Kiss－1肽的製造方法

2023-05-05 13:57:16 2

專利名稱：Kiss－1肽的製造方法
技術領域：
本發明涉及KiSS-1肽或其鹽的製造方法，該法是製造融合蛋白質或多肽，然後，使該融合蛋白質或多肽，進行肽鍵切斷反應。
背景技術：
採用基因重組技術製造肽時，由於肽在細胞內易被分解，所以，常常使之的融合蛋白形式表達。為了從融合蛋白質切出目的肽，已知可用溴化氰的化學的切斷法(イタクラ，科學，198，1056(1977))、用フアフタ-Xa進行酶切斷的方法(ナガイ，酶學方法，153，46(1987))。
而且，作為蛋白質中肽鍵的切斷方法，已知採用2-硝基-5-硫氰基安息香酸切斷醯基半胱氨酸鍵(《生物化學實驗講座》，1，蛋白質化學II，日本生化學會編，東京化學同人發行，第247～250頁，1976年)。然而，關於從蛋白質切出目的肽沒有公開。
在此前已知的技術中，在從融合蛋白質切出目的肽時，在採用溴化氰的場合，不適於含有甲硫氨酸的肽的製造，而且，有切取的收率等問題存在。
因此，從融合蛋白質或多肽切取目的肽，希望有高效率的切出方法。
發明的公開本發明人對具有新穎生理活性肽的KiSS-1肽或其鹽的高效的製造方法進行了悉心的探討，結果發現製造N末端有半胱氨酸的蛋白質或者多肽的N末端上連接有KiSS-1肽的融合蛋白質或多肽，然後，通過進行肽鍵切斷反應，可以有效地製造KiSS-1肽或其鹽。
即，本發明提供(1)KiSS-1肽或其鹽的製造方法，其特徵是，對在N末端有半胱氨酸的蛋白質或肽的N末端上連接有KiSS-1肽的融合蛋白質、肽或其鹽，通過該半胱氨酸殘基的氨基側肽鍵的切斷反應而進行。
(2)KiSS-1肽或其鹽製造方法，其特徵是，培養具有編碼N末端有半胱氨酸的蛋白質或肽的N末端上連接有KiSS-1肽的融合蛋白質或肽的DNA載體的轉化體並表達融合蛋白質、肽或其鹽，使表達的融合蛋白質、肽或其鹽通過該半胱氨酸殘基的氨基側肽鍵進行切斷反應而實施。
(3)(1)或(2)中記載的製造方法，KiSS-1肽的C末端是醯胺。
(4)(1)或(2)中記載的方法，其中，切斷反應是S-氰基化反應，然後，進行氨解或水解反應。
(5)(1)或(2)中記載的方法，其中，KiSS-1肽是含有序列編號No1表示的胺基酸序列的肽。
(6)(1)或(2)中記載的製造方法，其中，KiSS-1肽是含有①從序列編號No1表示的胺基酸序列的N末端起，第40～54號的氨基序列的肽；②從序列編號No1表示的氨基序列的N-末端起第45～54號的胺基酸序列的肽；③從序列編號No1表示的胺基酸序列的N-末端起，第46～54號的胺基酸序列的肽；④從序列編號No1表示的胺基酸序列的N末端起，第47～54號的胺基酸序列的肽。
(7)(1)或(2)中記載的製造方法，其中，N末端有半胱氨酸的蛋白質或肽是N末端有半胱氨酸的幹擾素、白介素類、成纖維細胞生長因子、(前)尿激酶類、淋巴毒素、腫瘤壞死因子(TNF)、β-半乳糖苷酶、貯存的蛋白質類、鏈黴菌抗生物素蛋白、蛋白質A、蛋白質G、組織纖溶酶原激活物(TPA)或其突變蛋白或片段。
(8)(1)或(2)中記載的製造方法，其中，N-末端有半胱氨酸的蛋白質或肽，是含有序列編號No3表示的胺基酸序列，在其末端添加有半胱氨酸殘基的蛋白質或肽。
(9)權利要求1或2中記載的製造方法，其中，N-末端有半胱氨酸的蛋白質或肽，是含有序列編號No3表示的胺基酸序列、其N-末端添加有半胱氨酸殘基的蛋白；KiSS-1肽是具有序列編號No1表示的胺基酸序列的肽；製造的KiSS-1肽是其C末端為醯胺的含有序列編號No1表示的胺基酸序列的肽。
(10)在N-末端有半胱氨酸的蛋白質或在肽的N末端連接KiSS-1肽的融合蛋白質、肽或其鹽。
(11)(10)中記載的融合蛋白質、肽或其鹽它含有序列編號No3表示的胺基酸序列，在其N末端添加有半胱氨酸殘基的蛋白質N末端上連接含有序列編號No1表示的氨基序列的KiSS-1肽。
(12)含有編碼(10)中記載的融合蛋白質或肽的DNA的DNA。
(13)(12)中記載的DNA含有①序列編號No4表示的鹼基序列或序列編號No5表示的鹼基序列。
(14)具有(12)中記載的DNA的載體。
(15)含有(14)中記載的載體的轉化體，以及(16)提供一種用FERM BP-6907表示的大腸桿菌MM 294(DE3)/pTFC-KiSS-1另外，本發明還提供(17)下面的①～④的步驟構成的(2)中記載的製造方法①製造編碼在N末端有半胱氨酸的蛋白質或肽的N末端半胱氨酸上連接KiSS-1肽的融合蛋白質或肽的DNA；②製造具有該DNA的載體；③把保持該載體的轉化體進行培養，使表達融合蛋白質、肽或其鹽；④把表達的融合蛋白質、肽或其鹽進行切斷反應，以切斷該半胱氨酸殘基的氨基側的肽鍵。
附圖的簡單說明

圖1表示本發明反應步驟中的反應機理。
圖2表示實施例中使用的DNA片段。
圖3表示製造實施例1中得到的雙鏈結構的人KiSS-1肽的模式圖。
圖4表示實施例2得到的質粒pTFC-KiSS-1的構建圖。
實施本發明的最佳方案作為本發明方法所用的KiSS-1肽，可以採用例如WO00/24890(國際申請PCT/JP 99/05905號)所記載的人KiSS-1肽，具體的可以是含有從本申請序列編號No1表示的胺基酸序列的N末端起第47～54號的氨基序列，由8～54個的胺基酸殘基構成的肽等。
「含有從本申請的序列編號No1表示的胺基酸序列中的N末端起的第47～54號的胺基酸序列，由8～54個胺基酸殘基構成的肽」，即含有從序列編號No1表示的胺基酸序列的N末端起第47～54號的胺基酸序列，並且由8～54個胺基酸殘基構成的肽的任何1種均可，而肽活性(例如肽和受體的結合活性、因肽引起的受體表達細胞的細胞刺激活性等)等實質上是相同的。具體的是，可以採用①本申請的序列編號No1表示的胺基酸序列表示的肽；②本申請序列編號No1表示的胺基酸序列中，在C末端具有從N末端起第47～54號胺基酸序列，由8～15個胺基酸殘基構成的肽等。
更具體的是，作為KiSS-1肽，可以是①本申請序列編號No1表示的胺基酸序列表示的肽；②由本申請的序列編號No1表示的胺基酸序列的N末端起第40～54號所構成的胺基酸序列所表示的肽；③由本申請的序列編號No1表示的胺基酸序列的N末端起第45～54號構成的胺基酸序列所表示的肽；④由本申請的序列編號No1表示的胺基酸序列的N末端起第46～54號構成的胺基酸序列所表示的肽；⑤由本申請的序列編號No1表示的胺基酸序列的N末端起第47～54號構成的胺基酸序列所表示的肽。
所述KiSS-1肽，相對於WO 00/24890(國際申請PCT/JP 99/05905號)記載的受體-蛋白質OT7T 175來說，具有配體活性。
在本說明書中，肽是按照肽標記的慣例，左端為N末端(氨基端)、右端為C末端(羥基端)。序列編號No1表示的肽的C末端也可以是醯胺基(-CONH2)、羧基(-COOH)、羧酸酯基(-COO)、烷基醯胺基(-CONHR)或酯基(-COOR)。作為酯或烷基醯胺的R，例如，可以列舉甲基、乙基、正丙基、異丙基或正丁基等的C1-6烷基；環戊基、環己基等的C3-8環烷基；苯基、α-萘基等的C6-12芳基；苄基、苯乙基、二苯甲基等苯基-C1-2烷基；或α-萘甲基等α-萘基-C1-2烷基等C7-14芳烷基，此外，還可舉出作為口服酯而廣泛採用的三甲基乙醯氧甲基等。
作為本發明的KiSS-1肽鹽，可以採用生理學允許的鹼(例如鹼金屬等)和酸(有機酸、無機酸)的鹽，然而，生理學上允許的酸加成鹽是特別優選的。作為這些鹽的實例，如，可以採用與無機酸(例如鹽酸、磷酸、溴氫酸、硫酸)的鹽，或者，與有機酸(例如醋酸、甲酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、安息香酸、甲磺酸、苯磺酸)的鹽等。
