瓊脂糖酶及其基因的製作方法

2023-05-24 18:50:56 1

專利名稱：瓊脂糖酶及其基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及在高溫下具有瓊脂糖酶活性的新型瓊脂糖酶及其生產方法和應用。本發明也涉及在高溫下具有瓊脂糖酶活性的多肽和編碼所述多肽的基因。此外，本發明涉及利用所述基因通過基因工程生產在高溫下具有瓊脂糖酶活性的多肽的方法。
具體地說，本發明涉及可用於從瓊脂糖生產具有各種生理活性的低聚合度瓊脂寡糖、在高溫下具有瓊脂糖酶活性的α-瓊脂糖酶、以及所述酶的生產方法和應用。本發明也涉及在高溫下具有可用於在瓊脂糖凝膠電泳之後從瓊脂糖凝膠提取核酸等的活性的β-瓊脂糖酶及其生產方法、所述酶的應用以及用所述酶從瓊脂糖凝膠提取核酸等的方法。
背景技術：
瓊脂糖是瓊脂的主要組分。瓊脂糖是一種其結構為D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖通過α-1，3鍵和β-1，4鍵交替連接在一起的多糖。為了從瓊脂生產寡糖，人們必須將瓊脂糖降解為更小的分子。為此，傳統上已知化學降解瓊脂糖的方法和酶促消化瓊脂糖的方法。在化學降解法中，可以用酸水解瓊脂糖。在這種情況下，主要切割α-1，3鍵。已知有兩種類型的酶消化瓊脂糖，即切割瓊脂糖中β-1，4鍵的β-瓊脂糖酶和切割瓊脂糖中α-1，3鍵的α-瓊脂糖酶。
通過在β-1，4鍵切割瓊脂糖獲得的寡糖稱為新瓊脂寡糖。新瓊脂寡糖在其還原末端具有D-半乳糖，其聚合度以平均數表示。另一方面，通過在α-1，3鍵切割瓊脂糖獲得的寡糖稱為瓊脂寡糖。瓊脂寡糖在其還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖，其聚合度以平均數表示。最近，已表明在其還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖的瓊脂寡糖具有諸如以下的生理活性細胞凋亡誘導活性、制癌活性、各種抗氧化活性、免疫調節活性、抗變態反應活性、抗炎活性和抑制α-糖苷酶的活性(WO99/24447，日本專利申請11-11646號)。基於生理活性，可以提供含有所述瓊脂寡糖作為其有效成分的藥用組合物和功能食品或飲料。
在化學降解瓊脂糖的方法中控制所生產的寡糖的大小是困難的。具體地說，選擇性生產具有低聚合度的較小的寡糖相當困難(例如T.Tokunaga等，Bioscience Industry，49734(1991))。如果使用β-瓊脂糖酶，由於這種酶僅切割β-1，4鍵，所以僅可以獲得不具有上述生理活性的新瓊脂寡糖。
預期使用具有切割α-1，3鍵的活性的α-瓊脂糖酶，生產具有生理活性的瓊脂寡糖。已知的α-瓊脂糖酶包括由海洋革蘭氏陰性菌菌株GJ1B產生的酶(Carbohydrate Research，66207-212(1978)；在EuropeanJournal of Biochemistry，214599-607(1993)中提出該菌株為解瓊脂交替單胞菌(Alteromonas agarlyticus)GJ1B)，以及由弧菌屬(Vibrio)細菌生產的酶(JP-A 7-322878；菌株JT0107-L4)。然而，利用解瓊脂交替單胞菌GJ1B來源的α-瓊脂糖酶，不可能生產具有重要的生理活性瓊脂二糖，因為這種酶不能消化己糖或更短的寡糖。此外，所述弧菌屬細菌來源的α-瓊脂糖酶不能用來用瓊脂糖作為原料生產瓊脂寡糖，因為該酶僅對己糖和更短的寡糖表現出其活性，而對瓊脂糖根本不起作用。
本發明人進行深入的研究，以便獲得切割瓊脂糖中α-1，3鍵並且產生具有重要生理活性的瓊脂寡糖的酶，發現了產生具有適合於此目的的特性的酶的兩種微生物。分離由這些微生物產生的酶，並且指明其理化特性以及酶特性。此外，本發明人還分離出所述兩種酶的基因，發現了用所述基因(WO 00/50578)通過基因工程便捷地生產具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的方法。如果人們想通過用所述兩種α-瓊脂糖酶之一處理溶解的瓊脂糖而獲得瓊脂寡糖，則反應溫度需要低於約40℃，因為所述酶的最適反應溫度約為40℃。在這種情況下，如果瓊脂糖濃度高，則瓊脂糖可能固化，可能妨礙所述酶促反應。因此，如果使用這樣一種酶，則需要用低濃度的瓊脂糖進行所述處理。因而不能處理高濃度的瓊脂糖，瓊脂寡糖的生產率低。因此，需要在即使瓊脂糖以高濃度溶解時瓊脂糖也不會固化的高溫下具有活性的熱穩定α-瓊脂糖酶。
另一方面，在基因工程領域廣泛進行在瓊脂糖凝膠電泳之後從瓊脂糖中提取已經過限制性酶處理或者擴增反應的核酸等。對於所述程序，常規上使用最適溫度約37℃的β-瓊脂糖酶。又是在這種情況下，根據所述酶的最適溫度，需要降低反應溫度，並且必須通過將含有待處理核酸等的瓊脂糖凝膠溶於大體積的水中降低瓊脂糖濃度，以防止瓊脂糖固化。這樣，待回收的核酸等的濃度也不可避免地被降低。濃度的降低產生問題，因為這導致回收率降低、瓊脂糖消化效率降低和程序延長。為了解決這些問題，可以在高於常規溫度的溫度下進行反應所用的瓊脂糖酶是必不可少的。美國專利第5,869,310號中描述的黃桿菌(Flavobacterium sp.)菌株NR19來源的β-瓊脂糖酶可以被認為是這樣一種瓊脂糖酶，雖然其最適溫度並不是如此高，並且熱穩定性不足。因此，需要在高濃度的瓊脂糖不會固化的高溫下具有活性的熱穩定β-瓊脂糖酶。
如上所述，現有技術在瓊脂寡糖生產和從瓊脂糖凝膠提取諸如核酸的物質方面存在問題。
發明目的本發明的主要目的是提供具有瓊脂糖酶活性、可以用於有效生產瓊脂寡糖、從瓊脂糖凝膠有效提取諸如核酸的物質等的多肽；所述多肽的胺基酸序列；編碼所述多肽的基因；生產所述多肽的方法；生產瓊脂寡糖的方法以及從瓊脂糖凝膠提取諸如核酸的物質的方法。
發明概述鑑於上述問題，本發明人已經進行了深入的研究和探索，以便獲得在高溫下切割瓊脂糖中α-1，3鍵並且可用於生產具有重要生理活性的瓊脂寡糖的酶、以及在高溫下切割瓊脂糖中β-1，4鍵並且可用於從瓊脂糖凝膠有效提取核酸等的酶。結果，本發明人成功地發現了產生具有適合於所述相應目的的特性的兩種酶的微生物。從所述微生物中分離出所述酶，並且指出其理化特性和酶特性。
此外，本發明人成功地分離出編碼所述酶的基因，並且發現了用所述基因通過基因工程便捷地生產本發明的具有α-瓊脂糖酶活性的多肽和具有β-瓊脂糖酶活性的多肽的方法。因而完成了本發明。
本發明概述如下。本發明的第一方面涉及新型瓊脂糖酶，所述瓊脂糖酶含有選自以下的胺基酸序列或者在所述胺基酸序列中一個或多個胺基酸被取代、缺失、添加和/或插入的胺基酸序列(1)由SEQ ID NO22的胺基酸序列中第21號胺基酸至第437號胺基酸的417個殘基組成的胺基酸序列；或者(2)由SEQ ID NO23的胺基酸序列中第318號胺基酸至第1089號胺基酸的772個殘基組成的胺基酸序列。
所述瓊脂糖酶的示例為具有水解D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵的活性的酶、或者具有水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的活性的酶。
本發明的第二方面涉及編碼具有瓊脂糖酶活性的多肽的基因。所述基因編碼第一方面的瓊脂糖酶。所述基因的示例為含有由SEQ IDNO20的核苷酸序列中第61號核苷酸至第1311號核苷酸的1251個核苷酸組成的核苷酸序列或者在所述由1251個核苷酸組成的核苷酸序列中一個或多個核苷酸被取代、缺失、添加和/或插入的核苷酸序列的基因、或者含有由SEQ ID NO21的核苷酸序列中第952號核苷酸至第3267號核苷酸的2316個核苷酸組成的核苷酸序列或者在所述由2316個核苷酸組成的核苷酸序列中一個或多個核苷酸被取代、缺失、添加和/或插入的核苷酸序列的基因。
本發明的第三方面涉及在嚴謹條件下可與第二方面的基因雜交並且編碼第一方面的具有瓊脂糖酶活性的多肽的基因。
本發明的第四方面涉及含有第二或第三方面的基因的重組DNA分子。
本發明的第五方面涉及帶有第四方面的重組DNA分子的轉化子。
本發明的第六方面涉及具有瓊脂糖酶活性的多肽的生產方法，所述方法包括培養能夠產生瓊脂糖酶的微生物(例如屬於微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)所屬屬的微生物)，並且從培養物中收集第一方面的瓊脂糖酶。
本發明的第七方面涉及具有瓊脂糖酶活性的多肽的生產方法，所述方法包括培養第五方面的轉化子，並且從培養物中收集第一方面的瓊脂糖酶。
本發明的第八方面涉及瓊脂寡糖的生產方法，所述方法包括用第一方面的瓊脂糖酶消化瓊脂糖，並且從消化物中收集瓊脂寡糖。
本發明的第九方面涉及從瓊脂糖凝膠中提取物質的方法，所述方法包括用第一方面的瓊脂糖酶消化瓊脂糖凝膠。
本發明的第十方面涉及用於第九方面的從瓊脂糖凝膠提取物質的方法的試劑盒，所述試劑盒含有第一方面的瓊脂糖酶。
本發明的第十一方面涉及改進第一方面的瓊脂糖酶熱穩定性的方法，所述方法包括從N末端缺失構成所述瓊脂糖酶的至多30％的多肽。
發明詳述此中所用的寡糖是指由2個或2個以上、10個或10個以下的單體組成的糖。瓊脂寡糖是指其結構為D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖通過α-1，3鍵和β-1，4鍵交替連接在一起並且在其還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖的寡糖。新瓊脂寡糖是指其結構為D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖通過α-1，3鍵和β-1，4鍵交替連接在一起並且在其非還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖的寡糖。
多糖是指除單糖和寡糖之外的糖類。
本發明的瓊脂糖酶是含有由SEQ ID NO22的胺基酸序列中第21號胺基酸至第437號胺基酸的417個殘基組成的胺基酸序列、或者含有由SEQ ID NO23的胺基酸序列中第318號胺基酸至第1089號胺基酸的772個殘基組成的胺基酸序列的瓊脂糖酶。在一個實施方案中，它是一種含有在上述胺基酸序列中一個或多個胺基酸被取代、缺失、添加和/或插入的胺基酸序列的多肽。例如，包括具有與所述胺基酸序列至少70％或更高、優選80％或更高、更優選90％或更高的同源性的區的多肽。可以依照已知方法，利用用於這類計算的任何電腦程式如DNASIS(Takara Shuzo)來計算同源性。
本發明的瓊脂糖酶既可以作用於多糖(例如瓊脂糖)，也可以作用於寡糖(例如瓊脂寡糖和新瓊脂寡糖)。例如，最適反應溫度為45℃或更高。對於本發明的酶並無具體限制，只要它們具有這樣的特性。其實例包括由海洋微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)生產的瓊脂糖酶。
對於本發明的瓊脂糖酶的切割模式並無具體限制。例如，所述瓊脂糖酶可以是水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的α-瓊脂糖酶，或者是水解D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵的β-瓊脂糖酶。
本發明的α-瓊脂糖酶是水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵並且既可以作用於多糖(例如瓊脂糖)也可以作用於寡糖(例如瓊脂己糖)的酶。對於本發明的所述酶並無具體限制，只要它具有這樣的特性。其實例包括瓊脂糖酶II，即由海洋微生物NAB2-1-1(FERMBP-7855)生產的α-瓊脂糖酶。
由微生物NAB2-1-1生產的瓊脂糖酶II是一種水解多糖或寡糖中3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的酶。所述酶作用於瓊脂糖、瓊脂己糖和比瓊脂己糖長的瓊脂寡糖(例如瓊脂辛糖)以及新瓊脂己糖和比新瓊脂己糖長的新瓊脂寡糖。
本發明的β-瓊脂糖酶是水解D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵並且既可以作用於多糖(例如瓊脂糖)也可以作用於寡糖(例如瓊脂己糖)的酶。對於本發明的所述酶並無具體限制，只要它具有這樣的特性。其實例包括瓊脂糖酶I，即由海洋微生物NAB2-1-1(FERMBP-7855)生產的β-瓊脂糖酶。
由微生物NAB2-1-1生產的瓊脂糖酶I是一種水解多糖或寡糖中D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵的酶。所述酶作用於瓊脂糖、新瓊脂己糖和比新瓊脂己糖長的新瓊脂寡糖(例如新瓊脂辛糖)以及瓊脂己糖和比瓊脂己糖長的瓊脂寡糖。
以下描述測定上述酶的活性以及所述酶的理化特性和酶特性的方法。
(1)酶學測定方法通過用Agarose LO3(Takara Shuzo)作為底物進行酶促反應，然後用高效液相色譜定量測定所得的瓊脂四糖或新瓊脂四糖，測定本發明瓊脂糖酶的活性。具體地說，此中所用的用於測定純化酶製劑的活性或者純化過程中酶的活性的酶活性測定方法如下。
製備在含有10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2)(就瓊脂糖酶I而言)中或者在含有10mM氯化鈣和10mM氯化鈉的20mMTris-HCl緩衝液(pH7.2)(就瓊脂糖酶II而言)中含有0.2％(w/v)或0.5％(w/v)濃度的瓊脂糖的溶液。將作為底物的180μl該溶液與20μl酶溶液混合。讓混合物於50℃反應5-30分鐘，優選反應10分鐘，然後在沸水中或於75℃加熱1分鐘以終止反應。讓30μl所述反應混合物經過TSKgelα-2500柱(內徑7.8mm；長度300mm；Tosoh)。用70％乙腈溶液作為洗脫液，以0.8ml/分鐘的流速，定量測定以約25分鐘的保留時間洗脫出的瓊脂四糖或者以約24分鐘的保留時間洗脫出的新瓊脂四糖。一個單位(1U)定義為在10分鐘內產生1μmol瓊脂四糖的酶量。
(2)最適pH讓酶作用於用乙酸緩衝液(pH4.5)、蘋果酸緩衝液(pH5.5)、乙酸緩衝液(pH6.0、6.5)或Tris-HCl緩衝液(pH7.0、7.5、8.8)製備的反應混合物中作為底物的瓊脂糖。結果，證明瓊脂糖酶I和瓊脂糖酶II都在弱酸性至弱鹼性條件下表現出其消化瓊脂糖的活性。
(3)最適溫度本發明的瓊脂糖酶II在範圍為45-55℃的溫度下表現出高酶活性，在約50℃下表現出最高活性。本發明的瓊脂糖酶I在範圍為45-70℃的溫度下表現出高酶活性，在約55-65℃下表現出最高活性。
(4)熱穩定性在48℃、50℃、55℃、60℃或65℃下處理給定的時間之後，測定酶製劑的剩餘活性。結果，瓊脂糖酶II在55℃處理10分鐘之後表現出40％的其活性。瓊脂糖酶I在60℃處理10分鐘之後，表現出100％的其活性；在60℃處理20分鐘之後，表現出100％的其活性；在60℃處理30分鐘之後，表現出98％的其活性；在65℃處理10分鐘之後，表現出100％的其活性；在65℃處理20分鐘之後，表現出95％的其活性；在65℃處理30分鐘之後，表現出90％的其活性；而在65℃處理60分鐘之後，表現出90％的其活性。
(5)鈣離子需求已知的瓊脂糖酶需要鈣以表現出其活性。檢查本發明的相應瓊脂糖酶的鈣離子需求。結果，在無鈣離子時，瓊脂糖酶II的活性為存在鈣離子時所表現出的活性的60％。在無鈣離子時，瓊脂糖酶I的活性為存在鈣離子時所表現出的活性的100％。因此，瓊脂糖酶II和瓊脂糖酶I在不加入鈣離子的情況下都表現出其活性。
本發明的瓊脂糖酶II在CaCl2存在下被穩定化，而它不受錳離子或鎂離子的影響。
(6)分子量用10-20％聚丙烯醯胺梯度凝膠，通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定，估計瓊脂糖酶II和瓊脂糖酶I的分子量分別為約117,000和約48,000。
