中對靶RNA具有催化活性，該核酶能夠轉拼該所需的遺傳序列;(2)為該宿主細胞提供所說的靶RNA;(3)提供條件，使得該核酶轉拼所需的遺傳序列至該靶RNA的序列中。
25.一種在多細胞動物或植物中摘除細胞的方法，該方法包括給受精胚宿主細胞提供權利要求9的多核苷酸，該核酶編碼對該宿主細胞有毒的肽且該核酶能夠將該序列轉拼至該宿主細胞的靶中。
26.一種對植物雄性或雌性不育進行操縱的方法，該方法包括為該種植物的胚細胞提供權利要求9的多核苷酸，該核酶作用於一RNA，該RNA所表達的蛋白質是該植物受精所必需的，並導致表達該蛋白的細胞被摘除。
27.一種對植物進行抗植物病原菌的免疫的方法，該方法包括用權利要求9的多核苷酸轉化植物細胞，其中所說的多核苷酸所編碼的轉拼序列能夠給該植物提供抗該病原菌的免疫力，且其中被該病原菌感染的植物細胞導致該細胞的摘除。
28.根據權利要求1-7中任一項所說的多核苷酸分子，其中所說的核酶是核酶原。
29.根據權利要求8的多核苷酸分子，其中所說的核酶是核酶原。
30.根據權利要求9的多核苷酸分子，其中所說的核酶是核酶原。
31.根據權利要求10的多核苷酸分子，其中所說的核酶是核酶原。
32.根據權利要求11的多核苷酸分子，其中所說的核酶是核酶原。
33.根據權利要求12的宿主細胞，其中所說的核酶是核酶原。
34.根據權利要求21的方法，其中所說的核酶是核酶原。
35.根據權利要求22的方法，其中所說的核酶是核酶原。
36.根據權利要求23的方法，其中所說的核酶是核酶原。
37.根據權利要求24的方法，其中所說的核酶是核酶原。
38.根據權利要求25的方法，其中所說的核酶是核酶原。
39.根據權利要求26的方法，其中所說的核酶是核酶原。
40.根據權利要求27的方法，其中所說的核酶是核酶原。
全文摘要
本發明介紹了根據Ⅰ組內含子的催化活性而設計的能夠進行自我催化的轉拼的新核酶。利用這一設計，有可能構建出能夠以非常精確的方式將新的3′外顯子序列有效地拼接至任何選定的靶RNA序列中去的核酶。還介紹了利用本發明的新轉拼核酶摘除細胞的方法，該方法能夠在體內以定向、調節方式為宿主細胞提供毒性產物。還介紹了無活性的核酶原。
文檔編號C12N15/52GK1065681SQ9210029
公開日1992年10月28日 申請日期1992年1月17日 優先權日1991年1月17日
發明者J·哈塞爾福, A·布蘭德, N·波瑞蒙, H·M·古德曼 申請人:綜合醫院有限公司