作為本發明的方法中使用的N末端有半胱氨酸的蛋白質或肽，未加以特別規定。對於N末端無半胱氨酸的蛋白質或肽的，可用公知的方法使N末端含有半胱氨酸。
作為該N末端有半胱氨酸的蛋白質或肽，分子量100～100000是優選的，而分子量300～50000的更優選的。另外，作為N末端有半胱氨酸的蛋白質或肽，具有1～1000個胺基酸的是優選的，而含3～500個胺基酸的是更優選的。
作為該蛋白質或肽，例如，可以有幹擾素類、白介素類、成纖維細胞生長因子(aFGF、bFGF等)等各種生長因子類、(前)尿激酶類、淋巴毒素、腫瘤壞死因子(TNF)、β-半乳糖苷酶等的酶蛋白類、貯藏蛋白類、鏈黴菌抗生物素蛋白、蛋白質A、蛋白質G、組織纖溶酶原激活物(TPA)、它們的突變蛋白，或在其一部分(片段)等N末端上含有半胱氨酸的這類蛋白質或肽。其中優選使用成纖維細胞生長因子(aFGF bFGF等)或其突變蛋白或其部分片段(如，bFGF CS23突變蛋白等)。
作為bFGF CS23突變蛋白，例如，可以是含有以Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Phe-Pro-Pro-Gly-His-Phe-Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu-Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-Phe-Phe-Leu-Arg-Ile-His-Pro-Asp-Gly-Arg-Val-Asp-Gly-Val-Arg-Glu-Lys-Ser-Asp-Pro-His-Ile-Lys-Leu-Gln-Leu-Gln-Ala-Glu-Glu-Arg-Gly-Val-Val-Ser-Ile-Lys-Gly-Val-Ser-Ala-Asn-Arg-Tyr-Leu-Ala-Met-Lys-Glu-Asp-Gly-Arg-Leu-Leu-Ala-Ser-Lys-Ser-Val-Thr-Asp-Glu-Gys-Phe-Phe-Phe-Glu-Arg-Leu-Glu-Ser-Asn-Asn-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr-Thr-Ser-Trp-Tyr-Val-Ala-Leu-Lys-Arg-Thr-Gly-Gln-Tyr-Lys-Leu-Gly-Ser-Lys-Thr-Gly-Pro-Gly-Gln-Lys-Ala-Ile-Leu-Phe-Leu-Pro-Met-Ser-Ala-Lys-Ser(序列編號No3)表示的胺基酸序列，其N末端附加有半胱氨酸的蛋白質等。
本發明的方法所用的編碼融合蛋白質(包括融合肽)的DNA，(1)可以化學合成全部的鹼基序列，(2)也可以在編碼蛋白質的鹼基序列的N末端側，插入編碼半胱氨酸的鹼基序列，再在其N末端側插入編碼KiSS-1肽的鹼基序列，由此構建該DNA。另外，(3)為得到該肽的片段時，採用定位誘變等辦法，使緊跟所要求的片段後的胺基酸殘基置換成半胱氨酸，而構建該DNA。
作為上述(1)場合的製造方法，例如，可以採用人們已知的磷醯胺法、磷酸三酯法、二酯法磷酸氫鹽法等，對短的DNA以一次，對長的DNA在分次合成後，用T4DNA連接酶進行連接而製成。
作為上述(2)的製造方法，例如，編碼C末端側的蛋白質的DNA，用適當的限制酶從染色體或cDNA切斷，連接在載體上而得到，或者取得cDNA。然後，用限制酶切斷N末端，而成為半胱氨酸，或者，改變合成DNA，使全蛋白或在其一部分的DNA的5′-末端上結合的N末端成為半胱氨酸。在其5′-末端上連接編碼目的蛋白質的DNA(既可以是化學合成的，也可由活體克隆而成)。
作為編碼這樣得到的融合蛋白質的DNA具體實例，可以是，例如，以下式表示的DNAGGTACTTCTCTGTCTCCGCCGCCGGAATCTTCTGGTTCTCGTCAGCAGCCGGGTCTGTCTGCTCCGCACTCTCGTCAGATCCCGGCTCCGCAGGGTGCTGTTCTGGTTCAGCGTGAAAAAGACCTGCCGAACTAACTGGAACTCTTTCGGTCTGCGTTTC-TGC或TGT-R(1)[式中，R由CCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCACTTCAAGGACCCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCCGACGGCCGAGTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAAGCAGAAGAGAGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGAGCGCTAATCGTTACCTGGCTATGAAGGAAGATGGAAGATTACTAGCTTCTAAGTCTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAATCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTGGCACTGAAACGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCTATACTTTTTCTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGC(bFGFCS23突變蛋白片段)構成的鹼基序列]。
上式(I)表示，在編碼含有人KiSS-1肽的肽的DNA鹼基序列(序列編號No2)上，通過編碼半胱氨酸的鹼基序列，結合以R表示的鹼基序列。
編碼KiSS-1肽的DNA，可以用上式(I)表示的DNA及編碼序列編號No15表示的KiSS-1成熟肽的DNA或其改性DNA(例如，J.Natl.Cancer Inst.，88，1731，1996；WO98/39448)，可用人們已知的方法進行製造。
5′末端有ATG、其下遊是編碼該融合蛋白質的區域、接著有翻譯終止密碼子的DNA(質粒)，可通過化學合成，或者，以遺傳工程製成的已知的該蛋白質的cDNA，或來自染色體的該蛋白質的DNA進行加工而製造的。
編碼本發明的N末端有半胱氨酸的蛋白質或在肽的N末端連接KiSS-1肽的融合蛋白質，或肽的DNA，採用現有的DNA技術，例如，特定部位定向性誘變技術，將其變換成編碼目的突變蛋白的DNA。
特定部位定向性誘變技術是大家已知的，示於Lather，R.F.及Lecoq，J.P.編著的「遺傳工程」，科學出版社(1983年)第31～50頁。指出寡核苷酸的誘變，示於Smith，M.及Gillam，S.編著的「遺傳工程原理和方法」，Plenum出版社(1981年)3卷1～32頁。