(7)依照Edman降解法測定胺基酸序列依照Edman降解法測定的瓊脂糖II和瓊脂糖酶I的N末端胺基酸序列分別為Glu-Thr-Ile-Val-Leu-Gln-Ala-Glu-Ser-Phe和Ala-Asp-Xaa-Asp-Gly-Val-Pro-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly。瓊脂糖酶II和瓊脂糖酶I的N末端胺基酸序列分別示於SEQ ID NO2和SEQ ID NO1。
如下所述，分離出編碼瓊脂糖酶II的基因和編碼瓊脂糖酶I的基因。也測定了由這些基因所編碼的胺基酸序列。由瓊脂糖酶II基因和瓊脂糖酶I基因編碼的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO23和SEQ IDNO22。由SEQ ID NO23的胺基酸序列中第318號胺基酸至第1089號胺基酸的772個胺基酸組成的多肽表現出本發明的α-瓊脂糖酶的活性，而由SEQ ID NO22的胺基酸序列中第21號胺基酸至第437號胺基酸的417個胺基酸組成的多肽表現出本發明的β-瓊脂糖酶的活性。
可以從通過培養微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)所獲得的培養物中，純化本發明的瓊脂糖酶。NAB2-1-1從海水中作為同化瓊脂的細菌分離出。它具有以下微生物學特性。
(1)形態學製備人工海水(商品名Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入0.3％(w/v)濃度的蛋白腖(Difco)和0.02％(w/v)濃度的酵母膏(Difco)。然後用3M碳酸鈉將pH調至7.8。向其中加入0.1％(w/v)濃度的AgaroseLO3(Takara Shuzo)。在高壓滅菌器中滅菌後，將上述微生物接種到所述混合物中，於37℃以120rpm培養過夜。在所述培養物中生長的微生物是革蘭氏陰性桿菌，所述桿菌為遊動的，有極生鞭毛，為需氧菌，並且需要鹽。
(2)生長製備人工海水(商品名Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入0.3％(w/v)濃度的蛋白腖(Difco)和0.02％(w/v)濃度的酵母膏(Difco)。然後用3M碳酸鈉將pH調至7.8。向其中加入1.5％(w/v)濃度的瓊脂(Nacalai Tesque)。將混合物高壓滅菌，製備平板。當將上述微生物接種到平板上時，表明(i)它在30-40℃下生長良好；(ii)當所述細胞生長時瓊脂凝膠液化；和(iii)它在pH6.0-8.0下生長良好。
NAB2-1-1於2001年1月10日(原始保藏日)保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心(International Patent OrganismDepositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan)，保藏號為FERM BP-7855。
可以通過分析編碼16S核糖體RNA(16S rRNA)的基因的核苷酸序列，獲得關於上述微生物的分類學位置的信息。已知16S rRNA基因的核苷酸序列對於每種微生物菌株是特異性的。具體地說，從微生物NAB2-1-1提取染色體DNA。用可以用來擴增所述基因中一個區或其部分的引物進行PCR。測定所擴增的DNA片段的核苷酸序列。針對已測定的序列，利用GanBank資料庫進行同源性搜索。則可以了解在所述區中具有相似核苷酸序列的微生物，即分類學上密切的微生物。
依照Bulletin of Japanese Society of Microbial Ecology，1031-42(1995)中描述的方法，擴增來源於微生物NAB2-1-1的16S核糖體RNA基因的DNA片段。使用在所述文獻中描述的引物27f和1492r進行PCR(引物27f和1492r的核苷酸序列分別示於SEQ ID NO32和33)。分析所得的DNA擴增片段的核苷酸序列。結果，發現了分別與產生本發明的瓊脂糖酶的所述微生物在上述區中具有最高約90％同源性的以下微生物Pseudoalteromonas sp.KT0812A舒氏氣單胞菌(Aeromonas schubertii)可以從NAB2-1-1以及NAB2-1-1的自發或人工突變體、或者從屬於NAB2-1-1所屬屬並且能夠產生本發明瓊脂糖酶的微生物中，獲得本發明的瓊脂糖酶。
可以依照已知的方法，例如輻射、紫外線照射或用誘變劑處理，獲得人工突變體。
已知屬於同一屬的微生物的16S rRNA基因的核苷酸序列之間的同源性一般為約99％或更高。因此，可以同本發明的微生物NAB2-1-1一樣，使用其16S rRNA基因的核苷酸序列與微生物NAB2-1-1的所述基因的核苷酸序列具有99％或更高同源性的微生物。
可以使用含有所述微生物可以利用的氮源、無機物質等以及用瓊脂、瓊脂糖等作為碳源的培養基，作為所述微生物培養用的培養基。可以使用市售的瓊脂或瓊脂糖。氮源的實例包括肉膏、酵母膏、酪蛋白水解物、胰腖和蛋白腖。優選使用酵母膏和蛋白腖。這樣的氮源也可以用作除瓊脂或瓊脂糖之外的碳源。此外，氯化鈉、檸檬酸鐵、氯化鎂、硫酸鈉、氯化鈣、氯化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、溴化鉀、氯化鍶、硼酸鈉、矽酸鈉、氟化鈉、硝酸銨、磷酸氫二鈉等可以聯合用作鹽。
特別是，優選使用通過向由人工海水Jamarin S組成的培養基中加入蛋白腖、酵母膏和瓊脂或瓊脂糖製備的培養基。優選加入0.1-2.0％濃度的瓊脂或瓊脂糖。通過適當改變瓊脂或瓊脂糖的濃度，可以製備固體或液體培養基。為了生產酶，優選使用0.1-0.3％濃度的液體培養物，而為了保存細胞，則優選使用1.2-2.0％濃度的固體培養物。如果使用低熔點瓊脂糖進行液體培養，則它可以以0.1-1.0％的濃度使用。
例如，培養溫度為30-40℃，培養基的pH為6.0-8.0，而培養時間為12-48小時，雖然根據培養基的組成，可以或多或少地改變培養條件。
在如上所述的培養期間所產生的本發明的α-瓊脂糖酶和/或β-瓊脂糖酶被分泌到細胞外。然後在培養後通過離心、過濾等除去細胞，獲得培養上清液。
可以運用真空濃縮或超濾來濃縮所得的培養上清液，以製備液體酶。或者，可以將培養上清液通過凍幹、噴霧乾燥等轉變為粉狀酶，以製備粗製酶製劑。可以採用常規純化方法，例如用硫酸銨鹽析或溶劑沉澱，部分純化本發明的α-瓊脂糖酶和/或β-瓊脂糖酶。此外，聯合運用已知的純化方法，例如柱色譜(例如離子交換柱和凝膠過濾柱)，可以獲得在電泳時產生單一條帶的純化酶製劑。
通過將如此獲得的培養物或不同純化程度的本發明的α-瓊脂糖酶，與作為底物的紅藻中所含有的多糖(例如瓊脂或瓊脂糖)反應，可以生產瓊脂寡糖，例如瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖。
瓊脂糖是一種其結構為D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖通過α-1，3鍵和β-1，4鍵交替連接在一起的多糖。β-瓊脂糖酶是水解瓊脂糖中β-1，4鍵的酶。通過該酶的作用產生的在其還原末端具有D-半乳糖的寡糖稱為新瓊脂寡糖，它不表現出諸如用瓊脂寡糖所觀察到的生理活性。如果使用切割瓊脂糖中α-1，3鍵的α-瓊脂糖酶，則可以產生在其還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖的瓊脂寡糖。來源於解瓊脂交替單胞菌GJ1B和弧菌屬細菌(菌株JT0107-L4)的兩種酶已知是α-瓊脂糖酶。然而，由解瓊脂交替單胞菌GJ1B產生的α-瓊脂糖酶不能作用於瓊脂己糖或更短的瓊脂寡糖而所述弧菌屬細菌來源的α-瓊脂糖酶不能消化瓊脂糖。因此，用這樣的α-瓊脂糖酶從原料-瓊脂糖有效生產瓊脂二糖或瓊脂四糖是不可能的。
本發明人先前發現的WO 00/50578中所述的α-瓊脂糖酶是作用於瓊脂糖、瓊脂己糖和比瓊脂己糖長的瓊脂寡糖的酶。因此，它們作用於瓊脂糖，產生瓊脂寡糖。此外，它們還可以切割由於所述作用而產生的瓊脂己糖中的單一α-1，3鍵。利用所述酶，有可能生產瓊脂二糖和瓊脂四糖，它們是依照常規方法幾乎不能生產的二糖和四糖。這些酶的最適反應溫度為約40℃。瓊脂糖通常以1％(w/v)的濃度使用。在這一濃度下，它於50℃不固化，但於40℃固化。也就是說，如果使用常規的酶，則高濃度的瓊脂糖在所述酶的最適反應溫度下固化，因此可能妨礙所述酶促反應。因此，難以有效地生產瓊脂二糖或瓊脂四糖。
另一方面，由於本發明的α-瓊脂糖酶的最適反應溫度為50℃，因此，可以將其用於在瓊脂糖不固化的溫度下進行反應。因此，這使得能夠有效地生產瓊脂寡糖。
由上述理化特性可見，本發明的α-瓊脂糖酶是作用於瓊脂糖、瓊脂己糖和比瓊脂己糖長的瓊脂寡糖的酶。因此，它作用於瓊脂糖，產生瓊脂寡糖。此外，它可以切割由於所述作用而產生的瓊脂寡糖中的α-1，3鍵，產生諸如瓊脂二糖和瓊脂四糖的更小的瓊脂寡糖。另外，其最適溫度高，並且熱穩定性非常好。因此，運用本發明的α-瓊脂糖酶，有可能大量獲得依照常規方法一直難以生產的二糖和四糖-瓊脂二糖和瓊脂四糖，而不會由於瓊脂糖固化而妨礙反應。
常規α-瓊脂糖酶和本發明的α-瓊脂糖酶的底物特異性示於表1。在該表中，符號+和-分別代表所述酶能夠和不能消化所述底物。
表1底物瓊脂糖瓊脂己糖瓊脂四糖解瓊脂交替單胞菌 + --GJ1B弧菌屬細菌(JT0107-L4)- ++瓊脂糖酶1-7和+ +-瓊脂糖酶4-3瓊脂糖酶II + +-運用本發明的α-瓊脂糖酶所產生的瓊脂寡糖含有瓊脂二糖和瓊脂四糖。所述瓊脂寡糖可以含有瓊脂己糖或比瓊脂己糖長的瓊脂寡糖，只要其存在不幹擾應用目的。例如，可以用瓊脂、瓊脂糖或者來源於瓊脂或瓊脂糖的瓊脂寡糖作為原料，來用本發明的α-瓊脂糖酶生產瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖。所述α-瓊脂糖酶作用所用的條件並無具體限制，只要所述酶在所用的條件下表現出其活性。例如，優選讓瓊脂糖酶II於pH6.0-8.0、45-55℃下作用。對於所述反應混合物的組成並無具體限制，只要它適合於所述酶的作用。
如上所述，運用本發明的α-瓊脂糖酶所產生的寡糖主要是低聚合度的己糖或更短的寡糖。然而，通過適當選擇反應條件等，有可能任選地產生具有不同聚合度的寡糖。通過分離和純化如此獲得的寡糖，也有可能獨立地獲得瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖。
通過讓如上所述獲得的培養物或不同純化程度的本發明β-瓊脂糖酶作用於在紅藻中所含有的多糖(例如瓊脂或瓊脂糖)，可以將瓊脂或瓊脂糖消化為瓊脂寡糖，例如新瓊脂二糖、新瓊脂四糖和新瓊脂己糖。
弧菌JT0107-1，4(JP-A 8-38172)和Pseudomonas altantica(Morrice，L.M.等，Eur.J.Biochem.，135，553-558(1983))來源的酶已知是β-瓊脂糖酶。其最適反應溫度為約30℃。如果用這樣一種酶從瓊脂糖凝膠中提取核酸等，則由於瓊脂糖在所述酶表現出其活性的溫度固化，而妨礙了所述反應。因此，它不能得到實際應用。已知黃桿菌菌株NR19(美國專利第5,869,310號)、假單胞菌(Pseudomonas sp.)N-7(JP-B 7-97987)和弧菌(Vibrio sp.)PO-303(JP-A 8-294389)來源的酶的最適反應溫度高於上述酶。然而，由於其最適溫度(55℃或更低)低於低熔點瓊脂糖凝膠的熔點(65℃)，因此對於實際應用仍有問題。
另一方面，本發明的β-瓊脂糖酶在寬範圍的溫度(50-70℃)下表現出高活性，並且在55-65℃表現出最高活性。因此，它使得其中瓊脂糖凝膠完全熔化的反應得以進行。此外，本發明的β-瓊脂糖酶的98％的活性在於65℃處理30分鐘後仍得以保留，表明它的熱穩定性非常好。因此，應用本發明的β-瓊脂糖酶使得能夠從瓊脂糖凝膠中有效地提取核酸等，而不會由於瓊脂糖固化受到妨礙。這樣的提取依照常規方法是困難的。
本發明的α-瓊脂糖酶基因是編碼具有上述α-瓊脂糖酶活性的多肽的基因。因此，它是指含有編碼具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的胺基酸序列的核苷酸序列的核酸。本發明的α-瓊脂糖酶基因的實例包括含有來源於微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)的編碼瓊脂糖酶II的核苷酸序列的基因。編碼瓊脂糖酶II的基因的示例為具有編碼由SEQ IDNO23中第318號胺基酸至第1089號胺基酸的772個胺基酸構成的多肽的核苷酸序列的基因。
本發明的α-瓊脂糖酶基因也包括含有編碼具有在上述胺基酸序列中一個或多個胺基酸被取代、缺失、添加或插入的胺基酸序列並且具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。
另外，本發明的所述基因包括具有由SEQ ID NO21中第952號核苷酸至第3267號核苷酸的2316個核苷酸組成的核苷酸序列的基因。本發明的所述基因也包括含有具有在上述核苷酸序列中一個或多個核苷酸被取代、缺失、添加或插入的核苷酸序列並且編碼具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。
此外，本發明的基因包括含有在嚴謹條件下與上述基因雜交並且編碼具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。可以依照例如T.Maniatis等(編著)，Molecular CloningA Laboratory Manual 2nd ed.，1989，Cold Spring Harbor Laboratory中所述的方法進行雜交。所述嚴謹條件的示例為與探針於65℃在含有6×SSC(1×SSC0.15M氯化鈉、0.015M檸檬酸鈉，pH7.0)、0.5％SDS、5×Denhardt氏液和100mg/ml鯡精DNA的溶液中保溫過夜。
本發明的β-瓊脂糖酶基因是編碼具有上述β-瓊脂糖酶活性的多肽的基因。因此，它是指含有編碼具有β-瓊脂糖酶活性的多肽的胺基酸序列的核苷酸序列的核酸。本發明的β-瓊脂糖酶基因的實例包括含有來源於微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)的編碼瓊脂糖酶I的核苷酸序列的基因。編碼瓊脂糖酶I的基因的示例為具有編碼由SEQ IDNO22中第21號胺基酸至第437號胺基酸的417個胺基酸殘基構成的多肽的核苷酸序列的基因。
本發明的β-瓊脂糖酶基因也包括含有編碼具有在上述胺基酸序列中一個或多個胺基酸被取代、缺失、添加或插入的胺基酸序列並且具有β-瓊脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。
另外，本發明的所述基因包括具有由SEQ ID NO20中第61號核苷酸至第1311號核苷酸的1251個核苷酸組成的核苷酸序列的基因。本發明的所述基因也包括含有在上述核苷酸序列中一個或多個核苷酸被取代、缺失、添加和/或插入的核苷酸序列並且編碼具有β-瓊脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。
此外，本發明的所述基因包括含有在嚴謹條件下與上述基因雜交並且編碼具有β-瓊脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。所述嚴謹條件的示例為如上所述的那些條件。
例如，本發明的瓊脂糖酶基因可以如下克隆。
從產生瓊脂糖酶的微生物中製備基因組DNA。可以依照合適的已知方法，製備基因組DNA。例如，可以聯合使用已知方法，例如溶菌酶處理、蛋白酶處理、RNA酶處理、苯酚處理和乙醇沉澱，製備基因組DNA。採用合適的已知方法，例如超聲處理或用限制性酶消化，降解如此獲得的基因組DNA。依照構建重組DNA分子的常規方法，將所得的DNA片段摻入到載體(例如質粒載體)中。然後將所述重組DNA分子導入合適的宿主(例如大腸桿菌)中，獲得轉化子。可以從常規方法中選擇適用於待使用的載體和宿主的用於構建重組DNA分子、轉化等的方法，例如在Molecular CloningA Laboratory Manual 2nd ed.中描述的那些方法。因此，獲得含有帶有瓊脂糖酶基因的轉化子的基因組文庫。
