用於植入前因子的新型檢測方法以及植入前因子肽的製作方法

2023-05-05 17:06:51

專利名稱：用於植入前因子的新型檢測方法以及植入前因子肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及植入前因子(preimplantation factor,以下簡稱為PIF),它是受孕和胚胎可存活性(embryo viability)的早期標誌物。本發明還涉及檢測PIF活性的新方法，以及PIF肽。
2.
背景技術：
不育是困擾世界上數百萬對夫婦的重要健康問題。人類孕體的早期死亡是一個常見現象，而這也是造成不育的一方面因素。在自然的單個胎兒(single conceptions)中，約有73%都在妊娠的第6周之前死亡(Boklage CE.，從受孕至足月生產之間人類胎兒的存活概率.國際生育學雜誌(Int J Fertil) 1990; 35:75)。這主要是由於在植入之前或植入後的很短時間內所發生的早期胚胎死亡。大齡婦女的生育率較低，而由年輕婦女捐獻卵母細胞後生育率提高，與上述現象相關的數據表明對於獲得成功的妊娠而言，卵母細胞的質量很重要(Navot D, Bergh PA, Williams MA等,較差的卵母細胞質量而不是植入失敗引起了與年齡相關的雌性生育力的下降，柳葉刀(Lancet) 1991; 337:1375)。體外受精(in vitro fertilization,以下簡稱為「IVF」)技術已經被發展起來，用於解決不育的問題。但是，在體外培養用於植入的胚胎時的人工條件下，維持胚胎的可存活性甚至更困難一些。在體外，胚胎的生長速度要比在體內時慢，通常只有25 — 65%的胚胎能夠發育到囊胚階段(在Gomel V, Leung PCK,編的「體外受精和輔助生殖」(Invitro fertilization and assisted reproduction)第 10屆世界大會(Procc 10th WorldCongress)，1997:1 中的 Gardner DK, Lane M, KOuridakis K, Schoolvcraft WB.,基於生理學複合體的無血清培養基增強哺乳動物胚胎發育(Complex physiologically basedserum-free culture media increase mammalian embryo development))現有技術尚不倉泛鑑別出那些可能植入和存活的胚胎。人絨毛膜促性腺激素(hCG)是目前正在使用的用於體內受精和早期胚胎植入的標誌物，但是，它只有在植入後的幾天才能被檢測到。由於缺乏胚胎可存活性的適當標誌物，因此，目前很多不能植入的胚胎都被轉移了，從而降低了獲得成功妊娠的機會。為了解決胚胎可能無法存活的問題，更多數量的胚胎被同時轉移到了未來母親的體內。大量胚胎的轉移可能導致多次懷孕(multiple pregnancies),這是固有的危險,但如果只轉移少量胚胎，又可能有沒有一個胚胎能植入的風險，從而失去一整個IVF周期。很明顯，需要改進對胚胎的選擇，並定義準確的標誌物以確定胚胎的可存活性。此外，使用非侵入性方法，通過在培養基中檢測對可存活的、能植入的胚胎特異的產物，將使得人們可以選擇出那些最有可能產生成功妊娠的胚胎，而不會對胚胎產生傷害。決定妊娠成功與否的另一個因素是孕體與母體免疫系統之間的相互作用。在受精後的很短時間內，應該發生妊娠的系統母體識別(a systemic maternal recognition ofpregnancy)。由特異性早期胚胎信號所激發的母體免疫系統調節，可能是該過程中的關鍵。一旦卵母細胞被受精，合子直到孵化中的囊胚(hatching blastocyst)都被透明帶(thezone pellucida)所包圍，透明帶是堅硬的半透明的膜。因此，當胚胎還在輸卵管和子宮腔內發育時，胚胎一母體之間的交流(communication)就已經通過胚胎所分泌的化合物而同時發生了。