在製造具有編碼融合蛋白質的區域的DNA質粒時，作為載體使用的質粒，例如，來自大腸桿菌(Escherichia coli)的pBR332[基因，2，95(1977)]、pBA313[基因，2，75(1977)]、pBR324，pBR325[基因，4，124(1978)]、pBR327、pBR328[基因，9，287(1980)]、pBR329[基因，17，79(1982)]、pKY2289[基因，3，1(1978)]、pKY2700[生物化學，52，770(1980)]、pACYC177、pACYC184[細菌學雜誌，134，1141(1978)]、pRK248、pRK646、pDF[酶學方法，68，268(1979)]、pUC18、pUC19[基因，33，103(1985)]等。另外，噬菌體，如，使用λ噬菌體的λgt系的λgt·λC[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，71，4579(1974)]，λgt·λ B[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72，3461(1975)]，λDam[基因，1,255(1977)]以及抑素載體[科學，196，161(1977)；病毒學雜誌，29,255(1979)]，使用纖維狀噬菌體的mp系的mp18、mp19[セニシユ-ペロン等，基因，33，103(1985)]載體等。
上述DNA，在ATG的上遊有啟動子是優選的。該啟動子，只要是在轉化體製造中相對於所用的宿主是適當的啟動子即可。
例如，對大腸桿菌(Eschericha coli)有trp啟動子、tac啟動子、recA啟動子、λPL啟動子、lpp啟動子、T7啟動子等；對枯草桿菌(Bacillus subtilis)有SPO1啟動子、SPO2啟動子、penP啟動子等；對酵母(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))有PHO5啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子等；對動物細胞，有來自SV40的啟動子等。根據需要，也可把SD(Shine and Delgarno)序列插入啟動子的下遊。
在用T7啟動子系的場合，作為T7啟動子，在T7 DNA上找到的17種啟動子[J.L.Oakley等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，744266～4270(1977)，M.D.Rosa，Cell，16815～825(1979)，N.Panayotatos等，Nature，28035(1979)，J.J.Dunn等，J.Mol.Biol.，166477～535(1983)中的任何1種均可，然而，10啟動子[A.H.Rosenberg等，Gene，56125～135(1987)是優選的。
作為轉錄終止子，是在大腸桿菌系工作的終止子，優選的可以使用T終止子[F.W.Studier等，J.Mol.Biol.，189131-130(1986)]。
作為T7 RNA聚合酶基因，可以是T7基因[F.W.Studier等，J.Mol.Biol.，189113～130(1986)。
在上述載體上重組T7啟動子、T7終止子而構建的載體是優選的，作為這種載體，可以是pET-1、pET-2、pET-3、pET-4和pET-5[A.H.Rosenberg，Gene，56125～135(1987)]、pTB960-2[EP-A-499990]等，然而，優選的是使用pTB960-2。
本發明的轉化體，是把上述方法得到的用於表達的質粒，用已知的方法[例如，Cohen，S.N等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，692110(1972)，通過轉化宿主而製造的。
作為轉化的微生物宿主，例如，大腸桿菌(Escherichia)屬菌、芽孢桿菌(Bacillus)屬菌、酵母、動物細胞等。
作為所述大腸桿菌屬的實例，可以有大腸桿菌(E.coli)，具體的有大腸桿菌(Escherichia coli)K12 DH1[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，60，160(1968)]，JM-103[Nucleic Acids Research，9，309(1981)]、JA221[Joumal of MolecularBiology，120，517(1978)]、HB101[Journal of Molecular Biology，41，459(1969)]、C600[Genetics，39，440(1954)]、N4830[Cell，25，713(1981)]、K-12MM294[Proc.Natl.Acad.Sci.，73，4174(1976)]、BL-21等。
作為上述芽孢桿菌屬，例如，有枯草芽孢桿菌(Bacillus subilis)，具體的可以是枯草芽孢桿菌MI114(基因、24，255(1983)，207～21[Journal ofBiochemistry，95，87(1984)]等。
作為上述酵母，例如，可以有釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，具體的可以有釀酒酵母AH22[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)]、XSB52-23C[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，2173(1980)]、BH-641A(ATCC28339)、20B-12[Genetics，85，23(1976)]、GM3C-2[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，2258(1981)]等。
作為動物細胞，例如，可以有猴細胞COS-7[Cell，23，175(1981)]、非洲綠猴腎細胞株系[日本臨床，21，1209(1963)]、中國倉鼠細胞CHO[J.Exp.Med.，108，945(1985)]、小鼠L細胞(J.Nat.Cancer Inst.4，165(1943)]、人FL細胞[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.94，532(1957)]、倉鼠C細胞等。
在用T7啟動子的場合，作為其轉化體的宿主，可以使用已重組的T7RNA聚合酶基因(T7基因1)[F.W.Studier等，J.Mol.Biol.189113～130(1986)]的大腸桿菌株，例如MM294，DH-1，C600，JM109，BL21，或者把T7 RNA聚合酶基因(T7基因1)重組至別的質粒中的大腸桿菌等。優選的是使用重組了T7基因1的λ噬菌體溶原化的MM294株及BL21株。此時，作為T7基因1的啟動子，可以採用異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷(簡稱為IPTG)來誘導表達的lac啟動子。
在轉化埃希氏桿菌屬菌株時，可以按照Pro.Natl.Acad.Sci.USA，69卷，2110(1972)及Gene，17卷，107(1982)等中所述的方法進行。
在以芽孢桿菌屬菌株作為宿主的轉化，例如，可以按照Molecular andGeneral Genetics，168，111(1979)等已知的方法進行。
以酵母菌作為宿主的轉化，例如，可以按照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)等已知的方法進行。
以動物細胞作為宿主進行轉換時，例如，可以按照Virology，52，456(1973)等已知的方法進行。
融合蛋白可在培養基上培養上述轉化體，通過生成的融合蛋白而製造。
培養基的pH要求在約6～8。