接著，篩選基因組文庫，以選擇帶有所述瓊脂糖酶基因的轉化子。從可以所述轉化子中分離出所述瓊脂糖酶基因。篩選方法的實例如下。
(1)用瓊脂糖酶活性的表達作為指標進行篩選讓基因組文庫在瓊脂平板上生長。帶有瓊脂糖酶基因的轉化子表達具有瓊脂糖酶活性的多肽。所述多肽通過其瓊脂糖酶活性的作用，溶解瓊脂凝膠。因此，選擇在瓊脂平板溶解瓊脂凝膠的菌落或噬斑。
(2)用抗體進行篩選如上所述製備粗製、部分純化或純化的瓊脂糖酶酶製劑。用所述製劑作為抗原，依照常規方法製備抗瓊脂糖酶抗體。
讓基因組文庫在平板上生長。將生長的菌落或噬斑轉移到尼龍濾膜或硝化纖維素濾膜上。已表達的重組蛋白與所述菌落或噬斑一起被轉移到所述濾膜上。讓濾膜上的重組蛋白與所述抗瓊脂糖酶抗體反應，以鑑定與所述抗體反應的克隆。
可以依照已知方法，例如通過使過氧化物酶綴合第二抗體與已經與所述抗瓊脂糖酶抗體反應的濾膜反應，讓所述濾膜與顯色底物一起保溫，然後檢測所顯現出的顏色，可以鑑定與所述抗體反應的克隆。
如果使用導致在所述載體中所摻入的DNA中的基因高表達的表達載體，來構建在上述方法(1)或(2)中使用的基因組文庫，則可以容易地選擇帶有目標基因的轉化子。
(3)通過用DNA探針雜交進行篩選讓基因組文庫在平板上生長。將生長的菌落或噬斑轉移到尼龍濾膜或硝化纖維素濾膜上。將DNA通過變性固定化到所述濾膜上。依照常規方法，讓濾膜上的DNA與標記探針雜交，以鑑定與所述探針雜交的克隆。
用於這種篩選的探針包括基於上述瓊脂糖酶的胺基酸序列的信息製備的寡核苷酸、基於另一胺基酸序列的信息製備的寡核苷酸、和用基於這樣的胺基酸序列的信息製備的引物所擴增的PCR片段。用於所述探針的標記的實例包括但不限於放射性同位素標記、螢光標記、洋地黃毒苷標記和生物素標記。
富集了如下製備的帶有瓊脂糖酶基因的轉化子的基因組文庫，可以用作供所述篩選用的基因組文庫。
依照常規方法，從產生瓊脂糖酶的微生物中製備基因組DNA，用合適的限制性酶消化，通過瓊脂糖凝膠電泳分離，然後轉印到尼龍濾膜或硝化纖維素濾膜上。依照常規方法，讓濾膜上的DNA與上述標記探針雜交，以檢測與所述探針雜交的DNA片段。從所述瓊脂糖凝膠中提取和純化對應於所述信號的DNA片段。
依照常規方法，將如此獲得的DNA片段摻入到載體(例如質粒載體)中，構建重組DNA分子。然後將所述重組DNA分子導入合適的宿主(例如大腸桿菌)中，獲得轉化子。可以從常規方法中選擇適用於待使用的載體的轉化方法，例如在Molecular CloningA LaboratoryManual 2nd ed.中描述的那些方法。因此，獲得富集了帶有瓊脂糖酶基因的轉化子的基因組文庫。
使用這樣一種基因組文庫，可以更有效地進行篩選。
可以在如上所述的方法(1)-(3)中篩選轉化子，克隆目標基因。通過運用PCR，可以在體外進行克隆，而無需利用轉化子。
從產生瓊脂糖酶的微生物中製備基因組DNA。用基因組DNA作為模板，使用基於所述瓊脂糖酶的胺基酸序列的信息製備的一對引物，進行PCR。因此，可以獲得含有瓊脂糖酶基因的DNA片段。此外，例如通過用所述片段作為探針進行雜交，或者用基於所述片段的核苷酸序列製備的引物進行PCR，可以獲得全長瓊脂糖酶基因。可以依照已知方法，測定如上所述獲得的基因的核苷酸序列。如果所述克隆不編碼完整的瓊脂糖酶多肽，則通過重複包括基於所述已測定核苷酸序列製備新探針和用所述探針篩選基因組文庫獲得新克隆的程序，揭示所述瓊脂糖酶的完整可讀框(ORF)。例如，基於如此獲得的信息，可以製備含有編碼所述瓊脂糖酶的完整ORF的克隆。
通過基因工程，通過將如上所述獲得的編碼所述瓊脂糖酶的基因與合適的表達載體連接，可以大量生產具有瓊脂糖酶活性的多肽。
以下簡述用於獲得本發明的基因的方法。
用溶菌酶裂解通過培養微生物NAB2-1-1而獲得的細胞，然後除去蛋白質、經過乙醇沉澱等，獲得染色體DNA。NAB2-1-1染色體DNA用限制性酶完全消化。將對應於所述限制性酶的連接物與已消化的DNA連接。用所得的染色體DNA作為模板，使用基於本發明的瓊脂糖酶I或II的N末端胺基酸序列或內部胺基酸序列製備的引物以及對應於所述連接物的核苷酸序列的引物，進行PCR。
通過分析如上所述獲得的PCR產物的核苷酸序列，可以確定編碼本發明的瓊脂糖酶的核苷酸序列。如果不能測定所述完整序列，則可以重複上述程序。或者，用染色體DNA作為模板，可以進行引物步查。
基於所述瓊脂糖酶的胺基酸序列設計的引物可以是混合引物。或者，用基於所述N末端胺基酸序列和內部胺基酸序列製備的引物，用NAB2-1-1染色體DNA作為模板，通過PCR獲得擴增產物，可以使用基於所述擴增產物的核苷酸序列製備的新引物。
如此獲得的編碼瓊脂糖酶II的基因具有編碼由1089個胺基酸構成的多肽的ORF。所述ORF的核苷酸序列示於SEQ ID NO21。由所述ORF的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列示於SEQ ID NO23。在所述基因的核苷酸序列中，發現了對應於P2(瓊脂糖酶II的N末端胺基酸序列)的核苷酸序列、編碼具有信號肽樣序列的26個胺基酸的上遊核苷酸序列、和更上遊區中的SD樣序列。
因此，SEQ ID NO23的胺基酸序列是本發明α-瓊脂糖酶的一個實例。該胺基酸序列與先前測定的瓊脂糖酶II的N末端胺基酸序列的比較表明，瓊脂糖酶II是一種由SEQ ID NO23的胺基酸序列中第27號胺基酸至第1089號胺基酸的胺基酸序列構成的多肽，並且所述胺基酸序列由SEQ ID NO21的核苷酸序列中第79號核苷酸至第3270號核苷酸(包括終止密碼子)的核苷酸序列所編碼。
在所述ORF中發現了三個推定的鈣結合區(171-184、271-283和987-999)。
所述編碼瓊脂糖酶I的基因有一個編碼由438個胺基酸構成的多肽的ORF。所述ORF的核苷酸序列示於SEQ ID NO20。由所述ORF的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列示於SEQ ID NO22。在所述基因的核苷酸序列中，發現了對應於P1(瓊脂糖酶I的N末端胺基酸序列)的核苷酸序列、編碼20個胺基酸的上遊核苷酸序列、和更上遊區中的SD樣序列。
因此，SEQ ID NO22的胺基酸序列是本發明的瓊脂糖酶的一個實例。該胺基酸序列與先前測定的瓊脂糖酶I的N末端胺基酸序列的比較表明，瓊脂糖酶I是一種由SEQ ID NO22的胺基酸序列中第21號胺基酸至第438號胺基酸的胺基酸序列構成的多肽，並且所述胺基酸序列由SEQ ID NO20的核苷酸序列中第61號核苷酸至第1314號核苷酸(包括終止密碼子)的核苷酸序列所編碼。
如上所述獲得的瓊脂糖酶I的胺基酸序列與得自黃桿菌菌株NR19的已知β-瓊脂糖酶的胺基酸序列僅有33％的同源性。因此，認為本發明的瓊脂糖酶I具有絕對新穎的序列。
通過將編碼本發明的瓊脂糖酶的基因(例如編碼瓊脂糖酶I或瓊脂糖酶II的基因)與合適的載體連接，可以構建重組DNA分子。此外，通過將所述重組DNA分子導入合適的宿主中，可以製備轉化子。用通過培養所述轉化子所獲得的培養物，生產本發明的瓊脂糖酶。因此，有可能用所述轉化子大量生產本發明的瓊脂糖酶(例如瓊脂糖酶I或瓊脂糖酶II)。
通過依照已知方法，在編碼瓊脂糖酶的基因中引入突變，可以產生突變型瓊脂糖酶。可以使用的用於引入突變的方法的實例包括但不限於寡核苷酸雙琥珀法(Hashimoto-Gotoh，T.等，Gene，152271-275(1995))、帶缺口的雙鏈體法(the gapped duplex method)(Kramer，W.等，Nucl.Acids Res.，129441(1984)；Kramer，W.等，Methods in Enzymology，154350(1987))和Kunkel法(Kunkel，T.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488(1985)；Kunkel，T.A.，Methods in Enzymology，154367(1987))。
通過表達編碼在待表達的瓊脂糖酶的N末端添加信號序列的多肽的基因，可以使目標瓊脂糖酶分泌到轉化子外。所述信號序列並不限於具體的信號序列，其示例為由SEQ ID NO22中第1號胺基酸至第20號胺基酸所示的瓊脂糖酶I的信號序列。這一信號序列由SEQ IDNO22中的第1號核苷酸至第60號核苷酸的核苷酸序列編碼。或者，所述信號序列的示例為由SEQ ID NO23中第1號胺基酸至第26號胺基酸所示的瓊脂糖酶I的信號序列。這一信號序列由SEQ ID NO21中的第1號核苷酸至第78號核苷酸的核苷酸序列編碼。
可以用來構建重組DNA分子的載體的示例包括但不限於質粒載體、噬菌體載體和病毒載體。可以根據使用所述重組DNA的目的，選擇合適的載體。如果構建重組DNA分子以生產瓊脂糖酶，則優選含啟動子和/或供表達控制用的其它區的載體。這樣的質粒載體的實例包括但不限於pKF19k、pT7BlueT和pET16b。可以用於製備轉化子的宿主包括但不限於諸如細菌、酵母和絲狀真菌的微生物以及哺乳動物、魚類、昆蟲等的培養細胞。用適合於所述宿主的載體構建的重組DNA分子來構建轉化子。
以下簡述通過基因工程生產瓊脂糖酶I的方法。
將含有編碼具有例如始於SEQ ID NO22的第21號胺基酸的胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的DNA片段，插入到合適的質粒載體(例如pKF19k(Takara Shuzo)、pT7BlueT(Takara Shuzo)或pET16b(TakaraShuzo)中，構建質粒。在合適的液體培養基中，培養用這樣的質粒轉化的大腸桿菌(例如大腸桿菌JM109或BL21(DE3)pLysS)。如有需要，用IPTG等進行誘導。讓所述質粒中所插入的DNA片段所編碼的多肽表達。單位體積的培養物中由這種轉化子表達的β-瓊脂糖酶活性通常高於用NAB2-1-1培養物所觀察到的所述活性。
對於瓊脂糖酶II，用編碼具有例如始於SEQ ID NO23的第27、181或318號胺基酸的胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的DNA片段，通過如上關於瓊脂糖酶I所述的基因工程，可以製備表達瓊脂糖酶II的轉化子。所得的轉化子表達α-瓊脂糖酶活性，單位體積的培養物中的所述活性通常高於用NAB2-1-1培養物所觀察到的所述活性。
如上所述通過基因工程生產的本發明的瓊脂糖酶，可以通過常規純化方法例如用硫酸銨鹽析或溶劑沉澱進行部分純化。此外，聯合運用已知的純化方法，例如柱色譜(例如陰離子交換柱或凝膠過濾柱)，可以獲得電泳時產生單一條帶的純化酶製劑。
如果通過基因工程生產的本發明的瓊脂糖酶不溶解，則可以依照已知方法將其溶解並回收。
通過讓如此獲得的不同純化程度的本發明重組α-瓊脂糖酶與作為底物的紅藻中所含有的多糖(例如瓊脂或瓊脂糖)反應，可以生產瓊脂寡糖，例如瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂己糖和瓊脂辛糖。
例如，通過用1％(w/v)瓊脂糖作為底物，於50℃反應16小時，可以生產所述瓊脂寡糖。
同樣，通過讓如此獲得的不同純化程度的本發明的重組β-瓊脂糖酶作用於已經經過核酸等電泳的瓊脂糖凝膠，可以有效地提取瓊脂糖凝膠中的物質(例如核酸)。
例如，在於1％(w/v)或3％(w/v)瓊脂糖凝膠上電泳的情況下，通過讓本發明的重組β-瓊脂糖酶於67℃作用於含有目標物質的瓊脂糖凝膠達10分鐘，可以有效地提取所述凝膠中的物質。
通過從N末端缺失所述ORF的至多30％，可以改進本發明的瓊脂糖酶的熱穩定性。待缺失區並無具體限制，只要它至多為所述ORF的30％(例如10％、20％等)。例如，通過從N末端缺失瓊脂糖酶II的29.1％(即317個胺基酸)，可以改進瓊脂糖酶II的熱穩定性。在鈣存在下觀察到特別顯著的熱穩定性的改進。
對於用於缺失N末端部分以改進熱穩定性的方法並無具體限制。它可以通過用蛋白酶處理或者通過用基因工程技術來進行。
實施例以下實施例更詳細地說明本發明，但不應解釋為限制本發明的範圍。
實施例1活性測定方法當純化本發明的瓊脂糖酶時，通過用Agarose LO3(Takara Shuzo)作為底物進行酶促反應，然後用高效液相色譜定量測定所得的瓊脂四糖或新瓊脂四糖，測定純化的或者部分純化的所述酶製劑的活性。以下詳細描述所述程序。
製備在含有10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2)(就瓊脂糖酶I而言)中或者在含有10mM氯化鈣和10mM氯化鈉的20mMTris-HCl緩衝液(pH7.2)(就瓊脂糖酶II而言)中含有0.2％(w/v)或0.5％(w/v)濃度的瓊脂糖的溶液。將作為底物的180μl該溶液與20μl酶溶液混合。讓混合物於50℃反應5-30分鐘，優選反應10分鐘，然後在沸水中或於75℃加熱1分鐘以終止反應。讓30μl所述反應混合物經過TSKgel α-2500柱(內徑7.8mm；長度300mm；Tosoh)。用70％乙腈溶液作為洗脫液，以0.8ml/分鐘的流速進行洗脫。定量測定由於酶促反應產生的以約25分鐘的保留時間洗脫出的瓊脂四糖或者以約24分鐘的保留時間洗脫出的新瓊脂四糖。一個單位(1U)定義為在10分鐘內產生1μmol瓊脂四糖或新瓊脂四糖的酶量。
實施例2從NAB2-1-1生產瓊脂糖酶製備100ml人工海水(商品名Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入濃度分別為0.3％(w/v)和0.02％(w/v)的蛋白腖(Difco)和酵母膏(Difco)。然後用3M碳酸鈉將pH調至7.8。將所得的混合物轉移到500ml錐形瓶中。向其中加入0.4g NuSieve GTG Agarose(Takara Shuzo)。用高壓滅菌器滅菌後，將NAB2-1-1接種到所述混合物中，於37℃以120rpm培養過夜。所得的培養物用作預培養物。
如下進行主培養。在5,000ml小型發酵容器中製備3,000ml人工海水(商品名Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入濃度分別為0.3％(w/v)和0.02％(w/v)的蛋白腖(Difco)和酵母膏(Difco)。然後將pH調至7.8。向其中加入12g NuSieve GTG Agarose(Takara Shuzo)。混合物用高壓滅菌器滅菌。將30ml預培養物接種到所述混合物中，於37℃以250rpm培養18小時。然後將培養物以8,000×g離心20分鐘，收集約3,000ml已經除去了細胞的上清液。
以下操作於4℃或4℃以下進行。
將上清液置於透析膜(Sanko Junyaku)中，於約500g聚乙二醇中浸泡兩夜，以將其濃縮約10倍。將300ml濃縮液對緩衝液I(含有10mM氯化鈣和10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2))透析以便脫鹽。
將透析液上樣至已經用所述緩衝液平衡的填充陰離子交換樹脂DEAE Toyopearl 650M(Tosoh)的柱(2.0cm×12cm)上。柱子用約120ml緩衝液I洗滌。收集不吸附流分和洗滌流分(約400ml)，將其合併作為瓊脂糖酶I級分。用10mM至1,000mM氯化鈉的線性梯度(總洗脫體積400ml)進行洗脫。收集在300mM-600mM氯化鈉濃度洗脫出的約160ml的流分，作為瓊脂糖酶II級分。
將瓊脂糖酶I級分和瓊脂糖酶II級分對緩衝液II(含有10mM氯化鈣、10mM氯化鈉、5％甘油和1mM PMSF的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2))透析以便脫鹽。