已經表明，以孕婦的血清和可存活胚胎為條件的培養基，可以提高血小板和T淋巴細胞在⑶2抗體存在下形成玫瑰花結的量。正如在1997年7月8日授權的Barnea等人的美國專利5，646，003以及1999年11月9日授權的Barnea等人的美國專利5,981, 198中已經公開的那樣，植入前因子(PIF)的存在可以通過將淋巴細胞、血小板、來自懷孕受試者的熱失活的血清、豚鼠補體以及Tll (抗⑶2)單克隆抗體(Dakko，丹麥)混合在一起而檢測出來，其中，懷孕受試者的PIF提高了血小板和淋巴細胞之間形成的玫瑰花結的量。已經發現，PIF(i)由二細胞期前的可存活的早期人和小鼠胚胎所分泌；在IVF之後，在胚胎轉移後的3 — 4天，可以在外周循環中檢測到；(iii)與73%的帶回家的嬰兒有關，而在早期PIF陰性結果中則為3% ；(iv)在子宮內受孕後5 — 6天可以檢測出來；(V)在未懷孕的血清或不可存活的胚胎中不存在；以及(vi)除了人之外，還存在於多種懷孕的哺乳動物中，包括小鼠、馬、奶牛和豬。此外，如果發生自然流產，在hCG分泌減少前的兩周，就已經觀察到了 PIF從循環系統中的消失。在上述PIF檢測中所使用的單克隆抗體，其靶標是被稱為CD2的淋巴細胞相關抗原。⑶2存在於約80 — 90%的人外周血淋巴細胞上，以及超過95%的胸腺細胞、所有形成紅細胞玫瑰花結的T淋巴細胞以及NK細胞的一個亞型上。⑶2在T細胞活化中的各種作用已經被提出，包括作為粘附分子以減小T細胞活化所需抗原的量，以及作為T細胞活化的共同刺激分子(costimulatory molecule)分子或直接促進劑。而且，已經暗示，0)2在誘導免疫無能、細胞因子生產的調節以及T細胞正選擇的調控中起作用。⑶2的天然配基是結構相關的IgSF CAMs⑶58 (LFA-3)，一種組織分布較廣的細胞表面粘附配基。此外，⑶2可以與⑶48、⑶59以及⑶15 (Lewis x)相關的糖結構發生相互作用。CD2以很低的親和力與CD58結合，而解離常數卻非常大。CD2及其配基CD58的側向再分布也影響了細胞粘附的強度。CD2粘附性的調控影響了 CD2增強抗原敏感度的能力。不能進行親和力調控的CD2細胞系在抗原特異性應答上表現出了明顯的不足。CD2親和力提高所產生的粘附力，直接為T細胞敏感度做出了貢獻，而後者與CD2介導的信號轉導無關。
3.

發明內容
本發明涉及用於檢測PIF存在與否的分析方法，以及通過此方法鑑定出來的PIF肽。具體地說，本發明涉及用於檢測PIF的流式細胞術檢測方法。它至少部分地基於如下觀察結果利用了螢光標記的抗淋巴細胞和抗血小板的抗體的流式細胞術表明，在PIF存在下，玫瑰花結的形成增加。它還基於如下觀察結果流式細胞術表明，在PIF存在下，與CD2結合的單克隆抗體減少了。本發明還涉及PIF肽，當PIF肽被加入到Jurkat細胞培養物中時，能夠觀察到它可以或者Q)減少抗CD2抗體與Jurkat細胞的結合；(ii)增加Jurkat細胞中CD2的表達；或者(iii)降低Jurkat細胞的可存活性。在另外的實施方案中，本發明提供了 ELISA檢測方法，可以通過確定待測樣品對抗CD2抗體與CD2底物相結合的效果而檢測PIF。
4.


