淋巴管和血管的內皮細胞基因的製作方法

2023-05-13 02:26:16

專利名稱：淋巴管和血管的內皮細胞基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及在淋巴管內皮細胞中特異性表達的多核苷酸和蛋白。
背景技術：
近來關於淋巴血管生長因子(lymphangiogenic growth factors)和癌症的淋巴管內生長和轉移(Mandriota等，EMBO J.20672-682(2001)；Skobe，等，Nat.Med.7192-198(2001)；Stacker，等，Nat.Med.7186-191(2001)；Karpanen等，Cancer Res.611786-1790(2001))的聯繫的證據表明，淋巴管可用作腫瘤治療的又一個靶點。癌細胞通過直接侵入周圍組織，擴散到體腔，侵入血管系統(血管源性轉移)在體內擴散，也通過淋巴系統擴散(淋巴轉移)。局部淋巴結播散是多種常見癌症轉移的第一步，並且和疾病的預後高度相關。參與從腫瘤區引流組織液的淋巴結稱為哨兵淋巴結(sentinel nodes)，在適當的位置上通過診斷發現這些淋巴結，並在疑有癌細胞轉移的情況下，則去除它們。然而，雖然其與臨床相關(relevance)，對於導致通過血流或通過淋巴系統轉移的機制卻知之甚少。
直到最近，儘管淋巴管在醫學上很重要，它們受到的重視遠小於血管。淋巴管從大多數組織的組織間隙收集富含蛋白質的液體和白細胞，並將它們作為淋巴這種白色不透明的液體運輸到血液循環。小淋巴管匯合成較大的淋巴管，將淋巴液通過胸導管引流到頸部的大靜脈。淋巴結是沿淋巴管分布的過濾站，收集淋巴管(collecting lymphatic vessels)周圍的平滑肌收縮和身體的運動(bodily movements)驅動淋巴的運動，流動的方向由靜脈內的瓣膜控制，就像在靜脈中一樣。淋巴毛細管內覆內皮細胞，它們之間具有很多大的內皮間隙並有明顯的接點。淋巴毛細管還缺乏連續的基底膜，而且沒有周細胞。錨絲(Anchoring filaments)連接淋巴管內皮細胞的近腔表面和血管周圍的細胞外基質，並在組織水腫時錨絲牽引內皮細胞以保持淋巴管的開放。淋巴管缺乏或堵塞通常由感染，外科手術或放療造成，極少數情況下由遺傳缺陷造成，使得蛋白富集液在組織中聚集，即淋巴水腫。淋巴系統對於腸脂肪吸收和免疫應答也很重要。細菌，病毒和其他外來物質被淋巴管吸收並運送到淋巴結，在淋巴結中，外來物質被呈遞給免疫細胞，而樹突細胞則在此藉由淋巴來穿行。對操縱淋巴管的理解和能力進展緩慢。
淋巴管內皮細胞的發育或功能異常可導致淋巴管腫瘤或畸形，例如淋巴管瘤或淋巴管擴張。Witte等，Regulation of Angiogenesis(eds.Goldber，I.D. Rosen，E.M.)65-112(Birk_user，Basel，Switzerland，1997)。VEGFR-3酪氨酸激酶受體在正常淋巴內皮中表達，並在多種類型的血管腫瘤中發生上調，包括卡波奇肉瘤(Kaposi’s sarcomas)。Jussila等，Cancer Res 58，1955-1604(1998)；Partanen，等，Cancer 862406-2412(1999)。由感染，手術，放射治療或遺傳缺陷造成的淋巴管缺失或功能障礙導致淋巴水腫，其特徵是富含蛋白的液體在該組織中的慢性累積，從而導致腫脹。VEGFR-3信號對淋巴管生成的重要性在家族性淋巴水腫的遺傳學中得到了揭示，所述疾病的特徵是皮膚淋巴管發育不全，導致外貌變醜和肢體腫脹致殘。Witte，等，Regulationof Angiogenesis(eds.Goldber，I.D. Rosen，E.M.)65-112(Birk_user，Basel，Switzerland，1997)；Rockson，S.G.，Am.J.Med.110，288-295(2001)。一些患有淋巴水腫的家族成員是編碼酪氨酸激酶結構域的VEGFR3外顯子的錯義突變雜合子，這種突變導致受體蛋白失活。Karkkainen，等，Nature Genet.25153-159(2000)；Irrthum，等，Am.J.Hum.Genet.67295-301(2000)。
本領域需要關於控制內皮細胞多樣性的轉錄程序的信息，以及血管生成和淋巴管生成的機制的信息。本領域還需要新的血管標誌物，所述標誌物可用作研究包括腫瘤轉移在內的多種涉及淋巴管的疾病的有價值的靶點。

發明內容
本發明的組合物包括分離的多核苷酸，具體為淋巴管內皮細胞基因，多肽，這些多核苷酸編碼的分離的多肽，重組DNA分子，克隆的基因或其簡併變體，尤其是天然存在的變體例如等位基因變體，以及特異性識別一種或多種存在於所述多肽上的表位的抗體。
本發明的組合物還包括含有本發明的多核苷酸的載體(包括表達載體)，經遺傳改造含有這種多核苷酸的細胞，和經遺傳改造表達這種多核苷酸的細胞。
在選定的實施方案中，本發明這種分離的多核苷酸包含序列表中所述的多核苷酸序列，例如SEQ ID NO1-30之一。
本發明的多核苷酸還包括，但不限於，與SEQ ID NO1-30的核苷酸序列的互補序列在高度嚴格的條件下雜交的多核苷酸；與SEQ ID NO1-30的核苷酸序列的互補序列在中等嚴格的條件下雜交的多核苷酸；上述任一種多核苷酸的等位基因變體多核苷酸；編碼上述任一種蛋白的種同源物(species homologue)的多核苷酸；編碼包含SEQ ID NO1-30之一編碼的多肽的特定結構域或截短部分(truncation)的多肽的多核苷酸。示例性的高度嚴格的雜交條件是在42℃，含有50％甲醯胺，5xSSPE，5x Denhardt′s溶液，0.1％SDS和0.1mg/ml變性的鮭精DNA的溶液中雜交20小時，然後用1xSSC，0.1％SDS在65℃洗滌30分鐘。
本發明的另一方面涉及LEC和BEC多肽，包括上述多核苷酸編碼的多肽。在一些實施方案中，所述多肽是本發明多肽的成熟形式。特別是經純化並分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO31-44，46，48，50，52，81，187，207，211，221，235，241，293，和391之一的胺基酸序列；以及經純化並分離的多肽，所述多肽包含選自以下序列的胺基酸序列(a)SEQ ID NOs31-34，46，48，207，676，859，和861；和(b)(a)中的胺基酸序列的包括至少10個胺基酸的胞外區片段。此外，本發明還包括上述純化並分離的可溶性多肽，所述多肽包含SEQ ID NO31-34，46，48，207，676，859，和861之一的胺基酸序列的胞外區片段，其中所述多肽缺乏任何跨膜區。這種多肽還缺乏任何細胞內區。本發明還涉及融合蛋白，所述蛋白包含與有含免疫球蛋白恆定區的免疫球蛋白片段融合的上述多肽。
相關地，本發明還提供了一種組合物，所述組合物包含上述的多肽或蛋白，以及可藥用的稀釋劑，載體或佐劑。本發明的多肽組合物可包含可接受的載體，如親水的載體例如可藥用的載體。還提供了包含這樣一種組合物的試劑盒，以及給藥受試哺乳動物所述藥物組合物來調節受試動物體內的淋巴系統的方案。本發明還提供了特異性結合上述多肽的抗體，在一些實施方案中所述抗體是人源化的。本發明還提供了包含特異性結合上述多肽的抗體的抗原結合區的蛋白，其中所述蛋白與所述多肽特異性結合。
本發明還涉及製備多肽的方法，包括在適宜的培養基中，使本發明的細胞培養物生長，並純化來自培養物或細胞提取物的蛋白。具體地，本發明涉及製備LEC多肽的方法，包括使得用本文所述的表達載體轉化或轉染的宿主細胞生長，其中生長的條件使所述細胞表達所述多核苷酸編碼的多肽。
本發明還提供了鑑定本文的產物和組合物的方法。具體地，本發明提供了鑑定LEC核酸的方法，包括(a)使含有候選LEC核酸的生物樣品和多核苷酸或其互補體在嚴格的雜交條件下接觸，所述多核苷酸包含SEQ IDNO1-30，45，47，49，51，82，93，111，188，208，212，236，242，294，和392之一的至少14個連續核苷酸的片段，所述雜交條件為(i)42℃，在含有50％甲醯胺，5xSSPE，5x Denhardt′s溶液，0.1％SDS和0.1mg/ml變性的鮭精DNA的溶液中雜交20小時，和(ii)65℃，1xSSC，0.1％SDS中洗滌30分鐘；和(b)檢測候選LEC核酸和該多核苷酸的雜交，由此鑑定LEC核酸。
本發明還提供了鑑定LEC蛋白的方法，包括(a)使含有候選LEC蛋白的生物樣品和選自本文所述抗體或本文所述蛋白或多肽的LEC蛋白結合配偶體在適宜二者結合的條件下接觸；和(b)檢測候選LEC蛋白和LEC結合配偶體之間的結合，由此鑑定LEC蛋白。
本發明還涉及鑑定LEC的方法，包括(a)使包含細胞的生物樣品和LEC結合配偶體在適宜兩者結合的條件下接觸，其中的LEC結合配偶體包含與多肽結合的抗體或該抗體的抗原結合片段，所述多肽包含SEQ IDNO31-34，46，48，207，676，859，和861之一；和(b)通過檢測細胞和LEC結合配偶體之間的結合鑑定LEC，其中LEC結合配偶體與細胞的結合可鑑定LEC。
本發明的多核苷酸在分子生物學領域的熟練技術人員已知的多種技術中有多種應用。這些技術包括用作雜交探針，作為PCR的引物，用於染色體和基因作圖，用於重組製備蛋白，和用於產生反義DNA或RNA、其化學類似物等諸如此類。例如，mRNA的表達主要限於特定的細胞或組織類型例如淋巴管內皮細胞時，本發明的多核苷酸可用作雜交探針，使用例如原位雜交法檢測樣品中特定細胞或組織mRNA的存在。
另一方面，本發明提供了一種包含分離的多核苷酸的組合物，所述多核苷酸包含編碼包含SEQ ID NO31-44，46，48，50，52，81，187，207，211，221，235，241，293，和391之一的胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及可藥用的稀釋劑，載體或佐劑。在一些實施方案中，所述組合物包含編碼該多肽的多核苷酸或其片段，所述多核苷酸包括SEQ ID NO14-30，45，47，49，51，82，93，111，188，208，212，222，236，242，294，和392之一的核苷酸序列。
本發明還提供了包含表達控制序列的表達載體，所述序列與包含編碼包含SEQ ID NO31-44，46，48，50，52，81，187，207，211，221，235，241，293，和391之一的胺基酸序列的多肽的核苷酸序列可操作地連接。在一些實施方案中，所述表達載體是含所述多核苷酸的複製缺陷的腺病毒或腺伴隨病毒載體。本發明另一方面涉及包含上述表達載體和可藥用的稀釋劑，載體或佐劑的組合物。此外，本發明提供了包含組合物的試劑盒，所述組合物包含上述多核苷酸或載體以及可藥用的稀釋劑，載體或佐劑，其包裝內還有將該組合物給藥受試哺乳動物以調節受試動物的淋巴系統的方案。