作為培養埃希氏桿菌屬菌株的培養基，例如，含葡萄糖、酪蛋白酸的M9培養基[Miller，Journal of Experiments in Molecular Genetics，431～433，Cold Spring Harbor Laboratory，New Yorkl972]是優選的。根據需要，為了有效的發揮啟動子的作用，例如，可以添加3β-吲哚基丙烯酸或異丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)等製劑。
當宿主為埃希氏桿菌屬菌株的場合，培養通常在約15～43℃進行約3～24小時，根據情況，也可以增加通氣或攪拌。
當宿主為芽孢桿菌屬菌株時，培養通常在約30～40℃進行約6～24小時，根據情況，也可以增加通氣或攪拌。
在培養宿主為酵母的轉化體時，作為培養基，可以是，例如Burkholder基本培養基[Bostian，K.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，77，4505(1980)]。培養基的pH優選調至約5～8。培養通常在約20℃～35℃進行約24～72小時，根據需要，可增加通氣或攪拌。
在培養宿主為動物細胞的轉化體時，作為培養基，例如，可以是，含約0.2～20％，優選的含約5～20％的胎牛血清的MEM培養基[Science，122，501(1952)]、DME培養基[Virology，8，396(1959)]、RPMI1640培養基[TheJournal of The American Medical Association，199，519(1967)]、199培養基[Proceeding of the Society for the Biologycal Medicine，73，1(1950)]等。pH優選是約6～8。培養通常在約30～40℃進行15～60小時，根據需要，可增加通氣或攪拌。
融合蛋白質，通過培養上述轉化體，在培養物中生成該融合蛋白質，使其積累，將其採取而製造。
作為培養基，例如，可以有含葡萄糖、酪蛋白酸的M9培養基[Miller，J.，Experiments in Molecular Genetics，431～433(Cold Spring Horbor LaboratoryNew York1972)]、2×YT培養基[Methods in Enzymology，101，20(1983)]、LB培養基等。
培養通常在約15～43℃進行約3～24小時，根據需要，可以增加通氣或攪拌。
在使用具有含λcIts阻抑物和λPL-啟動子的表達載體的重組體的場合，培養是在約15～36℃，優選的在約30～36℃的溫度下進行，λcIts阻抑物的滅活，優選在約37℃～42℃進行。另外，為使recA啟動子具有更好的效率，即，使recA基因表達抑制功能降低，根據需要，添加絲裂黴素C、萘啶酮(ナルジキシン)酸等試劑，或照射紫外線，或把培養液的pH調至鹼性均可。
用T7啟動子系時，(1)表達連結在1ac啟動子下遊的T7基因(RNA聚合酶基因)時，添加IPTG等，或(2)在表達連結在λPL啟動子下遊的T7基因時(RNA聚合酶)，提高培養溫度，通過生成的T7噬菌體RNA聚合酶1特異地，發揮T7啟動子的作用。
培養後，用已知的方法收集菌體，例如，懸浮在緩衝液中，例如，採用蛋白變性劑處理、超聲波處理或溶菌酶等酶處理、玻璃珠處理、弗氏壓碎機處理、凍融處理等，破碎菌體，用離心分離等已知的方法得到上清液。
為了要從上述得到的上清液中，分離出融合蛋白質，採用通常已知的蛋白質純化方法。例如，凝膠過濾法、離子交換色譜法、吸附色譜法、高速液相色譜法、親和性色譜法、疏水性色譜法、電泳等適當組合使用。另外，該融合蛋白質，不進行純化或以部分純化狀態，可進入下一個反應步驟。
另外，這樣得到的融合蛋白質或肽，對其可施加半胱氨酸殘基的氨基一側肽鍵的切斷反應。作為該切斷反應，例如，可以有S-氰基化反應後進行水解反應。在以KiSS-1肽的醯胺或其鹽作為最終產物製取的場合，作為該切斷反應，例如，可以有，S-氰基化反應後進行氨解。該S-氰基化反應，通過使S-氰基化試劑作用於原料化合物而進行。
作為S-氰基化試劑，例如，可以是2-硝基-5-硫氰基安息香酸(NTCB)、1-氰基-4-二甲氨基吡啶鎓鹽(DMAP-CN)、CN-離子等。該S-氰基化試劑的量，是全部硫醇基的摩爾數的約2倍～50倍量即可，優選的是約5倍～10倍量。
反應溫度在約0℃～80℃之間，而約0℃～50℃之間更優選的。作為所用的溶劑，只要是不與S-氰基化反應試劑反應的都可以，任何一種緩衝液也可以使用，例如，Tris-鹽酸緩衝液、Tris-醋酸緩衝液、磷酸緩衝液、硼酸緩衝液等。另外，有機溶劑，只要是不存在與S-氰基化反應試劑反應的即可。
該反應，可在pH1～12之間進行。特別是在使用NTCB的場合，pH為7～10，在使用DMAP-CN的場合，為防止S-S交換反應，pH在2～7之間是優選的。另外，在反應液中，也可以存在鹽酸胍等變性劑。
作為上述氨解或水解反應，例如，可以進行鹼處理。
作為該鹼處理，可把含有原料化合物的水溶液pH調至7～12來進行。
該pH的調節，例如，可往含有原料化合物的水溶液中添加適當的氨、氫氧化鈉、後述的氨基化合物，トリツマベ-ス(三(羥甲基)-氨基甲烷)、磷酸氫二鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋇等溶液，而氨等是特別優選的。
作為上述反應時的溶液濃度，例如在氨或氨基化合物的場合，是約0.01～15N，優選的是約0.1～3N；在氫氧化鈉的場合，是約0.01～2N，優選的是約0.05～1N；在トリツマベ-ス的場合，是約1mM～1M，優選的是約20mM～200mM；磷酸氫二鈉的場合，是約1mM～1M，優選的是約10mM～100mM；在氫氧化鉀的場合，是約0.01N～4N，優選的是約0.1～2N。反應溫度，是在約-20℃～80℃之間的任何1個溫度即可，而約-10℃～50℃之間是更優選的。
反應時間，優選的是S-氰基化反應為約1～60分，優選的是約15～30分；而水解反應是約5分～100小時，優選的是10分～15小時；氨解是約5分～24小時，優選的是約10～180分。
作為該氨基化合物，例如，可以是以式R1-(NR2)-H(式中，R1及R2既可以相同也可以不同，它表示(i)氫原子、(ii)C1-20烷基，C3-8環烷基，C6-14芳基或C6-14芳基-C1-3烷基(這些基團沒有取代基或在碳原子上有1～3個氨基、羥基等)、(iii)取代的氨基、(iv)羥基或C1-6烷氧基)表示的化合物等。
通過上述S-氰基化及氨解或水解，可進行圖1所示的反應。
用本發明的製造方法得到的KiSS-1肽的C末端，可以是上述那樣的醯胺(-CONH2)、羧基、羧酸酯(-COO-)、烷基醯胺(-CONHR)或酯(-COOR)，其中，醯胺、羧基(-COOH)或烷基醯胺是優選的，而醯胺或烷基醯胺是特別合適的。具體地是，本發明的製造方法製得的KiSS-1肽的C末端，可以是圖1所示的-CO-X。X表示R1(NR2)-(式中各符號的含義同上)或OH。
作為上述C1-20烷基的實例，可以是，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、戊基、異戊基、新戊基、1-乙基戊基、己基、異己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基及二十烷基等。
作為上述C3-8環烷基的實例，例如，有環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基等。
作為上述C6-14芳基的實例，可以是苯基、萘基、蒽基、菲基、苊基等。
作為上述C6-14芳基-C1-3烷基的實例，例如，有苄基、苯乙基、3-苯基丙基、(1-萘基)甲基、(2-萘基)甲基等。
