只生育單一性別後代的哺乳動物的生產的製作方法
2023-05-04 15:30:36 1
專利名稱：只生育單一性別後代的哺乳動物的生產的製作方法
背景技術：
1.發明領域本發明通常涉及生產單一性別後代的方法。同過去別人使用的乏味的分離精子的方法相比，本發明中的方法是通過對生殖系進行遺傳修飾來實現的。因此，生育單一類型子代的特性就可以遺傳給後代。這項技術在農業，特別在牛肉和豬肉產業中有特殊的用途。
2.技術背景此處所有的出版物和專利申請都在同等程度上被引用，似乎每一篇出版物和專利申請都是具體並單獨地被引用的。
通過識別性染色體，雄性和雌性哺乳動物在遺傳上是可區別的。正常雌性哺乳動物含有兩條X染色體，而正常雄性則含有一條X和一條Y。由於在交配中，雌性哺乳動物只貢獻X染色體，因此是雄性配子決定了後代的性別。在正常情況下，由於哺乳動物的精液中含X染色體的精子和含Y染色體的精子的數目大致相等，因此用正常交配技術產生雄性或雌性子代的機率十分接近於50％。
在過去的幾十年中，改變產生特定性別後代的概率的能力已經成為眾多興趣關注的主題。在人類的生育中，減少性連鎖疾病發生的願望在一定程度上加強了這種興趣。例如，由於雄性只接受一條X染色體，因此有幾百種X連鎖的疾病在雄性身上典型地顯現出來，如血友病和萊-尼綜合症。通過增加產生雌性的概率，夫婦能夠避免生育顯示此類疾病的男孩。
在農業中，預先決定牲畜性別的能力具有改進產業經濟和管理的潛力。根據產業特定部門的不同，大多數畜牧場主對不同性別的動物有不同的喜好。例如，雄性小牛對牛奶場主來說，基本上沒有用處。另一方面，肉牛場主則偏愛雄性小牛，因為雄性小牛同它們的雌性同伴相比，長得更快，而且能更有效的增加體重。養豬場主喜歡用母豬做的燻肉，而不喜歡用公豬做的。家禽場主喜歡選擇母雞而不是公雞。
用多種方式機械分選精子的方法已經存在一段時間了，這導致了精液製劑的商業銷售，這種精液製劑可以用在人工授精中以影響子代的性別。美國專利號5,439,362和5,840,504提供了對多種機械方法的評論，並且在此以參考文獻形式引用。這些方法包括基於精子特性的技術，例如尺寸，頭部形狀，質量，表面性質，表面大分子，DNA含量，泳動速度和運動性(見Windsor等人寫的評論，1993，Reprod.Fert.Dev.5155)。例如，有人試圖根據膜抗原外形潛在的差別，用免疫學方法來分離精子(如美國專利號5,439,362)。最近更多的方法集中在精子的分選技術上，藉此精子細胞用一種螢光染料處理，接著根據攜帶X染色體的精子較高的DNA含量、因此具有較高的螢光而用流式細胞儀分選(Johnson，1996，Genderpreselectioninmammalsanoverview，DTW103(8-9)288-291)。
但是，機械分離的方法乏味而且並不完全準確。尤其對於精子分選技術而言，不能在短時間內獲得大量精子將使這些精子在人工授精方法中的使用複雜化。而且，已經有人爭辯說DNA的標記會造成潛在的遺傳損傷。另外，機械化的精子分選技術不能通過單獨繁殖的單一性別動物系中將特定性狀遺傳下去，那些希望操縱動物後代性別的農場主必需為每次授精購買精子。
胚胎分離技術是最成功的，藉此將胚胎從母體中取出，對一些細胞進行活組織檢查，接著用PCR擴增去分析性染色體特異的DNA。然而，這種方法十分乏味，需要廣泛的訓練，昂貴的設備以及需要移植胚胎的受體雌性動物。因此，這項技術很少使用。
對生殖系進行遺傳修飾以使其偏向於生育某一特定性別後代的報導很少。美國專利號5,596,089報導了一種操縱哺乳動物性別表型的方法，該方法利用SRY啟動子(從Y染色體編碼的睪丸決定因子而來)在胚胎發育中啟動白喉毒素基因在雄性生殖組織中的轉錄。這個基因用Cre-Lox系統來控制和激活。但是，由於用這種處理產生的雌性後代在遺傳上仍是雄性的(XY)，因此這種方法只能操縱性別的表型。