本發明還提供了由上述表達載體轉化或轉染的宿主細胞。
本發明的多肽可用於多種傳統方法和目前用於其它蛋白的方法中。此外，本發明的多肽還可用於產生特異性結合該多肽的抗體。
本發明還提供了差異調節血管內皮細胞(BEC)或淋巴管內皮細胞(LEC)的生長和分化的方法，包括使內皮細胞和包含差異調節血或淋巴管內皮細胞的試劑的組合物接觸，所述試劑選自(a)包含BEC多肽或LEC多肽的胺基酸序列的多肽，或該多肽的活性片段；(b)包含編碼(a)的多肽的核苷酸序列的多核苷酸；(c)特異性結合(a)的多肽的抗體；(d)包含(c)的抗體的片段的多肽，其中所述片段和抗體與所述多肽結合；(e)編碼(a)的多肽的人基因或mRNA的反義核酸；(f)編碼(a)的多肽的人基因或mRNA的幹擾RNA(RNAi)。所述方法包括使內皮細胞與所述組合物在活體外或活體內接觸。所述組合物可包含可藥用的稀釋劑，佐劑或載體，而且所述接觸步驟包括將所述組合物給藥受試哺乳動物從而差異調節受試哺乳動物的BEC或LEC。
此外，所述方法包括鑑定患有以LEC過度增生為特徵的疾病的人類受試者；給藥所述人類受試者該組合物，其中的試劑差異性抑制LEC的生長和BEC的生長；可選地該方法可包括鑑定患有以LEC過度增生為特徵的疾病的人類受試者；篩選受試者的LEC以便鑑定表3中的多肽的過度表達；將該組合物給藥該人類受試者，其中所述試劑通過抑制篩選步驟鑑定的多肽的表達，差異抑制LEC的生長和BEC的生長。
本發明還涉及調節人類受試者的淋巴管內皮細胞的生長的方法，包括以下步驟鑑定患有增生性淋巴疾病的人類受試者，篩查受試者鑑定表3所示LEC多肽的過低表達或過低活性，其中所述蛋白不在表1或2中；將所述組合物給藥所述人類受試者，其中所述試劑包括篩選步驟所鑑定的LEC多肽(a)或該多肽的活性片段，或包括包含編碼該多肽的核苷酸序列的多核苷酸(b)。
本發明的另一方面涉及使用一種試劑製備用於差異調節血管內皮細胞(BEC)或淋巴管內皮細胞(LEC)的生長或分化的藥物，所述試劑選自(a)包含BEC多肽或LEC多肽的胺基酸序列的多肽，或該多肽的活性片段；(b)包含編碼多肽(a)的核苷酸序列；(c)特異性結合多肽(a)的抗體；(d)包含(c)的抗體的片段的多肽，其中所述片段和抗體與該多肽結合；(e)編碼多肽(a)的人基因或mRNA的反義核酸；(f)編碼多肽(a)的人基因或mRNA的幹擾RNA(RNAi)。
本發明另一方面提供了調節內皮細胞生長的化合物的鑑定方法，包括以下步驟在存在或缺失一種化合物的條件下培養內皮細胞；測定細胞內BEC或LEC基因的至少一種的表達，其中BEC或LEC基因選自編碼表3和4中的多肽的基因，其中存在所述化合物相比於缺失所述化合物時至少一種BEC基因的表達改變表明該化合物是BEC生長的調節物，且其中存在所述化合物相比於缺失所述化合物時至少一種LEC基因的表達改變表明該化合物是LEC生長的調節物。所述方法可用於篩選選擇性調節BEC或LEC生長或分化的化合物，其中測定步驟包括測定細胞中至少一種BEC基因和至少一種LEC基因的表達，且其中所述方法包括通過篩選差異調節至少一種BEC基因的表達相比於至少一種LEC基因的表達的化合物，篩選出可選擇性調節BEC或LEC生長或分化的化合物。
此外，本發明涉及本發明上述方面的方法或用途，其中所述多肽是表3中的LEC多肽，以及差異調節LEC生長或分化相比於BEC生長或分化的試劑。在一些實施方案中，所述LEC多肽包括SEQ ID NO81，187，207，211，221，235，241，293，和391之一的胺基酸序列；在另外的實施方案中，所述LEC多肽包括SEQ ID NO31-34，46和48之一的胺基酸序列。在這些實施方案中，試劑可以是特異性結合上述LEC多肽的抗體，或者這種抗體的多肽片段。此外，該試劑可以是上述多肽的胞外區，或編碼胞外區的多核苷酸，或者反義分子或核酸。可選地，所述多肽是表4中的BEC多肽，且該試劑差異調節BEC生長分化相比於LEC生長和分化。優選，所述多肽不在表1或2中。
本發明的方法還涉及檢測樣品中本發明的多核苷酸或多肽存在的方法。這種方法可例如，被用作上述疾病的預後和診斷評估的一部分，以及鑑定顯示易患有所述疾病的受試者。此外，本發明還提供了在用於治療與淋巴管內皮細胞有關的疾病的臨床實驗中評估藥物有效性，監控病人的病情進展的方法。
本發明還提供了鑑定調節本發明的多核苷酸和/或多肽的表達的化合物。所述方法可用於例如，鑑定可緩解與上述SEQ ID NO1-30之一的蛋白表達有關的疾病的症狀的化合物。這種方法包括，但不限於，用於鑑定與本發明的多肽反應(例如結合)的化合物或其他物質的分析試驗。
此外，本發明提供了測定患遺傳性淋巴水腫的危險性的方法，所述方法包括(a)測定人類受試者中與遺傳性淋巴水腫基因型相關的核酸突變，而且與相應的野生型等位基因所編碼的多肽的胺基酸序列相比，所述突變改變該人類受試者的至少一種等位基因編碼的胺基酸序列，其中所述野生型多肽是表3中鑑定的多肽。可選地，測定患遺傳性淋巴水腫的危險性的方法，包括(a)測定人類受試者中與遺傳性淋巴水腫基因型相關的核酸突變，而且與相應的野生型等位基因所編碼的多肽的胺基酸序列相比，所述突變改變該人類受試者的至少一種等位基因編碼的胺基酸序列，其中所述野生型多肽包含SEQ ID NO31-44，46，48，52，54，207，676，859，和861之一的胺基酸序列；(b)使核酸中突變的存在或缺失與患遺傳性淋巴水腫的危險性相關，其中核酸中所述突變的存在與患遺傳性淋巴水腫的危險性相關，且核酸中所述突變缺失與患遺傳性淋巴水腫的危險性不增加相關。
測定患淋巴水腫的危險性的另一種方法包括以下步驟(a)測定人類受試者的核酸的突變，所述突變改變了人類受試者的至少一種轉錄因子等位基因編碼的胺基酸序列，並且與野生型等位基因編碼的轉錄因子多肽的轉錄調節活性相比，所述突變改變了該等位基因編碼的轉錄因子多肽的轉錄調節活性，其中所述野生型轉錄因子多肽包含SEQ ID NO81，SEQ ID NO211，SEQ ID NO241之一的胺基酸序列，和表5中的序列編碼的轉錄因子；和(b)使核酸中所述突變的存在或缺失和發生遺傳性淋巴水腫的危險性相關聯，其中核酸中存在所述突變和患淋巴水腫危險性增加相關，而核酸中缺失所述突變和患遺傳性淋巴水腫危險性不增加相關。在該方法中，所述野生型轉錄因子等位基因可包含表述為SEQ ID NO54的Sox18胺基酸序列。在本方法的一些實施方案中，所述分析鑑定了改變Sox18等位基因編碼的蛋白的反式激活區或DNA結合區的胺基酸序列的突變；在本方法的另一些實施方案中，與野生型SOX18對相應基因的轉錄活化相比，所述突變降低了SOX18反應型基因的轉錄活化。
本發明另一方面提供了測定患遺傳性淋巴水腫的危險性的方法，包括(a)測定人類受試者的核酸中的突變，其中與野生型等位基因編碼的野生型粘附多肽相比，所述突變改變至少一種LEC基因的等位基因編碼的胺基酸序列，並改變該LEC基因等位基因編碼的粘附多肽的結合親合力，其中所述野生型粘附多肽包含SEQ ID NO31-34，46，207，676，859，和861之一的胺基酸序列；和(b)使核酸中存在或缺失所述突變和患遺傳性淋巴水腫的危險性相關聯，其中核酸中存在所述突變和出現淋巴水腫的危險性增加相關聯，而核酸中缺失所述突變和患遺傳性淋巴水腫的危險性不增加相關聯。在本方法的一些實施方案中，至少一種基因相應於編碼SEQ ID NO54所述的胺基酸序列的人Sox18基因。
在測定出現本發明的遺傳性淋巴水腫的方法中，所述測定可確定突變的存在，並且關聯性步驟可確定病人患遺傳性淋巴水腫的危險性的增加。
本發明還涉及篩選患遺傳性淋巴水腫的危險性增加的人類受試者的方法，包括測定人類受試者的核酸中的突變，所述突變改變了所述核酸編碼的至少一種包含表3中胺基酸序列的多肽的胺基酸序列。在本發明的一些實施方案中，所述多肽包SEQ ID NO31-44，46，48，50，52，54，207，676，859，以及861之一的胺基酸序列，並與患遺傳性淋巴水腫的危險性相關聯，而且特別涉及包含SEQ ID NO54的SOX18胺基酸序列的多肽。
本發明的另一方面涉及測定或篩選出現上述遺傳性淋巴水腫的危險性的方法，其中該方法包括以下步驟的至少一步(a)測定人類受試者的至少一種多核苷酸的至少一個密碼子的核苷酸序列；(b)進行雜交試驗以便測定所述人類受體的核酸具有的核苷酸序列和一種或多種對照序列相同還是不同；(c)進行多核苷酸遷移(migration)試驗，確定人類受試者的核酸具有的核苷酸序列和一種或多種對照序列相同還是不同；(d)使用限制性內切酶進行消化，確定人類受試者的核酸具有的核苷酸序列和一種或多種對照序列相同還是不同。
本發明的另一方面提供了測定或篩選出現上述遺傳性淋巴水腫的危險性，其中所述方法包括進行聚合酶鏈反應(PCR)以便擴增包含LEC多核苷酸編碼序列的核酸，並測定所擴增核酸的核苷酸序列。
本發明還提供了篩選人類受試者中的遺傳性淋巴水腫基因型的方法，包括(a)提供包含來自所述受試者的核酸的生物樣品，和(b)分析所述核酸中存在的突變，與編碼SEQ ID NO31-44，46，48，50，52，54，207，676，859，和861之一的胺基酸序列的人類基因相比，所述突變改變了人類受試者中的至少一種基因的至少一種等位基因所編碼的胺基酸序列，其中當所述突變改變人受試者中編碼的胺基酸序列，且這種改變與人類受試者中的淋巴水腫相關時，這種突變的存在指示了遺傳性淋巴水腫基因型。在本方法的一些實施方案中，所述生物樣品是細胞樣品。在本方法的另一些實施方案中，所述分析包括測定所述核酸的一部分的序列。本發明的另一些實施方案中，所述人類受試者通過篩選方法被鑑定為具有遺傳性淋巴水腫基因型。
本發明另一方面提供了抑制淋巴管生成的方法，包括給藥受試者LEC跨膜多肽的抑制物，其中所述LEC跨膜多肽包括SEQ ID NO31-34，46 48，207，676，859，和861之一的胺基酸序列，且其中所述抑制物選自(a)LEC跨膜多肽的可溶性細胞外區片段；(b)與所述LEC跨膜多肽的胞外區結合的抗體；(c)包含(b)的抗體的抗原結合區的多肽；和(d)與編碼該LEC跨膜多肽的核酸或其互補鏈互補的反義核酸。在本方法一些實施方案中，所述抑制物是包含LEC多肽的胞外區片段的多肽，其中胞外區序列選自以下序列SEQ ID NO31的胺基酸1-152，SEQ ID NO32的胺基酸1-695和SEQ IDNO33的胺基酸1-248。在本方法的一些實施方案中，所述受試者是患有腫瘤的人。