如下對瓊脂糖酶II級分進行進一步純化。將經透析的瓊脂糖酶II級分上樣至填充25ml QAE Toyopearl 550C(Tosoh)的柱(2.0cm×8.0cm)上。在這種情況下，用10mM至800mM氯化鈉的線性梯度(總洗脫體積250ml)進行洗脫。獲得於約500mM洗脫出的約70ml的流分。將該流分對緩衝液II透析，用離心超濾膜CENTRIPREP-10(Amicon)濃縮至約1ml。用以緩衝液II平衡的填充Sephadex G-100(Pharmacia)的柱(0.8cm×50cm)對濃縮液進行凝膠過濾。獲得約20ml的瓊脂糖酶II級分。再次用超濾膜將該級分濃縮至約1ml的體積。
經純化的蛋白在含十二烷基硫酸鈉(SDS)的聚丙烯醯胺凝膠上電泳，表明所述蛋白被純化至幾乎均質。總活性約為150U。
如下對瓊脂糖酶I級分進行進一步純化。
讓經透析的瓊脂糖酶I級分(約400ml)吸附到已經用緩衝液II平衡的填充CM Toyopearl 650(Tosoh)的柱(2.0cm×9.5cm)上。用10mM至1,000mM氯化鈉的線性梯度(總洗脫體積300ml)進行洗脫。收集在至多300mM氯化鈉濃度洗脫出的約90ml的瓊脂糖酶I級分。將該級分對含有1.0M硫酸銨的緩衝液II透析過夜，上樣至用同一緩衝液平衡的填充30ml Butyl Toyopearl 650M(Tosoh)的柱(2.0cm×9.5cm)上。用1.0M至0M硫酸銨的梯度(總洗脫體積300ml)進行洗脫。回收300mM至0M濃度下洗脫出的瓊脂糖酶I級分(約60ml)。同瓊脂糖酶II一樣，將所述級分對緩衝液II透析，用離心超濾膜CENTRIPREP-10(Amicon)濃縮至約1ml的體積。
經純化的蛋白在含十二烷基硫酸鈉(SDS)的聚丙烯醯胺凝膠上電泳，表明所述蛋白被純化至幾乎均質。總活性約為310U。
實施例3酶的各種特性的檢查[與瓊脂糖酶I和瓊脂糖酶II反應的產物的鑑定]用瓊脂糖酶I或瓊脂糖酶II的純化酶，對20μl在含有10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2)(就瓊脂糖酶I而言)中或者在含有10mM氯化鈣和10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2)(就瓊脂糖酶II而言)中含有0.5％(w/v)濃度的瓊脂糖的溶液進行消化。讓消化產物經過凝膠過濾柱(Tosoh，TSKgel α-2500)，用70％乙腈作為洗脫液。結果，在約24分鐘和約28分鐘處觀察到瓊脂糖酶I的主峰。基於所觀測到的標準品的保留時間，認為這些峰分別對應於新瓊脂四糖和新瓊脂己糖。對於使用瓊脂糖酶II的消化產物，在約22分鐘、約25分鐘和約29分鐘的保留時間處觀察到主峰。基於所觀測到的標準品的保留時間，認為這些峰分別對應於瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖。通過對其進行薄層色譜，使用組成為氯仿∶甲醇∶乙酸＝3∶3∶1的展開劑進行兩輪展層，證實了所述反應產物。三種瓊脂寡糖即瓊脂二糖(Rf值＝0.76)、瓊脂四糖(Rf值＝0.50)和瓊脂己糖(Rf值＝0.33)以及兩種新瓊脂寡糖即新瓊脂四糖(Rf值＝0.59)和新瓊脂己糖(Rf值＝0.41)用作對照。結果，用苔黑酚-硫酸，在對應於用瓊脂糖酶I獲得的反應產物的新瓊脂寡糖的位置上，觀測到顯色物質。在對應於用瓊脂糖酶II獲得的反應產物的瓊脂寡糖的位置上，觀測到顯色物質。這些結果表明，瓊脂糖酶I是一種水解瓊脂糖分子中D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵產生新瓊脂寡糖的β-瓊脂糖酶，而瓊脂糖酶II是一種水解瓊脂糖分子中的α-1，3鍵產生瓊脂寡糖的α-瓊脂糖酶。
將瓊脂糖酶I溶液和瓊脂糖酶II溶液對無鈣緩衝液(含有10mM氯化鈉和1mM EDTA的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2))透析過夜。向其中加入在含有10mM氯化鈉和1mM EDTA的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2)中含有0.2％(w/v)濃度的瓊脂糖的溶液。讓混合物於50℃反應10分鐘。通過在沸水中加熱1分鐘(就瓊脂糖酶I而言)或於75℃加熱1分鐘(就瓊脂糖酶II而言)終止反應。然後，測量活性。將用含鈣的常規緩衝液進行反應時所觀測到的活性定義為100％。結果，瓊脂糖酶I和瓊脂糖酶II分別表現出約100％和約60％的其活性。
酶失活受到抑制並且對於瓊脂糖酶I和瓊脂糖酶II而言反應容易進行的溫度分別是50-65℃和45-55℃。
將所述酶溶液於48℃、50℃、55℃、60℃或65℃加熱給定時間。然後，向所述經加熱的溶液中加入在含有10mM氯化鈉的20mMTris-HCl緩衝液(pH7.2)(就瓊脂糖酶I而言)中或者在含有10mM氯化鈣和10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2)(就瓊脂糖酶II而言)中含有0.2％(w/v)濃度的瓊脂糖的溶液。讓混合物於50℃反應10分鐘。通過在沸水中加熱1分鐘(就瓊脂糖酶I而言)或於75℃加熱1分鐘(就瓊脂糖酶II而言)終止反應。然後，測量活性。將於50℃常規反應10分鐘時所觀測到的活性定義為100％。結果，瓊脂糖酶I在於65℃處理60分鐘之後表現出其活性的約85％，瓊脂糖酶II在於55℃處理10分鐘後表現出其活性的約40％。
用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳測定分子量。依照常規方法，用含有SDS的10-20％聚丙烯醯胺梯度凝膠和分子量標記(Bio-Rad，肌球蛋白(MW 200,000)、β-半乳糖苷酶(MW 116,250)、磷酸化酶b(MW97,400)、牛血清白蛋白(MW 66,200)、卵清蛋白(MW 45,000)、碳酸酐酶(MW 31,000)、胰蛋白酶抑制劑(MW 21,500)、溶菌酶(MW 14,400))，進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳。根據遷移率測定，瓊脂糖酶I和瓊脂糖酶II的分子量分別為約48,000和約117,000。
依照Edman降解法，測定瓊脂糖I和瓊脂糖酶II的氨基末端胺基酸序列。用10-20％聚丙烯醯胺梯度凝膠，對含有對應於約10pmol酶蛋白的瓊脂糖酶I或瓊脂糖酶II的純化酶製劑溶液進行SDS-PAGE。電泳後，將凝膠上分離的酶轉印到膜ProBlot(Applied Biosystems)。用蛋白測序儀G1000A(Hewlett Packard)，分析所述膜中已經吸附有所述酶的部分。結果，所測定的瓊脂糖酶I的氨基末端胺基酸序列(P1；SEQID NO1)和瓊脂糖酶II的氨基末端胺基酸序列(P2；SEQ ID NO2)分別為Ala-Asp-Xaa-Asp-Gly-Val-Pro-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly和Glu-Thr-Ile-Val-Leu-Gln-Ala-Glu-Ser-Phe。
用2mmol純化的瓊脂糖酶I或II，進行半胱氨酸殘基的羧甲基化。用HPLC從通過用賴氨醯內肽酶消化所獲得的消化產物中，分離和純化肽片段。對於所述柱使用μBondasphare C8(Waters)，用溶液A(0.1％TFA)和溶液B(含0.1％TFA的80％乙腈)進行洗脫。通過將溶液B的比率在50分鐘內以線性方式從0％提高至100％，以0.5ml/分鐘的流速進行洗脫。於214nm進行檢測，以便收集流分。對相應的肽流分進行胺基酸序列分析。對於瓊脂糖酶I，測定部分胺基酸序列PI3(SEQ IDNO3)和PI4(SEQ ID NO4)。對於瓊脂糖酶II，測定部分胺基酸序列PII5(SEQ ID NO5)、PII6(SEQ ID NO6)和PII7(SEQ ID NO7)。
實施例4瓊脂寡糖的生產向2ml反應用緩衝液(含有10mM氯化鈣和10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2))中加入Agarose LO3，終濃度為1.0％(w/v)。再向其中加入約1.0U瓊脂糖酶II的純化製劑。讓混合物於50℃反應16小時。反應後，反應混合物通過0.22μm濾膜(Millipore)過濾。用高效液相色譜，在與實施例1中測量本發明所述酶的活性所用條件相同的條件下，分析經過濾的反應混合物，以測定所產生的瓊脂寡糖。結果，在反應混合物中檢測到瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖。因此，證明上述酶促反應產生這些較小的瓊脂寡糖。
實施例5新瓊脂寡糖的生產向2ml反應用緩衝液(含有10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2))中加入Agarose LO3，終濃度為1.0％(w/v)。再向其中加入約1.0U瓊脂糖酶I的純化製劑。讓混合物於65℃反應16小時。反應後，反應混合物通過0.22μm濾膜(Millipore)過濾。用高效液相色譜，在與實施例1中測量本發明所述酶的活性所用條件相同的條件下，分析經過濾的反應混合物，以測定所產生的新瓊脂寡糖。結果，在反應混合物中檢測到新瓊脂四糖和新瓊脂己糖。因此，證明上述酶促反應產生這些較小的新瓊脂寡糖。
實施例6用瓊脂糖酶I從瓊脂糖凝膠中回收核酸用1μg DNA分子量標記-λHindIII(Takara Shuzo)在1.0％(w/v)SeaPlaque GTG瓊脂糖凝膠上進行電泳。切割含有分離的大小約4.4kbp和約6.6kbp的DNA片段的凝膠，將其置於1.5ml Eppendorf管中。向其中加入1ml反應緩衝液(含50mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2))。讓混合物於室溫靜置10分鐘。然後棄去緩衝液，將凝膠留在管中。將管於67℃保溫5分鐘，以熔化凝膠。向其中加入1.0U純化的瓊脂糖酶I。將混合物於室溫保溫10分鐘。將Eppendorf管置於冰上，以證實瓊脂糖酶凝膠完全溶解。然後依照常規方法進行乙醇沉澱，回收所述DNA片段。同樣，對DNA分子量標記-100bp分子量梯式標記(Ladder Marker)(Takara Shuzo)進行從3.0％(w/v)NuSieveGTG瓊脂糖凝膠回收DNA。在這種情況下，回收了400bp和500bp的DNA片段。所述DNA回收率與Pseudoaltermonas atlantica(TakaraShuzo)來源的市售β-瓊脂糖酶的回收率的比較結果示於表2中。
如果使用所述市售β-瓊脂糖酶，則在加入所述酶之前，應該將溫度從熔化瓊脂糖凝膠所用的溫度降至所述酶可以作用的溫度。由於反應溫度低，因此需要的反應時間長，延長所述程序所用的時間。
另一方面，如果使用本發明的瓊脂糖酶I，則可以在熔化瓊脂糖凝膠之後立即加入所述酶。由於反應可以在高溫下進行而無需降低溫度，所以所述程序僅需要短時間。
表2回收率(％)*標記 所回收的DNA 瓊脂糖酶Iβ-瓊脂糖酶片段的大小(市售的)λ-HindIII 4.4kbp 78 516.6kbp 86 55100bp分子量梯 400bp84 32500bp81 45所需時間**約30分鐘 約3小時*DNA回收量/DNA上樣量×100。
**直至乙醇沉澱所需的時間。
實施例7從NAB2-1-1製備染色體DNA製備1升人工海水(商品名Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入濃度分別為0.3％(w/v)和0.02％(w/v)的蛋白腖(Difco)和酵母膏(Difco)。然後用3M碳酸鈉將pH調至7.8。向其中加入0.1％(w/v)濃度的瓊脂(Nacalai Tesque)。用高壓滅菌器將混合物滅菌。將10μl產瓊脂糖酶的菌株NAB2-1-1的甘油儲液接種到2ml所述培養基中，於37℃培養過夜。將1ml所述培養物接種到100ml同一種培養基中，於37℃培養過夜。以8,000×g離心10分鐘收集細胞。將細胞懸浮於10ml緩衝液A(含有100mM NaCl和10mM EDTA(pH8.0)的100mMTris-HCl緩衝液(pH8.0))中。向其中加入0.25ml的溶菌酶溶液(20mg/ml)。讓混合物於37℃保溫1小時。然後向其中加入含有5.0％濃度的SDS的2.5ml緩衝液A。讓所得混合物於60℃在振蕩下保溫20分鐘。向其中加入1.5ml蛋白酶K溶液(20mg/ml)。讓混合物於37℃保溫過夜。然後向混合物中加入幾乎等體積的苯酚，將所得的混合物於室溫溫和振蕩約10分鐘。將混合物以2,000×g離心10分鐘。將上清液轉移到冷乙醇中。用玻璃棒纏繞染色體DNA。向從中纏繞了染色體DNA的溶液中加入幾乎等體積的苯酚，進行同樣的程序，以再次纏繞染色體DNA。將染色體DNA懸浮於10μl緩衝液A中。向其中加入50μl RNA酶A溶液(10mg/ml)，讓混合物於37℃保溫10分鐘。通過乙醇沉澱從溶液中回收染色體DNA，將其懸浮於5ml緩衝液B(含有140mM NaCl和1mM EDTA(pH7.5)的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5))中。將懸浮液對同一種緩衝液透析過夜。則獲得約5.0mg染色體DNA。根據OD260nm/280nm，測定所述DNA的純度。在每種情況下所述數值都是約1.8。用所述染色體DNA如下所述克隆瓊脂糖酶I和瓊脂糖酶II。
實施例8瓊脂糖酶I基因的克隆依然實施例3中所述測定的瓊脂糖酶I的N末端胺基酸序列P1(SEQ ID NO1)，設計混合引物1和2(SEQ ID NO8和9)，用DNA合成儀合成，並進行純化。具體地說，SEQ ID NO8和9所示的混合引物1和2分別對應於胺基酸序列P1中第4-10號和第4-13號胺基酸的胺基酸序列。用這些引物和LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)進行所述瓊脂糖酶I基因的克隆。
如下進行初次PCR。在實施例7中製備的染色體DNA用限制性酶BamHI完全消化。用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo)，將BamHI連接物連接到所述經消化的DNA的末端。將其一部分置於0.5ml PCR用試管中。向其中加入5μl 10×LA PCR緩衝液、8μl dNTP混合物、1μl混合引物1、1μl引物C1(LA PCR體外克隆試劑盒(TaKaRa Shuzo)所附的引物)、0.5μl TaKaRa LA Taq和無菌水至50μl。在溶液上鋪上50μl礦物油之後，用自動基因擴增儀器熱循環儀(Takara Shuzo)使所述試管進行反應。於94℃變性2分鐘之後，進行30個循環的PCR。每個循環由94℃變性1分鐘、引物於50℃退火2分鐘和於72℃合成反應2分鐘組成。
接著，用所述反應混合物作為模板進行二次PCR。除用通過初次PCR獲得的1μl反應混合物作為模板以及使用混合引物2和引物C2(LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)所附的引物)組合之外，在與初次PCR所用條件相同的條件下進行PCR。在PCR之後，除去礦物油上層，用5μl反應混合物在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳，然後所述DNA用溴化乙錠染色，以證實擴增產物。結果，觀察到約0.8kb的DNA片段。所述DNA片段被命名為βN。
將從瓊脂糖凝膠上切取的擴增片段βN與載體pT7Blue連接，用來轉化大腸桿菌JM109。依照雙脫氧鏈終止法，用轉化子測定擴增片段βN的所述末端區的核苷酸序列。根據所述N末端區的序列，設計引物3和4(SEQ ID NO10和11)。根據除所述N末端區之外的末端區的序列，設計引物5和6(SEQ ID NO12和13)。用DNA合成儀合成所述引物，然後純化。運用這些引物和LA PCR體外克隆試劑盒(TakaraShuzo)，以相似的方式克隆βN上遊和下遊的DNA片段。在這種情況下，引物於55℃退火1分鐘。
