一種驢皮膠原的製備方法

2023-05-05 13:33:36

專利名稱：一種驢皮膠原的製備方法
技術領域：
本發明屬於膠原的製備技術領域，特別涉及一種驢皮膠原的製備方法。
背景技術：
膠原是動物體內含量最多、分布最廣的一類蛋白質家族，廣泛存在於從低等脊椎 動物到哺乳動物的一切組織中；具有其他合成材料無法比擬的生物相容性、可生物降解性 以及生物活性。現已至少發現了 30餘種膠原鏈的編碼基因，可以形成16種以上的膠原分 子。根據它們在體內的分布和功能特點，目前將膠原分成間質膠原、基底膜膠原和細胞外周 膠原，間質型膠原分子佔整個機體膠原的絕大部分，包括I型、II型、III型膠原分子，其主要 分布於皮膚、肌腱等組織；基底膜膠原通常是指IV型膠原.其主要分布於基底膜；細胞周膠 原通常中指V型膠原，在結締組織中大量存在。近年來，養驢慢慢受到畜牧業人士的關注，因為，不僅驢肉本身具有較高的經濟使 用價值，驢皮還具有很高的藥用價值，具有天然的補血、止血作用，是製作阿膠的主要原料。驢皮生皮料是極其複雜的物質，基本上是由蛋白質和非蛋白質兩大組分組成，其 中，蛋白質佔鮮皮的30% 35%。新剝下來的生皮pH值為6. 8 7. 8，在存放過程中隨皮料 的逐漸變質，PH值亦隨之變化。組成生皮的蛋白質種類很多，皮料蛋白質分為纖維蛋白(結 構蛋白)、非纖維蛋白(非結構蛋白)和酶等。纖維蛋白由膠原、角朊、彈性硬朊組成。膠原約 佔生皮總量(除皮下層)的29%，約佔全部蛋白質總量的88%。目前，驢皮的應用主要是作為熬製阿膠的重要原料。根據中國藥典2005年版一部 的記載，阿膠的製法如下
將驢皮(馬科動物驢EquusasinusL.的乾燥皮或鮮皮)浸泡去毛，切塊洗淨，分次水煎， 小組過，合併濾液，濃縮(可分別加入適量的黃酒、冰糖和豆油)至稠膏狀，冷凝，切塊，晾乾， 即得。上述簡單的熬製方法，沒有針對驢皮中所含膠原成分的特性進行選擇性提取和精 制，使阿膠中除含膠原外，還含有部分水解產生的賴氨酸、精氨酸、組氨酸等多種胺基酸，以 及鈣、硫等成分；並且阿膠的水溶性差，只能烊化服用，也不能作為化妝品等使用，其使用受 到較大限制。

發明內容
本發明的主要目的是針對上述現有技術中存在的對驢皮的應用僅限於熬製阿膠， 而阿膠中成分複雜、水溶性差，除作為口服藥物外其它應用受到較大限制等問題，提供一種 驢皮膠原的製備方法，以驢皮為原料，通過特定的提取和精製方法，得到水溶性好的驢皮膠 原，不僅保留生物活性，與人肌體、皮膚同源性及相容性，並且具有生物可降解性和低抗原 性等特點，能被水以任性比例稀釋，可用於製備外科植入物和組織工程醫療產品，開發醫 藥、醫學試劑、及保健品等。為了實現上述發明目的，本發明採用的技術方案如下一種驢皮膠原的製備方法，包括下述主要步驟 (1)脫毛、脫脂
以檢驗、檢疫合格的鮮驢皮為原料，採用常規方法脫毛、脫脂後，再用水洗至中性，0°C 以下冷凍保存備用；
由於膠原在常溫及高溫條件下容易變性失活，因而需要冷凍保存。(2)碎皮、鹼液浸泡
取上述步驟(1)處理後備用的驢皮解凍，碎皮成20-40目的顆粒，加入pH為7. 5-9. 5 (可優選為7. 5-9. 0)的氫氧化鈉溶液，其加入量按照驢皮顆粒質量氫氧化鈉溶液體積 =lg (8-12)ml計算，浸泡軟化48-96h ；用去離子水衝洗至pH為6. 0-7. 0，得到中性驢皮顆 粒；
發明人通過大量試驗發現，由於驢皮的表皮結構緊密，不容易軟化，需要先將其碎成一 定細度的小顆粒，才有利於後續的軟化處理，發明人通過大量試驗證實，當顆粒粗於20目 時，由於顆粒太粗，加入鹼液後浸泡處理超過96h也難以全部軟化；理論上，碎皮的顆粒越 細越有利於軟化，但由於鮮驢皮的理化特性，又很難將其碎成超過40目的更細的顆粒，因 此，綜合考慮，以20-40目為好；