本發明還提供了調節受試哺乳動物的淋巴管生成的方法，包括將LEC多核苷酸的反義分子給藥需要調節淋巴管生成的受試哺乳動物，其量可有效抑制LEC多核苷酸編碼的多肽的轉錄或翻譯，其中所述LEC多核苷酸包含選自SEQ ID NO14-30，45，47，49，51，208，677，860，和862之一的核苷酸序列。
本發明的方法還包括治療上述與淋巴管內皮細胞相關的疾病的方法，包括將該化合物給藥顯示與所述疾病相關的症狀或有患該病趨勢的個體。
本發明另一方面提供了治療遺傳性淋巴水腫的方法，包括(a)鑑定患有遺傳性淋巴水腫的人類受試者，而且與包含SEQ ID NO31-44，46，48，50，52，54，207，676，859，和861之一的胺基酸序列的多肽的胺基酸序列相比，所述人類受試者具有的突變改變了所編碼的至少一種多肽的胺基酸序列；和(b)將淋巴管生長因子給藥所述受試者，所述淋巴管生長因子選自VEGF-C多核苷酸，VEGF-C多肽，VEGF-D多核苷酸，和VEGF-D多肽。
本發明還提供了治療遺傳性淋巴水腫的方法，包括鑑定患有淋巴水腫的人類受試者，所述人類受試者中編碼表3所示LEC蛋白的基因的至少一種等位基因具有突變，所述突變與人類受試者中的淋巴水腫相關；且其中LEC蛋白不是VEGFR-3；以及將一種包含淋巴管生長試劑的組合物給藥受試者，所述試劑選自；VEGF-C多肽，VEGF-D多肽，VEGF-C多核苷酸，和VEGF-D多核苷酸。本發明還涉及利用選自VEGF-C多肽，VEGF-D多肽，VEGF-C多核苷酸，和VEGF-D多核苷酸的淋巴管生長試劑製備用於治療遺傳性淋巴水腫的藥物的用途，其中遺傳性淋巴水腫由表3中鑑定的LEC基因的突變造成，且其中的基因不是VEGFR-3。
此外，本發明涉及通過給藥調節靶基因產物的總體活性的化合物和其它物質治療這種疾病或病症的方法。化合物和其它物質可在靶基因表達或靶蛋白活性的水平上起所述調節作用。這些治療方法包括將本發明的多肽或多核苷酸給藥內皮細胞，例如LEC和/或BEC，或例如人類病人等有機體。本發明的示例性方法是給藥以下治療劑之一能夠調節本發明的至少一種多核苷酸的表達的反義多核苷酸，本發明的多肽，本發明的多核苷酸，特異性識別本發明的多肽的抗體或抗體片段，VEGF-C多核苷酸，VEGF-C多肽，VEGF-D多核苷酸，VEGF-D多肽和可溶性VEGFR-3多肽。
本發明另一方面提供了篩選內皮細胞疾病或患有該疾病的傾向性的方法，包括從人類受試者獲得包含內皮細胞mRNA的生物樣品；根據樣品中由該基因轉錄的mRNA的量測定BEC或LEC基因的表達，其中BEC或LEC基因編碼表3或4中鑑定的多肽。
本發明涉及抑制淋巴管內皮細胞生長的方法，所述方法包括使細胞和組合物接觸，所述組合物包含至少一種與能夠抑制生長的試劑偶聯的抗體，其中所述試劑選自細胞毒性劑和細胞生長抑制劑，其中所述抗體特異性結合由一種多核苷酸編碼的多肽，其包含SEQ ID NO14-17，45，47，860和862之一的序列。本發明的一個具體實施方案中，所述多肽包含SEQ IDNO31-34，46，48，859和861之一的胺基酸序列。
本發明還涉及檢測淋巴管內皮細胞的方法，所述方法包括將細胞和一種組合物接觸，所述組合物包含至少一種與可檢測的試劑，例如螢光分子或放射標記的分子偶聯的抗體。在具體的實施方案中，所述抗體特異性結合包含SEQ ID NO14-17，45，47，860和862之一的序列的多核苷酸編碼的多肽。本方法更具體的實施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO31-34，46，48，859和861之一的胺基酸序列。
本發明還涉及分離淋巴管內皮細胞的方法，其包括將所述細胞域固體基質接觸，所述基質含有至少一種能夠和細胞的細胞膜中的跨膜蛋白結合的抗體，並分離與該抗體基質特異性結合的細胞。在具體的實施方案中，所述抗體與包含SEQ ID NO14-17，45，47，860和862之一的序列的多核苷酸編碼的多肽特異性結合。本方法更具體的實施方案中，所述多肽包含SEQID NO31-34，46，48，859和861之一的胺基酸序列。
本發明還涉及將激動劑或拮抗劑給藥淋巴管內皮細胞，包括選擇能夠特異性結合淋巴管內皮細胞特異蛋白的抗體，肽或小分子量化合物，其中的抗體，肽或小分子量的化合物是生長因子受體，細胞因子受體，趨化因子受體，或造血因子受體的激動劑或拮抗劑，並將所述抗體，肽或小分子量的化合物和需要生長刺激或抑制的淋巴管內皮細胞接觸。在具體的實施方案中，這種淋巴管內皮細胞與淋巴水腫，淋巴管瘤，淋巴管骨髓瘤(lymphangiomyeloma)，淋巴管肌瘤病(lymphangiomatosis)，淋巴管擴張(lymphangiectasis)，淋巴管肉瘤(lymphosarcoma)和淋巴管硬化(lymphangiosclerosis)有關。
本發明還涉及將細胞毒性或細胞生長抑制性藥物給予淋巴管內皮細胞，包括篩選能夠特異性結合淋巴管內皮細胞特異性蛋白的抗體，肽或小分子量化合物，其中所述抗體，肽或小分子化合物與細胞毒性或細胞生長抑制性的藥物結合。在具體的實施方案中，所述複合物給藥可用於治療易於轉移到淋巴系統的惡性腫瘤疾病。
本發明還提供了監測藥物對內皮細胞的效力或毒性的方法，包括測定給藥前後受試哺乳動物內皮細胞的至少一種BEC或LEC基因的表達，其中所述至少一種BEC或LEC基因編碼表3或4中所述的多肽，並且其中BEC或LEC基因的表達的改變和藥物對內皮細胞的效力或毒性有關。
所述發明涉及淋巴管內皮細胞標記蛋白，所述蛋白包含SEQ IDNO14-17之一的多核苷酸；和在嚴格條件下與SEQ ID NO14-17之一雜交的多核苷酸編碼的多肽。在具體的實施方案中，所述淋巴管內皮細胞標記蛋白包含SEQ ID NO31-34之一的多肽。
本發明還涉及能夠特異性結合淋巴管內皮細胞標記蛋白的抗體，所述標記蛋白包含SEQ ID NO31-34之一的多肽。
本發明還涉及檢測淋巴管內皮細胞的方法，包括使所述細胞和抗體接觸，其中所述抗體具有可檢測的標記。
本發明還涉及抑制淋巴管內皮細胞的至少一種生物活性的方法，包括使細胞和能夠與至少一種由SEQ ID NO14-17，45，47，860和862之一編碼的多肽結合的試劑接觸，其中所述多肽與沒有和該試劑接觸的多肽相比，活性被降低。
本發明還涉及抑制淋巴管內皮細胞生長的方法，所述方法包括將所述細胞和一種反義寡核苷酸接觸，所述反義寡核苷酸能夠特異性結合至少SEQ ID NOSEQ ID NO1-30，45，47，860和862之一的多核苷酸。在具體的實施方案中，所述反義寡核苷酸主要由SEQ ID NO1-30，45，47，860和862之一的約12到約25個連續的核苷酸組成。
根據本申請的全文內容，本發明的其它特徵和變化對於本領域熟練技術人員是顯而易見的，並且所有這些特徵都意圖作為本發明的內容。


圖1LEC和BEC中差異表達的基因的實例。其轉錄子的Northern印跡和雜交。通過使用GAPDH測證明加樣量相等。在微陣列分析時，從LEC中提取RNA，並在VEGF-C存在的條件下培養(LEC/+C)。驗證微陣列結果時，也從沒有加入VEGF-C的LEC培養物(LEC/-C)中提取RNA作為對照。
圖2BEC和LEC中表達的細胞骨架結構，鈣粘著蛋白複合物和整聯蛋白α9。對LEC和BEC的混合培養物進行雙染，顯示N-鈣粘著蛋白(a)，VE-鈣粘著蛋白(c)，β-連環蛋白(e)，片珠蛋白(plakoglobin)(g)，F-肌動蛋白(i)和整聯蛋白α9(k)，以及LEC特異的標記物podoplanin(綠；b，d，f，h，j，l)。整聯蛋白α9在淋巴管內皮中表達(arrow)但不在血管內皮中表達楔形(arrowhead)。人皮膚的連續切片使用整聯蛋白α9(m)，VEGFR-3(n)或血管內皮抗原PAL-E(o)的抗體染色。
發明詳述淋巴管系統的一個主要作用是去除叢血毛細血管中不斷滲出的過量的富含蛋白的間質液體，並將其引流回血液循環(Witte，M.H.，等，Microsc.Res.Tech.55122-145.2001；Karpanen，T.，等，J.Exp.Med.194F37-F42.2001；Karkkainen，M.J.，等，Trends Mol.Med.718-22.2001)。此外，所述淋巴系統通過淋巴結鏈過濾淋巴液及其抗原，提供了持續的免疫監視，並且是從腸道吸收脂類的主要途徑之一。長期以來已知多種類型的癌症中，淋巴管提供了腫瘤轉移的主要途徑，而且局部淋巴結擴散與疾病的進展相關。遺傳性淋巴水腫，手術後繼發的淋巴水腫，以及絲蟲病引起的淋巴管堵塞，其特徵都是受損部位的功能喪失和變形腫脹，與淋巴管的不全堵塞相關。Witte，M.J.，等，Microsc.Res.Tech 55122-145(2001)。
儘管淋巴管在醫學上很重要，直到最近，人們對血管系統的這部分細胞生物學的注意仍然很少。過去四年中的研究揭示了淋巴管特異的血管內皮生長因子VEGF-C和VEGF-D的存在，所述生長因子是受體酪氨酸激酶VEGFR-3的配體，並顯示了它們對於淋巴管的正常發育的重要性(見，Jeltsch，M.，等，Science 2761423-1425(1997)；Veikkola，T.，等，EMBO J.201223-1231(2001)；M_kinen，T.，等，Nat.Med.7199-205(2001))。這些分子也參與淋巴水腫和淋巴管轉移的發展(Karpanen，T.，等，J.Exp.Med.194F37-F42(2001)；Karkkainen，M.J.，等，Trends Mol.Med.718-22.2001)。
生長因子血管內皮生長因子C(VEGF-C)，以及編碼VEGF-C，和VEGF-C變體和類似物的天然人類和非人類哺乳動物，和鳥類多核苷酸序列，在以下文章中詳述1998年2月2日提交的國際專利申請PCT/US98/01973，1998年8月6日公開的國際公開WO98/33917；Joukov等，J.Biol.Chem.，273(12)6599-6602(1998)；和Joukov等，EMBO J.，16(13)3898-3911(1997)，所有這些文章的全文內容包含在文中作為參考。如本文詳述，人VEGF-C(SEQ ID NO863)最初是以人類細胞中作為419個胺基酸的前蛋白-VEGF-C多肽的形式產生的。根據布達佩斯條約的規定，將編碼人VEGF-C(SEQ ID NO864)的cDNA保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209(USA)，(保藏日1995年7月24日，ATCC保藏號97231)。其它物種的VEGF-C序列也有報導。見例如Genbank保藏號MMU73620(Mus musculus)；和CCY15837(Coturnix coturnix)，包含在文中作為參考。