Bruton等人在美國專利號5,223,610中建議，製作能在精子細胞中表達非致死的調節子的轉基因動物，可能成為一種檢驗治療法對精子受精力的影響的方法。儘管精子發生中的某些變化是意料中的結果，Bruton等人並沒有建議這種方法也可以用來操縱由此產生的後代的性別。
本發明提供了幾個優點，同時也克服了現有技術的不足。第一，在本發明所述的轉基因動物製造出來之後，不需要進一步的技術即可生產特定性別的子代。能產生單一性別子代的雄性動物可以應用在正常的多方交配或人工授精方法中。而且，當雄性轉基因哺乳動物被用來產生單一性別的子代時，遺傳修飾不會傳遞給後代，發明的專利性質就得到了保護。一旦發展了這種遺傳修飾，就可以通過克隆技術或者甚至是通過使用載體雌性動物的自然育種技術以相對低的成本來繁殖。
3.發明概述本發明涉及生產動物的方法，這些動物具有經過改變的生育某一特定性別子代的傾向性，本發明涉及的特別是那些生產具有此類傾向性的哺乳動物的方法。這些方法涉及對異配性別(帶有兩條不同的性染色體從而決定子代性別的性別)進行遺傳修飾，以使經遺傳修飾過的配子帶上標記或者失活。這些哺乳動物，同時也是本發明的對象，將會生育單一性別的子代。
同時也包含那些對同配性別動物進行遺傳修飾的方法，這些遺傳修飾使得這些動物的異形配子的子代能生育單一性別的後代。這些經過遺傳修飾的同配性別的動物，同時也是本發明的對象，提供了一種通過育種技術來繁殖生育單一性別性狀的方法。這些育種技術也是本發明的對象。同時也包含用來完成此處所述方法的遺傳構建體和工具。
5.發明詳述定義除非另外定義，此處使用的所有技術和科學術語都和本發明所屬領域中普通技術人員所共同理解的具有相同的含義。儘管任何同此處所述的那些相似或等同的方法和材料都可以用在本發明的實施或檢驗中，此處還是描述了優選的方法和材料。為本發明的用途，對下面的術語進行了定義。
如此處所用的，異配性別的意思是含有兩條不同的性染色體，即一條X染色體和一條Y染色體，因此表明這樣的動物將決定子代的性別。在哺乳動物中，異配性別是雄性，而在鳥類中，則是雌性。同配性別意味著含有兩條相同的染色體，即含有兩條X染色體的遺傳上正常的雌性哺乳動物。
發明描述本發明包含一種生產動物，特別是哺乳動物的方法，其中這種動物具有經過改變的生育某一特定性別後代的傾向性。術語「後代」指直系子代或後代，即子代的子代，由所生產的動物的性別決定。
這些方法通過將核酸構建體引入所述動物生殖系的至少一條性染色體上來實現，其中核酸構建體編碼一種能在減數分裂後在發育著的精子細胞中表達的轉基因。轉基因的表達用來改變由所述正在發育的精子細胞產生的精子的受精力，以使所生產的哺乳動物具有經過改變的生育某一特定性別後代的傾向性。
這些方法也可以用來生產異配性別和同配性別的動物。例如，當用這些方法生產在一條性染色體上帶有轉基因並且是異配性別的產精子動物時，減數分裂後攜帶轉基因的配子就具有了經過改變的受精力，即完成與卵細胞受精的能力發生了改變。因此這些動物在第一代中就具有一種非自然的生育某一特定性別子代的概率，這種概率依賴於轉基因的性質以及表達轉基因的精子失活的程度。
當這些方法生產同配性別的產卵細胞動物時，在第一代中生育某一特定性別子代的概率不會受到影響，因為這種動物不產生精子。因此，如果轉基因位於兩條性染色體的其中一條上，依賴自然概率它就會傳遞給大約一半的子代，無論是雄性還是雌性。如果轉基因位於兩條性染色體上，所有的子代都會得到轉基因。但是，如果轉基因是用來影響精子受精力的，那麼產卵細胞哺乳動物的第一代子代生育某一特定性別後代的概率就不會改變。