進一步的，將碎至20-40目的驢皮顆粒放入適宜pH值的鹼液中進行浸泡處理，可軟化 膠質，有利於提高後續步驟酶解的效率，但PH值過低或過高都不利於軟化效果，大量試驗 證實，以pH為7. 5-9. 5的氫氧化鈉溶液較好；而浸泡時間的選擇，則與驢皮顆粒的細度及鹼 液的pH值等密切相關，互相影響，在驢皮顆粒為20-40目、pH為7. 5-9. 5範圍內，浸泡時間 通常在48-96h內可獲得理想的軟化效果；
通過本步驟特定條件的碎皮、鹼液浸泡處理，可有效軟化驢皮中的膠質，為後續酶解等 步驟有效提取驢皮膠原提供必要的保證。(3)低溫酶解
取上述步驟(2)處理後的中性驢皮顆粒，加入pH為4. 3-6. 5 (可優選為4. 5-6. 0)的 鹽酸溶液，其加入量按照中性驢皮顆粒質量鹽酸溶液體積=lg: (45-50)ml計算，再加入 8-10UI (UI是酶活力國際單位，指在特定條件下，1分鐘內轉化1微摩爾底物，或者底物中 1微摩爾有關基團所需的酶量；在胃蛋白酶的活力測定中是指在37°C 士0. 5°C，每分鐘能 催化水解血紅蛋白生成lymol酪氨酸所需的胃蛋白酶量)的胃蛋白酶，低溫(10°C以下)放 置3-4d，攪拌和靜置間隔處理，攪拌的總時間與靜置的總時間比約為1: (1. 5-2. 5)，得到含 有驢皮膠原的初液；
本步驟通過在鹽酸溶液中、胃蛋白酶作用下低溫酶解處理，使驢皮中的膠原充分溶解 到溶液中，有利於後續步驟有效的提取驢皮膠原。(4)提取、純化
將上述步驟(3)得到的初液離心，取得上清液，加入NaCl，充分攪拌，使驢皮膠原從溶 液中析出、沉澱，靜置8-16小時，取沉澱，用去離子水洗滌1-2次，得到酸溶性驢皮膠原沉 澱；
本步驟通過離心處理，將酶解後溶於溶液中的膠原提取出來，並進一步通過鹽析處理， 使驢皮膠原從溶液中析出沉澱，而其它雜質則保留在溶液中被除去，從而達到純化驢皮膠 原的目的；但該步驟得到的是酸溶性的膠原，不宜直接與皮膚接觸，發明人通過大量試驗研究發 現，通過特定的改性手段，可使之變為水溶性的膠原，從而滿足多種應用的需要。(5)改性
將上述步驟(4)得到的酸溶性驢皮膠原沉澱用0. 2-1. 0M (可優選為0. 4-0. 6M)的醋 酸溶液溶解，其用量按照酸溶性驢皮膠原沉澱質量醋酸溶液體積=lg: (45-50)ml倍量計 算；測定蛋白質含量，加入丙酮(C3H60)作為改性劑，其加入量按照蛋白質質量丙酮體積 =lg (10-15)ml計算，在4-8°C下，用氫氧化鈉調節溶液pH為10-12，反應5_9h，再用HC1調 節pH為4. 0-4. 2，析出沉澱，靜置8-16小時；取沉澱，甩幹，用pH為4. 0-4. 2的鹽酸溶液洗 滌1-3次，得到改性後的驢皮膠原產品，即可。本步驟通過在鹼性條件下、以丙酮作為改性劑對驢皮膠原進行改性，可有效除去 酸溶性驢皮膠原中的端肽，成為水溶性的改性驢皮膠原，為I型活性膠原；由於僅僅只是去 除了端肽，蛋白的三股螺旋結構並沒有被破壞，故仍然能保留其原有的生物活性。同時，本 步驟中將改性靜置後的沉澱進行甩幹處理也是非常必要的，可有效除去溶解於醋酸溶液中 的非纖維蛋白等雜質，以提高產品中改性驢皮膠原的純度。發明人通過大量對比試驗，從眾多理論上可用作蛋白改性劑的物質中進行篩選， 發現以丙酮對前述步驟(4)所得酸溶性驢皮膠原進行改性，可獲得理想的水溶性膠原，並且 還具有一些其它改性劑所不能兼具的特點，如生物活性、與人肌體、皮膚的相容性、低抗原 性、生物可降解性等。本發明中用到的各種溶液，在未作特別說明時，均是指水溶液。與現有技術相比，本發明的有益效果是
本發明方法以鮮驢皮為原料，通過特定組合的工藝步驟及參數條件進行提取和精製處 理得到酸溶性膠原，再採用丙酮在鹼性條件下對酸溶性膠原進行改性，得到水溶性的驢皮 膠原產品，該水溶性的驢皮膠原具有下述特點