前蛋白(prepro)-VEGF-C多肽經多階段處理產生成熟的和最活潑的VEGF-C多肽，根據還原條件下的SDS-PAGE估計約為21-23 kD(SEQ IDNO863)。這樣的加工包括單肽(殘基1-31)的裂解；裂解羧基末端肽(大約對應於約胺基酸228-419並具有並具有Balbiani環3蛋白(BR3P)序列的隔開的(spaced)半胱氨酸殘基[Dignam等，Gene，88133-40(1990)；Paulsson等，J.Mol.Biol.，211331-49(1990)])來產生月29kD的部分加工形式；以及裂解(明顯在細胞外)氨基末端肽(大約對應於胺基酸32-103)以產生約21-23kD的完全加工形式。實驗證據表明，部分加工的VEGF-C(例如，29kD的形式)能夠結合VEGFR-3(Flt4受體)，而只有完全加工的VEGF-C才以高親合力結合VEGFR-2。很明顯VEGF-C多肽天然地結合成非二硫化物連接的二聚體。
已證明VEGF-C的胺基酸103-227對於保持VEGF-C的功能不都是必要的。由胺基酸113-213組成(並且缺乏殘基103-112和214-227)的多肽保持結合和刺激VEGF-C受體的能力，並且預期包含大約殘基131到大約殘基211的多肽將保持VEGF-C的生物活性。胺基酸位置156上的半胱氨酸殘基顯示對於VEGFR-2的結合能力很重要。然而，VEGF-CΔC156多肽(即，由於缺失或替代而缺乏該半胱氨酸的類似物)仍然是VEGFR-3的有效激活物。VEGF-C多肽的位置165上的半胱氨酸對於結合兩種受體都很重要，然而缺乏位置83或137上的半胱氨酸的類似物與天然VEGF-C競爭結合兩種受體並刺激兩種受體。
VEGF-D在結構和功能上與VEGF-C最為接近(見美國專利6,235,713和國際專利WO 98/07832，包含在文中作為參考)。VEGF-D的多核苷酸序列見SEQ ID NO866；編碼的胺基酸序列見SEQ ID NO865。和VEGF-C一樣，VEGF-D最初是作為前蛋白肽表達的，並經過了N末端和C末端的蛋白裂解加工，形成非共價連接的二聚體。VEGF-D刺激體內內皮細胞的有絲分裂反應。在胚胎形成期間，VEGF-D以一種複雜的時間和空間模式表達，且它在成人的心臟，肺和骨骼肌中持續表達。VEGF-D的生物活性片段分離物稱為VEGF-DΔNΔC，在國際專利公開WO 98/07832中描述，包含在文中作為參考。VEGF-DΔNΔC由VEGF-D的胺基酸殘基93-201(SEQ ID NO26)組成，可選地與親合標記肽FLAG_，或其他序列連接。
前蛋白-VEGF-D多肽具有推定的21個胺基酸的信號肽，並且明顯通過與加工前蛋白-VEGF-C類似的方式進行蛋白裂解加工。「重組成熟」的VEGF-D缺乏殘基1-92和202-354，其保持活化受體VEGFR-2和VEGFR-3的能力，並且和非共價連接的二聚體結合。因此，優選的VEGF-D多核苷酸包括編碼胺基酸93-201的核苷酸序列。上述將功能保持性修飾引入VEGF-C多肽的方法也適於將功能保持性的修飾引入VEGF-D多肽。本發明的另一方面還涉及實施本發明的方法，其用VEGF-D多肽代替VEGF-C多肽。
與血管內皮細胞相比，淋巴管內皮顯示特殊的形態學和分子特徵。例如，淋巴毛細管比毛細血管更大，它們具有無規且塌陷的管腔，其中沒有血細胞，不連續的基底層，重疊的細胞間連接複合體和將淋巴內皮細胞連接到細胞外基質的錨絲(Witte，M.H.，等，Microsc.Res.Tech.55122-145(2001))。和毛細血管不同，沒有周細胞覆蓋淋巴毛細管。在分子水平上，鑑定了多種淋巴管特異性標記物，包括VEGFR-3，Prox-1轉錄因子，透明質酸(hyaluronan)受體LYVE-1，膜粘蛋白podoplanin，β趨化因子受體D6，細胞骨架蛋白粒橋蛋白I和II以及舉是細胞甘露糖I(Wigle，J.T. Oliver，G.，Cell 98769-778(1999)；Banerji，S.，等，J.Cell Biol.144789-801(1999)Breitenede r-Geleff，S.，等，Am.J.Pathol.154385-394(1999)Nibbs，R.J.，等，Am.J.Pathol.158867-877(2001)；Ebata，N.，等，Microvasc.Res.6140-48.(2001)；Irjala，H.，等，J.Exp.Med.1941033-1041(2001))。本發明還涉及使用基因繪圖(gene profiling)的方法，鑑別淋巴毛細管內皮細胞與血管內皮細胞。
「嚴格的雜交條件」或「嚴格的條件」指這樣一種條件，例如寡核苷酸的核酸在該條件下與其靶序列特異性雜交。嚴格的條件與序列有關，並且根據環境而不同。較長的核酸比較短的核酸的雜交溫度更高。通常，嚴格的條件被選為在特定的離子強度和PH下，比特定序列的熱溶解溫度(Tm)低約5℃。Tm是溫度(在特定的離子強度，PH和核酸濃度條件下)，在該溫度下，約50％的與靶核苷酸互補的核酸與靶核苷酸以等當量雜交。術語「互補」指兩個核酸分子的核苷酸之間的標準Watson-Crick鹼基配對。通常，嚴格的條件是pH7.0-8.3，鹽濃度低於約1.0M鈉離子，通常為約0.01-1.0M鈉離子(或其他鹽)，而且對於短探針，引物和寡核苷酸(例如10-50個核苷酸)溫度至少約30℃，而對於較長的探針，引物和寡核苷酸溫度至少約60℃。如本領域已知，嚴格的條件可通過加入去穩定劑，例如甲醯胺來實現。示例性的嚴格條件是在含有50％甲醯胺，5xSSPE，5x Denhardt′s溶液，0.1％SDS和0.1mg/ml變性的鮭精DNA的溶液中，在42℃下雜交20小時，然後在65℃下，1xSSC，0.1％SDS中洗滌30分鐘。
根據本發明，發現血管和淋巴管內皮細胞具有不同的基因表達圖。這些結果提供了關於內皮細胞基因型多樣性的新發現，並揭示了新的潛在的淋巴內皮分子，其中一些還提供了治療以異常血管生成或淋巴管生成為特徵的疾病的重要靶點。
已發現了編碼參與炎症過程以及介導細胞-細胞和細胞-基質間相互作用的蛋白的基因的表達不同。此外，內皮細胞生物學領域還鑑定了多種以前未知的基因，它們在兩種細胞系中的差異表達。所述基因的一些最初是從神經組織中克隆的，包括參與突觸巨分子的吸收和突觸形成以及重構的基因(neuronal pentraxins I和II(Kirkpatrick，L.L.，等，J.Biol.Chem.27517786-17792.2000)，參與突觸小泡的運輸的基因(NAP-22(Yamamoto，Y.，等，Neurosci.Lett.224127-130.1997)，piccolo(Fenster，S.D.，等，Neuron25203-214(2000))以及參與軸突生長和引導的基因(Nr-CAM(Grumet，M.，Cell Tissue Res.290423-428(1997)，reelin(Rice，D.S. Curran，T.，Annu.Rev.Neurosci.241005-1039(2001))。
此外，LEC還特異性表達一些目前仍未定型的基因，最初在神經組織中克隆並在其中高表達(KIAA基因(Kikuno，R.，等，Nucleic Acids Res.30166-168.2002)。本文的基因表達profiling數據支持一下觀點控制神經細胞定位，引導軸突生長錐(axonal growth cones)到達它們的特異性靶點，以及突觸形成具有相同的分子機制，通常該機制也適用於血管系統形成及BEC和LEC的確定。首先在神經系統發育中描述的一些其他信號分子也參與血管系統的發育，反之也如此(Shima和Mailhos，Curr.Opin.Genet.Dev.10536-542(2000)；Oosthuyse，等，Nat.Genet.28131-138(2001)；Sondell，等，Eur.J.Neurosci.124243-4254(2000))。
在LEC中，觀察到在平滑肌細胞(SMCs)和周細胞中表達的一些基因的表達，例如基質Gla，它是礦質結合的細胞外基質蛋白，參與抑制血管和組織的鈣化(Luo，G.，等，Nature 38678-81(1997))，單胺氧化酶A，它是主要的單胺激素和神經遞質的降解酶(Rodriguez，M.J.，等，Cell Tissue Res.304215-220(2001))，整聯蛋白α9(Palmer，E.L.，等，J.Cell Biol.1231289-1297(1993))和載脂蛋白D(Hu，C.Y.，等，J.Neurocytol.30209-218(2001))。LEC和SMCs之間類似的基因表達模式與淋巴毛細管周圍缺乏SMC有關。LEC還獨立執行一些SMC的任務。例如，淋巴流動的保持是由於LEC的內在收縮性(Witte，M.H.，等，Microsc.Res.Tech.55122-145(2001))，與血管SMCs的收縮能力類似。
淋巴管和血管的分子鑑別在研究涉及血管和/或淋巴管的疾病以及這類疾病的靶向治療中是重要的。目前，已鑑定了多種淋巴內皮特異的標誌物，但其中一些只在部分淋巴管中表達，而另一些也在一些血管內皮或其他細胞類型中表達，而且其表達模式在病理條件下發生改變(例如，VEGFR-3(Valtola，R.，等，Am.J.Pathol.1541381-1390.1999))。本發明的新的血管標記物的鑑定應提供對病理條件下的血管和淋巴管的更可信的分析，並最終使診斷和治療更好。此外，抑制參與血管生成和/或淋巴管生成的調控的特定分子的功能已知能夠防止腫瘤生長和轉移，並且刺激血管和淋巴管的生長顯示對多種病理條件有益。因此，本發明鑑定的BEC和LEC特異性分子調節物可提供治療以異常血管生成和淋巴管生成為特徵的疾病的新靶點。
一些新的LEC基因編碼跨膜蛋白，它們可能是淋巴管內皮細胞特異的分子標記(表6)。這些基因和編碼的蛋白可用於淋巴管疾病的靶向治療。它們也可用於製備抗體，抗LEC特異性蛋白的抗體可用來鑑別生理和病理條件下的血管和淋巴管。抗體也可用於分離淋巴管內皮細胞。這些蛋白也可調節淋巴管生成，並為淋巴管疾病例如淋巴水腫提供新的候選基因。
淋巴管內皮細胞特異性表面分子可用作靶向抗體，肽和小分子量化合物的分子藥物，它們可作為生長因子受體，細胞因子和趨化因子受體，以及造血因子受體信號，細胞粘附和細胞與胞外基質或其他細胞表面分子相互作用的激動劑或拮抗劑。這種分子也可用於將細胞毒性或抑制細胞生長的藥物靶向淋巴管內皮細胞，以及用於附著電荷密集的(electron-dense)，不透射線的，或者放射活性的標記物來顯像與淋巴管相關的疾病過程。所述疾病包括，淋巴水腫，淋巴管瘤，淋巴管骨髓瘤，淋巴管肌瘤病，淋巴管擴張，淋巴肉瘤和淋巴管硬化.