從產卵細胞的轉基因親本中得到轉基因的產卵細胞者將攜帶這一轉基因，但是由於它們不產生精子，它們的直系子代不會受到影響。但是那些得到轉基因的產精子的異配性別動物將基本上生育單一性別的後代，這種程度由任何在減數分裂後得到含有轉基因的染色體的精子失活來決定。由於產卵細胞的同配性別的動物具有無限制攜帶轉基因的能力，因此當轉基因導入同配性別動物系中時，任何後續代中的產精子者都可能受到影響。
本發明中的方法基本上是通過在動物的生殖系中引入轉基因來實現的，憑藉此方法就可以產生生育某一特定性別後代的傾向性被改變的動物。因此，任何適於產生轉基因動物的方法都可能用到。特別優選的方法包括核移植技術，在此處引用的美國專利號5,945,577以及共同未決的專利申請系列號.08/888,057和08/888,283中有詳細描述。當然，一旦通過在動物生殖系中引入轉基因產生了合適的轉基因動物，那麼本發明中的轉基因動物也可以用自然育種技術來生產。
轉基因的表達最好只是令精子失活，如減少它的運動力或者受精力，而不是殺死精子。這就意味著本發明中的方法可以通過對雌性供體卵細胞進行胞質內精子注射來實現。通過這種方法，同配性別的雌性載體系可以用體外技術再生，這種再生還需要來自攜帶轉基因X染色體的雄性動物的精子。同樣的，只生育雌性後代的異配性別的雄性動物可以從攜帶轉基因Y染色體的雄性精子中產生。但是，由於本發明中的動物可以用核移植技術或其它遺傳技術很容易的產生，因此在表達時對精子有毒理作用的轉基因也可以使用。
為了達到轉基因在發育著的精子細胞中的特異表達，轉基因的表達可以由精子特異性的序列來控制。這樣的控制序列可以通過轉錄或翻譯控制機制來影響其在精子中的特異表達。在優選的實施方案中，控制序列是一種精子細胞特異基因的啟動子，這種啟動子只在減數分裂後的精子細胞中特異性的影響轉錄。許多這類啟動子已經確認，任何一種都可以用來影響減數分裂後精子中轉基因的特異性表達。尤其是，精子特異性的控制序列包括魚精蛋白基因1或2的啟動子。
術語「經過改變的受精力」或者「經過改變的生育某一特定性別後代的傾向性」基本上指的是轉基因的表達以某種方式影響了正在發育的轉基因精子細胞，導致轉基因精子細胞和非轉基因的同類相比，具有不同的授精能力。在優選的實施方案中，通過使含有轉基因染色體的精子失活，從而使非轉基因的精子在受精過程中具有競爭優勢來實現這一點。但是，轉基因本身提供競爭優勢即改善精子運動力的實施方案也是可行的。
對於那些編碼結構蛋白質的轉基因來說，它們所編碼的蛋白質應該具有以下特徵(1)不能通過精子細胞之間的胞質連接，因此就定位在含有轉基因染色體的精子細胞中；(2)能使含有轉基因染色體的精子細胞失活，帶上標記或者增加受精力。關於轉基因的單倍體表達，有人爭辯說在精子生成過程中精子細胞通過胞質橋共享基因產物或轉錄物，從而使配子在發育的減數分裂後階段呈現出表型上的雙倍性。但是，一些研究表明並不總是這樣的(如Zhang和Martin-Deleon，1997，Mol.Repro.Dev.46252-257)。事實上，已經有人提出，一些基因轉錄物從細胞核中轉運出來之後，立刻就結合在細胞膜上或者穩固地定位下來，如同那些編碼細胞骨架蛋白的轉錄物一樣，從而不會被互相聯結的精子細胞所共享(Caldwell和Handel，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA882407-2411)。也有許多報導指出，轉錄物儲存在非多核糖體的核糖核蛋白(RNP)顆粒中(Burmester和Hoyer-Fender，1996，Mol.Repro.Dev.4510-20；Sommerville和Ladomery，1996，Chromosoma104469-478)，或者諸如擬染色體(CB)之類的細胞器中(Biggiogera等人，1990，Mol.Repro.Dev.26150-158)，進一步提示這些轉錄物並不能輕易的在精子細胞之間通行。