圖1A-B.由小鼠胚胎培養物條件培養基(MECCM)的PIF純化；(A)示出了MECCM-3kDA超濾液的高效液相色譜(HPLC)的譜圖，所述超濾液先前已通過MabCD2親和層
析進行了純化；(B)示出了在對(A)中得到的PIF活性級分進行進一步HPLC純化後的譜圖。圖2A-C.從MECCM純化得到的不同PIF肽的Western印跡分析；Mab⑶2被用作一抗，反意(anti-sense)小鼠馬辣根過氧化物酶(HRP) —生物素鏈黴親和素複合體被用作二抗。通過ECL檢測試劑(Amersham Pharmacia Biotech)鑑定特異性PIF帶。圖3A-B. (A)示出了在新鮮的培養基(CM)、小鼠胚胎培養物條件培養基(MECCM)和Mab⑶2的存在下，淋巴細胞一血小板玫瑰花結形成(L-P)的流式細胞儀測定。L(Mab⑶45-PE)和P (Mab⑶42a_FITC)的螢光標記的特異抗體被用於檢測L-P複合物。與培養基(CM)相比，MECCM 的 L-P 形成要高 30 — 40%。(B)示出了 MECCM 對 MabCD2 與 Jurkat細胞(JC)相結合的作用的FC。JC與樣品一起進行溫育，並進一步與Mab⑶2Cy5 —起進行溫育。與⑶2結合的抗體被存在於MECCM中的PIF所降低。箭頭指出了 PIF活性。圖4A-C.從MECCM純化得到的PIF肽的質譜譜圖。通過超濾、滲濾、HPLC, Mab⑶2親和層析以及進一步的HPLC而從MECCM純化得到的PIF活性級分的分子量(MW)通過質譜測定。PIF 肽的 MW 為 A) 610 — 995Da ；B) 963 — 1848Da ；以及 C) 1807 — 1846Da。圖5A-F. PIF對在Jurkat細胞中的MabCD2結合(A)、螢光(B)和可存活性(C)的陰性作用以及PIF對MabCD2結合⑶、突光(E)和可存活性(F)的陽性作用的流式細胞術分析。在陽性樣品中，PIF與⑶2競爭(箭頭指出了 PIF活性)。圖6.合成的PIF肽對Jurkat細胞CD2表達的影響。
5.
具體實施例方式在第一組實施方案中，本發明提供了一種用於確定樣品中是否存在植入前因子的方法，該方法包括檢測樣品中是否含有抑制抗CD2抗體與CD2抗原相結合的成分的步驟；其中，抑制抗CD2抗體與CD2相結合的能力與植入前因子的存在之間具有正相關性。例如，此類方法可以用於流式細胞術或者酶聯免疫吸附測定方法之中，使用本領域公知的其他技術。在下面的第7部分中，介紹了用於檢測抗CD2抗體與CD2相結合的流式細胞術方法的一個非限制性實例。此處所使用的術語抗CD2抗體，可以是與CD2特異性結合的單克隆或多克隆抗體。Pharmigen就出售一種此類的單克隆抗體(見下文)。⑶2抗原可以是純化⑶2抗原的形式，也可以由細胞所攜帶。在本發明的一個非限制性實施方案中，所述細胞為Jurkat細胞。表達CD2的其他細胞系在本領域中是公知的。
樣品可以是血清樣品(例如，來自有待檢測受精/植入/胚胎存留的受試者的血清)，可以是培養液樣品(例如，為在IVF轉移前確定胚胎的可存活性)，也可以是有待檢測PIF肽是否存在的溶液(例如，在PIF作用劑的純化中；參見下面的第6部分)。受試者可以是人類受試者(例如疑為已受孕的人)或非人類受試者(例如農業動物或動物園的動物)。在第二組實施方案中，本發明提供了一種用於確定樣品中是否存在植入前因子的方法，包括通過流式細胞術檢測樣品中是否含有能增加淋巴細胞、血小板和抗⑶2抗體之間形成的玫瑰花結的成分的步驟，其中，玫瑰花結形成量的增加與植入前因子的存在之間具有正相關性。例如，此類檢測可以通過使用螢光標記的以淋巴細胞和血小板為靶標的抗體而進行，其中，最好對抗血小板和抗淋巴細胞的抗體使用不同的標記。所述的增加是相對於已知的陰性對照而言的。