淋巴管內皮細胞表面分子也可用來靶向基因治療，例如通過抗體包被的脂質體(含有蛋白或基因作為運載物)，或通過病毒轉導載體例如具有修飾的衣殼/包膜的腺病毒，腺伴隨病毒或慢病毒。淋巴管內皮細胞特異性分子的處理可用於治療與組織水腫相關的疾病過程，所述治療通過增加液體通過淋巴管壁的運輸，例如通過調節內皮細胞-細胞或細胞-基質相互作用或者通過刺激跨內皮轉運。將例如細胞毒性或抑制細胞生長的化合物靶向淋巴管內皮細胞對於治療可能通過淋巴系統轉移的惡性腫瘤有價值。
淋巴管內皮細胞分子可促進淋巴管內皮細胞的體外生長以及淋巴管的體外組織改造，所述淋巴細胞和淋巴管用於其中的淋巴管被破壞的疾病，例如手術後或者多種類型的淋巴水腫。細胞表面蛋白配體可進一步用於包被各種用於細胞粘附的聚合基質，例如生物植入物。
淋巴管內皮細胞特異性分子例如表面分子是調節感染，自身免疫和感染過程的重要工具，所述過程涉及白細胞遷移和免疫識別以及次級免疫應答的刺激。這種過程包括抗原呈遞細胞遷移入包括淋巴結的淋巴系統，和淋巴細胞和其他白細胞亞類的跨內皮細胞輸送，以及各種類型的白細胞的回巢，存活和功能。
這些分子使得可調節從腸道吸收的包括脂肪酸/乳糜微粒的脂肪酸的代謝，和調控各種器官例如皮下組織和動脈壁的脂肪組織中脂肪的聚集。
淋巴管內皮細胞特異性分子還使得可調節從腸道吸收的包括脂肪酸/乳糜微粒的脂肪酸的代謝，和調控各種器官例如皮下組織和動脈壁的脂肪組織中脂肪的聚集。
淋巴細胞特異性跨膜蛋白據信在細胞粘附(例如淋巴管內皮細胞-淋巴管內皮細胞，淋巴管內皮細胞-平滑肌細胞，淋巴管內皮細胞-免疫系統細胞例如淋巴細胞或樹突細胞之間的粘附)，細胞-胞外基質接觸中起作用，或者作為生長因子，細胞因子，趨化因子，或者微生物受體或離子通道。所述跨膜蛋白和細胞內分子相連，所述細胞內分子可誘導細胞生長，細胞遷移，細胞凋亡，細胞分化或細胞粘附或其他內皮細胞特異的細胞功能，例如白細胞粘附受體的表達，一氧化氮的釋放，抗凝蛋白，吸收周圍組織的液體和蛋白以及腸道或脂肪組織的脂肪。具有短細胞內區的TM蛋白可和其他TM蛋白的複合，作為輔助性受體起作用。
跨膜蛋白及其細胞內結合配偶分子可用作正常和疾病狀態下的淋巴管內皮細胞的分子標記物，並用於鑑別生理和病理情況下的血管和淋巴管。
淋巴管特異性跨膜蛋白的抗體，以及與淋巴管特異性TM蛋白的胞外區結合的肽和小分子化合物可用於粘附電荷密集的，不透射線的或者放射活性的標記物來顯像與淋巴管相關的疾病過程。這種疾病包括淋巴水腫，淋巴管瘤，淋巴管骨髓瘤，淋巴管肌瘤病，淋巴管擴張，淋巴肉瘤和淋巴管硬化。類似地，可在治療患有淋巴管生長不足例如淋巴水腫的病人時，或者可選地在為防止淋巴管生長的治療例如腫瘤的治療時使淋巴管顯像，從而易化本發明的治療方法的監督。
預期LEC-特異性TM蛋白的抗體也可用於分離淋巴管內皮細胞。
淋巴管特異性跨膜蛋白的抗體，或者與淋巴管特異性TM蛋白的胞外區結合的肽或小分子化合物據信可用於將藥物遞送靶向淋巴管內皮細胞，例如通過將抗體，肽或小分子化合物與細胞毒性或抑制細胞生長的化合物偶聯。這種偶聯的化合物可用於治療易於通過淋巴系統轉移的惡性腫瘤疾病，以及緩解與任何這種疾病相關的症狀的治療劑。所述抗體，肽或小分子化合物也可和刺激淋巴管內皮細胞的分子偶聯以加強刺激，所述分子例如生長因子，細胞因子和趨化因子。
此外，淋巴管特異性TM蛋白或與淋巴管特異性TM蛋白的胞外區結合的肽，或小分子化合物的抗體可用來靶向基因治療，例如通過抗體包被的脂質體(含有蛋白，基因或其他分子作為運載體)，或者通過病毒轉導載體例如具有修飾的衣殼/包膜的腺病毒，腺伴隨病毒或慢病毒。淋巴管內皮細胞特異性分子的處理可用於治療與組織水腫相關的疾病過程，所述疾病是由於淋巴管的相對缺乏，或相對功能不全，可以由感染，手術，放射治療或基因缺陷導致液體通過淋巴管壁的運輸增加，例如通過調節內皮細胞-細胞或細胞-基質相互作用或者通過刺激跨內皮轉運。
淋巴管內皮細胞分子可促進淋巴管內皮細胞的體外生長以及淋巴管的體外組織改造，用來治療其中的淋巴管被破壞的疾病，例如手術後或者多種類型的淋巴水腫，以及本文所述的其他應用。細胞表面蛋白配體可進一步用來包被各種用於細胞粘附的聚合基質，例如生物植入物。
涉及白細胞遷移和免疫識別的炎症，自身免疫和感染過程，例如抗原呈遞細胞遷移進入包括淋巴結的淋巴系統，和淋巴細胞和其他白細胞亞類的跨內皮細胞輸送，以及各種類型的白細胞的回巢，存活和功能可通過靶向內皮細胞特異性TM蛋白被調節，該蛋白介導這些細胞粘附過程。
本文還涉及將淋巴管特異性基因的上調，例如在癌症中，用作診斷標誌物，並使用淋巴管內皮細胞特異性蛋白的抗體來監控這種上調表達，例如通過組織免疫染色或通過使用可以淋巴管內皮細胞特異性mRNA在例如本文的嚴格雜交條件下雜交的探針。
淋巴管內皮細胞特異性轉錄因子預期對淋巴管內皮細胞從胚胎幹細胞，內皮前體細胞，或者血管內皮細胞的分化有用。
淋巴管內皮細胞特異性轉錄因子預期可改善淋巴管內皮細胞在體外的生長，以及促進淋巴管的體外組織改造，所述淋巴細胞和淋巴管用於其中的淋巴管被破壞的疾病，例如手術後或者多種類型的淋巴水腫，以及本文公開的其他應用。
細胞內信號蛋白參與調解淋巴管內皮細胞的增殖，分化，凋亡，遷移或粘附的信號通路，預計所述蛋白可用作抑制這些信號事件的小分子化合物的靶點，以及依賴這種信號的細胞功能的靶點。預計信號蛋白還參與VEGFR-3信號通路，並可用於調節至少部分由VEGFR-3信號控制的細胞活性，例如淋巴管生成。
預期淋巴管內皮細胞分子還可改善淋巴管內皮細胞在體外的生長，以及促進淋巴管的體外組織改造，所述淋巴細胞和淋巴管用於其中的淋巴管被破壞的疾病，例如手術後或者多種類型的淋巴水腫，以及本文所述的其他應用。
預期淋巴管特異性轉錄因子也可用於調節內皮細胞中的基因表達，來誘導其它淋巴管特異性基因在例如血管內皮細胞或內皮前體細胞中的表達。
預期淋巴管特異性基因轉錄物可提供用於RNA幹擾(RNAi)誘導的表達抑制的的靶點。RNAi技術與其可用於本發明的方法，例如有效治療高和低增殖性內皮細胞相關疾病和病症的治療方法，以及緩解與任何這種疾病或病症有關的症狀。RNAi的方法在本領域已知，且已知的RNAi技術可用於本發明的多個方面。見Fire等，Nature 391806-811.(1998)和Sharp，P.，Genes和Dev.13139-141.(1999)，包含在文中作為參考。優選RNAi化合物是與表達所需靶點的的部分或全部編碼區對應的雙鏈RNA分子。
多種新的LEC基因編碼轉錄因子，所述轉錄因子控制細胞的命運(iroquois相關同源框基因)，並且在淋巴管內皮細胞的分化中有重要作用。本文公開的轉錄因子可控制例如淋巴管內皮細胞的增殖所涉及的基因的轉錄，並且是淋巴管生長的重要分子調節物(表5)。淋巴管內皮細胞特異性轉錄因子對淋巴管內皮細胞從胚胎幹細胞，內皮前體細胞和從血管內皮細胞中的分化有用。
淋巴內皮轉錄因子使得淋巴管內皮細胞的體內生長，以及促進淋巴管的體內組織改造，用在其中的淋巴管被破壞的疾病中，例如手術後或者多種類型的淋巴水腫。
本發明的多核苷酸通常，本發明分離的多核苷酸包括LEC和BEC多核苷酸，它們顯示不同的表達並在表3，4，14，15和16中被鑑定。這些多核苷酸的序列以及其可獲得的已知的資料庫保藏號在表16中提供。在表14和15種，這些保藏號與唯一的序列鑑定物(sequence idenfier)相關，從而可通過每種保藏物(citation)的序列鑑定物確定保藏號。多核苷酸序列可包括一個編碼區並包括非編碼的側翼序列，可被本領域熟練技術人員輕易鑑定。本發明涉及的多核苷酸包含一個編碼區的部分或全部，具有或不具有側翼區，例如多腺苷酸序列，5′非編碼序列，等等諸如此類。本發明的多核苷酸還包括，但不限於，與SEQ ID NO1-30，45，47，49和51之一的核苷酸序列的互補序列在高度嚴格的雜交條件下雜交的多核苷酸；與SEQ ID NO1-30，45，47，49和51之一的核苷酸序列的的互補序列在中度嚴格的雜交條件下雜交的多核苷酸；上述多核苷酸之一的等位基因變體；編碼上述蛋白之一的種同源物的多核苷酸，編碼包含SEQ ID NO31-44，46，48，50和52之一的特定結構域或截短序列的多肽的多核苷酸。這種多核苷酸在上述條件下與SEQ ID NO1-30，45，47，49和51之一的互補序列或者SEQ ID NO1-30，45，47，49和51之一的片段雜交，其中所述片段大於至少約10bp，並且可選地在其他實施方案中，大於約20到約50bp，或者在適當的情況下，大於約100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，或800bp。
本發明的多核苷酸還提供了上述多核苷酸的變體。通常這種變體序列與上述多核苷酸的差異不大於約20％，即，與相應的對照序列相比，類似序列中單個核苷酸替代，添加，和/或缺失的數量除以變體核苷酸序列的總數為約0.2或更小。這種序列據說與所述序列具有80％的序列相同性。這種變體序列可通常通過應用前述算法鑑定。
在一種實施方案中，本發明的變體多核苷酸序列與所述序列的差異不大於10％，即，，與相應的對照序列相比，類似序列中單個核苷酸替代，添加，和/或缺失的數量除以變體核苷酸序列的總數為約0.1或更小。這種序列據說與所述序列具有90％的序列相同性。這種變體序列可通常通過應用前述算法鑑定。
在本發明另一實施方案中，本發明的變體多核苷酸序列與所述序列的差異不大於5％，即，，與相應的對照序列相比，類似序列中單個核苷酸替代，添加，和/或缺失的數量除以變體核苷酸序列的總數為約0.05或更小。這種序列據說與所述序列具有95％的序列相同性。這種變體序列可通常通過應用前述算法鑑定。
在本發明另一實施方案中，本發明的變體多核苷酸序列與所述序列的差異不大於2％，即，，與相應的對照序列相比，類似序列中單個核苷酸替代，添加，和/或缺失的數量除以變體核苷酸序列的總數為約0.02或更小。這種序列據說與所述序列具有98％的序列相同性。這種變體序列可通常通過應用前述算法鑑定本發明的多核苷酸可以通過已經建立的重組DNA技術(see Sambrook J等(2d Ed.；1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)和其他任何一種核苷酸序列連接。用於連接多肽的核苷酸序列包括各種載體，例如，質粒，粘粒，λ噬菌體衍生物，噬菌粒等本領域已知的載體。相應地，本發明還提供了包含本發明的多核苷酸的載體以及含有該多核苷酸的宿主細胞。通常，載體含有在至少一種生物體中有功能的複製起點，便利的限制性核酸內切酶位點，以及宿主細胞的選擇性標記物。本發明的載體包括表達載體，複製載體，探針生成載體，測序載體(sequencing vectors)，和逆轉錄病毒載體。本發明的宿主細胞可以是原核或真核細胞，並可以是單細胞有機體或者多細胞有機體的一部分。本領域熟練技術人員已知大量適宜的載體和啟動子，並且可購得它們用來產生本發明的重組構建體。
