一種產黃青黴菌的梯度高濃度青黴素培養基選育法
2023-05-04 16:30:51 2
一種產黃青黴菌的梯度高濃度青黴素培養基選育法
【專利摘要】本發明涉及一種產黃青黴菌菌種的優選方法，具體是，將普通工業生產用產黃青黴菌菌株從米孢子出發，經調配溶液、梯度高濃度青黴素平板培養基篩選、復篩、驗證而獲得耐受性好的高產菌株。採用梯度高濃度青黴素培養基篩選的菌株的方法，開闢了工業發酵生產用產黃青黴菌的優選的新途徑。該方法操作簡便，所用儀器設備少，成本低廉，效率高，易於工業生產推廣應用。
【專利說明】一種產黃青黴菌的梯度高濃度青黴素培養基選育法
[0001]摘要
本發明涉及一種產黃青黴菌菌種的優選方法，具體是，將普通工業生產用產黃青黴菌菌株從米孢子出發，經調配溶液、梯度高濃度青黴素平板培養基篩選、復篩、驗證而獲得耐受性好的高產菌株。採用梯度高濃度青黴素培養基篩選的菌株的方法，開闢了工業發酵生產用產黃青黴菌的優選的新途徑。該方法操作簡便，所用儀器設備少，成本低廉，效率高，易於工業生產推廣應用。
【技術領域】
[0002]本發明屬於工業發酵生產用產黃青黴菌的高產菌株優選，特別涉及的是一種用含梯度高濃度的青黴素的PDA培養基誘變篩選普通菌株，從而獲得高產菌株的方法。
【背景技術】
[0003]青黴素作為我國兩大戰略性原料藥品之一，不僅是人們健康生活的保障，同時也對我國在世界藥品市場的地位有重要的影響。
[0004]我國青黴素工業菌種的發酵能力，發酵指數和生產成本與國外企業相比還有很大差距，國外工業菌株發酵能力約是我國的1.8倍，其發酵成本僅佔售價的25%，而我國發酵產品的生產成本佔到售價的50% — 60%。這使得我國發酵產品的利潤空間和發酵工業的贏利能力遠低於國外同類企業。我國更多是以規模生產在國際市場參與競爭。
[0005]青黴素的技術創新勢在必行。而在技術創新中，優良菌株的選育工作是其中的重要組成部分，一個耐受性好的高產菌株可以直接提高發酵效率，帶來巨大的經濟效益。
[0006]
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一種廉價高效的產黃青黴菌菌種的優選方法，具體是，將普通工業生產用產黃青黴菌菌株從米孢子出發，經調配溶液、梯度高濃度青黴素平板培養基篩選、復篩、驗證而獲得耐受性好的高產菌株。
[0008]本發明的技術方案是:將工業發酵用米孢子的懸濁液，塗布在含有高濃度梯度青黴素的PDA培養基上誘變並初篩，在培養箱中培養，以菌落的形態為特徵選出優良菌株，然後再用含青黴素的PDA平板復篩，選出表現優良的菌株，接種到搖瓶中微量發酵，以效價為特徵選出優良高產菌株。
[0009]米孢子是工業發酵生產接種用的小米孢子。米孢子懸濁液是將工業發酵用米孢子用滅菌水洗脫，製成IXio6 Ix IO7個孢子/Cm3的懸濁液。在無菌工作檯上，將稀釋好的懸池液塗布在含青黴素濃度分別為:50~60mg/ml, 60~70mg/ml, 70~80mg/ml, 80~90mg/ml,9(Tl00mg/ml，10(Tll0mg/ml的PDA平板培養基上，每個濃度四個培養皿。然在培養箱中遮光，25°C培養7、天觀察菌落的特徵和形態。
[0010]菌落呈圓臺型突起、突起布滿褶皺、褶皺厚實均勻、顏色呈灰綠色、突起高且粗壯的為待驗證的菌株，選取靠近高濃度的一端的塗布12個平板，一般每個平板上會有3飛個符合要求的菌株，把這些菌株全部挑出、編號、接種到含青黴素6(T70mg/ml的PDA平板培養基上進行復篩，同樣在培養箱中25°C靜置培養。6天後，最符合上述優良菌落特徵的菌株挑出、編號，進一步驗證，將挑出的菌株接種到IOml試管培養基中，在搖床上25°C，搖床200轉/分鐘，培養56小時，再轉接到裝有30ml培養基的250ml搖瓶中，搖床上26°C，搖床200轉/分鐘繼續培養6天，每天補加2ml濃度為30%的苯乙酸滅菌溶液。
[0011]用培養六天後的發酵液，測青黴素的效價，效價在3X 104IU/ml以上的即為優良高產菌株。
[0012]本發明的優點是:
1、採用含特定梯度濃度青黴素的PDA培養基誘變育種，效率高，操作程序簡便，所用儀器設備少，成本低，是一種易於推廣的青黴菌育種方法。
[0013]2、復篩和驗證保證了誘變後新菌株的耐受性和穩定性，高產效果明顯，在不到一個月的時間裡選育到2株新菌株，效價增產分別為9%和12%，經濟效益顯著。
[0014]【具體實施方式】:
實施例1:
將工業發酵用米孢子用滅菌水洗脫，製成I X IO6個孢子/Cm3的懸濁液。在無菌工作檯上，將稀釋好的懸池液塗布在含青黴素濃度分別為:50mg/ml,60mg/ml, 70mg/ml,80mg/ml,90mg/ml, 100mg/ml的PDA平板培養基上，每個濃度四個直徑90mm培養皿。然在培養箱中遮光，25°C培養7、天觀察菌落的特徵和形態。菌落呈圓臺型突起、突起布滿褶皺、褶皺厚實均勻、顏色呈灰綠色、突起高且粗壯的為待驗證的菌株，選取靠近高濃度的一端的塗布12個平板，共計60個符合 要求的菌株，把這些菌株全部挑出、編號、接種到含青黴素60mg/ml的PDA平板培養基上進行復篩，同樣在培養箱中25°C靜置培養6天，最符合上述優良特徵的菌株共計74個挑出、編號。再將挑出的菌株接種到IOml試管培養基中，在搖床上25°C，搖床200轉/分鐘，培養56小時；再轉接到裝有30ml培養基的250ml搖瓶中，搖床上26°C，搖床200轉/分鐘繼續培養6天，每天補加2ml濃度為30%的苯乙酸滅菌溶液。用培養六天後的發酵液，測青黴素的效價，效價在3X104IU/ml以上的即為優良高產菌株。通過本實施例，獲得一個耐受性好遺傳穩定的新菌株，其效價為3.3X 104IU/ml，可增產9%。其中本實施例中用到的培養基配方如下:
試管培養基):蔗糖2，玉米漿6.7，碳酸鈣0.5，ρΗ5.8
搖瓶培養基(％):乳糖13，玉米漿3，甘油1.5，碳酸鈣1，部分無機鹽類硫酸鈉0.5，磷酸二氫鉀0.3，硫酸鎂0.005%,硫酸銅0.002%，磷酸二氫鉀0.03，硫酸亞鐵0.0015,ρΗ5.9 ο
[0015]實施例2:
將工業發酵用米孢子用滅菌水洗脫，製成I X IO7個孢子/Cm3的懸濁液。在無菌工作檯上，將稀釋好的懸池液塗布在含青黴素濃度分別為:60mg/ml, 70mg/ml,80mg/ml,90mg/ml,100mg/ml, 110mg/ml的PDA平板培養基上，每個濃度四個直徑90mm培養皿。然在培養箱中遮光，25°C培養7、天觀察菌落的特徵和形態。菌落呈圓臺型突起、突起布滿褶皺、褶皺厚實均勻、顏色呈灰綠色、突起高且粗壯的為待驗證的菌株，選取靠近高濃度的一端的塗布12個平板，共計49個符合要求的菌株，把這些菌株全部挑出、編號、接種到含青黴素60mg/ml的PDA平板培養基上進行復篩，同樣在培養箱中25°C靜置培養6天，最符合上述優良特徵的菌株共計68個挑出、編號。再將挑出的菌株接種到IOml試管培養基中，在搖床上25°C，搖床200轉/分鐘，培養56小時；再轉接到裝有30ml培養基的250ml搖瓶中，搖床上26°C，搖床200轉/分鐘繼續培養6天，每天補加2ml濃度為30%的苯乙酸滅菌溶液。用培養六天後的發酵液，測青黴素的效價，效價在3X104IU/ml以上的即為優良高產菌株。通過本實施例，獲得一個耐受性好遺傳穩定的新菌株，其效價為3.4X 104IU/ml，可增產12%。其中本實施例中用到的培養基配方如下:
試管培養基(％ ):蔗糖2，玉米漿6.7，碳酸鈣0.5，ρΗ5.8
搖瓶培養基(％):乳糖13，玉米漿3，甘油1.5，碳酸鈣1，部分無機鹽類硫酸鈉0.5，磷酸二氫鉀0.3，硫酸鎂0.005%,硫酸銅0.002%，磷酸二氫鉀0.03，硫酸亞鐵0.0015，ρΗ5.9 。
【權利要求】
1.一種產黃青黴菌菌種的優選方法，其特徵在於:將工業發酵用米孢子的懸濁液，塗布在含有高濃度梯度青黴素的PDA培養基上誘變並初篩，在培養箱中培養，以菌落的形態為特徵選出優良菌株，然後再用含青黴素的PDA平板復篩，選出表現優良的菌株，接種到搖瓶中微量發酵，以效價為特徵選出優良高產菌株。
2.如權利要求1所述的一種產黃青黴菌菌種的優選方法，其特徵在於所述米孢子懸濁液:是將工業發酵用米孢子用滅菌水洗脫，製成IXlO6 IX IO7個孢子/ml的懸濁液。
3.如權利要求1所述的一種產黃青黴菌菌種的優選方法，其特徵在於:初篩用PDA培養基所含青黴素的濃度分別為:50~60mg/ml, 60~7Omg/ml, 7O~80mg/ml, 80~90mg/ml,90~lOOmg/ml,100~110mg/ml。
4.如權利要求1所述的一種產黃青黴菌菌種的優選方法，其特徵在於:復篩用PDA培養基所含青黴素的濃度為6(T70`mg/ml。
【文檔編號】C12N1/14GK103834571SQ201210471741
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月21日 優先權日:2012年11月21日
【發明者】張偉寶 申請人:青島百草匯中草藥研究所