本發明也提供了下列分離的肽(I)-種分離的肽，具有選自由如下成員所構成的組的序列=Met-Val-Arg-Ile-Lys-Pro-Gly-Ser-Ala;Met-Val-Arg-IIe-Lys-Pro-Gly-Ser-Ala-Asn-Lys-Phe-Ser;Met-Val-Arg-Ile-Lys-Pro-Gly-Ser-Ala-Asn-Lys-Phe-Ser-Asp;以及 Met-Val-Arg-Ile-Lys-Pro-Gly-Ser-Ala-Asn-Lys-Phe-Ser-Asp-Asp,或者一種包含所述肽的分離的肽,能夠與抗⑶2抗體相結合併且不是環子孢子蛋白(circumsporooite protein)；(2) 一種具有序列 Ser-Gly-Ile-Val-Ile-Tyr-Gln-Tyr-Met-Asp-Asp-Arg-Tyr-Val-Gly-Ser-Asp-Leu的分離的肽，或者一種包含所述肽的分離的肽，能夠與抗⑶2抗體相結合併且不是HIV蛋白；(3) 一種具有序列 Val-Ile-Ile-Ile-Ala-Gln-Tyr-Met-Asp 的分離的妝，或者一種包含所述肽的分離的肽，能夠與抗CD2抗體相結合；以及(4) 一種分離的肽，具有選自由如下成員所構成的組的序列Ser-Gln-Ala-Val-GIn-Glu-His-Ala-Ser-Thr 以及 Ser-Gln-Ala-Val-Gln-Glu-His-Ala-Ser-Thr-Asn-Xaa-Gly，其中Xaa可以是任何胺基酸，或者一種包含所述肽的分離的肽，能夠與抗CD2抗體相結合併且不是人類類維生素A (retinoid)和甲狀腺激素的沉默介質(silencing mediator)。(5) 一種具有序列 Ser-Gln-Ala-Val-Gln-Glu-His-Ala-Ser-Thr-Asn-Met-Gly 的分離的肽。6.實施例PIF肽的鑑定通過超濾、凍幹、高效液相色譜(HPLC)、親和層析和western印跡,將PIF從大體積的MECCM中分離出來。二細胞(two-cell-to)囊胚期的小鼠胚胎在含有下列成分的Ham’sF-IO培養基中培養數天青黴素、鏈黴素、MgS04、NaHC03、KHC03和乳酸鈣，此外還添加O. 1%的BSA。使用前，MECCM 一直儲存在一 80°C。將一升MECCM利用Amicon 膜(3kDa截止；YM_3kDa, Amicon. Millipore Co.,美國)通過超濾進行純化。利用300ml純水對濃縮的MECCM進行進一步的滲濾。此外，也以同樣的方式對新鮮的培養基(CM，不含胚胎)進行處理。只有MECCM-3kDa超濾液和滲濾液表現出了 PIF活性，然後它們被收集起來並通過凍幹法濃縮。已經觀察到，PIF能夠結合抗⑶2單克隆抗體(Mab⑶2)。因此，首先通過親和層析將PIF活性部分進行純化，其中使用了瓊脂糖-醯肼-MabCD2活化膠。按下述方法製備抗體親和基質。通過Econo-Pac IODG脫鹽柱，將I. 5mg Mab⑶2 (cloneRPA-2. 10, Pharmigen, Becton Dickinson)與pH 5· 5的偶聯緩衝液進行緩衝液交換,並進一步用高碘酸鈉氧化，並偶聯至2ml的瓊脂糖-醯肼活化膠上，可以按照製造商提供的說明進行(Affi-gel Hidrazide免疫親和試劑盒，BioRad實驗室，加州，美國)。然後，利用MabCD2親和層析柱(10x20mm)對Mab⑶2 — 3kDa超濾液一滲濾液凍乾粉進行進一步純化。將2gMECCM - 3kDa粉末溶於IOml純水中，將pH調至中性，通過O. 22m注射器無菌濾器(CorningInc. , NY,美國)進行過濾，並在重力流動的情況下通過親和層析柱5次。所述柱子用5柱床體積的PH 7. 2的IOOmM磷酸鹽緩衝液衝洗，然後用5柱床體積的O. 5MNaCl衝洗。