本發明範圍內的序列不限於本文所述的具體序列，還包括其等位基因變體。等位基因變體的測定通常可通過比較SEQ ID NO1-30，45，47，49和51之一的序列，其代表性的中間片段，或者與SEQ ID NO1-30，45，47，49和51之一的序列具有至少99.9％的同一性同核苷酸序列和相同物種的另一分離株(isolate)的序列。此外，為了提供密碼子多樣性，本發明包括的核酸分子編碼的胺基酸序列與本文公開的特異性開放閱讀框架(ORFs)的胺基酸序列相同。換言之，在ORF的編碼區，尤其涉及使用一種密碼子替換另外一種編碼相同胺基酸的密碼子。
除非本文特別指出的，所有定義的術語都是本領域已知的，例如見美國專利6,350,447，包含在文中作為參考。
本發明還涉及根據本發明的LEC或BEC多核苷酸之一的序列的反義多核苷酸。這種反義多核苷酸與在LEC和BEC中差異表達的本發明的多核苷酸序列或其片段是基本互補的(例如，至少90％互補性)，優選完全互補，所述本發明的多核苷酸見序列表，表3，4，14-16，以及本說明書的全文內容。這些多核苷酸序列包括SEQ ID NO1-30，45，47，49和51之一或其包括至少10個連續的核苷酸的片段。所述反義核苷酸包含與編碼蛋白質的「有義」核酸互補的核苷酸序列(例如，與雙鏈cDNA分子的編碼序列或mRNA序列互補)。設計並最優化反義核苷酸的方法見Lima等，(J Biol Chem；272626-38.1997)和Kurreck等，(Nucleic Acids Res.；301911-8.2002)。一方面，本文的反義核酸分子包括與至少約10，25，50，100，250或500個核苷酸或者整個編碼序列互補的序列。本發明的反義核酸通過化學合成或酶偶聯反應使用本領域已知的方法構建。
在一種實施方案中，反義核酸分子與編碼本發明的多肽的核苷酸序列的編碼鏈的「編碼區」反義。術語「編碼區」指包含被翻譯成胺基酸殘基的密碼子的核苷酸序列的區。在另一實施方案中，該反義核酸分子與編碼該多核苷酸的核苷酸序列的「讓步區(conceding region)」反義。術語「讓步區」指與編碼區側接的5′和3′序列，它們不被翻譯成胺基酸(即，也稱為5′和3′非翻譯區)。
本發明的反義核酸可根據Watson和Crick或Hoogsteen鹼基配對規則進行設計。所述反義核酸分子可以和本發明的多核苷酸的mRNA的整個編碼區互補，但更優選僅和mRNA的編碼或非編碼區的一部分反義的寡核苷酸。反義寡核苷酸的長度可以是例如約5，10，15，20，25，30，35，40，45，or50個核苷酸。本發明的反義核酸可使用化學合成或酶偶聯反應使用本領域已知的方法構建。例如，反義核酸(例如，反義寡核苷酸)可利用化學方法，使用天然存在的核苷酸或者經不同的修飾後的核苷酸合成，所述修飾是為了增加分子的生物穩定性或者提高反義和有義核酸之間形成的雙鏈的物理穩定性(例如，可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)。
所述本發明的反義核酸分子通常給藥受體或在原位生成使得它們和編碼互補多核苷酸的細胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結合，從而抑制蛋白的表達(例如通過抑制轉錄和/或翻譯)。雜交反映了形成穩定雙鏈的通常的核苷酸互補性，或者如果反義核苷酸分子與DNA雙鏈結合，表明是通過雙螺旋結構的大溝(groove)中的特異性相互作用。
給藥本發明的反義核酸分子的途徑的實例包括直接注入組織位點。可選地，可修飾反義核酸分子使其靶向選定的細胞然後系統地給藥。例如，就系統給藥而言，反義核酸分子可被修飾使得它們特異性結合選定的細胞表面表達的受體或抗原(例如，通過連接所述反義核酸分子和結合細胞表面受體或抗原的肽或抗體)。反義治療的其他途徑可用於本發明，例如局部給藥，經皮給藥[見Brandin Curr.Opin.Mol.Ther.3244-8.2001]，使用納米顆粒系統的反義給藥[Lambert等，Adv.Drug.Deliv.Rev.4799-112.2001]，或給藥與肽偶聯的反義核苷酸[Juliano等，Curr.Opin.Mol.Ther.2297-303.2000]。
本發明還涉及將本發明的多核苷酸用於基因治療或用於重組表達載體中，所述載體產生可調節LEC活性的本發明的多核苷酸或多肽，並可用於例如淋巴水腫的LEC疾病的治療。將編碼本發明的多肽的功能性基因遞送到適當的細胞可通過使用載體在活體外，原位或活體內實現，所述載體包括病毒載體(例如腺病毒，腺伴隨病毒或逆轉錄病毒)，或在活體外用生理DNA轉移方法(例如，脂質體或化學處理)實現。見，例如，Anderson，Nature，supplement to vol.392，no.6679，25-20頁(1998)。關於基因治療技術的其他綜述見Friedmann，(Science，2441275-1281.1989)；Verma，(ScientificAmerican26368-72，81-84.1990)；和Miller，(Nature，357455-460.1992)。將本發明的任何一種核苷酸或者編碼本發明的多肽的任何一種基因導入也可通過染色體外基質(substrate)(瞬時表達)或人工染色體(穩定表達)實現。細胞也可在存在本發明的蛋白的條件下離體培養，使所述細胞增殖或在細胞中產生所需的效果或活性。在另一實施方案中，包含表達本發明的多核苷酸或多肽的載體的細胞可在活體外培養，並被給藥需要治療LEC疾病或病症的個體。
根據公開的核酸構建體，可能通過常規的重組DNA/RNA技術製備包含SEQ ID NO1-30，45，47，49和51之一的序列的基因之一的基因產物。多種表達載體/宿主系統可用來包含並表達所述編碼序列。這些表達載體/宿主系統包括，但不限於，微生物，例如重組噬菌體轉化的細菌，質粒，噬菌粒或粘粒DNA表達載體；酵母表達載體轉化的酵母菌；病毒表達載體感染的昆蟲細胞系統(例如，杆狀病毒)；病毒表達載體轉染的植物細胞系統(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV；菸草花葉病毒，TMV)或細菌表達載體轉化的植物細胞系統(例如，Ti或pBR322質粒)；甚至動物細胞系統。用於重組蛋白製備的哺乳動物細胞包括，但不限於，VERO細胞，HeLa細胞，中國藏書卵巢(CHO)細胞，COS細胞(例如COS-7)，WI38，BHK，HepG2，3T3，RIN，MDCK，A549，PC12，K562和HEK 293細胞.
本發明的多肽通常，本發明的分離LEC和BEC由上述本發明差異表達的LEC和BEC多核苷酸編碼。LEC和BEC的序列以及其已知的資料庫保藏號在表16中提供。在表14和15中，這些保藏號與唯一的序列鑑定物相關，因此可通過每篇文獻的(citation)序列鑑定物進行鑑定。本發明分離的多肽包括，但不限於，包含SEQ ID NO31-44，46，48，50和52之一的胺基酸序列或者SEQID NO.1-30，45，47，49和51之一的核苷酸序列編碼的胺基酸序列的多肽，或相應的全長或成熟蛋白。本發明還提供了SEQ ID NO.31-44，46，48，50和52之一的胺基酸序列的生物活性或免疫活性變體，或保持生物活性的相應全長或成熟蛋白適宜的變體多肽，該多肽具有至少約65％，至少約70％，至少約75％，至少約80％，至少約85％，86％，87％，88％，89％，至少約90％，91％，92％，93％，94％，典型地至少約95％，96％，97％，更典型地至少約98％，或最典型地至少約99％的胺基酸同一性。本發明還涉及本發明的蛋白的片段，所述片段包含本發明公開的序列的至少10個連續的胺基酸，且能夠顯示相應的全長蛋白的生物活性。
通過公開的核苷酸序列的翻譯在序列表中鑑定了蛋白質編碼序列。這種蛋白的成熟形式可通過全長多核苷酸在適宜的哺乳動物細胞或者其他宿主細胞中的表達獲得。成熟形式的蛋白的序列也可通過全長形式的胺基酸序列確定。本發明的蛋白如果是膜結合的，還提供可溶形式的蛋白。在這種形式中，部分或所有使得蛋白成為膜結合的蛋白的區均被缺失，使得該蛋白能夠從表達它的細胞完整地分泌。
本領域已知的多種方法可用來獲得本發明分離的多肽或蛋白中的任何一種。最簡單的水平上，可使用可購得的肽合成儀來合成所述胺基酸序列。本發明的多肽和蛋白還可任選地從細胞中純化，所述細胞被改變以表達所需的多肽或蛋白。如果細胞通過基因操縱而產生其通常不產生或者以低水平產生的多肽或蛋白，就稱本文的細胞被改變以表達所需的多肽或蛋白。本領域熟練技術人員可輕易採用將重組或合成序列引入真核或原核細胞並在其中表達的方法，以生成可產生本發明的多肽或蛋白之一的細胞。
多肽的「片段」指分子的任何部分，例如肽核(core)，或者肽核的變體，或者多肽的細胞外區。多肽的「變體」指在結構和生物活性上與整個分子，或其片段基本相似的分子。因此，如果兩種分子具有類似的活性，即使兩種分子之一的組成或次級，三級或四級結構與另一種分子不同，或者即使胺基酸殘疾的序列不同，仍認為它們是本發明所述的變體。多肽或遺傳序列的「類似物」指與分離的多肽或遺傳序列在功能和結構上基本類似的蛋白或遺傳序列。
應理解可對純化的或分離的多肽進行保守的胺基酸取代，所述多肽包含SEQ ID NO.31-44，46，48，50和52的序列之一，產生保持生物活性或免疫活性的多肽，特別是這種取代的數目較小時。「保守的胺基酸取代」指一種胺基酸被具有類似的化學性質的側鏈的胺基酸取代。用來進行保守取代的類似的胺基酸包括具有酸性側鏈的胺基酸(穀氨酸，天冬氨酸)；具有鹼性側鏈的胺基酸(精氨酸，賴氨酸，組氨酸)；具有極性氨基側鏈的胺基酸(穀氨醯胺，天冬醯胺)；具有疏水的親脂的側鏈的胺基酸(亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，丙氨酸，甘氨酸)；具有芳香基側鏈的胺基酸(苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸)；具有小側鏈的胺基酸(甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，蛋氨酸)；或者具有脂肪族羥基側鏈的胺基酸(絲氨酸，蘇氨酸)。