對於上遊區，用引物3和4獲得約0.6kb的DNA片段，將其命名為βUN。對於βN下遊的區，用引物5和6獲得約1.3kb的DNA片段，將其命名為βC。將βUN和βC兩者與載體pT7Blue(Novagen)連接。依照雙脫氧鏈終止法，測定核苷酸序列。分析DNA片段βN、βUN和βC的核苷酸序列，並進行序列比對。結果發現一個編碼由438個胺基酸構成的蛋白的ORF。
所述ORF的核苷酸序列和由所述ORF的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO20和22。發現在βUN中，存在一個胺基酸序列P1的核苷酸序列、一個編碼胺基酸序列P1上遊的20個胺基酸的核苷酸序列和更上遊區中的一個SD樣序列。
在實施例3中測定的N末端胺基酸序列P1對應於SEQ ID NO22中第21-33號胺基酸的序列。在實施例3中測定的部分胺基酸序列PI3(SEQ ID NO3)和PI4(SEQ ID NO4)分別與SEQ ID NO22中的第265-272號胺基酸和第367-376號胺基酸的序列匹配。
實施例9瓊脂糖酶II基因的克隆根據如實施例3中所述測定的瓊脂糖酶II的N末端胺基酸序列P2(SEQ ID NO2)和PII6(SEQ ID NO6)，設計混合引物7和8(SEQ IDNO14和15)。它們與相互不同的鏈雜交。用DNA合成儀合成所述混合引物，並進行純化。
具體地說，SEQ ID NO14所示的混合引物7對應於胺基酸序列P2的第1-8號胺基酸，SEQ ID NO15所示的混合引物8對應於編碼胺基酸序列PII6中第2-10號胺基酸的DNA的互補鏈。
用這些引物和LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)進行所述瓊脂糖酶II基因的克隆。
如下進行初次PCR。將在實施例7中製備的10ng NAB2-1-1染色體DNA置於0.5ml PCR用試管中。向其中加入5μl 10×LA PCR緩衝液、8μl dNTP混合物、混合引物7和8各40pmol、0.5μl TaKaRa LATaq和無菌水至50μl。在溶液上鋪上50μl礦物油之後，用自動基因擴增儀器熱循環儀(Takara Shuzo)使所述試管進行反應。於94℃變性2分鐘之後，進行30個循環的PCR。每個循環由94℃變性1分鐘、引物於50℃退火2分鐘和於72℃合成反應2分鐘組成。除去礦物油上層，用5μl反應混合物在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳，然後所述DNA用溴化乙錠染色，以證實擴增產物。結果，觀察到約600bp的DNA片段。所述DNA片段被命名為αN。
將從瓊脂糖凝膠上切取的擴增片段αN與載體pT7Blue連接，用來轉化大腸桿菌JM109。依照雙脫氧鏈終止法，用轉化子測定擴增片段αN的所述末端區的核苷酸序列。根據N末端區的序列，設計引物9和10(SEQ ID NO16和17)。根據除所述N末端區之外的末端區的序列，設計引物11和12(SEQ ID NO18和19)。用DNA合成儀合成所述引物，然後純化。運用這些引物和LA PCR體外克隆試劑盒(TakaraShuzo)，以相似的方式克隆αN上遊和下遊的DNA片段。
在這種情況下，如下進行PCR。在實施例7中製備的NAB2-1-1染色體DNA用限制性酶BamHI完全消化。用DNA連接試劑盒(TakaraShuzo)，將BamHI連接物連接到所述經消化的DNA的末端。將其一部分置於0.5ml PCR用試管中。向其中加入5μl 10×LA PCR緩衝液、8μl dNTP混合物、1μl混合引物9、1μl引物C1、0.5μl TaKaRa LA Taq和無菌水至50μl。在溶液上鋪上50μl礦物油之後，用自動基因擴增儀器熱循環儀(Takara Shuzo)使所述試管進行反應。於94℃變性2分鐘之後，進行30個循環的PCR。每個循環由94℃變性1分鐘、引物於50℃退火2分鐘和於72℃合成反應3分鐘組成。
接著，用所述反應混合物作為模板進行二次PCR。除用通過初次PCR獲得的1μl反應混合物作為模板以及使用引物10和引物C2組合之外，在與初次PCR所用條件相同的條件下進行PCR。除去礦物油上層，用5μl反應混合物在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳，然後所述DNA用溴化乙錠染色，以證實擴增產物。結果，觀察到約500bp的DNA片段。所述DNA片段被命名為αUN。
同樣，用引物11和12獲得αN下遊的約2kb的DNA片段，將其命名為αC。將αUN和αC兩者與載體pT7Blue(Novagen)連接。依照雙脫氧鏈終止法，測定核苷酸序列。分析DNA片段αN、αUN和αC的核苷酸序列，並進行序列比對。結果發現一個編碼由1089個胺基酸構成的蛋白的ORF。
所述ORF的核苷酸序列和由所述ORF的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO21和23。發現在αUN中，存在一個胺基酸序列P2的核苷酸序列、一個編碼胺基酸序列P2上遊的具有信號肽樣序列的26個胺基酸的核苷酸序列和更上遊區中的一個SD樣序列。
所述胺基酸序列P2對應於SEQ ID NO23中第27-36號胺基酸的序列。在實施例3中測定的部分胺基酸序列PII5(SEQ ID NO5)、PII6(SEQ ID NO6)和PII7(SEQ ID NO7)分別與SEQ ID NO23中的第129-138號胺基酸、第640-649號胺基酸和第738-747號胺基酸的序列匹配。
此外，發現三個推定的鈣結合區(SEQ ID NO23中的171-184、271-283和987-999)。
實施例10瓊脂糖酶I表達用質粒的構建引物13(SEQ ID NO24)是一種合成DNA，它在第12-17號核苷酸處具有一個限制性酶EcoRI的識別序列，在第19-38號核苷酸處具有一個對應於SEQ ID NO22的胺基酸序列中第21-27號胺基酸的核苷酸序列。用引物13和引物14(SEQ ID NO25)如下進行PCR，引物14在第11-16號核苷酸處具有一個限制性酶PstI的識別序列，並且與染色體上的瓊脂糖酶I讀框下遊約300bp的部分互補的鏈雜交。向0.5mlPCR用試管中，加入引物13和14各10pmol、10ng作為模板的得自NAB2-1-1的染色體DNA、5μl 10×ExTaq緩衝液、8μl dNTP混合物、0.5μl TaKaRa ExTaq和無菌水至50μl。將試管置於自動基因擴增儀器熱循環儀(Takara Shuzo)中。於94℃變性2分鐘之後，進行25個循環的PCR。每個循環由94℃1分鐘、55℃2分鐘和72℃2分鐘組成。通過乙醇沉澱將PCR產物濃縮和脫鹽，用限制性酶EcoRI(Takara Shuzo)和PstI(Takara Shuzo)雙重消化，然後在1.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。對EcoRI-PstI消化物進行提取和純化。將經純化的產物與已經用相同酶消化的pUC18(Takara Shuzo)混合，用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo)進行連接。用10μl連接混合物轉化大腸桿菌JM109。讓轉化子在含有濃度為1.5％(w/v)的瓊脂和濃度為50μg/ml氨苄青黴素的LB培養基上生長。從白色菌落製備質粒，進行DNA測序。選擇正確插入所述PCR產物的質粒，將其命名為pNB101。pNB101是一種編碼瓊脂糖酶I的胺基酸序列(SEQ ID NO22)中第21-437號胺基酸的胺基酸序列的質粒。用質粒pNB101轉化的大腸桿菌被命名為大腸桿菌JM109/pNB101，於2001年1月10日(原始保藏日)保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心(International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higasshi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan)，保藏號為FERM BP-7854。
將導入了pNB101的轉化子接種到含有50μg/ml氨苄青黴素的2.5ml LB肉湯中，於37℃培養過夜。將一部分培養物接種到2.5ml相同的新鮮培養基中，於37℃培養直至其達到指數生長期。此時，向其中加入IPTG，終濃度為1.0mM。再於20℃繼續培養2小時，以誘導所述目標蛋白的表達。然後離心收集細胞，將其重懸於150μl細胞破碎溶液(含有10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2))中。通過超聲處理破碎細胞。通過離心將作為上清液的提取物和沉澱相互分離，用作用瓊脂糖作為底物測量β-瓊脂糖酶活性用的樣品。然後，觀察作為上清液的提取物的活性。在100ml所述培養物中所含有的活性為野生型菌株NAB2-1-1的活性的約25倍。
實施例11利用pET16b的瓊脂糖酶I的表達系統用引物15(SEQ ID NO26)和引物16(SEQ ID NO27)，用NAB2-1-1染色體DNA作為模板，在實施例10中所述的條件下進行PCR。引物15是一種在第20-39號核苷酸處具有一個對應於瓊脂糖酶I胺基酸序列(SEQ ID NO22)中第21-27號胺基酸的核苷酸序列以及在第14-19號核苷酸處具有一個限制性酶NdeI的識別序列的引物。引物16是一種在第12-17號核苷酸處具有一個限制性酶XhoI的識別序列並且與染色體上瓊脂糖酶I讀框下遊約300bp的一個部分互補的鏈雜交的引物。通過乙醇沉澱濃縮所述擴增片段，用NdeI(Takara Shuzo)和XhoI(Takara Shuzo)消化，進行提取和純化。將所述產物與已經用相同的酶消化的pET16b(Takara Shuzo)連接。所得的質粒被命名為pNB201。pNB201是一種編碼瓊脂糖酶I胺基酸序列(SEQ ID NO22)中第21-437號胺基酸的胺基酸序列的質粒。
用pNB201轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，用所得的轉化子，如以上實施例10中所述測定β-瓊脂糖酶活性。然後，觀察所述提取物的活性。在100ml所述培養物中所含有的活性約NAB2-1-1的活性的約50倍。
實施例12瓊脂糖酶II表達用質粒的構建引物17(SEQ ID NO28)是一種合成DNA，它在第10-15號核苷酸處具有一個限制性酶EcoRI的識別序列，在第17-37號核苷酸處具有一個對應於瓊脂糖酶II胺基酸序列(SEQ ID NO23)中第27-33號胺基酸的核苷酸序列。用引物17和引物18(SEQ ID NO29)如下進行PCR，引物18在第11-16號核苷酸處具有一個限制性酶BamHI的識別序列，並且與染色體上的瓊脂糖酶II讀框下遊約250bp的部分雜交。在採用ExTaq的反應系統(Takara Shuzo)中，使用引物17和18各10pmol以及10ng得自野生型菌株NAB2-1-1的染色體DNA作為模板進行PCR。於94℃變性2分鐘之後，進行30個循環的PCR。每個循環由94℃1分鐘、50℃2分鐘和72℃3分鐘組成。通過乙醇沉澱濃縮PCR產物，用限制性酶EcoRI(Takara Shuzo)和BamHI(Takara Shuzo)雙重消化，然後在1.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。對EcoRI-BamHI消化物進行提取和純化。如實施例10中所述，用pUC18構建雜種質粒，用其轉化大腸桿菌JM109。所述雜種質粒被命名為pNA101。pNB101是一種編碼瓊脂糖酶II的胺基酸序列(SEQ ID NO23)中第27-1089號胺基酸的胺基酸序列的質粒。
用質粒pNA101轉化的大腸桿菌被命名為大腸桿菌JM109/pNA101，於2001年1月10日(原始保藏日)保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心(International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan)，保藏號為FERM BP-7853。
除了在細胞破碎產物中包含10mM氯化鈣之外，如實施例10中所述，對導入了pNA101的轉化子測定α-瓊脂糖酶活性。觀察所述提取物的活性。在100ml所述培養物中所含有的活性為野生型菌株NAB2-1-1的活性的約15倍。
實施例13具有缺失的瓊脂糖酶II蛋白的活性如下所述，通過基因工程製備經修飾的蛋白。測定所述經修飾的蛋白的α-瓊脂糖酶活性。
引物19(SEQ ID NO30)是一種在第19-40號核苷酸處具有一個對應於瓊脂糖酶II胺基酸序列(SEQ ID NO23)中第181-188號胺基酸的核苷酸序列且在第12-17號核苷酸處具有一個限制性酶EcoRI的識別序列的引物。
用引物19和引物18(SEQ ID NO29)以及用NAB2-1-1的染色體DNA作為模板進行PCR。將產物與pUC18連接，如實施例12中所述轉化大腸桿菌JM109。通過證實連接位點的DNA序列而獲得的雜種質粒被命名為pNA201d。從pNA201d表達的蛋白是其中瓊脂糖酶II胺基酸序列(SEQ ID NO23)中直至第180號胺基酸的部分缺失的蛋白。換句話說，pNA201d是一種編碼瓊脂糖酶II的胺基酸序列(SEQ IDNO23)中第181-1089號胺基酸的胺基酸序列的質粒。在用IPTG誘導表達之後，如實施例10中所述進行活性的測量，只是在所述細胞破碎產物中包含10mM氯化鈣。觀察所述提取物的α-瓊脂糖酶活性。在100ml所述培養物中所含有的活性為NAB2-1-1的活性的約2倍。
引物20(SEQ ID NO31)在第19-40號核苷酸處具有一個對應於瓊脂糖酶II胺基酸序列(SEQ ID NO23)中第318-325號胺基酸的核苷酸序列，且在第12-17號核苷酸處具有一個限制性酶EcoRI的識別序列。用引物20和引物18(SEQ ID NO29)以及用NAB2-1-1的染色體DNA作為模板進行PCR，用pUC18構建一個雜種質粒-pNA301d。從導入了pNA301d的大腸桿菌JM109表達了一種其中瓊脂糖酶II胺基酸序列(SEQ ID NO23)中直至第317號胺基酸的肽缺失的蛋白。換句話說，pNA301d是一種編碼瓊脂糖酶II的胺基酸序列(SEQ ID NO23)中第318-1089號胺基酸的胺基酸序列的質粒。如實施例10中所述進行活性的測量，只是在所述細胞破碎產物中包含10mM氯化鈣。觀察所述提取物的α-瓊脂糖酶活性。在100ml所述培養物中所含有的活性為NAB2-1-1的活性的約15倍。此外，得自導入了pNA301d的轉化子的提取物，對無鈣緩衝液(含有10mM氯化鈉和1mM EDTA(pH7.2)的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2))透析，然後與在含有10mM氯化鈉和1mM EDTA(pH7.2)的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2)含有0.2％濃度的瓊脂糖的溶液反應。結果觀察到與用含鈣緩衝液所觀察到的活性相似的消化活性。
實施例14與AgarACE酶(Promega)的比較[最適溫度]將本發明的瓊脂糖酶I的酶學特性與Promega出售的海洋黃桿菌來源的β-瓊脂糖酶-AgarACE酶的所述特性進行比較。
向通過在20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.3)中加熱溶解的40μl 1.0％(w/v)NuSieve GTG Agarose(FMC)中，加入10μl瓊脂糖酶I或AgarACE酶(Promega；依照所附的數據單，相當於0.29單位)。讓混合物於45℃、50℃、55℃、60℃或65℃反應10分鐘。依照實施例1中所述的方法，預先測量兩種酶的活性。然後，加入所述酶，使得在各個反應中包括相同的酶活性。反應後，如實施例1中所述計算酶活性。將最高酶活性定義為100％，以相對值表示的結果示於表3中。由所述結果可見，瓊脂糖酶I的最適溫度是50-65℃，而AgarACE酶的最適溫度是45-50℃。