但是，即使轉錄物能在精子細胞之間共享，控制或使精子的受精力偏向於生成某一性別的選擇還是能夠通過遺傳機制來實現的。例如，某些自主的自在因子被認為能夠通過轉錄物共享來影響精子的受精力和正在發育的精子細胞的不平衡狀態(如鼠的t等位基因，參見Miller的評論，1997，Mol.HumanRepro.3(8)669-676)。有人提出，這類自在因子編碼了能通過胞質橋自由擴散的轉錄物或基因產物，從而使攜帶野生型等位基因的精子細胞失活，但卻使得到這類因子的精子細胞產生對失活作用的免疫力。例如，將這樣的一個因子插入Y染色體，預計可以有多種交配情況。例如，在Y染色體上攜帶自在因子的雄性就可以和兩條X染色體上都攜帶有野生型等位基因的雌性交配了。這種交配對只能產生雄性後代。
如果確實出現轉錄物，還是有可能用調節序列將轉錄物錨定在含有X或Y染色體的精子細胞中的。例如，本發明中所用的啟動子可以是雜合啟動子，它們由來自不同的精子特異性控制序列的序列設計成。特別是，已經表明在小鼠魚精蛋白2mRNA的3』非翻譯區連接上一種磷蛋白，就會抑制mRNA的翻譯直至精子生成過程的較遲階段，據推測可能在調節蛋白去磷酸化之後(Fajardo等人，1995，Dev.Biol.，1994，166643-653)。有人針對其它的精子特異性基因提出了一種相似的調節方式(Kwon和Hecht，1993，Mol.Cell.Biol.13(10)6547-6557)。因此，通過確保本發明的構建體含有合適的3』端非翻譯區域，就有可能用蛋白質相互作用將轉錄物錨定在單倍體精子細胞中。
對於那些轉基因產物影響它們所位於的精子細胞的受精力的實施方案而言，適合於本發明目的的蛋白質實例是精子細胞中高度不溶性的細胞骨架組分，這些骨架組分構成了外部的緻密纖維或精子尾部的纖維鞘或精子頭部的核周鞘。這些蛋白質在精子細胞中形成大的叢集，不太可能從一個精子細胞中通行到另一個中。另一個例子是含有很強的核定位序列的蛋白質，這些序列將把蛋白質引導至細胞核中，從而阻止蛋白質從一個精子細胞通行到另一個。
為了使精子失活，轉基因產物可以過量表達，或者修飾以使其不能正常地行使功能，即令其突變，或者轉基因產物也可以來自於其它物種。細胞骨架或者核蛋白的改變會使精子的運動力降低，或者產生其它缺陷和較低的受精力。要增強精子的表現，可以改變這些蛋白質，即有益突變，從而增強功能。在代謝中起作用的核調節蛋白質也可以被加工，以使其在精子中特異性表達時提供競爭性優勢。
蛋白質也可以經過改變而含有一段如綠色螢光蛋白之類的標記蛋白序列，即含有綠色螢光蛋白序列的融合蛋白，這類標記蛋白序列可以用來標記攜帶某條或者另一條性染色體的精子細胞。可將被標記的精子分離，從而產生單一性別的後代。另外，與標記物、例如綠色螢光蛋白形成的融合蛋白，能夠允許肉眼監視和評估蛋白質在精子細胞之間通過胞質橋的轉運，假使這種轉運存在的話。這種融合蛋白質也允許肉眼估測精子的運動力和受精力。
儘管優選的實施方案利用結構蛋白的變化來實現本發明的方法，那些編碼具有調節功能的轉錄物即反義轉錄物的轉基因，在與精子特異性控制元件偶聯之後，也可以用來改變精子的受精力。
轉基因通常應該插入一條或者另一條性染色體。要產生雄性哺乳動物，基因應該插入X染色體以使含X染色體的精子失活；要產生雌性，基因應該插入Y染色體以使含有Y染色體的精子失活。可選擇的是，用來提供競爭性優勢的轉基因應該插入能夠決定所要特定後代性別的性染色體中。