(1)改性後的膠原的三股螺旋結構並沒有被破壞，仍然保留其原有的生物活性；
(2)產品中主要成分為分子量約300KD左右的I型活性膠原，水溶性好，能被水以任意 比例稀釋；
(3)來源於脊椎動物的膠原與人肌體、皮膚具有良好的同源性和相容性，其分子量和結 構相似；塗於皮膚後可快速溶入表皮；
(4)該膠原的變性溫度約為36.5°C，經人肌體、皮膚吸收後，在人體正常體溫和體內膠 原酶的作用下，可生物降解為小分子多肽、單肽，又可在其他酶的作用下繼續分解成二十餘 種胺基酸，易被吸收，繼續發揮營養作用；
(5)通過測定，與改性前有端肽的膠原相比，改性後無端肽的膠原與膠原抗原的結合力 差，具有低抗原性。因此，這種保留了生物活性、且具有水溶性好、與人肌體、皮膚同源性及相容性好、 生物可降解性和低抗原性等特點的活性驢皮膠原產品，可用於製備外科植入物和組織工程 醫療產品，開發醫藥、醫學試劑、及保健品等。


圖1是本發明實施例1中步驟(4)所得的酸溶性驢皮膠原、步驟(5)所得的水溶性 膠原分別與膠原抗體的結合曲線圖；圖1中，a是步驟(4)所得的酸溶性驢皮膠原與膠原抗 體的結合曲線，b是步驟(5)所得的水溶性膠原與膠原抗體的結合曲線。圖2是本發明實施例1所得膠原隨溫度變化的變性曲線圖。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明的上述發明內容作進一步的詳細描述。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於下述實施例。在不脫離本發明上 述技術思想情況下，根據本領域普通技術知識和慣用手段，做出各種替換和變更，均應包括 在本發明的範圍內。實施例1
本實施例驢皮膠原通過包括下述步驟的方法製備
(1)脫毛、脫脂
以檢驗、檢疫合格的鮮驢皮為原料，脫毛、脫脂後，用水洗至中性，o°c以下冷凍保存備
用；
(2)碎皮、鹼液浸泡
取上述步驟(1)處理後備用的驢皮解凍，碎皮成20-40目的顆粒，取500g驢皮顆粒，加 入pH為7. 5的氫氧化鈉溶液6000ml，浸泡軟化96h ；用去離子水衝洗至pH約為6. 0，得到 中性驢皮顆粒；
(3)低溫酶解
取上述步驟(2)處理後的中性驢皮顆粒200g，加入pH為6. 5的鹽酸溶液9000ml，再加 入8UI的胃蛋白酶，10°C以下低溫放置3d，攪拌和靜置間隔處理，攪拌的總時間與靜置的總 時間比為1:2. 5，得到含有驢皮膠原的初液；
(4)提取、純化
將上述步驟(3)得到的初液離心，取得上清液，加入NaCl，充分攪拌，使驢皮膠原從溶 液中析出、沉澱，靜置8小時，取沉澱，用去離子水洗滌1次，得到酸溶性驢皮膠原沉澱；
(5)改性
取上述步驟(4)得到的酸溶性驢皮膠原沉澱10g，用1. 0M的醋酸溶液400ml溶解，測定 蛋白質含量(為6. 9mg/ml)，加入丙酮約27600ml作為改性劑，在約4°C，用氫氧化鈉調節溶 液pH為10. 0，反應9h，再用HC1調節pH為4. 0，析出沉澱，靜置16小時；取沉澱，甩幹，用 pH為4. 0的鹽酸溶液洗滌3次，得到改性後的驢皮膠原產品，即可。發明人委託四川醫療器械生物材料和製品檢驗中心對上述實施例得到的改性驢 皮膠原產品進行檢驗，檢驗報告顯示在電泳圖中有a、0、Y的對應色帶，分子量分別為 100KD、200KD 和 300KD。進一步的水溶性、抗原性、與人肌體、皮膚的相容性等測試顯示該產品能被水以 任意比例稀釋，水溶性好；與膠原抗原的結合力差，在膠原與膠原抗體的結合曲線圖(如圖 1所示)中幾乎為一直線，具有低抗原性；塗於人肌體、皮膚後迅速溶入表皮，與人肌體、皮膚 相容性好；在36. 5°C左右變性降解而粘度降低(如圖2所示)。