微陣列本發明的另一方面是一種組合物，所述組合物包含多種用於檢測以具體細胞類型為特徵的基因表達模式和檢測具體細胞類型例如淋巴管內皮細胞的表達模式中的變化的多核苷酸探針。例如，本發明包含陣列，例如微陣列，所述陣列包含具有選自序列表中顯示的多核苷酸序列的至少10個連續的核苷酸的多核苷酸。
本發明還涉及這樣的微陣列，所述微陣列包含的多核苷酸具有選自SEQ ID NO1-30，45，47，49和5的至少10個連續的核苷酸。本發明的微陣列包含至少3種多核苷酸，其中每種列舉的多核苷酸具有選自SEQ IDNOSEQ ID NO1-30，45，47，49和51的獨特的序列。這種微陣列還具有完全相同的多核苷酸和其它多核苷酸，例如用於使用微陣列的基於雜交的分析中的對照多核苷酸。陣列，包括微陣列，具有三種以上不同的本發明的多核苷酸，例如至少5中，7種，9種，20種，50種或更多這種多核苷酸，所述陣列被認為是本發明的陣列，並具有使生物樣品例如各種內皮細胞類型產生細微差的能力，或者在使用這種微陣列的過程中，提供不同的，通常更高水平的置信度，例如用於篩選特定的內皮細胞，用於篩選異常的或疾病細胞和組織，等諸如此類。
術語「微陣列」指可雜交的陣列元件的有序排列。所述陣列元件(arrayelements)的排列使得優選在固體支持物上有至少三種或更多種不同的陣列元件，更有選至少100種陣列元件，並最有選至少1000種陣列元件。優選，所述固體支持物是1cm2的基質表面，珠，紙，尼龍或其他類型的膜，濾紙，晶片，玻璃載玻片，或任何其它適宜的固相支持物。每個陣列元件的雜交信號是獨立可識別的。在右選地實施方案中，所述陣列元件包括多核苷酸探針。
雜交的意思是將兩種或多種核酸在適宜鹼基配對的條件下接觸。雜交包括部分或完全互補的核酸之間的相互作用。適宜的雜交條件對於本領域熟練技術人員是已知的。在具體的應用中，需要獲得較低程度的嚴格條件。在這些條件下，即使反應鏈的序列不是完全互補的，在一個或幾個位點是錯配的，雜交仍可出現。通過根據本領域的知識調節條件可使反應條件的嚴格程度較低，例如增加鹽濃度和/或降低溫度。適宜的雜交條件是允許從可鑑定的表達單位例如基因的基因表達的檢測的那些條件。優選的雜交條件是嚴格的雜交條件，例如在42℃在溶液(即，雜交溶液)中(所述溶液包含50％甲醯胺，1％SDS，1M NaCl，10％葡聚糖硫酸酯)，並在洗滌液中65℃洗滌30分鐘，所述洗滌溶液包含1XSSC和0.1％SDS。應理解在本領域中，相同程度的嚴格條件可通過改變溫度和緩衝液，或鹽濃度來實現，如Ausubel，等(Eds.)，Protocols in Molecular Biology，John Wiley Sons(1994)，pp.6.0.3 to 6.4.10所述。雜交條件的修飾可由經驗確定或根據探針的鳥嘌呤/胞嘧啶(GC)鹼基配對精確計算。雜交條件可如Sambrook，等，(Eds.)，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory PressCold Spring Harbor，New York(2d.Ed.；1989)，9.47-9.51頁所述計算。
使用本發明的探針和引物的一種方法是用於檢測人細胞中的基因表達。通常，靶基因將表達RNAs，但也可篩選基因組DNA或cDNA文庫。通過改變雜交條件的嚴格程度和靶結合位點(即探針的序列，相應於SEQ IDNO1-30，45，47，49和51之一的一部分)，雜交可產生不同程度的同源性。
所述微陣列可用於大量靶多核苷酸的大規模的遺傳或基因表達分析。所述微陣列還可用於診斷疾病和監測治療。此外，所述微陣列還可用於檢測個體對疾病的易感性。此外，所述微陣列還可用來檢測對感染，藥物治療的細胞反應性，等等諸如此類。
所述核算探針可以是基因組DNA or cDNA or mRNA多核苷酸或寡肽，或者任何RNA樣或DNA樣物質，例如肽，核酸，分支DNA，等等諸如此類。所述探針可以是有義或反義核苷酸探針。如果靶多核苷酸是雙鏈的，所述探針可以是有義或反義鏈。如果靶多核苷酸是單鏈的，所述探針可以是互補的單鏈。在一種實施方案中，所述探針是cDNAs。目的DNA序列的大小可變，優選具有100-10000個核苷酸，更有選為150-3500個核苷酸。
探針可以用多種合成或酶技術製備，這是本領域已知的。所述探針可以通過使用本領域已知的化學方法(Caruthers等，Nucleic Acids Res.，Symp.Ser.，215-233，1980)合成其全部或部分。
藥物配製劑和給藥途徑本發明的蛋白(無論其來源，例如來自重組和非重組來源)可被給藥需要治療的病人，可以單獨給藥，或者與適宜的載體，稀釋劑，輔劑或賦形劑以治療或改善各種疾病的劑量混合，以藥物組合物的方式給藥。這種組合物可以包括(除了蛋白質和載體以外)稀釋劑，濾液，鹽，緩衝液，穩定劑，增溶劑，以及其它本領域已知的物質。術語「可藥用的」指非毒性物質，它不幹擾活性成分的生物活性的有效性。載體的性質有賴於給藥途徑。本發明的藥物組合物還包含細胞因子，趨化因子，淋巴因子，生長因子，或其它生血因子，例如PDGF，VEGF(具體為VEGF-C或VEGF-D)，VEGFR-3(包括含有細胞外區的可溶性VEGFR-3肽)，M-CSF，GM-CSF，TNF，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IFN，TNF0，TNF1，TNF2，G-CSF，Meg-CSF，血小板生成素，幹細胞因子，和紅細胞生成素。也涉及這些多肽的各種形式，例如分離的全蛋白質，亞基，片段(例如可溶性片段)，和蛋白融合物。所述藥物組合物還可含有其它試劑，該試劑可增強所述蛋白的活性，補充其活性或在治療中的用途。這種添加因子和/或試劑可包含在所述藥物組合物中，產生與本發明的蛋白協同的作用，或者用以使副作用最小化。相反，本發明的蛋白可以包含在具體的細胞因子，淋巴因子，其它生血因子，血小板生成或抗血小板因子，或者抗炎試劑的製劑中，從而使所述細胞因子，淋巴因子，其它生血因子，血小板生成或抗血小板因子，或者抗炎試劑的副作用最小化。本發明的蛋白可以在多聚體(例如異二聚體或同二聚體)或在與其自身或其它蛋白的複合物中有活性。結果，本發明的藥物組合物以這種多聚物形式或複合物形式包含本發明的蛋白。
本申請的組合物的配製和給藥見″Remington′s Pharmaceutical Sciences，″Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，最新版。治療有效劑量還指足以緩解症狀的化合物的量，例如治療，治癒預防或緩解相關醫學病情的量，或者增加有益改變，治癒，防止或改善這種病情的速率的量。單獨給藥獨立的活性成分時，所述治療有效劑量指該單獨的成分。當聯合給藥時，治療有效劑量指產生治療效果的活性成分的聯合用量，可以是聯合給藥，序貫給藥或者同時給藥。
進行本發明的治療方法或用途時，將治療有效量的本發明的蛋白給藥患有待治療的病情或疾病的哺乳動物。可根據本發明的方法單獨或聯合其他治療(例如使用細胞因子，淋巴因子或其它生血因子的治療)給藥本發明的蛋白。與一種或多種細胞因子，淋巴因子或其它生血因子聯合給藥時，本發明的蛋白可同時和所述細胞因子，淋巴因子，其它生血因子，溶栓因子或抗血小板因子同時給藥，或者序貫給藥。如果是序貫給藥的，主治醫師將決定聯合給藥本發明的蛋白和細胞因子，淋巴因子，其它生血因子，溶栓因子或抗血小板因子的適當順序。
給藥途徑適宜的給藥途徑可例如，包括經口，經直腸，經黏膜，或經腸道給藥；腸道外遞送，包括肌肉內，皮下，髓內注射，以及鞘內，直接心室內，靜脈內，腹膜內，鼻腔內或眼內注射。給藥用於所述藥物組合物中或用於進行本發明的方法的本發明的蛋白，可通過多種常用方式進行，例如口服，吸入，局部應用或用於皮膚，皮下，腹膜內，胃腸外或靜脈內注射。靜脈內給藥哺乳動物，例如人類病人，是優選的。可選，可將化合物以局部而非系統的方式給藥，例如通過將所述化合物注射入目的作用位點。
組合物/配製劑用於本發明的藥物組合物因此可以使用一種或多種生理上可接受的載體(包擴賦形劑和輔劑)以常見的方式進行配製，所述載體可促進將該活性化合物加工成可藥用的製劑。這些藥物組合物可以由例如，通過普通的混合，溶解，顆粒化，製備糖衣丸，研磨，乳化，裝入膠囊，截留(entrapping)，或凍幹法製備。適合的配製劑有賴於所選的給藥途徑。當治療有效量的本發明的蛋白口服給藥時，本發明的蛋白可為片劑，膠囊，粉末，溶液或酏劑的形式。如果以片劑的形式給藥，本發明的藥物組合物還可以含有固相載體例如凝膠或輔劑。所述片劑，膠囊，以及粉末含有約5-95％的本發明的蛋白，並有選含有約25-90％的本發明的蛋白。當以液體形式給藥時，可添加液體載體例如水，汽油，動物或植物油例如花生油，礦物油，大豆油或芝麻油，或者合成油。液體形式的藥物組合物還可包含生理鹽水，葡聚糖，或其它糖類的溶液，或者二醇例如乙二醇，丙二醇或聚乙二醇。當以液體形式給藥時，該藥物組合物含有約0.5-90％重量的本發明的蛋白，並有選含有1-50％重量的本發明的蛋白。
當通過靜脈內，皮膚或皮下注射給藥治療有效量的本發明的蛋白時，本發明的蛋白將是不含致熱源，可胃腸外給藥的水溶液形式。這種胃腸外可接受的具有適當的pH值，等張性，穩定性，等等性質的蛋白溶液的製備物，是本領域熟練技術人員已知的。優選的用於靜脈內，皮膚或者皮下注射的藥物組合物含有(除本發明的蛋白以外)等張的載體，例如氯化鈉注射液，乳酸林格氏注射液，或者本領域已知的其它載體。本發明的藥物組合物還包括穩定劑，防腐劑，緩衝液，抗氧化劑，或其它本領域熟練技術人員已知的添加劑。對於注射而言，本發明的試劑可配置成水溶液，優選是生理上相容的緩衝液，所用緩衝液例如漢克氏液(Hank’s solution)，林格氏液，或者生理鹽水。對於經黏膜給藥，適合待透過的屏障得滲透劑被用於該製劑。這種滲透劑通常是本領域已知的。
對於口服給藥，所述化合物可通過將活性化合物與本領域已知的可藥用的載體結合而被輕易地配製。這樣的載體使得本發明的化合物能夠配製成片劑，丸劑，糖衣丸，膠囊，液體，凝膠，糖漿，漿，懸液等等，用於待治療的病人口服。用於口服的藥物製備物可通過與固相賦形劑結合而獲得，可選地研磨產生的混合物，並且如需要，在加入適宜的輔劑後加工顆粒的混合物，以獲得片劑或糖丸的核心。適宜的賦形劑是，具體為，填充物例如糖類，包括乳糖，蔗糖，甘露糖或山梨糖；纖維素製備物例如，玉米澱粉，小麥澱粉，大米澱粉，土豆澱粉，凝膠，黃芪膠，甲基纖維素，羥丙甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入分解劑，例如交聯的聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂，或藻酸，或其鹽例如藻酸鈉。可給糖衣丸核心提供適宜的包衣。為此目的，可是用濃縮的蔗糖溶液，其可選地含有阿拉伯膠，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，carbopol凝膠，聚乙二醇，和/或二氧化鈦，漆液，以及適宜的有機溶劑或溶劑混合物。染料和色素可加入所述片劑或糖衣丸中，用來鑑別或表徵活性化合物製劑的不同組合。