作為C1-6烷氧基的實例，可以有甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、已氧基等。
作為上述(iii)取代基的氨基取代基的實例例如，可以有胺基酸、2～10個胺基酸構成的肽等。
作為上述胺基酸，既可以是L-構型也可以是D-構型，作為其實例，例如Ala，Arg，Asp，Asn，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Met，Leu，Lys，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，Val等。
作為上述肽的實例，可以有，例如H-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5、H-Val-Ala-Leu-D-Ala-Ala-Pro-LeH-Ala-Pro-Arg-OH等。
在上述中，優選R2是氫原子、R1是氫原子或C1-20烷基。
在上述氨解反應中，在採用氨或氨基化合物的場合，可以得到對應的醯胺體。
為了分離切出的目的肽，可以採用通常已知的肽純化法。例如，凝膠過濾法、離子交換色譜法、高速液相色譜法、親和色譜法、疏水色譜法、薄層色譜法、電泳法等進行適當組合而純化。
這樣得到的KiSS-1肽或其鹽，可採用已知的方法，例如萃取、鹽析、分配、重結晶、色譜法等，從反應溶液中進行分離、純化，然而，作為優選的實例，例如，可以有SP-瓊脂糖(フアルマシアバイオテク(株))、DEAE-5PW(東ソ-(株))、或者通過SP-5PW(東ソ-(株))的離子交換色譜法等純化法。
所得到的KiSS-1肽或其鹽，根據需要，也可以通過冷凍乾燥，製成粉末。在進行冷凍乾燥時，可以添加山梨糖醇、甘露糖醇、右旋糖、麥芽糖、海藻糖、甘油等穩定劑。
用本發明的方法製造的KiSS-1肽或其鹽，可以與滅菌水、人血清白蛋白(HSA)、生理鹽水或其他公知的生理學上允許的載體混合，對哺乳動物(例如人類)可以是非口服的或局部給藥。例如，其1日給藥量，每人約0.01mg～50mg，優選的是約0.1mg～10mg，可以靜脈或肌肉注射等非口服方式給藥。
含有本發明方法製造的KiSS-1肽或其鹽的製劑，還可以含有鹽、稀釋劑、助劑、其他載體、緩衝劑、粘合劑、表面活性劑、防腐劑等生理上允許的其他活性成分。非口服製劑，提供的形式是安瓿，它是製劑與滅菌水溶液或生理學上允許的溶劑形成的懸浮液，或在使用時用生理學上允許的稀釋液進行稀釋的滅菌粉末(把通常的肽溶液冷凍乾燥而得到的)的安瓿。
採用本發明製造方法得到的KiSS-1肽或其鹽，由於具有抑制癌轉移的活性，可用作所有的癌(例如肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、乳腺癌等)的預防或治療用藥。
另外，由於KiSS-1肽或其鹽具有胎盤功能調節作用，所以，可以用作絨毛癌、葡萄胎、侵入奇胎、流產、胎兒發育不全、糖代謝異常、脂質代謝異常或引產的預防或治療用藥。
在本說明書及附圖中，胺基酸、肽、保護基、活性基、其他用簡略符號表示的場合，它們均按照IUPAC-IUB(生物化學名詞委員會)規定的簡略符號或該領域的慣用符號標註，其實例如下。另外，在涉及胺基酸等旋光異構體時，如未特別說明，均指L體。
DNA脫氧核糖核酸A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鳥嘌呤C胞嘧啶RNA核糖核酸EDTA乙二胺四醋酸Gly甘氨酸Ala丙氨酸Val纈氨酸Leu亮氨酸Ile異亮氨酸Ser絲氨酸Thr蘇氨酸Met蛋氨酸Glu穀氨酸Asp天冬氨酸Lys賴氨酸Arg精氨酸His組氨酸Phe苯丙氨酸Pyr酪氨酸Trp色氨酸Pro脯氨酸Asn天冬醯胺Cys半胱氨酸Asx天冬醯胺或天冬酸Glx穀氨酸胺或穀氨酸ATP三磷酸腺苷本說明書序列表的序列編號，表示下述序列。
表示KiSS-1肽的胺基酸序列。
表示編碼KiSS-1肽的DNA的鹼基序列。
表示bFGF CS 23突變蛋白的胺基酸序列。
表示編碼式(I)表示的融合蛋白的DNA片段的鹼基序列。
表示編碼式(I)表示的融合蛋白質的DNA片段的鹼基序列。
表示編碼bFGF CS 23突變蛋白片段的DNA鹼基序列。
表示用於製備實施例1中KiSS-1肽的結構基因的寡聚體的鹼基序列。
表示用於製備實施例1中KiSS-1肽的結構基因的寡聚體的鹼基序列。
表示用於製備實施例1中KiSS-1肽的結構基因的寡聚體的鹼基序列。
表示用於製備實施例1中KiSS-1肽的結構基因的寡聚體的鹼基序列。
表示用於製備實施例1中KiSS-1肽的結構基因的寡聚體的鹼基序列。
表示用於製備實施例1中KiSS-1肽的結構基因的寡聚體的鹼基序列。
表示用於製備實施例1中KiSS-1肽的結構基因的寡聚體的鹼基序列。
表示用於製備實施例1中KiSS-1肽的結構基因的寡聚體的鹼基序列。
表示KiSS-1成熟肽的胺基酸序列。
通過下列實施例更詳細地說明本發明，然而，本發明並不限於此。
實施例實施例1 編碼KiSS-1肽的DNA的製造(a)DNA片段的合成使用圖2所示的8種DNA片段(#1、#4、#5、#8アマシヤム·フアルマシア·バイオテク社，#2、#3、#6、#7キコ-テツク社)(序列表中，序列編號No7～14)，製備KiSS-1肽的結構基因(圖3)。
(b)DNA寡聚體的磷酸化除了構成5′的#1(序列編號No7)以及#8(序列編號No14)以外，把6種DNA寡聚體(#2～#7)(序列編號No8～13)分別在25μl磷酸化反應液[DNA寡聚體10μg、50mM Tris-HCl、pH7.6、10mM MgCl2、1mM精脒、10mM二硫蘇糖醇(以下簡稱為DTT)、0.1mg/ml牛血清白蛋白(以下簡稱為BSA)、1mMATP、10單元T4多核苷酸激酶(寶酒造)]中，在37℃使反應1小時，使各寡聚體的5′末端磷酸化。進行苯酚處理後，添加2倍量的乙醇、冷卻至-70℃後，離心，使DNA沉澱。
(c)DNA片段的連結把上述(a)中得到的DNA片段和#1及#8合併成為120μl。把該混合液於90℃保持10分鐘後，緩慢冷卻至室溫，進行退火。用TaKaRa DNA LigationKit Ver.2(寶酒造)進行連接反應。在30μl退火液中加入Ligation Kit II液30μl充分混合後，添加Ligation KitI液60μl，於37℃使反應1小時，進行連接。在苯酚處理後，回收水層，添加2倍量的乙醇，冷卻至-70℃後，離心DNA的沉澱。把這樣得到的DNA片段，用T4多核苷酸激酶(寶酒造)進行磷酸化後，供以下的(d)使用。
(d)KiSS-1肽表達載體的構建(圖4)作為表達用的載體，是使pTFC(特開2000-270871，特願平11-080303號)，用NdeI及AvaI(寶酒造)於37℃消化4小時後，採用1％瓊脂凝膠電泳，用QAIquick Gel Extraction Kit(キアゲン社)萃取4.4kb的DNA片段，溶於25μl TE緩衝液中。該pTFC的NdeI、AvaI片段和上面配製的KiSS-1肽的結構基因，用TaKaRa DNA Ligation Kit ver 2(寶酒造)進行連接反應。
用該反應液10μl，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞(東洋紡)，在含10μg/ml的四環素的LB瓊脂培養基上接種，於37℃培養過夜，選出生成的耐四環素菌落。把該轉化體用LB培養基培養過液，用QIAprep8 MiniprepKit(キアゲン社)，製備質粒pTFC-KiSS-1。該KiSS-1結構基因部分的鹼基序列，採用アプイドベイオシステムズ社製造的型號377 DNA序列測定儀進行證實。用質粒pTFC-KiSS-1轉化大腸桿菌MM 294(DE3)，得到KiSS-1肽-CS23融合蛋白質表達株M294(DE3)/pTFC-KiSS-1(圖4)。