實施例2
本實施例驢皮膠原通過包括下述步驟的方法製備
(1)脫毛、脫脂
以檢驗、檢疫合格的鮮驢皮為原料，脫毛、脫脂後，用水洗至中性，o°c以下冷凍保存備
用；
(2)碎皮、鹼液浸泡
取上述步驟(1)處理後備用的驢皮解凍，碎皮成20-40目的顆粒，取500g驢皮顆粒，加 入pH為9. 5的氫氧化鈉溶液4000ml，浸泡軟化48h ；用去離子水衝洗至pH約為7. 0，得到 中性驢皮顆粒；
(3)低溫酶解
取上述步驟(2)處理後的中性驢皮顆粒200g，加入pH為4. 3的鹽酸溶液10000ml，再 加入10UI的胃蛋白酶，10°C以下低溫放置4d，攪拌和靜置間隔處理，攪拌的總時間與靜置 的總時間比為1:1. 5，得到含有驢皮膠原的初液；
(4)提取、純化
將上述步驟(3)得到的初液離心，取得上清液，加入NaCl，充分攪拌，使驢皮膠原從溶 液中析出、沉澱，靜置16小時，取沉澱，用去離子水洗滌2次，得到酸溶性驢皮膠原沉澱；
(5)改性
取上述步驟(4)得到的酸溶性驢皮膠原沉澱10g，用0. 2M的醋酸溶液500ml溶解，測定 蛋白質含量(為4. lmg/ml)，加入丙酮約30750ml作為改性劑，在約8°C，用氫氧化鈉調節溶 液pH為12. 0，反應5h，再用HC1調節pH為4. 2，析出沉澱，靜置8小時；取沉澱，甩幹，用pH 為4. 2的鹽酸溶液洗滌2次，得到改性後的驢皮膠原產品，即可。實施例3
本實施例驢皮膠原通過包括下述步驟的方法製備
(1)脫毛、脫脂
以檢驗、檢疫合格的鮮驢皮為原料，脫毛、脫脂後，用水洗至中性，o°c以下冷凍保存備
用；
(2)碎皮、鹼液浸泡
取上述步驟(1)處理後備用的驢皮解凍，碎皮成20-40目的顆粒，取500g驢皮顆粒，加 入pH為8. 0的氫氧化鈉溶液5000ml，浸泡軟化72h ；用去離子水衝洗至pH約為6. 5，得到 中性驢皮顆粒；
(3)低溫酶解
取上述步驟(2)處理後的中性驢皮顆粒200g，加入pH為4. 5的鹽酸溶液9500ml，再加 入8UI的胃蛋白酶，10°C以下低溫放置3d，攪拌和靜置間隔處理，攪拌的總時間與靜置的總 時間比為1:2，得到含有驢皮膠原的初液；
(4)提取、純化
將上述步驟(3)得到的初液離心，取得上清液，加入NaCl，充分攪拌，使驢皮膠原從溶 液中析出、沉澱，靜置12小時，取沉澱，用去離子水洗滌2次，得到酸溶性驢皮膠原沉澱；
(5)改性
取上述步驟(4)得到的酸溶性驢皮膠原沉澱10g，用0. 4M的醋酸溶液460ml溶解，測定蛋白質含量(為7. 5mg/ml)，加入丙酮約41400ml作為改性劑，在約6°C，用氫氧化鈉調節溶 液pH為11. 0，反應6h，再用HC1調節pH為4. 2，析出沉澱，靜置12小時；取沉澱，甩幹，用 PH為4. 2的鹽酸溶液洗滌2次，得到改性後的驢皮膠原產品，即可。實施例4
本實施例驢皮膠原通過包括下述步驟的方法製備
(1)脫毛、脫脂
以檢驗、檢疫合格的鮮驢皮為原料，脫毛、脫脂後，用水洗至中性，o°c以下冷凍保存備
用；
(2)碎皮、鹼液浸泡
取上述步驟(1)處理後備用的驢皮解凍，碎皮成20-40目的顆粒，取500g驢皮顆粒，加 入pH為9. 0的氫氧化鈉溶液5500ml，浸泡軟化60h ；用去離子水衝洗至pH約為6. 8，得到 中性驢皮顆粒；
(3)低溫酶解
取上述步驟(2)處理後的中性驢皮顆粒200g，加入pH為6.0的鹽酸溶液9800ml，再加 入9UI的胃蛋白酶，10°C以下低溫放置4d，攪拌和靜置間隔處理，攪拌的總時間與靜置的總 時間比為1:2，得到含有驢皮膠原的初液；
(4)提取、純化
將上述步驟(3)得到的初液離心，取得上清液，加入NaCl，充分攪拌，使驢皮膠原從溶 液中析出、沉澱，靜置12小時，取沉澱，用去離子水洗滌1次，得到酸溶性驢皮膠原沉澱；