結合上的PIF用3ml O. IM的乙酸洗脫下來。將洗下PIF的級分收集起來，進行PIF活性檢測，並通過凍幹法濃縮。總量為300mg的經親和層析進一步純化的MECCM_3kDa超濾液被分為三批，在Clipeus C18 製備性柱(Higgins Analytical, Inc.,美國)上進行 HPLC。製備性 HPLC 的運行參數為:流速，15ml/min。緩衝液:A = O. I %三氟乙酸(TFA);B = O. I % TFA，溶於99. 9%乙腈中(CH3CN)15梯度0% B，5分鐘，加上O — 60% B 30分鐘，以及O — 100% B 3分鐘。通過蒸發進一步濃縮HPLC的級分。將HPLC濃縮的級分的pH值調至中性，並再次檢測PIF活性。幾個級分表現出較高的PIF活性(參見圖1A)。這些級分通過附加的HPLC，在Vydac C8分析柱(4.6x250mm;Hesperia,加州，美國)上加以純化。附加HPLC的運行參數為流速，lml/min。緩衝液A = O. I %三氟乙酸(TFA);B = O. 1% TFA，溶於99. 9%乙腈中(CH3CNX梯度0% B，5分鐘，加上O — 60% B 30分鐘，以及O — 100% B 3分鐘。幾個洗脫級分表現出PIF活性(參見圖1B)，並被進一步測序以確定其胺基酸組成，通過質譜確定它們的分子量(MW)。 由MECCM純化得到的PIF活性級分在Western印跡(「WB」)中給出了正信號。在WB中，使用CM超濾凍幹部分的溶液作為陰性對照。WB的條件如下。對於膠，使用了 SDS-PAGE預裝膠(pre-casting gels) (BioRad),具有16. 5%瓊脂糖分離膠和4%瓊脂糖濃縮膠。跑膠的溶液中含有 IOOmM Tris, IOOmM Tricine, O. 1%SDS, pH 8.3 (Tris-Tricine 跑膠緩衝液)。由30微升PIF-MECCM純化級分和10微升Tricine上樣緩衝液[200mMTris (三羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl) pH 6. 8，2 %十二烷基磺酸鈉(SDS)，40%甘油，O. 04%考馬斯亮藍(CBB-G250) ] (BioRad)組成的樣品，在95°C下溫育5分鐘。冷卻後，將樣品加入到SDS聚丙烯醯胺凝膠(PAGE)的上樣孔中。為了確定低分子量(MW)多肽的分子量，將10微升用水按1:20稀釋的SDS-PAGE標準物(BioRad)加入到每塊膠的一個孔中。電泳時，樣品和標準物在175v下跑5分鐘，然後在60v下跑I小時。然後，將獲得的膠進行電印跡(electro-blot),使用IOOmM pH為11的CAPS [3-(環己氨基)-1-丙磺酸]緩衝液作為轉移緩衝液。電印跡在80mA下進行I小時，轉移到0. 22 μ m硝酸纖維素膜(BioRad)上。然後，利用5 %的封閉溶液(Amersham, Pharmacia, Biotech, NJ,美國)在室溫下封閉硝酸纖維素膜18小時，然後利用PBS-T[磷酸鹽緩衝液一 0. 05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯(Tween 20)]衝洗4次，持續20分鐘。進行一抗溫育時，已封閉的膜於室溫下在2 μ g/ml的Mab⑶2 (Pharmigen) — PBS 一 T溶液中溫育2小時,然後按上述方法衝洗。進行二抗溫育時，膜於室溫下在馬抗小鼠IgG —辣根過氧化物酶偶聯物(I : 1000，溶於PBS -T)溶液中溫育I小時。然後，通過ECL-化學螢光系統(Amersham)使PIF帶可見。圖2示出了從MECCM純化得到的PIF肽的典型WB。用於測定PIF的流式細胞術(FC)被發展起來，提高了美國專利5，646，003和5，981，198中所介紹的方法的效率和重現性。尤其是，採用懷孕和未懷孕的人和豬血清，MECCM，CM以及分離的PIF級分，通過FC對玫瑰花結的形成進行了評估，利用了 Mab⑶2或MabCD2-Cy5 (Cy-鉻偶聯的抗體)，MabCD45_PE (藻紅蛋白偶聯的抗體)以及MabCD41a_FITC(異硫氰酸螢光素偶聯的抗體)，所有的抗體都來自Pharmigen。