為了確保轉基因的最佳表達，將基因插在內源性表達的基因附近是很有用的。特異性定位於X和Y染色體上的基因已經確定了，並且已經為本領域所熟知(參見此處引用的美國專利號5,595,089和5,700,926,以及5,763,166)。可選擇的是，待插入的新位點可以用下面所述的技術或者本領域中常用的其它技術來確定。
應該指出的是，對於提供競爭性優勢的轉基因，可以設想這樣的實施方案將轉基因插在編碼某種所要特性的基因旁邊，而這個基因位於非性染色體上(常染色體)。將轉基因以此種方式插入，使得轉基因和所要的特性能以連鎖的方式遺傳。因此，得到常染色體上提供優勢的轉基因的精子細胞也連鎖地得到了所要的特性，而且通過連鎖的、精子特異性的競爭優勢，這些精子細胞也為所要特性在後代動物中的傳播提供了選擇優勢。這類技術對育種者設計或繁殖具有多種所要特性的動物系是有用的，減少了培育每種性狀至純合狀態所需的時間以及由此帶來的不便。
本發明也涵蓋了用上述方法生產的轉基因動物。關於具有失活作用的轉基因，轉基因哺乳動物也可以組成一個載體雌性動物系，這個動物系可以由許可的育種者來繁殖。
此處也涵蓋了在某些方式中使用本發明中所述轉基因動物的方法，這些方式能基本上改變生育某一特定性別後代的自然概率。可以用自然育種技術培育本發明中所述的轉基因動物，從而在任何後續代基本上改變生育某一特定性別後代的自然概率，由此實現上述的方法。
用來實現這些公開的方法的核酸構建體也是本發明的一部分。如上所述，這樣的核酸構建體包括精子特異性控制序列，它有效地與編碼某一蛋白質的轉基因序列連接在一起，這一蛋白質選自精子結構蛋白質，它們的突變體以及從它們設計的融合蛋白質中。轉基因序列可以是cDNA序列，基因組序列或者人工序列。
含有這類核酸構建體的載體也包括在本發明中，同時也包括原核和真核細胞系，這些細胞系含有插在染色體上的該核酸構建體或者帶有核酸構建體的載體。特別有用的細胞系包括含有整合在合適染色體上合適位置處的核酸構建體的成纖維細胞系，用來進行體細胞的細胞核移植(參見此處引用的美國專利號5,945,577)。含有核酸構建體的胚胎幹細胞系也是可取的。
如上面所討論的，在至少一條性染色體上帶有轉基因的同配性別產卵細胞的動物，即雌性哺乳動物，是轉基因的載體，並且可以培育來繁殖這種特性。因此，本發明也涵蓋了培育轉基因雌性哺乳動物系的方法，這種動物系的至少一條性染色體上帶有轉基因。這種方法基本上包括在所述轉基因雌性哺乳動物系的雌性後代中檢測所述轉基因，以及用所述的轉基因陽性雌性後代來延續這一品系。
在這種育種方法中，後代可以用自然育種技術來產生，從而含有一個拷貝的所述轉基因。可選擇的是，後代也可以通過胞質內精子轉移來產生，所述精子來源於基本上生育雄性後代的雄性動物，從而含有兩個拷貝的所述轉基因。
本發明也涵蓋用這種育種方法產生的轉基因雌性哺乳動物，以及用這種轉基因雌性哺乳動物來生育雄性哺乳動物的方法，而這種雄性哺乳動物基本上生育雄性後代。這種方法包含培育轉基因雌性哺乳動物從而來生產轉基因雄性哺乳動物。這樣產生的轉基因雄性哺乳動物也是本發明的一部分。
如上所述，這種育種方法中繁殖的轉基因在減數分裂後在由所述轉基因雌性的轉基因雄性後代產生的精子細胞中表達。如果轉基因對精子細胞有失活作用，用自然育種技術就能使這樣的轉基因雄性後代產生大量的雄性後代。可選擇的是，如果轉基因給精子提供競爭性優勢，由此產生的轉基因雄性後代就能通過自然育種技術生育大量雌性後代。生育單一性別後代的概率依賴於轉基因的性質而改變。但是，基本上』是雄性或雌性的後代，是指幾乎總是允許劣勢轉基因精子早於非轉基因精子而使卵細胞受精的小概率事件，或者具有競爭性優勢的轉基因精子未能敵過非轉基因精子而發生受精的小概率事件。