大腸桿菌MM294(DE3)/pTFC-KiSS-1，以保藏編號FERM BP-6907，於1999年10月4日保藏在通產省工業技術院生命工學工業技術研究所。另外，在1999年9月16日以保藏編號IFO 16321保藏在財團法人發酵研究所(IFO)。
(d)KiSS-1肽的製造用含5.0mg/L四環素的LB培養基1L(1％腖、0.5％酵母提取液、0.5％氯化鈉)，使MM294(DE3)/pTFC-KiSS-1在2L燒瓶中於37℃振蕩培養8小時。把得到的培養液移至含有19L主要發酵培養基(1.68％磷酸一氫鈉、0.3％磷酸二氫鉀、0.1％氯化銨、0.05％氯化鈉、0.025％硫酸鎂、0.02％消泡劑、0.00025％硫酸亞鐵、0.0005％鹽酸硫胺素、1.5％葡萄糖、1.5％酪蛋白酸)的50L體積的發酵槽內，於30℃開始通氣攪拌。在培養液的濁度達到500克萊特單位時，添加異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷，使其最終濃度達到12mg/L，再進行6小時培養。培養終止後，離心分離培養液，得到約600g溼菌體，保存在-80℃。
實施例2往實施例1得到的菌體100g中添加10mM EDTA(pH6.0)溶液300ml，進行超聲波處理(BRANSON SONIFIER MODEL450)後，進行離心分離(10000rpm，60分)。收集上清液，使沉澱物再次進行同樣操作。把收集到的上清液調節至pH6.0，流經以50mM磷酸緩衝液(pH6.0)平衡過的AF-HeparinToyopearl 650M柱(11.3cm ID×13.5cmL，東ソ-)，進行吸附、洗滌後，用0～100％B(B＝50mM磷酸緩衝液+2M NaCl，pH6.0)等進行梯度洗脫，得到KiSS-1肽-CS23融合蛋白質級分(用100份的梯度洗脫時間約100分鐘的級分)。該洗脫液，用ペリコンミニカセツト(ミリポア社)濃縮後，再在添加0.1M醋酸的同時進行濃縮，得到KiSS-1肽-CS23融合蛋白質的0.1M醋酸溶液。往該溶液添加尿素使其最終濃度達到6M後，添加DMPA-CN(1-氰基-4-二甲氨基吡啶鎓四氟硼酸鹽)約100mg，於室溫反應15分鐘。反應終止後，把反應液流經以50mM磷酸一鉀進行平衡過的Sephadex G-25柱(46mm ID×600mmL，フアルマシア)，以6ml/min的流速使平衡所用的50mM磷酸一鉀展開，得到S-氰基化的KiSS-1肽-CS23融合蛋白質的級分。把該洗脫液，用ペリコンミニカセツト(ミリポア社)進行濃縮脫鹽，得到KiSS-1肽-CS23融合蛋白質的脫鹽液。往該脫鹽液中添加尿素使最終濃度達到6M後，再添加25％氨水使達到3M銨濃度，於室溫反應15分鐘。反應終止後，用醋酸調至pH6.0，得到KiSS-1肽(醯胺體)。使該反應液流經以50mM磷酸一鉀平衡過的Sephadex G-25柱(46mmID×600mmL)，以6ml/min的流速將平衡用的50mM磷酸一鉀展開，得到KiSS-1肽的級分(醯胺體)。讓該級分通過用含3M尿素的50mM MES+3 M尿素(pH4.5)平衡過的SP-5PW(21.5mmID×150mmL，東ソ-)，進行吸附、洗滌後，用0～30％B(B＝50mM磷酸緩衝液+1M NaCl+3M尿素，pH4.5)進行梯度洗脫，得到KiSS-1肽(醯胺體)級分(以60份的梯度洗脫時間約為30分鐘的級分)。讓該級分再次流經以0.1％三氟醋酸平衡的C4P-50(21.5mmID×300mmL，昭和電工)，進行吸附、洗滌後，用20～50％B(B80％乙腈/0.1％三氟醋酸)進行梯度洗脫，收集KiSS-1肽(醯胺體)級分(用60份的梯度洗脫時間約45分鐘的級分)後，進行冷凍乾燥，得到KiSS-1肽(醯胺體)冷凍乾燥粉末約40mg。
實施例3 KiSS-1肽特性的測定a)胺基酸組成分析用胺基酸分析儀(日立L-8500A，胺基酸分析儀)測定胺基酸的組成。結果顯示，與從KiSS-1肽的DNA鹼基序列預測的胺基酸組成一致(表1)。
表1胺基酸 每摩爾的殘基數 由KiSS-1肽的鹼基序列的預測值Asx 3.54Thr*)0.91Ser*)7.38Glx 7.07Pro 8.18Gly 4.95Ala 2.93Cys 0 0Val 2.02Met 0 0Ile 0.91Leu 5 5Tyr 1.01Phe 1.92His 1.11Lys 1.01Arg 3.84Trp 0.41酸解(6N HCl-4％巰基乙酸水解24～48小時的平均值)。
*)外推至0小時的值。
b)N末端胺基酸序列分析N末端胺基酸序列，用氣相蛋白質測序儀(PEアプライドバイオシステムズ型號492)測定。其結果與從KiSS-1肽的DNA鹼基序列預測的N末端胺基酸序列相一致(表2)。
表2N末端胺基酸序列分析殘基No. 檢出的PTH*)-胺基酸 由KiSS-1肽的鹼基序列預測的胺基酸1Gly(28) Gly2Thr(24) Thr3Ser(12) Ser4Leu(14) Leu5Ser(9)Ser6Pro(16) Pro7Pro(17) Pro8Pro(14) Pro9Glu(7)Glu10 Ser(4)Ser11 Ser(6)Ser用100pmol。
*)乙內醯苯硫脲c)C末端胺基酸的分析C末端胺基酸用胺基酸分析儀(日立L-8500A胺基酸分析儀)進行分析，然而，由於C末端被醯胺化，無法檢出(表3)。
表3C末端胺基酸分析C末端胺基酸 回收率(％)KiSS-1肽 Phe -氣相肼分解法(100℃，3.5小時)實施例4 生物活性測定採用實施例2中得到的人的KiSS-1肽，按WO99/33976的實施例3中記載的方法(細胞內鈣離子濃度上升活性)測定活性，可以證實與人胎盤提取液純化的標樣具有同等的活性。
實施例5 KiSS-1肽(非醯胺體)的製造往實施例1得到的菌體100g中添加10mM EDTA(pH6.0)溶液300ml，超聲波處理(BRANSON SONIFIER MODEL450)後，進行離心分離(10000rpm，60分)。收集上清液，用沉澱物再次進行同樣操作。把收集到的上清液調節至pH6.0，流經以50mM磷酸緩衝液(pH6.0)平衡過的AF-Heparin Toyopearl650M柱(11.3cmID×13.5cmL，東ソ一)，進行吸附、洗滌後，用0～100％B(B＝50mM磷酸緩衝液+2MNaCl、pH6.0)進行梯度洗脫，得到KiSS-1肽-CS23融合蛋白質級分(用100份的梯度洗脫時間約100分的級分)。該洗脫液用ペリコンミニカセツト(ミリポア社)濃縮後，再在添加0.1M醋酸的同時進行濃縮，得到KiSS-1肽-CS23融合蛋白質的0.1M醋酸溶液。往該溶液中添加尿素使達到最終濃度6M後，添加DMAP-CN約100mg，於室溫反應15分鐘。反應終止後，使反應液流經以50mM磷酸一鉀平衡過的Sephadex G-25柱(46mmID×600mmL，フアルマシア)，以6ml/min的流速以平衡用的50mM磷酸一鉀進行展開，得到S-氰基化的KiSS-1肽-CS23融合蛋白質級分。該洗脫液用ペリコンミニカセツト(ミリポア社)濃縮·脫鹽，得到KiSS-1肽-CS23融合蛋白質脫鹽液。往該脫鹽液添加尿素使最終濃度達到6M後，再添加1N NaOH使達到0.05N NaOH濃度，於0℃反應15分鐘。反應終止後，用醋酸調節pH至6.0，得到KiSS-1肽(非醯胺體)。讓該反應液流經以50mM磷酸一鉀平衡後的Sephadex G25柱(46mm ID×600mmL)，以6ml/min的流速以平衡用的50mM磷酸一鉀進行展開，得到KiSS-1肽級分(非醯胺體)。把該級分流經以含3M尿素的50mM MES+3M尿素(pH4.5)平衡的SP-5PW(21.5mmID×150mmL，東ソ-)，進行吸附、洗滌後，用0～30％B(B＝50mM磷酸緩衝液+1M NaCl+3M尿素，pH4.5)進行梯度洗脫，得到KiSS-1肽(非醯胺體)級分(用60份梯度洗脫時間約30分鐘的級分)。把該級分再流經以0.1％三氟醋酸平衡的C4P-50(21.5mmID×300mmL，昭和電工)，吸附、洗滌後，用20～50％B(B80％乙腈/0.1％三氟醋酸)進行梯度洗脫，收集KiSS-1肽(非醯胺體)級分(用60份的梯度洗脫時間約45分鐘的級分)後，進行冷凍乾燥，得到KiSS-1肽(非醯胺體)冷凍乾燥粉末約30mg。