MECCM與CM相比，其標記的P-L複合體比例要高30 - 40% (圖3A)。而且，已經發現，在檢測分析中MECCM或懷孕的血清與固定化Mab⑶2的預溫育，阻止了 P-L的形成。在檢測分析中，向L-P中加入Mab⑶58(淋巴細胞功能相關的抗原-3或LFA-3)抗體並不能通過PIF活性樣品的作用而完全阻止玫瑰花結的形成。發展了一種利用Jurkat細胞(JC)和MabCD2_Cy5的FC-PIF定量檢測法(圖3B)。使用無限增殖的淋巴細胞系後，就不再需要新鮮的供體血液以通過生物測定法評估PIF活
性。已經確認JC-FC檢測對於人血清樣品(參加表I)而言是有效的，並且在PIF純化期間被用於評估級分的PIF活性。純化的PIF活性級分的MW通過質譜分析測定,利用產自Perspective Biosystems(Cambridge, MA,美國)的 Voyager-RP Biospectrometry MALDI-TOF 工作站。將樣品與基質相混合，其中，所述基質存在於乙腈水為I '2的混合物中，並含有1%的三氟乙酸。譜圖為約200次掃描的平均值。來自MECCM的PIF肽的MW在610 — 1845Da之間(圖4)。此外，已經評估出了 PIF-活性級分與Mab⑶2的預溫育消除了該PIF-活性。這些數據表明，PIF可能是⑶2或同源肽的一部分。然而，在對純化的PIF肽進行測序之後，證明了這些肽並不是CD2的一部分，而且，它們的胺基酸序列是獨特的。通過JC-FC檢測證明，MEECM-PIF肽對T細胞所表達的⑶2有三種不同的作用。這些作用涉及減小Mab⑶2與JC的結合；通過JC對⑶2表達進行向上調節(up-regulating);或降低JC的可存活性。從小鼠胚胎中得到的純化PIF活性級分通過Edman降解進行測序，採用AppliedBiosystems脈衝液體測序儀(Pulsed Liquid Sequencer)(型號477A)。用異硫氰酸苯酯對釋放出來的胺基酸進行衍生處理，以便得到PTH-胺基酸，PTH-胺基酸可以通過在與測序儀配合的HPLC系統上進行的反向HPLC檢測出來。幾種PIF級分得到了獨一無二的序列。幾種肽給出的序列，其N端的九個或十個殘基是完全相同的，這表明這些肽是由相同的分子(參見表II)截短後得到的不同形式。PIF肽被確定為至少三個獨特的家族，為來源於胚胎的或妊娠相關的小肽。包括三種PIF肽的一個家族的胺基酸序列與環子孢子蛋白(Circumsporozoite protein) (_原蟲惡性痕原蟲(Plasmodium falciparum))的一個區域100%匹配。PIF肽的這一家族通過JC向上調節⑶2的表達。一種與上述PIF肽家族只有前五個胺基酸殘基相同的PIF肽(14個胺基酸)，以及另一種與HIV-I RNA指導的DNA聚合酶(逆轉錄酶，EC 2. 7. 7. 49 )序列有11個胺基酸匹配的PIF肽(18個胺基酸)，也可以通過JC向上調節⑶2的表達。此外，另一個包括兩個PIF肽(9個和13個胺基酸)的家族與人受體作用因子(receptor-interacting factor)的序列有10個胺基酸匹配,後者為類維生素A和甲狀腺激素的沉默介質(a silencing mediator for retinoid and thyroid hormonereceptor, SMRT)(Chen and Evans, 1995)。該 PIF 肽家族的更短的成員表現出了對 MabO)2與JC結合的競爭作用，而且更長的PIF肽降低了 JC的可存活性。值得注意的是，由核受體介導的轉錄沉默在發育、分化和腫瘤形成中很重要。PIF肽通過固相肽合成(SPPS)法進行合成,使用Applied Biosystems肽合成儀，採用Fmoc (9-芴甲氧羰基)化學法，其中每個胺基酸的氨基氮都被Fmoc所封閉。