(5)改性
取上述步驟(4)得到的酸溶性驢皮膠原沉澱10g，用0. 6M的醋酸溶液480ml溶解，測定 蛋白質含量(為5. 2mg/ml)，加入丙酮約25000ml作為改性劑，在約4°C，用氫氧化鈉調節溶 液pH為11. 0，反應7h，再用HC1調節pH為4. 1，析出沉澱，靜置14小時；取沉澱，甩幹，用 pH為4. 1的鹽酸溶液洗滌1次，得到改性後的驢皮膠原產品，即可。發明人委託同一單位對上述各實施例得到的改性驢皮膠原產品進行電泳測試、及 水溶性、抗原性、與人肌體、皮膚的相容性等測試，結果均與實施例1所得的原產品的測試 結果相似。
權利要求
一種驢皮膠原的製備方法，包括下述步驟(1)脫毛、脫脂以檢驗、檢疫合格的鮮驢皮為原料，脫毛、脫脂後，用水洗至中性，0℃以下冷凍保存備用；(2)碎皮、鹼液浸泡取上述步驟(1)處理後備用的驢皮解凍，碎皮成20-40目的顆粒，加入pH為7.5-9.5的氫氧化鈉溶液，其加入量按照驢皮顆粒質量:氫氧化鈉溶液體積=1g:(8-12)ml 計算，浸泡軟化48-96h；用去離子水衝洗至pH為6.0-7.0，得到中性驢皮顆粒；(3)低溫酶解取上述步驟(2)處理後的中性驢皮顆粒，加入pH為4.3-6.5的鹽酸溶液，其加入量按照中性驢皮顆粒質量:鹽酸溶液體積=1g:(45-50)ml計算，再加入8-10UI的胃蛋白酶，10℃以下低溫放置3-4d，攪拌和靜置間隔處理，攪拌的總時間與靜置的總時間比為1:(1.5-2.5)，得到含有驢皮膠原的初液；(4)提取、純化將上述步驟(3)得到的初液離心，取得上清液，加入NaCl，充分攪拌，使驢皮膠原從溶液中析出、沉澱，靜置8-16小時，取沉澱，用去離子水洗滌1-2次，得到酸溶性驢皮膠原沉澱；(5)改性將上述步驟(4)得到的酸溶性驢皮膠原沉澱用0.2-1.0M的醋酸溶液溶解，其用量按照酸溶性驢皮膠原沉澱質量:醋酸溶液體積=1g:(45-50)ml倍量計算；測定蛋白質含量，加入丙酮作為改性劑，其加入量按照蛋白質質量:丙酮體積=1g:(10-15)ml計算；在4-8℃下，用氫氧化鈉調節溶液 pH為10.0-12.0，反應5-9h，再用HCl調節pH為4.0-4.2，析出沉澱，靜置8-16小時；取沉澱，甩幹，用pH為4.0-4.2的鹽酸溶液洗滌1-3次，得到改性後的驢皮膠原產品，即可。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的步驟(2)中加入的氫氧化鈉溶液pH為7. 5-9. 0。
3.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的步驟(3)中加入的鹽酸溶液pH為4. 5-6. 0。
4.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的步驟(5)中，用0. 4-0. 6M的醋酸溶液溶解酸溶性驢皮膠原沉澱。
全文摘要
本發明公開了一種驢皮膠原的製備方法，以鮮驢皮為原料，通過脫毛、脫脂，碎皮、鹼液浸泡，低溫酶解，提取、純化，改性等步驟，得到改性後的驢皮膠原產品。通過該方法得到的驢皮膠原產品，不僅保留了三股螺旋結構而具有生物活性，與人肌體、皮膚同源性及相容性，並且具有生物可降解性和低抗原性等特點，能被水以任性比例稀釋，可用於製備外科植入物和組織工程醫療產品，開發醫藥、醫學試劑、及保健品等。
文檔編號C08H1/06GK101851339SQ20101017632
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月19日 優先權日2010年5月19日
發明者廖知恆, 李國英, 楊信誠, 陳麗, 雷小林 申請人:成都新際生物活性膠原開發有限公司