實施例6 KiSS-1肽的特性測定a)胺基酸組成分析胺基酸組成是用胺基酸分析儀(日立L-8500A胺基酸分析儀)進行分析。結果與從KiSS-1肽的DNA鹼基序列預測的胺基酸組成一致(表4)。
表4胺基酸組成分析胺基酸 每1摩爾的殘基數由KiSS-1肽的鹼基序列的預測值Asx 3.3 4Thr*)0.9 1Ser*)7.0 8Glx 7.0 7Pro 7.8 8Gly 4.7 5Ala 2.8 3Cys 0 0Val 1.9 2Met 0 0Ile 0.9 1Leu 5 5Tyr 1.0 1Phe 1.9 2His 0.9 1Lys 0.9 1Arg 3.7 4Trp 0.4 1酸解(6N HCl-4％巰基乙酸水解24～48小時的平均值)。
*)外推至0小時的值。
b)N末端胺基酸序列分析N末端胺基酸序列是用氣相蛋白質測序儀(PE アプライドバイオシステムズ型號492)測定。結果與從KiSS-1肽的DNA鹼基序列預測的N末端胺基酸序列一致(表5)。
表5N末端胺基酸序列分析殘基No.檢出的PTH*)-胺基酸 由KiSS-1肽的鹼基序列預測的胺基酸1 Gly(17) Gly2 Thr(13) Thr3 Ser(11) Ser4 Leu(15) Leu5 Ser(8) Ser6 Pro(10) Pro7 Pro(11) Pro8 Pro(10) Pro9 Glu(5) Glu10 Ser(5) Ser用100pmol。
*)乙內醯苯硫脲c)C末端胺基酸的分析C末端胺基酸是用胺基酸分析儀(日立L-8500A胺基酸分析儀)進行分析(表6)。
表6C末端氯基酸分析C末端胺基酸 回收率(％)KiSS-1肽 Phe 48.5氣相肼分解法(100℃，3.5小時)工業上應用的可能性採用本發明的製造方法，在工業上可以大量生產用於下列疾病預防與治療的藥劑，例如，所有的癌(例如，肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、乳腺癌等)、還可用於絨毛癌、葡萄胎、侵入奇胎、流產、胎兒發育不全、糖代謝異常、脂質代謝異常或引產的預防和治療。
序列表序列表110武田藥品工業株式會社(Takeda Chemical Industries，Ltd.)120KiSS-1肽的製造方法1302677WOOP150JP11-3586931511999-12-1716015210121154212PRT213人223多肽的C-末端是醯胺(-CONH2)形式4001Gly Thr Ser Leu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Ser Gly Ser Arg Gln Gln15 10 15Pro Gly Leu Ser Ala Pro His Ser Arg Gln Ile Pro Ala Pro Gln Gly20 25 30Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Leu Pro Asn Tyr Asn Trp Asn35 40 45Ser Phe Gly Leu Arg Phe50 542102211162212DNA213人4002ggtacttctc tgtctccgcc gccggaatct tctggttctc gtcagcagcc gggtctgtct60gctccgcact ctcgtcagat cccggctccg cagggtgctg ttctggttca gcgtgaaaaa120gacctgccga actacaactg gaactctttc ggtctgcgtt tc 1622103211146212PRT213人4003Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His15 10 15Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu20 25 30Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp35 40 45Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser50 55 60Ile Lys Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly65 70 75 80Arg Leu Leu Ala Ser Lys Ser Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu85 90 95Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr100 105 110Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser115 120 125Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala130 135 140Lys Ser1452104211165212DNA213人4004ggtacttctc tgtctccgcc gccggaatct tctggttctc gtcagcagcc gggtctgtct 60gctccgcact ctcgtcagat cccggctccg cagggtgctg ttctggttca gcgtgaaaaa 120gacctgccga actacaactg gaactctttc ggtctgcgtt tctgc 1652105211165212DNA213人4005ggtacttctc tgtctccgcc gccggaatct tctggttctc gtcagcagcc gggtctgtct 60gctccgcact ctcgtcagat cccggctccg cagggtgctg ttctggttca gcgtgaaaaa 120gacctgccga actacaactg gaactctttc ggtctgcgtt tctgt 1652106211432212DNA213人4006cccgaggatg gcggcagcgg cgccttcccg cccggccact tcaaggaccc caagcggctg 60tactgcaaaa acgggggctt cttcctgcgc atccaccccg acggccgagt tgacggggtc 