儘管，確信本發明能用任何一種動物來輕易實現，但是優選的動物包括哺乳動物，這中間最好的是小鼠，牛和豬。
通過參考下面的實驗方法，本發明的全部範圍將變得更加明顯。
優選實施方案詳述用於評估魚精蛋白啟動子特異性的轉基因構建體設計了兩個構建體。通過將啟動子和EGFP基因構建體配對，設計了第一個構建體，用來檢驗魚精蛋白啟動子的功能。建成了六隻轉基因小鼠(三隻雄性和三隻雌性)，其中一隻表達定位於整個精子的EGFP(數據沒有列出)。第二個構建體含有一段核定位序列，其它部分與第一個構建體相同。目的是確定EGFP表達能否定位於精子的細胞核。建成了三隻轉基因小鼠，將使其生育雄性後代來評估精子。
用來評估蛋白質在精子細胞之間轉移的轉基因構建體為了實現本發明的方法，可以在發育的精子細胞中自轉基因表達分子量為85kDa和27kDa的精子外緻密纖維(ODF)蛋白質，或者是它們的衍生物。這兩種蛋白質的序列信息都是已知的，因此可以很容易的做到以下幾點(i)分離小鼠精子細胞群，(ii)製備用來篩選的cDNA文庫，(iii)篩選這樣的文庫以獲得一個或幾個能用來製作轉基因的cDNA克隆，或者PCR擴增合適的序列。用本領域中熟知的技術，能很容易的構建含有融合基因的構建體，這個融合基因是將綠色螢光蛋白(GFP)摻入ODF蛋白序列的融合體。下面給出了對這些構建體的描述。
1.CMV/ODF-GFP+SV40或IRES/NEO這個構建體允許在成纖維細胞中檢測ODF/GFP融合蛋白盒的功能。
2.CMV/NEO+PROT/ODF-GFP這個構建體允許在ES或成纖維細胞中進行選擇、在精子細胞中的較遲表達以及在精子細胞中追蹤GFP螢光。具有功能的PROT/ODF-GFP盒可以使得構建體用於同源重組。
融合蛋白構建體對確定那些攜帶轉基因的精子，以及調查蛋白質在精子細胞之間的轉移是很有用的。在這個構建體中所用的啟動子是小鼠魚精蛋白啟動子，但是任何能限制基因在減數分裂後的精子細胞中表達的啟動子或者其它表達控制元件都可以使用。
能夠用這些構建體來製備轉基因小鼠。在性成熟期，使雄性和雌性配對，並且監視轉基因的傳遞。另外，讓轉基因雌性交配來生育轉基因雄性。這些GI和GO雄性將和雌性配對，並且監視轉基因的傳遞。在與至少五隻雌性交配之後，雄性將被施以無痛致死術，並且摘除睪丸和附睪。從附睪中取出一些精子樣品，並且在半數的精子中檢驗GFP的存在。如果這些結果是模稜兩可的，對睪丸進行冷凍切片來檢查生精小管和GFP的分布。
預期轉基因會從雌性轉基因動物而不是雄性轉基因動物傳給後代。這將意味著轉基因蛋白質影響了精子的受精力。如果不是這樣，就有必要用修飾過的基因製備一個構建體，重新檢驗對受精力的作用。(注意預期子代性別比不會發生變化，因為在這項研究中，轉基因的靶子並不是性染色體)。
由於綠色螢光融合蛋白的表達，來自轉基因雄性的半數轉基因精子預期會在尾部有綠色螢光。這將顯示轉基因在減數分裂後的成功表達。而且，它也顯示轉基因正確定位在半數的轉基因精子細胞中。
牛X染色體上能用於基因打靶的DNA序列的確定如前面所述，插在X染色體上從而在含X染色體的精子細胞中表達的有害基因會降低將產生雌性小牛的精子的受精力。這種基因應該插在它可能表達的位點。要做到這一點，就需要確定臨近組成型表達的內源基因的一段序列。為了避免破壞基因的功能，對這片DNA區域進行鑑定是必要的。
這可以通過篩選牛YAC文庫以分離兩個帶有標記位點的酵母人工染色體(YAC)克隆來實現，這些標記位點已被鑑定位於X染色體的特定區域，在假常染色體邊界(PAB)區域附近。YAC克隆原位雜交(FISH)中的螢光能夠用於確認X染色體上的合適位點。將這些克隆亞克隆入粘粒載體來獲得更小的DNA插入物。外顯子捕獲法將被用來確定編碼序列在這些粘粒克隆中的存在。