表3相對活性(％)45℃50℃55℃60℃65℃70℃瓊脂糖酶I89 97 100 100 100 95AgarACE 100 98 84 25 11 0[熱穩定性]將10μl瓊脂糖酶I或AgarACE酶(依照所附的數據單，相當於0.29單位)於60℃或65℃保溫給定的時間，然後加入到通過在20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.3)中加熱溶解的40μl 1.0％(w/v)NuSieve GTGAgarose(FMC)中。如上所述，加入所述酶，使得在各個反應中包括相同的酶活性。讓混合物於55℃反應10分鐘(就瓊脂糖酶I而言)或於45℃反應10分鐘(就AgarACE酶而言)。如實施例1中所述計算酶活性。將未經加熱而觀測到的所述活性定義為100％，以相對值表示的結果示於表4中。由所述結果可見，幾乎100％的瓊脂糖酶I活性在於65℃保溫10分鐘後得以保留，而AgarACE酶在於65℃保溫10分鐘後完全被失活。
表4殘留活性(％)保溫時間(min) 010 20 30瓊脂糖酶I(60℃) 100 100100 98(65℃) 100 10095 90AgarACE(60℃) 100 81 48 21(65℃) 100 3 00實施例15鈣引起的酶熱穩定性的改變將用pNA101(實施例11)或pNA301d(實施例13)轉化的大腸桿菌JM109接種到含有50μg/ml氨苄青黴素的2.5ml LB肉湯中，於37℃培養過夜。將一部分培養物接種到100ml相同培養基中，於37℃培養直至其達到指數生長期。此時，向其中加入IPTG，終濃度為1.0mM。再於20℃繼續培養2小時，以誘導所述目標蛋白的表達。然後離心收集細胞，將其懸浮於5ml細胞破碎溶液(含有10mM氯化鈉和1mM氯化鈣的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2))中。通過超聲處理破碎細胞。通過離心收集上清液。測量上清液中的α-瓊脂糖酶活性。用細胞破碎溶液稀釋上清液，使得在單位體積的每種樣品中含有相同的酶活性。將如此獲得的每種酶的提取物對含鈣的緩衝液A(含有10mM氯化鈉和10mM氯化鈣的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2))或者不含鈣的緩衝液B(含有10mM氯化鈉和1mM EDTA(pH7.2)的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2))透析過夜。將20μl所述酶溶液於55℃或50℃保溫10分鐘，然後與180μl在含10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2)中含有0.2％濃度的瓊脂糖的溶液反應。依照實施例1中所述的方法，測定殘留的α-瓊脂糖酶活性。結果示於表5中。
用得自NAB2-1-1的天然瓊脂糖酶II作為對照。
表5殘留活性(％)*處理溫度 50℃ 55℃緩衝液A B A B天然瓊脂糖酶II100564210pNA101100604515pNA301d 100587012*每種酶在緩衝液A中於50℃處理後的殘留活性被定義為100。
實施例16具有缺失的瓊脂糖酶II蛋白的活性如下所述，通過基因工程製備經修飾的蛋白。測定所述經修飾的蛋白的α-瓊脂糖酶活性。
引物21(SEQ ID NO34)在第19-40號核苷酸處具有一個對應於瓊脂糖酶II胺基酸序列(SEQ ID NO23)中第290-297號胺基酸的核苷酸序列，且在第12-17號核苷酸處具有一個限制性酶EcoRI的識別序列。
用引物21和引物18(SEQ ID NO29)以及用NAB2-1-1的染色體DNA作為模板進行PCR，將產物與pUC18連接，如實施例12中所述轉化大腸桿菌JM109。通過證實連接位點的DNA序列而獲得的雜種質粒被命名為pNA401d。從pNA401d表達的蛋白是其中瓊脂糖酶II胺基酸序列(SEQ ID NO23)中直至第289號胺基酸的部分缺失的蛋白。換句話說，pNA401d是一種編碼瓊脂糖酶II的胺基酸序列(SEQ IDNO23)中第290-1089號胺基酸的胺基酸序列的質粒。將用實施例13中獲得的pNA301d或如上所述獲得的pNA401d轉化的大腸桿菌JM109，接種到含有50μg/ml氨苄青黴素的2.5ml LB肉湯中，於37℃培養過夜。將一部分培養物接種到100ml相同培養基中，於37℃培養直至其達到指數生長期。此時，向其中加入IPTG，終濃度為1.0mM。再於20℃繼續培養2小時，以誘導所述目標蛋白的表達。然後離心收集細胞，將其懸浮於5ml細胞破碎溶液(含有10mM氯化鈉和1mM氯化鈣的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2))中。通過超聲處理破碎細胞。通過離心收集上清液。測量上清液中的α-瓊脂糖酶活性。用細胞破碎溶液稀釋上清液，使得在單位體積的每種樣品中含有相同的酶活性。將20μl所述酶溶液於55℃或60℃保溫10分鐘，然後與180μl在含10mM氯化鈉的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2)中含有0.2％濃度的瓊脂糖的溶液反應。依照實施例1中所述的方法，測定殘留的α-瓊脂糖酶活性。結果示於表6中。這些結果表明，pNA401d的產物的熱穩定性等於或高於pNA301d的熱穩定性。
用得自NAB2-1-1的天然瓊脂糖酶II作為對照。
表6殘留活性(％)*處理溫度 55℃ 60℃天然瓊脂糖酶II 42 0PNA301d 70 31PNA401d 79 39*每種酶於50℃處理後的殘留活性被定義為100。
此外，在用IPTG於37℃誘導過夜後，通過離心收集上清液，然後如上所述通過超聲處理破碎細胞。定量測定上清液的蛋白含量。對上清液進行SDS-PAGE，使得蛋白的上樣量相同。另外，將收集上清液時獲得的沉澱懸浮於細胞破碎溶液中，以相似的方式進行SDS-PAGE。結果發現，經過誘導的用pNA401d獲得的上清液中目標蛋白的量高於用天然型或pNA301d獲得的上清液中的目標蛋白的量。因此，表明通過誘導從用pNA401d轉化的大腸桿菌JM109表達的突變型α-瓊脂糖酶容易被溶解。
工業應用性本發明提供了新型瓊脂糖酶。本發明的瓊脂糖酶的最適溫度高於常規瓊脂糖酶的最適溫度，並且所述瓊脂糖酶的熱穩定性非常好。因此，它可以用來在高溫下進行反應。因而，本發明的瓊脂糖酶非常有效，因為它能夠使反應在存在高濃度瓊脂糖時在不固化的情況下反應。
利用本發明的瓊脂糖酶，可以有效地從瓊脂糖直接有效地生產具有低聚合度、在其還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖的瓊脂寡糖(例如瓊脂二糖和瓊脂四糖)或者在其非還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖的新瓊脂寡糖(例如新瓊脂二糖和新瓊脂四糖)。
利用本發明的瓊脂糖酶，可以從瓊脂糖凝膠中有效地提取核酸等。
用本發明的瓊脂糖酶生產的瓊脂寡糖具有生理活性，例如細胞凋亡誘導活性、制癌活性、各種抗氧化活性、免疫調節活性和抗變態反應活性。因此，它們可用於藥用組合物、食品和飲料領域。
本發明首次公開了所述瓊脂糖酶的胺基酸序列和核苷酸序列。因此，有可能提供具有瓊脂糖酶活性的多肽的編碼基因。本發明也提供一種用於利用所述基因通過基因工程生產具有瓊脂糖酶活性的多肽的工業上有利的方法。
此外，在利用所述基因通過基因工程的所述生產方法中，並不需要向培養基中加入瓊脂糖來誘導所述瓊脂糖酶的產生。因此，認為在培養時節省了工作量，並且容易純化所述酶。
另外，基於本發明首次提供所述瓊脂糖酶基因這一事實，本發明基於所述基因的信息，提供了由所述基因編碼的重組多肽、與所述多肽或其片段特異性結合的抗體、以及與所述瓊脂糖酶特異性雜交的探針或引物。
序列表的獨立文本SEQ ID NO1瓊脂糖酶I的N末端胺基酸序列。
SEQ ID NO2瓊脂糖酶II的N末端胺基酸序列。
SEQ ID NO3瓊脂糖酶I的部分胺基酸序列。
SEQ ID NO4瓊脂糖酶I的部分胺基酸序列。
SEQ ID NO5瓊脂糖酶II的部分胺基酸序列。
SEQ ID NO6瓊脂糖酶II的部分胺基酸序列。
SEQ ID NO7瓊脂糖酶II的部分胺基酸序列。
SEQ ID NO8PCR引物1SEQ ID NO9PCR引物2SEQ ID NO10PCR引物3SEQ ID NO11PCR引物4SEQ ID NO12PCR引物5SEQ ID NO13PCR引物6SEQ ID NO14PCR引物7SEQ ID NO15PCR引物8SEQ ID NO16PCR引物9SEQ ID NO17PCR引物10SEQ ID NO18PCR引物11SEQ ID NO19PCR引物12SEQ ID NO20瓊脂糖酶I中ORF的核苷酸序列。
SEQ ID NO21瓊脂糖酶II中ORF的核苷酸序列。
SEQ ID NO22瓊脂糖酶I的胺基酸序列。
SEQ ID NO23瓊脂糖酶II的胺基酸序列。
SEQ ID NO24PCR引物13SEQ ID NO25PCR引物14SEQ ID NO26PCR引物15SEQ ID NO27PCR引物16
SEQ ID NO28PCR引物17SEQ ID NO29PCR引物18SEQ ID NO30PCR引物19SEQ ID NO31PCR引物20SEQ ID NO32設計的寡核苷酸引物，用於從16S核糖體擴增DNA片段SEQ ID NO33設計的寡核苷酸引物，用於從16S核糖體擴增DNA片段SEQ ID NO34PCR引物21
序列表110寶酒造株式會社(Takara Shuzo Co.，Ltd.)120瓊脂糖酶及其基因130663033150JP 2001-0523151512001-02-27150JP 2001-3257961512001-10-2416034210121113212PRT213未知220
223瓊脂糖酶I的N末端胺基酸序列4001Ala Asp Xaa Asp Gly Val Pro Ile Pro Ala Pro Ala Gly1 5 10210221110212PRT213未知220
223瓊脂糖酶II的N末端胺基酸序列
4002Glu Thr Ile Val Leu Gln Ala Glu Ser Phe1 5 1021032118212PRT213未知220
223瓊脂糖酶I的部分胺基酸序列4003Pro Thr Pro Ala Glu Leu Ala Asp1 5210421110212PRT213未知220
223瓊脂糖酶I的部分胺基酸序列4004Ala Thr Ser Asn Gly Ala Asn Ile Val Gln1 5 10210521110212PRT213未知220
223瓊脂糖酶II的部分胺基酸序列4005
Pro Ser His Ser Val Thr Leu Pro Ala Gly1 5 10210621110212PRT213未知220
223瓊脂糖酶II的部分胺基酸序列4006Leu Met Phe Asp Thr Gln Thr Asn Ser Thr1 5 10210721110212PRT213未知220
223瓊脂糖酶II的部分胺基酸序列4007Phe Gly Glu Val Leu Asp Tyr Ile Arg Gln1 5 10210821120212DNA213人工序列220
223PCR引物14008gayggngtnc cnathccngc
210921129212DNA213人工序列220
223PCR引物24009gayggngtnc cnathccngc nccngcngg 292101021126212DNA213人工序列220
223PCR引物340010gcattgatat aactatcgtt ccaacg 262101121124212DNA213人工序列220
223PCR引物440011cgtctgatat ggattgcaat tgcc 242101221126212DNA
213人工序列220
223PCR引物540012gccgctgcac attattattg atatgg 262101321125212DNA213人工序列220
223PCR引物640013caacaccagc tgagcttgca gaccc252101421123212DNA213人工序列220
223PCR引物740014garacnathg tnytncargc nga 232101521126212DNA213人工序列220
223PCR引物8
40015gtnswrttng tytgngtrtc raacat 262101621128212DNA213人工序列220
223PCR引物940016ctcaatgtca tattcccccc cttcagcg 282101721129212DNA213人工序列220
223PCR引物1040017cgcgttttgt ccatttacgc tgtatatcg 292101821127212DNA213人工序列220
223PCR引物1140018acccgcagcc gcattatgtg caaacac27
2101921127212DNA213人工序列220
223PCR引物1240019gcatgacctt tatgggttac ttgtcgc27210202111314212DNA213未知220
223瓊脂糖酶I基因中ORF的核苷酸序列40020atgcttcaga aaatcacact atgcgcgtct ctagttttaa ctagtacaac tgtttttgcc 60gcagattggg atggcgtacc aatcccagca ccagcgggtc aaaataaaac ttggcaattg120caatccatat cagacgactt taactacaca gcttcagcaa ataacaaacc aagcgctttt180acaagccgtt ggaacgatag ttatatcaat gcatggaaag ggcctggcga tacagaattt240agctcaggtc actcgtacac aaattcaggt aaactggctt tgcaagcagc tgaaaaacct300ggcacagata aggtttatgc aggtattatt tcttcaaaac aaacattcac ttatccgttg360tatatagaag cacgcgcaaa atcgaccaat aatacgatgg ccaatgcagt ttggatgtta420agtgccgatt caacgcaaga attagatgca atggaagctt acggcagtga tagaccgggc480caagaatggt tcgatcgccg tatgcatgta agccatcacg tatttattcg cgaaccattc540caagactatc aacccaaaga tgcgggttct tggatatata atgaacaagc gccttggcgc600gttgcctatc ataactatgg gatgcattgg aaagatcctt ggaatgttga ttactacata660gatggtgtgc ttgttagaag tgtttccggt caacaaatga tcgatccaca caactacacc720aacggtacgg gtgtaaacaa gccgctgcac attattattg atatggaaca ccaagactgg780cgtgatgtta aaccaacacc agctgagctt gcagaccctg cgagaagtat tttttatgta840gattggatcc gagtatacaa gccaactgat tcagcagctt cagcacccac accccctaca900ggtgcaacat ctcttaaggc tagacatagc aacaaatgct tagatttatc tgctggtaat960tctgcgaatg gtgcaaacat gcaacaatgg aattgcaacg cgacgaacac aaaccaagat 1020