偶聯時，利用 3mol/ml 的 2-(1H-苯並三唑-I-基)-1，I, 3, 3-tetrametyIuronium 四氟硼酸酯/I-輕基苯並三唑，在二異丙基乙胺存在下，將N端已被保護起來的胺基酸的羧基活化。然後，將活化的胺基酸順序地加入到新生的肽上。在合成完成後，通過反向HPLC進行最後的純化，並通過MALDI-T0F質譜和胺基酸分析對其加以確認。PIF合成肽在J urkat細胞的⑶2現象中表現出相似的作用(圖6)，也可以被Mab⑶2免疫檢測到。 7.用於PIF的流式細胞術7. I 材料材料包括Jurkat白血病細胞(JC);克隆培養基；用於流式細胞儀測量的Falcon管；Mab CD2_Cy5 (Cy-絡偶聯的抗體，clone RPA-2. 10, Pharmigen, Becton Dickinson)；生物樣品(可以是有待檢測PIF活性的人血清，也可以是假定的或合成的PIF肽的溶液)；PBS - 2%BSA (IOOmM磷酸鹽緩衝液一 2%牛血清清蛋白；陰性對照)；臺盼藍染液；C02細胞培養箱；流式細胞儀。7. 2 方法製備JC懸液■利用臺盼藍排阻染色法檢測JC培養物的可存活性。細胞的可存活性應該在80 — 90% 之間。■用 IOml PBS — 2%BSA 衝洗 JC 兩次。■在克隆培養基或PBS - 2%BSA中製備JC懸液，含有5，000, 000細胞/毫升。■將50ml JC懸液分散到falcon管中(250，000細胞/管)。樣品溫育■加入200 μ I樣品，來自早期妊娠對照的血清(3個陽性對照)或PBS — 2%BSA(陰性對照)。輕輕混合。■室溫下溫育20 — 30分鐘。■加入 200 μ I 在 PBS_2%BSA 中以 1: 200 稀釋的 MabCD2_Cy5。輕輕混合。■室溫下溫育20 - 30分鐘。流式細胞儀測定■測定每個管子的螢光(488nm雷射激發波長)。■將活的和全部細胞與全部死細胞的螢光(參見圖5)與對照進行比較。■按下述方法計算PIF活性全部細胞的螢光/%死細胞X活細胞的螢光結果的解釋PIF陰性的活性應該在130 - 340之間；PIF陽性樣品在陰性參考範圍之外。本文中引用了多篇參考文獻，在此以引用的方式將其全部內容包括在本文中。
表I 37名患者血清中流式細胞術PIF檢測的臨床有效性的確認
權利要求
1.一種具有序列 Ser-Gln-Ala-Val-Gln-Glu-His-Ala-Ser-Thr 的分離的妝。
2.一種具有序列 Ser-Gln-Ala-Val-Gln-Glu-His-Ala-Ser-Thr-Asn-Met-Gly 的分離 的肽。
3.一種具有序列 Ser-Gly-Ile-Val-Ile-Tyr-Gln-Tyr-Met-Asp-Asp-Arg-Tyr-Val-Gl 廣Ser-Asp-Leu的分離的肽。
全文摘要
本發明涉及用於檢測PIF存在與否的分析方法，以及通過此方法鑑定出來的PIF肽。具體地說，本發明涉及用於檢測PIF的流式細胞術檢測方法。它至少部分地基於如下觀察結果利用了螢光標記的抗淋巴細胞和抗血小板的抗體的流式細胞術表明，在PIF存在下，玫瑰花結的形成增加。它還基於如下觀察結果流式細胞術表明，在PIF存在下，與CD2結合的單克隆抗體減少了。本發明還涉及PIF肽，當PIF肽被加入到Jurkat細胞培養物中時，能夠觀察到它可以或者(i)減少抗CD2抗體與Jurkat細胞的結合；或者(ii)增加Jurkat細胞中CD2的表達；或者(iii)減小Jurkat細胞的可存活性。在另外的實施方案中，本發明提供了ELISA檢測方法，可以通過確定待測樣品對抗CD2抗體與CD2底物相結合的效果而檢測PIF。
文檔編號C07K14/47GK102875646SQ20121030713
公開日2013年1月16日 申請日期2002年6月28日 優先權日2001年7月2日
發明者艾坦·巴尼, 魯賓·雷內·岡薩雷斯·佩雷斯, 保羅·C·利維斯 申請人:倍奧英賽普特有限責任公司