要進行外顯子捕獲，就要將粘粒克隆亞克隆入質粒pSPL3中。在亞克隆之後，將亞克隆DNA轉染入COS-7細胞中。經過瞬間表達後，收穫RNA，用載體特異的寡核苷酸進行反轉錄來生成第一鏈的cDNA。在將RNA模板消化之後，進行起始輪PCR，接著用BstXI消化以除去那些不含外顯子的PCR產物。再進行第二輪PCR，接著用尿嘧啶—DNA糖基化方法快速克隆進噬菌粒載體中。
捕獲的外顯子就用來確定含有編碼序列的粘粒區域。其中一些序列將用來篩選牛cDNA文庫、確定全長基因，以確定粘粒區域，從而避免對這些區域進行同源重組。缺少外顯子和重複序列的粘粒區域將特別標明，以用來作為同源重組的目標位點。
預期上述技術將允許用同源重組的方法在X染色體的合適區域插入載體構建體，從而使載體構建體的插入不會對轉基因動物有害。相似的方法也可以用Y染色體或常染色體進行。
將DNA構建體插入預先確定的X染色體位點並且選擇能用作細胞核移植的正確打靶的成纖維細胞系。
要將序列正確導入有限壽命的原代培養細胞系，就必需作大規模的轉染，克隆和選擇。優化轉染效率，選擇以及使轉基因克隆細胞系傳代的方法在本領域中是熟知的，並且也可以用來實現這個目的。
基本上，DNA構建體是通過這樣一種方式構建的，即令X染色體同源序列位於陽性選擇標記(CMV/neo)和常有魚精蛋白啟動子盒的目的基因側翼。陰性選擇標記位於X染色體同源序列3』端的下遊，當發生同源重組時，它們將被刪除。構建體如下1.BTX5』序列+CMV/NEO+PROT/ODF-GFP+BTX3』序列+SV40/HGR2.BTX5』序列+PROT/ODF-GFP+CMV/NEO+BTX3』序列+SV40/HGR3.BTX5』序列+CMV/NEO+PROT/ODF+BTX3』序列+SV40/HGR4.BTX5』序列+PROT/ODF+CMV/NEO+BTX3』序列+SV40/HGRCMV/neo盒允許在成纖維細胞中選擇DNA插入。PROT/ODF-GFP盒將在精子細胞中表達，GFP可使表達可視化。如果融合蛋白太大而不能到達它的目的位點從而無法組裝入ODF，就必需用到PROT/ODF了。如果確是這種情況，ODF蛋白還需要經過誘變處理。由於雙順反子構建體表達3』端順反子的效率降低了，因此具有CMV/neo+PROT/ODF順序或者相反順序的構建體應該先進行測試。
用本領域中熟知的技術，電穿孔參數也可以得到優化。將細胞在選擇性培養基中生長，那些存活的克隆將得到繁殖。用PCR來評估總群體混合物，以確定同源重組體是否已經產生。如果存在同源重組體，在500個每個含有約10個細胞的孔中進行初始的連續稀釋培養，並用PCR評估。這樣就確保陰性選擇只在含有同源重組體的細胞群體中進行。因此，就可以丟棄任何存活的陰性選擇克隆。任何在影印培養後死掉的克隆都可以認為是真正的同源重組體，並且將用Southern分析法來篩選。待用細胞將是那些具有大約35次群體倍增壽命的胎兒成纖維細胞。在選擇過程中監測群體倍增情況，以儘量減少衰老。將大約3到5個細胞系冷凍，並且運往Ultimate Biosystem來生產後代。
預期第一輪選擇後在生產轉基因細胞中將運作良好，並且該實驗能很輕易地重複，從而使得能很容易地篩選成千上萬的克隆。將用PCR進行初篩選以確定同源重組體。接著應該對幾個重組體進行測試以確定那些能在培養基中生長良好的重組體。
權利要求