ataacctttg tcgccaaagg tgctggttat tacgaaatga aaaccaaaca caataaatgt1080ttagatgttg cgggtaaagc aaccagcaat ggcgcgaata tagtgcagtg gaattgttac1140aacgggacta accagcaatt taaattacta gacaaaggca atggttggtt ccaactacaa1200gcaaaacata gtggcaagtg tttagaaatt gcaaattctg caaccaccaa tggtgccaac1260gtgcaacagt gggcgtgtgg aaatagcaac aatcagcagt ggaaattcca gtaa 1314210212113270212DNA213未知220
223瓊脂糖酶II基因中ORF的核苷酸序列40021atgtttaaaa ctaaacgttc tctgctgagc tctagtattg cgctttcact ggctttactc 60ggcactaaag cgcatgcaga gactatagtc ttgcaagctg aatcgtttga taactccggc120ggtacgtatg atgacggcca acccaaccct gtcacgatat acagcgtaaa tggacaaaac180gcgattaatt ttgttaacgc gggtgatttt gtcgatttta atattaacgc tgaagggggg240gaatatgaca ttgagtattt agtcggcaca agtgtccaat caggtcctag tattgaagtg300ctcgttaata ctaatggtgc atgggaaagc caaggcacag tcgctgtacc gttaaccagt360tgggacgatt tccagcctct caaacccagc cattccgtaa ctttgccagc aggtgcttca420accattcgtt tgcacgcaat tggttcgact tggcaatgga acatggagtc tttttcttta480acacaagttg taccgcttga gccagaaaca cccgttgatg tagacgatat tgttattaac540ctagaaaact ttatctttac agacaaagaa ggagcagcta tttcaggtga taccatcgtc600ggttttggtg taacaaactc aggtataaat tttaatacgg tcggcgatta tgccgactac680acagtaaact ttactgaagc aggtacatac aacgcgacac tggctgctgg ttcacccatg720acaggtcaaa tcggtgcaca aattatcatg gataattcgg ttgccgcgtc atcgttactt780gcatctacag gtggctggga taattatgtc gactttgatc tcagtggcga cattgttata840ccaacgcccg gtacttacac tgtacgatta caaagttatg gtagcgcgaa ttggcagtgg900aacgcagata cactaacgct tagttatata tctggagaaa ccggcgacgg caatccaagt960ccaccacaag aaggtgattt gattgttgaa ttagaagatt tcgttaatac aggtacaacc 1020ggccgcgttg gaggcgatag cgttgaaggc tttggcgcaa cagcaactgg cgtgaactgg 1080gtgaccaatg gtgattatgg tgactacaac ataacctttg cagagcctgg tacctatcgt 1140gcctttttta cctattcagc cgccagtgca ggtagttacg gcgctcgtgt agatgtaaat 1200ggtgaacccg tagcatgggg ctattttgct gaaacaggca gttgggatgt tgcgtctgaa 1260gttgagcttt atggtggata ctttgttatt gaccaagcag gccaagcgaa tttgcgcgta 1320
gaagcaattg gtggatcaga ttggcagtgg ggcggtgata aactgcggat aacccgtgta1380ggtgatgttt catatgtccc tgaacgtcac tataatccga acgatcacta cgtggaagaa1440gttgaaggac cacaaacaca aattacctat ctaaaaccac caattgacat tcctaccaat1500aaaaaagttc taaaatcaga cgtttggtat acgtatccac aaaaccggga actggaaggt1560tttgatgatt ttggcgcaac tggcgcattc tggggacatc cgccagagca tgatttttat1620gaagaaaccg ttattatgga ttgggcagtc aatgtcgttg atacgttcca aagtgaaggt1680tttgagtata ctgctcgcgg cgaatttgac tggggttatg gttggttcac cgagtacgtg1740acaaacccgc agccgcatta tgtgcaaaca cttgacgatc gcaatgtgcg catgaccttt1800atgggttact tgtcgcacaa cggttataat aacaactggt taagtaatca tagtccagca1860tttgtacctt tcatgaaatc acaggttgat caaatattga aagcgtatcc ggacaagctg1920atgtttgata cacaaaccaa ctcaacccgt tcaaccgaca tgcgtacctt tggtggtgac1980ttctcgccat atgccatgga aaacttccgc atttggttag ataaaaaata cagtagtaac2040gagttggcca atatgggtat taataatatt caaacgtttg attacaaaca gcacttgtta2100aatgccggtg tgacacatca atcattcatg aatgcggcag atacattatc tggaaacgta2160ccattacttg aagatttcat ttattttaat cgtgatgtat ggaaccaaaa atttggtgaa2220gtattagatt atattcgcca gcaacgtcca gacatagaaa ttggtgcgag cacacatttg2280tttgaatctc gtggttatat atttaacgag aatatcacct tcttatcagg tgagctcaac2340ttaggtgcga gaaccactat ctctgaacta ccaacgaata tccttgtaca cttaaaaggg2400gcgcaggcag tagataaaac gttagcatac ttcccgtatc cttgggagtt tgacgaactt2460cgtttgcaag acgcaccgcg ttttggccgt ggttgggtcg cgcaagctta tgcttacggt2520ggtttattct cgattccggc taatgtttgg gttggtggtg aagtttggac ttggtctccg2580ggcgctgata actatcgtga tatttaccag tttgtacgag cgcaagcaga cttgttagac2640ggttatacct catattcaaa agtaggtctt gtgcacgcga tgttctcatc gatgaaagcg2700ggctttattg atgggggtaa ccaaattcaa tcaagcgtta aattactgac tgaagataat2760attaactttg atttattggt gtttggtgat gcgggttatc ctgttgtccc acgagctgaa2820gactttgata aattcgaaca tatcttcttc gatggtgatc aacaatactt aaccgctgaa2880caacaagcta tattagatgc acaaggtagc aaagtaagac acattggcca gcgcggtact2940ttaagcggta tcgaaataga tgtcagtatc aatggtagtg tttctaacga aacagtatct3000gcggtatctc gcattcatga aaccaatgca aatgcgccat atgttgtgca cttggttaat3060cgtccatttg caggcggtgt aacgccaaca ttaaatggcg tagaagtggc aattccgcaa3120ggttatttcc cggatacagt aacatcggcg acattacact taccggatgg taccagtacc3180aacttaagtg tttcgacaaa cgccgaaggt gatgctgtcg ttacggtaaa taacttagaa3240gtttggggta ttttagaatt agcgcactaa 327021022211437212PRT
213未知220
223瓊脂糖酶I的胺基酸序列40022Met Leu Gln Lys Ile Thr Leu Cys Ala Ser Leu Val Leu Thr Ser1 5 10 15Thr Thr Val Phe Ala Ala Asp Trp Asp Gly Val Pro Ile Pro Ala20 25 30Pro Ala Gly Gln Asn Lys Thr Trp Gln Leu Gln Ser Ile Ser Asp35 40 45Asp Phe Asn Tyr Thr Ala Ser Ala Asn Asn Lys Pro Ser Ala Phe50 55 60Thr Ser Arg Trp Asn Asp Ser Tyr Ile Asn Ala Trp Lys Gly Pro65 70 75Gly Asp Thr Glu Phe Ser Ser Gly His Ser Tyr Thr Asn Ser Gly80 85 90Lys Leu Ala Leu Gln Ala Ala Glu Lys Pro Gly Thr Asp Lys Val95 100 105Tyr Ala Gly Ile Ile Ser Ser Lys Gln Thr Phe Thr Tyr Pro Leu110 115 120Tyr Ile Glu Ala Arg Ala Lys Ser Thr Asn Asn Thr Met Ala Asn125 130 135Ala Val Trp Met Leu Ser Ala Asp Ser Thr Gln Glu Leu Asp Ala140 145 150Met Glu Ala Tyr Gly Ser Asp Arg Pro Gly Gln Glu Trp Phe Asp155 160 165Arg Arg Met His Val Ser His His Val Phe Ile Arg Glu Pro Phe170 175 180Gln Asp Tyr Gln Pro Lys Asp Ala Gly Ser Trp Ile Tyr Asn Glu185 190 195Gln Ala Pro Trp Arg Val Ala Tyr His Asn Tyr Gly Met His Trp200 205 210Lys Asp Pro Trp Asn Val Asp Tyr Tyr Ile Asp Gly Val Leu Val215 220 225Arg Ser Val Ser Gly Gln Gln Met Ile Asp Pro His Asn Tyr Thr
230 235 240Asn Gly Thr Gly Val Asn Lys Pro Leu His Ile Ile Ile Asp Met245 250 255Glu His Gln Asp Trp Arg Asp Val Lys Pro Thr Pro Ala Glu Leu260 265 270Ala Asp Pro Ala Arg Ser Ile Phe Tyr Val Asp Trp Ile Arg Val275 280 285Tyr Lys Pro Thr Asp Ser Ala Ala Ser Ala Pro Thr Pro Pro Thr290 295 300Gly Ala Thr Ser Leu Lys Ala Arg His Ser Asn Lys Cys Leu Asp305 310 315Leu Ser Ala Gly Asn Ser Ala Asn Gly Ala Asn Met Gln Gln Trp320 325 330Asn Cys Asn Ala Thr Asn Thr Asn Gln Asp Ile Thr Phe Val Ala335 340 345Lys Gly Ala Gly Tyr Tyr Glu Met Lys Thr Lys His Asn Lys Cys350 355 360Leu Asp Val Ala Gly Lys Ala Thr Ser Asn Gly Ala Asn Ile Val365 370 375Gln Trp Asn Cys Tyr Asn Gly Thr Asn Gln Gln Phe Lys Leu Leu380 385 390Asp Lys Gly Asn Gly Trp Phe Gln Leu Gln Ala Lys His Ser Gly395 400 405Lys Cys Leu Glu Ile Ala Asn Ser Ala Thr Thr Asn Gly Ala Asn410 415 420Val Gln Gln Trp Ala Cys Gly Asn Ser Asn Asn Gln Gln Trp Lys425 430 435Phe Gln210232111089212PRT213未知220
223瓊脂糖酶II的胺基酸序列