120cgggagaaga gcgaccctca catcaagcta caacttcaag cagaagagag aggagttgtg 180tctatcaaag gagtgagcgc taatcgttac ctggctatga aggaagatgg aagattacta 240gcttctaagt ctgttacgga tgagtgtttc ttttttgaac gattggaatc taataactac 300aatacttacc ggtcaaggaa atacaccagt tggtatgtgg cactgaaacg aactgggcag 360tataaacttg gatccaaaac aggacctggg cagaaagcta tactttttct tccaatgtct 420gctaagagct gc 432210721136212DNA213人工序列220223引物4007tatgggtact tctctgtctc cgccgccgga atcttc36210821145212DNA213人工序列220223引物4008tggttctcgt cagcagccgg gtctgtctgc tccgcactct cgtca 45210921142212DNA213人工序列220223引物4009gatcccggct ccgcagggtg ctgttctggt tcagcgtgaa aa 422101021147212DNA213人工序列220223引物40010agacctgccg aactacaact ggaactcttt cggtctgcgt ttctgcc 472101121146212DNA213人工序列220223引物40011acgagaacca gaagattccg gcggcggaga cagagaagta cccata 462101221145212DNA213人工序列220223引物40012agccgggatc tgacgagt gcggagcaga cagacccggc tgctg 452101321142212DNA213人工序列220223引物40013cggcaggtct ttttcacgct gaaccagaac agcaccctgc gg 422101421141212DNA213人工序列220223引物40014tcggggcaga aacgcagacc gaaagagttc cagttgtagt t4121015211145212PRT213人40015Met Asn Ser Leu Val Ser Trp Gln Leu Leu Leu Phe Leu Cys Ala Thr1 5 10 15His Phe Gly Glu Pro Leu Glu Lys Val Ala Ser Val Gly Asn Ser Arg20 25 30Pro Thr Gly Gln Gln Leu Glu Ser Leu Gly Leu Leu Ala Pro Gly Glu35 40 45Gln Ser Leu Pro Cys Thr Glu Arg Lys Pro Ala Ala Thr Ala Arg Leu50 55 60Ser Arg Arg Gly Thr Ser Leu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Ser Gly Ser65 70 75 80Arg Gln Gln Pro Gly Leu Ser Ala Pro His Ser Arg Gln Ile Pro Ala85 90 95Pro Gln Gly Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Leu Pro Asn Tyr100 105 110Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe Gly Lys Arg Glu Ala Ala Pro115 120 125Gly Asn His Gly Arg Ser Ala Gly Arg Gly Trp Gly Ala Gly Ala Gly130 135 140Gln14權利要求
1.一種KiSS-1肽或其鹽的製造方法，其特徵是，對在N末端有半胱氨酸的蛋白質或肽的N末端上連接有KiSS-1肽的融合蛋白質、肽或其鹽，對該半胱氨酸殘基的氨基側的肽鍵進行切斷反應。
2.一種KiSS-1肽或其鹽的製造方法，其特徵是，培養含有編碼N末端有半胱氨酸的蛋白質或肽的N末端上連接有KiSS-1肽的融合蛋白質，或肽的DNA載體的轉化體而表達融合蛋白質，肽或其鹽，對表達的融合蛋白質，肽或其鹽進行該半胱氨酸殘基的氨基側肽鍵的切斷反應。
3.權利要求1或2所述的製造方法，其中，KiSS-1肽的C末端是醯胺。
4.權利要求1或2所述的製造方法，其中，切斷反應是通過S-氰基化反應，然後進行氨解或水解反應而進行。
5.權利要求1或2所述的製造方法，其中，KiSS-1肽是含有序列編號No.1表示的胺基酸序列的肽。
6.權利要求1或2所述的製造方法，其中，KiSS-1肽含有①從序列編號No.1表示胺基酸序列的N末端起，第40～54號構成的胺基酸序列的肽；②從序列編號No.1表示胺基酸序列的N末端起，第45～54號構成的胺基酸序列的肽；③從序列編號No.1表示胺基酸序列的N末端起，第46～54號構成的胺基酸序列的肽；④從序列編號No.1表示胺基酸序列的N末端起，第47～54號構成的胺基酸序列的肽。
7.權利要求1或2所述的製造方法，其中，在N末端有半胱氨酸的蛋白質或肽，包括N末端有半胱氨酸的幹擾素類、白介素類、成纖維細胞生長因子、(前)尿激酶類、淋巴毒素、腫瘤壞死因子(TNF)、β-半乳糖苷酶、貯藏蛋白質類、鏈黴菌抗生物素蛋白、蛋白質A、蛋白質G、組織纖溶酶原激活物(TPA)或其突變蛋白或片段。
8.權利要求1或2所述的製造方法，其中，N末端具有半胱氨酸的蛋白質或肽是含有序列編號No.3表示的胺基酸序列，在其N末端添加半胱氨酸殘基的蛋白質或肽。
9.權利要求1或2所述的製造方法，其中，在N末端具有半胱氨酸的蛋白質或肽是含有序列編號No.3表示的胺基酸序列，在其N末端添加半胱氨酸的蛋白，KiSS-1肽是含有序列編號No.1表示的胺基酸序列的肽，製成的KiSS-1肽是其C末端為醯胺並以序列編號No.1表示的胺基酸序列的肽。
10.一種融合蛋白質、肽或其鹽，其中在N末端有半胱氨酸的蛋白質或肽的N末端上連結有KiSS-1肽。
11.權利要求10所述的融合蛋白質，肽或其鹽，其中含有序列編號No.3表示的胺基酸序列，在其N末端添加有半胱氨酸殘基的蛋白質的N末端上連結含有序列編號No.1表示的胺基酸序列的KiSS-1肽。
12.一種DNA，它含有編碼權利要求10所述的融合蛋白質或肽的DNA。
13.權利要求12所述的DNA，其中含有①序列編號No.4表示的鹼基序列或②序列編號5表示的鹼基序列。
14.一種具有權利要求12所述DNA的載體。
15.一種含有權利要求14所述載體的轉化體。
16.一種以FERM BP-6907表示的大腸桿菌MM 294(DE3)/pTFC-KiSS-1。
全文摘要
工業上可以大量製造Kiss－1肽或其鹽，它是通過將其中N末端具有半胱氨酸的蛋白質或在肽的N末端連接Kiss－1肽的融合蛋白質，通過對肽的半胱氨酸殘基的胺基酸側肽鍵進行切斷反應而進行的。
文檔編號C07K5/083GK1411509SQ00817291
公開日2003年4月16日 申請日期2000年12月14日 優先權日1999年12月17日
發明者末永正人, 山田隆央, 西村紀 申請人:武田藥品工業株式會社