1.一種生產哺乳動物的方法，這種哺乳動物生育某一特定性別後代的傾向性被改變，該方法包括將核酸構建體導入所述哺乳動物生殖系的至少一條性染色體中，其中該核酸構建體編碼一種能在發育著的精子細胞中在減數分裂後表達的轉基因，這種轉基因的表達改變了由上述發育著的精子細胞產生的精子的受精力，從而使上述哺乳動物具有被改變的生育某一特定性別後代的傾向性。
2.權利要求1中的方法，其中所述哺乳動物是異配性別的。
3.權利要求1中的方法，其中所述哺乳動物是同配性別的。
4.權利要求2中的方法，其中所述哺乳動物生育某一特定性別的第一代後代的傾向性被改變。
5.權利要求3中的方法，其中所述哺乳動物生育某一特定性別的第二代後代的傾向性被改變。
6.權利要求1中的方法，其中所述哺乳動物是用細胞核移植技術生產的。
7.權利要求1中的方法，其中所述哺乳動物是用自然育種技術生產的。
8.權利要求1中的方法，其中所述哺乳動物是用胞質內精子注射的方法生產的。
9.權利要求1中的方法，其中所述哺乳動物選自小鼠，牛和豬。
10.權利要求1中的方法，其中所述轉基因的表達由精子特異性的控制序列控制。
11.權利要求10中的方法，其中所述精子特異性控制序列是選自魚精蛋白1或2基因啟動子的啟動子。
12.權利要求1中的方法，其中所述轉基因選自精子結構蛋白，它們的突變體以及由它們設計的融合蛋白質。
13.權利要求12中的方法，其中所述精子結構蛋白是一種外緻密纖維(ODF)蛋白。
14.權利要求12中的方法，其中所述融合蛋白包含與綠色螢光蛋白(GFP)的融合體。
15.權利要求1中的方法，其中所述哺乳動物具有增強的生育雄性後代的傾向性。
16.權利要求1中的方法，其中所述哺乳具有增強的生育雌性後代的傾向性。
17.權利要求5中的方法，其中所述第二代後代基本上是雄性。
18.由權利要求1中的方法生產的轉基因哺乳動物。
19.通過對權利要求3中的哺乳動物進行育種而生產的轉基因哺乳動物系。
20.一種基本上改變生育某一特定性別後代的自然概率的方法，該方法包括用自然育種技術繁殖權利要求1中的轉基因哺乳動物，從而基本上改變任何後續代中生育某一特定性別後代的自然概率。
21.含有精子特異性控制序列以及與之可操作連接的cDNA序列的核酸構建體，該cDNA序列編碼選自下組的蛋白質；精子結構蛋白，它們的突變體以及由它們設計的融合蛋白質。
22.含有權利要求21中的核酸構建體的載體。
23.含有權利要求21中的核酸構建體的成纖維細胞系。
24.含有權利要求21中的核酸構建體的胚胎幹細胞系。
25.一種培育至少在一條性染色體上帶有轉基因的轉基因雌性哺乳動物系的方法，其中該轉基因在所述轉基因雌性哺乳動物的轉基因雄性後代產生的精子細胞中在減數分裂後表達，從而用自然育種技術就可以使所述轉基因雄性後代基本上生育雄性後代，所述方法包括檢測所述轉基因雌性哺乳動物系的雌性後代中的所述轉基因，以及用所述雌性後代來攜帶這一轉基因。
26.權利要求25中的方法，其中所述雌性後代是用自然育種技術產生的，並且含有一個拷貝的所述轉基因。
27.權利要求25中的方法，其中所述雌性後代是用胞質內精子移植來產生的，並且含有兩個拷貝的所述轉基因，所述精子則來自基本上生育雄性後代的雄性攜帶者。
28.用權利要求25中的方法產生的轉基因雌性哺乳動物。
29.一種生產基本上生育雄性後代的雄性哺乳動物的方法，該方法包括培育權利要求28中的轉基因雌性哺乳動物，從而來生產轉基因雄性哺乳動物。
30.用權利要求29中的方法生產的轉基因雄性哺乳動物。
全文摘要
本文公開了對動物進行遺傳修飾從而使其生育單一性別的後代或者子代的方法。
文檔編號C12N15/09GK1443037SQ01807315
公開日2003年9月17日 申請日期2001年2月26日 優先權日2000年2月24日
發明者J·M·羅博, A·F·龐斯德裡恩 申請人:麻薩諸塞大學