40023Met Phe Lys Thr Lys Arg Ser Leu Leu Ser Ser Ser Ile Ala Leu1 5 10 15Ser Leu Ala Leu Leu Gly Thr Lys Ala His Ala Glu Thr Ile Val20 25 30Leu Gln Ala Glu Ser Phe Asp Asn Ser Gly Gly Thr Tyr Asp Asp35 40 45Gly Gln Pro Asn Pro Val Thr Ile Tyr Ser Val Asn Gly Gln Asn50 55 60Ala Ile Asn Phe Val Asn Ala Gly Asp Phe Val Asp Phe Asn Ile65 70 75Asn Ala Glu Gly Gly Glu Tyr Asp Ile Glu Tyr Leu Val Gly Thr80 85 90Ser Val Gln Ser Gly Pro Ser Ile Glu Val Leu Val Asn Thr Asn95 100 105Gly Ala Trp Glu Ser Gln Gly Thr Val Ala Val Pro Leu Thr Ser110 115 120Trp Asp Asp Phe Gln Pro Leu Lys Pro Ser His Ser Val Thr Leu125 130 135Pro Ala Gly Ala Ser Thr Ile Arg Leu His Ala Ile Gly Ser Thr140 145 150Trp Gln Trp Asn Met Glu Ser Phe Ser Leu Thr Gln Val Val Pro155 160 165Leu Glu Pro Glu Thr Pro Val Asp Val Asp Asp Ile Val Ile Asn170 175 180Leu Glu Asn Phe Ile Phe Thr Asp Lys Glu Gly Ala Ala Ile Ser185 190 195Gly Asp Thr Ile Val Gly Phe Gly Val Thr Asn Ser Gly Ile Asn200 205 210Phe Asn Thr Val Gly Asp Tyr Ala Asp Tyr Thr Val Asn Phe Thr215 220 225Glu Ala Gly Thr Tyr Asn Ala Thr Leu Ala Ala Gly Ser Pro Met230 235 240Thr Gly Gln Ile Gly Ala Gln Ile Ile Met Asp Asn Ser Val Ala245 250 255Ala Ser Ser Leu Leu Ala Ser Thr Gly Gly Trp Asp Asn Tyr Val260 265 270
Asp Phe Asp Leu Ser Gly Asp Ile Val Ile Pro Thr Pro Gly Thr275 280 285Tyr Thr Val Arg Leu Gln Ser Tyr Gly Ser Ala Asn Trp Gln Trp290 295 300Asn Ala Asp Thr Leu Thr Leu Ser Tyr Ile Ser Gly Glu Thr Gly305 310 315Asp Gly Asn Pro Ser Pro Pro Gln Glu Gly Asp Leu Ile Val Glu320 325 330Leu Glu Asp Phe Val Asn Thr Gly Thr Thr Gly Arg Val Gly Gly335 340 345Asp Ser Val Glu Gly Phe Gly Ala Thr Ala Thr Gly Val Asn Trp350 355 360Val Thr Asn Gly Asp Tyr Gly Asp Tyr Asn Ile Thr Phe Ala Glu365 370 375Pro Gly Thr Tyr Arg Ala Phe Phe Thr Tyr Ser Ala Ala Ser Ala380 385 390Gly Ser Tyr Gly Ala Arg Val Asp Val Asn Gly Glu Pro Val Ala395 400 405Trp Gly Tyr Phe Ala Glu Thr Gly Ser Trp Asp Val Ala Ser Glu410 415 420Val Glu Leu Tyr Gly Gly Tyr Phe Val Ile Asp Gln Ala Gly Gln425 430 435Ala Asn Leu Arg Val Glu Ala Ile Gly Gly Ser Asp Trp Gln Trp440 445 450Gly Gly Asp Lys Leu Arg Ile Thr Arg Val Gly Asp Val Ser Tyr455 460 465Val Pro Glu Arg His Tyr Asn Pro Asn Asp His Tyr Val Glu Glu470 475 480Val Glu Gly Pro Gln Thr Gln Ile Thr Tyr Leu Lys Pro Pro Ile485 490 495Asp Ile Pro Thr Asn Lys Lys Val Leu Lys Ser Asp Val Trp Tyr500 505 510Thr Tyr Pro Gln Asn Arg Glu Leu Glu Gly Phe Asp Asp Phe Gly515 520 525Ala Thr Gly Ala Phe Trp Gly His Pro Pro Glu His Asp Phe Tyr530 535 540Glu Glu Thr Val Ile Met Asp Trp Ala Val Asn Val Val Asp Thr
545 550 555Phe Gln Ser Glu Gly Phe Glu Tyr Thr Ala Arg Gly Glu Phe Asp560 565 570Trp Gly Tyr Gly Trp Phe Thr Glu Tyr Val Thr Asn Pro Gln Pro575 580 585His Tyr Val Gln Thr Leu Asp Asp Arg Asn Val Arg Met Thr Phe590 595 600Met Gly Tyr Leu Ser His Asn Gly Tyr Asn Asn Asn Trp Leu Ser605 610 615Asn His Ser Pro Ala Phe Val Pro Phe Met Lys Ser Gln Val Asp620 625 630Gln Ile Leu Lys Ala Tyr Pro Asp Lys Leu Met Phe Asp Thr Gln635 640 645Thr Asn Ser Thr Arg Ser Thr Asp Met Arg Thr Phe Gly Gly Asp650 655 660Phe Ser Pro Tyr Ala Met Glu Asn Phe Arg Ile Trp Leu Asp Lys665 670 675Lys Tyr Ser Ser Asn Glu Leu Ala Asn Met Gly Ile Asn Asn Ile680 685 690Gln Thr Phe Asp Tyr Lys Gln His Leu Leu Asn Ala Gly Val Thr695 700 705His Gln Ser Phe Met Asn Ala Ala Asp Thr Leu Ser Gly Asn Val710 715 720Pro Leu Leu Glu Asp Phe Ile Tyr Phe Asn Arg Asp Val Trp Asn725 730 735Gln Lys Phe Gly Glu Val Leu Asp Tyr Ile Arg Gln Gln Arg Pro740 745 750Asp Ile Glu Ile Gly Ala Ser Thr His Leu Phe Glu Ser Arg Gly755 760 765Tyr Ile Phe Asn Glu Asn Ile Thr Phe Leu Ser Gly Glu Leu Asn770 775 780Leu Gly Ala Arg Thr Thr Ile Ser Glu Leu Pro Thr Asn Ile Leu785 790 795Val His Leu Lys Gly Ala Gln Ala Val Asp Lys Thr Leu Ala Tyr800 805 810Phe Pro Tyr Pro Trp Glu Phe Asp Glu Leu Arg Leu Gln Asp Ala815 820 825
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223PCR引物1340024ctgtttttgc cgaattcggc agattgggat ggcgtacc382102521138212DNA213人工序列220
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220
223PCR引物1640027gctgaaccct cctcgagtat tcaacaacaa ctgttg 362102821138212DNA213人工序列220
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223PCR引物19
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223PCR引物2040031ccggcgacgg cgaattcgaa tccaagtcca ccacaagaag 402103221120212DNA213人工序列220
223用於16S rRNA分析的PCR引物40032agagtttgat cctggctcag 202103321119212DNA213人工序列220
223用於16S rRNA分析的PCR引物40033ggctaccttg ttacgactt 1921034
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223PCR引物2140034acactgtacg agaattcgtt acaaagttat ggtagcgcga 40
權利要求
1.一種瓊脂糖酶，所述瓊脂糖酶含有由SEQ ID NO22的胺基酸序列中第21號胺基酸至第437號胺基酸的417個殘基組成的胺基酸序列或者在所述胺基酸序列中一個或多個胺基酸被取代、缺失、添加和/或插入的胺基酸序列，並且具有水解D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵的活性。
2.依照權利要求1的瓊脂糖酶，所述瓊脂糖酶可得自微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)。
3.一種基因，所述基因編碼權利要求1所限定的瓊脂糖酶。
4.依照權利要求3的基因，所述基因可得自微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)。
5.依照權利要求3的基因，所述基因含有由SEQ ID NO20的核苷酸序列中第61號核苷酸至第1311號核苷酸的1251個核苷酸組成的核苷酸序列或者在所述由1251個核苷酸組成的核苷酸序列中一個或多個核苷酸被取代、缺失、添加和/或插入的核苷酸序列。
6.一種基因，所述基因在嚴謹條件下可與權利要求3所限定的基因雜交，並且編碼具有水解D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵的活性的瓊脂糖酶。
7.一種重組DNA分子，所述重組DNA分子含有選自以下的基因(a)編碼瓊脂糖酶的基因，所述瓊脂糖酶含有由SEQ ID NO22的胺基酸序列中第21號胺基酸至第437號胺基酸的417個殘基組成的胺基酸序列或者在所述胺基酸序列中一個或多個胺基酸被取代、缺失、添加和/或插入的胺基酸序列，並且具有水解D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵的活性；和(b)在嚴謹條件下可(a)的基因雜交並且編碼具有水解D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵的活性的瓊脂糖酶的基因。
8.一種轉化子，所述轉化子帶有權利要求7所限定的重組DNA分子。
9.一種權利要求1所限定的瓊脂糖酶的生產方法，所述方法包括培養微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)，並且從所述培養物中收集所述瓊脂糖酶。
10.瓊脂糖酶的生產方法，所述方法包括培養權利要求8所限定的轉化子，並且從所述培養物中收集瓊脂糖酶。
11.從瓊脂糖凝膠中提取物質的方法，所述方法包括用權利要求1所限定的瓊脂糖酶消化瓊脂糖凝膠。
12.用於權利要求11所限定的從瓊脂糖凝膠提取物質的方法的試劑盒，所述試劑盒含有權利要求1所限定的瓊脂糖酶。
13.一種瓊脂糖酶，所述瓊脂糖酶含有由SEQ ID NO23的胺基酸序列中第318號胺基酸至第1089號胺基酸的772個殘基組成的胺基酸序列或者在所述胺基酸序列中一個或多個胺基酸被取代、缺失、添加和/或插入的胺基酸序列，並且具有水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的活性。
14.依照權利要求13的瓊脂糖酶，所述瓊脂糖酶可得自微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)。
15.一種基因，所述基因編碼權利要求13所限定的瓊脂糖酶。
16.依照權利要求15的基因，所述基因可得自微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)。
17.依照權利要求15的基因，所述基因含有由SEQ ID NO21的核苷酸序列中第952號核苷酸至第3267號核苷酸的2316個核苷酸組成的核苷酸序列或者在所述由2316個核苷酸組成的核苷酸序列中一個或多個核苷酸被取代、缺失、添加和/或插入的核苷酸序列。
18.一種基因，所述基因在嚴謹條件下可與權利要求15所限定的基因雜交，並且編碼具有水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的活性的瓊脂糖酶。
19.一種重組DNA分子，所述重組DNA分子含有選自以下的基因(a)編碼瓊脂糖酶的基因，所述瓊脂糖酶含有由SEQ ID NO23的胺基酸序列中第318號胺基酸至第1089號胺基酸的772個殘基組成的胺基酸序列或者在所述胺基酸序列中一個或多個胺基酸被取代、缺失、添加和/或插入的胺基酸序列，並且具有水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的活性；和(b)在嚴謹條件下可與(a)的基因雜交並且編碼具有水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的活性的瓊脂糖酶的基因。
20.一種轉化子，所述轉化子帶有權利要求19所限定的重組DNA分子。
21.權利要求13所限定的瓊脂糖酶的生產方法，所述方法包括培養微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)，並且從所述培養物中收集所述瓊脂糖酶。
22.瓊脂糖酶的生產方法，所述方法包括培養權利要求20所限定的轉化子，並且從所述培養物中收集瓊脂糖酶。
23.瓊脂寡糖的生產方法，所述方法包括用權利要求13所限定的瓊脂糖酶消化瓊脂糖，並且從所述消化物中收集瓊脂寡糖。
24.改進權利要求13所限定的瓊脂糖酶的熱穩定性的方法，所述方法包括從N末端缺失構成所述瓊脂糖酶的至多30％的多肽。
25.依照權利要求24的方法，其中從N末端缺失構成具有SEQ IDNO23胺基酸序列的瓊脂糖酶的至多30％的多肽。
26.一種瓊脂糖酶，所述瓊脂糖酶具有水解D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的β-1，4鍵的活性，並且最適反應溫度為55-65℃。
27.一種瓊脂糖酶，所述瓊脂糖酶具有水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的活性，並且最適反應溫度為45-55℃。
全文摘要
本發明涉及可用於有效地生產瓊脂寡糖、從瓊脂糖凝膠中有效地提取核酸等物質的、具有瓊脂糖酶活性的多肽、所述多肽的胺基酸序列、編碼所述多肽的基因、所述多肽的生產方法以及瓊脂寡糖的生產方法和從瓊脂糖凝膠提取核酸等物質的方法。
文檔編號C12N15/56GK1531595SQ0280891
公開日2004年9月22日 申請日期2002年2月26日 優先權日2001年2月27日
發明者友野潤, 佐川裕章, 章, 之進, 加藤鬱之進 申請人:寶生物工程株式會社