可口服的藥物製備物包括凝膠製成的推入式(push-fit)膠囊，以及柔軟的密封的凝膠和可塑劑製成的膠囊，所述可塑劑例如甘油或山梨醇。推入式膠囊可以包含活性成分，其與填充物例如乳糖，結合物例如澱粉，和/或潤滑劑例如滑石或硬脂酸鎂，以及可選的穩定劑混合。在軟性膠囊中，所述活性化合物可以溶解或懸浮在適宜的液體中，例如脂肪類油，液體石蠟，或者液體聚乙二醇。此外，還可加入穩定劑。所有口服給藥的配製劑應是適宜這種給藥的劑型。對於經頰給藥，所述組合物可以採用以通常方式配製的片劑或錠劑的形式。
對於通過吸入給藥，根據本發明所用的化合物可以來自壓縮的包裝或霧化器的氣溶膠噴霧的形式，使用適宜的推進物方便地遞送，所述推進物例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或者其他適宜的氣體。如果是壓縮的氣溶膠，所述劑型單位可以通過提供活瓣遞送來定量。例如用於吸入器或吹入器的凝膠的膠囊和藥筒，可配製成含有化合物的粉末混合物和適宜的粉末基質例如乳糖或澱粉。所述化合物可配置成用於通過注射胃腸外給藥，例如通過彈丸注射或者連續輸注。用於注射的配製劑可以單位劑量形式存在於，例如安瓿，或多劑型容器中，還可含有加入的防腐劑。所述組合物可以是懸液，溶液或油性或水性載體中的乳液的形式，並且包含配製用試劑(formulatory agents)例如懸浮劑，穩定劑和/或分散劑。
用於胃腸外給藥的藥物配製劑包括水中可溶形式的活性化合物的水溶液。此外，活性化合物的懸液可製備成適宜的油性注射懸液。適宜的親脂性溶劑或載體包括脂肪族油類，例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯類，例如乙基油酸酯或甘油三酸酯，或者脂質體。含水的注射懸浮液含有適宜的穩定劑或試劑，其可增加所述化合物的溶解性，使得可製備高濃度的溶液。可選地，所述活性成分可以是粉末形式，在使用之前，可用適宜的載體例如無菌的不含致熱源的水溶解。
所述化合物也可配製成直腸用組合物的形式，例如栓劑或灌腸劑，例如含有通常的栓劑基質，例如可可油或其它甘油酯。除了前述的配製劑外，所述化合物還可配製成貯存製備物。這種長效配製劑可通過植入(例如皮下或肌肉內)或通過肌肉內注射給藥。因此，例如所述化合物可與適宜的聚合物或疏水物質(例如可接受的油中的乳狀液)或離子交換樹脂配在一起，或者配製成基本不可溶的衍生物，例如配製成基本不可溶的鹽類。
本發明的疏水化合物的藥物載體是助溶系統，包含苯乙醇，非極性表面活性劑，可與水混合的有機共聚物，以及水相。所述助溶系統可以是VPD助溶系統。VPD是一種溶液，包含3％w/v的苯乙醇，8％w/v的非極性表面活性劑聚山梨醇酯80，和65％w/v的聚乙二醇300，溶於無水乙醇中。VPD助溶系統(VPD5W)由用5％的葡聚糖水溶液按1∶1稀釋的VPD組成。所述助溶系統有效地溶解疏水性化合物，並且其自身在系統給藥時產生的毒性較低。通常，助溶系統的比例可在較大範圍內變化，而不會破壞其溶解力和毒性。此外，助溶系統的成分也可不同；例如，其它低毒性的非極性表面活性劑可用來代替聚山梨醇酯80；聚乙二醇的比例可以變化；其它生物可相容的聚合物可替代聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮，以及其它糖或聚糖也可替代葡聚糖。可選地，其它用於疏水性藥物化合物的遞送系統也可被使用。脂質體和乳劑是已知的疏水藥物的遞送載體的實例。也可用一些有機溶劑例如二甲基亞碸，但通常其毒性較大。此外，所述化合物可是用持續釋放系統遞送，例如含有治療劑的固體疏水聚合物的半透性基質。各種緩釋物質已經確立並且是本領域熟練技術人員已知的。緩釋膠囊可根據其化學性質在幾個星期到超過100天的時間段內釋放所述化合物。根據治療劑的化學性質和生物穩定性，還可使用其它蛋白穩定化的方案。
所述藥物組合物還包含適宜的固相或凝膠相載體或賦形劑。這種載體或賦形劑的實例包括但不限於碳酸鈣，磷酸鈣，各種糖，澱粉，纖維素衍生物，凝膠和聚合物例如聚乙二醇。本發明的許多蛋白酶抑制性化合物可作為具有可藥用的抗衡離子的鹽。這種可藥用的鹼加成鹽是保持游離酸的生物效力和性質的那些鹽，通過與無機或有機鹼反應獲得，所述無機或有機鹼例如氫氧化鈉，氫氧化鎂，氨水，三烷基胺，二烷基胺，單烷基胺，二價胺基酸，乙酸鈉，苯甲酸鉀，三乙醇胺，等等諸如此類。
本發明的藥物組合物可以是本發明的蛋白與蛋白或肽抗原的複合物的形式。本發明的藥物組合物可以是脂質體的形式，其中本發明的蛋白是結合的，其除了可以和其它可藥用的載體結合以外，還可以和兩性試劑例如以聚合的微束形式，不可溶的單分子層，液體結晶，或薄層的形式存在於水溶液中的脂類。用於脂質體配製劑的適宜的脂類包括，但不限於，單甘油酯，二甘油酯，硫化物，溶血卵磷脂，磷脂，皂角苷，膽酸等。本領域熟練技術人員可以製備這樣的脂質體配製劑，如美國專利4,235,871；4,501,728；4,837,028；和4,737,323中所述，每篇文獻都包含在文中作為參考。
本發明的蛋白在藥物組合物中的量有賴於正在治療的疾病的病情的性質和嚴重性，以及病人接受過的治療的性質。最後，主治醫師決定用於治療每個個體病人的本發明的蛋白的量。開始，主治醫師將給藥低劑量的本發明的蛋白，並觀察病人的反應。較大劑量的本發明的蛋白會在從病人獲得樂觀的治療效果時給予，並且在該時間點，所述劑量不再增加。多種用於本發明的治療方法的藥物組合物包含約0.01μg到約100mg(優選約0.1μg到約10mg，更優選about 0.1μg to about 1mg)本發明的蛋白每公斤體重。給藥時，本發明所用的藥物組合物是不合致熱源，生理上可接受的形式。除本發明的蛋白以外的治療上有用的試劑，可以可選地或額外地，同時或序貫地與本發明的方法中的組合物一起給藥。
本發明的多核苷酸也可用於基因治療。這種多核苷酸可在體內或活體外被引入細胞內用於在受試哺乳動物中表達。本發明的多核苷酸還可通過已知的將核酸引入細胞或有機體的方法(包括，但不限於以病毒載體裸露的DNA的形式)給藥。細胞可以在存在本發明的蛋白的條件下離體培養，以進行增殖或者在這種細胞中產生所需的效果或活性。治療的細胞可被引入體內用於治療。
有效劑量適合用於本發明的藥物組合物包括一種組合物，它包含實現預期目的的有效量的活性成分。更具體地，治療有效量指有效預防被治療的受試者的病情進展或緩解其症狀的量。可確定有效劑量的適宜性質包括測定LEC和/或BEC的生長刺激或抑制，細胞分化成LEC和/或BEC的速率或程度，細胞表達模式改變成或偏離LEC或BEC的特定表達模式的傾向性，等等諸如此類。測定有效量在本領域熟練技術人員的能力範圍內，尤其是在本發明公開內容的啟發下。對於任何用於本發明的方法中的化合物而言，所述治療有效劑量首先可以通過細胞培養試驗來估計。例如，對於抑制性方法，可將藥劑給予動物模型，得到包含細胞培養測定的IC50(即檢驗化合物的濃度是最大抑制濃度的一半)的循環濃度範圍。這樣的信息可用來更準確地測定人類所用的劑量。
治療有效劑量指化合物的量導致症狀緩解，或者使患有致命性疾病的病人的生存期延長。這種化合物的毒性和治療有效性可通過標準的藥學方法在細胞培養或試驗動物中測定，例如用於測定LD50(使50％的數量致死的劑量)或ED50(對50％的數量治療有效的劑量)的方法。毒性和治療性效果的劑量比是治療的指數，並且可表示為LD50和ED50之間的比例。顯示高治療指數的化合物是優選的。從這些細胞培養試驗和動物研究獲得的數據可用於配製較大範圍的用於人類的劑量。這種化合物的劑量優選在包括ED50的循環濃度的範圍內，所述範圍幾乎沒有或沒有毒性。所述劑量可在該範圍內變化，根據所用劑量和給藥途徑而不同。準確的配製，給藥途徑和劑量可根據病人的病情由醫師決定。見例如，Fingl等，1975，in″ThePharmacological Basis of Therapeutics″，Ch.1 p.1。
給藥的組合物的劑量有賴於被治療的受試者，該受試者的體重，病情的嚴重程度，給藥的方式和醫師的判斷。
包裝如果需要，組合物可以存在於包裝或含有一個或多個含活性成分的單位劑量形式的配藥器中。所述包裝可，例如，包含金屬或塑料箔的例如泡狀包裝。所述包裝或配藥器可附有給藥說明。也可製備配製在相容的藥物載體中包含本發明的化合物的組合物，所述組合物置於適宜的容器中，並包含治療所述指徵說明。
此外，本發明包含利用這種組合物製備用於治療細胞或例如人的有機體的藥物，所述細胞或有機體患有LEC和/或BEC過度增生或增殖低下的疾病，例如淋巴水腫，淋巴管瘤，淋巴管骨髓瘤，淋巴管肌瘤病，淋巴管擴張，淋巴肉瘤，或淋巴管硬化，所述治療包括將有效量或劑量的本發明的組合物給藥所述細胞或有機體。適宜的組合物包括，但不限於，任何根據本發明的多核苷酸(例如反義多核苷酸)，和本發明的任何多肽，特異性識別本發明的多核苷酸或多肽的抗體，對於調節本發明的多核苷酸的表達有效的小分子，等等諸如此類。還涉及本發明的組合物用於製備藥物來改善與LEC或BEC相關的疾病或病症有關的症狀。
抗體抗體可用於調節本發明的多肽，這是由於可容易地產生具有相關特異性的抗體的能力，以及將抗體用於人類治療的技術的不斷改進。因此本發明涉及使用對本發明的目的多肽特異的抗體(例如單克隆和多克隆抗體，單鏈抗體，嵌合抗體，雙功能、雙特異性抗體，人源化抗體，人抗體，以及互補決定區(CDR)移植的抗體，包括含有特異性識別本發明的多肽地CDR序列)。優選的抗體是人抗體，例如在轉基因動物中產生的抗體，其可根據WO93/11236，published June 20，1993，其全文包含在文中作為參考所述的方法製備和鑑定。本發明還提供了抗體片段，包括Fab，Fab，F(ab)2，和Fv。術語″對...的特異性″用於描述本發明的抗體時，指本發明的抗體的可變區識別並結合目的多肽的水平與其結合其他物質相比，可見測出有所不同，其水平較高(即，儘管可能存在局部的序列同一性，同源性或相似性，通過測定結合親合力的差異，能夠區別目的多肽和其它已知的同家族多肽)。也應理解特異性抗體也和其它蛋白反應(例如，金黃色葡萄球菌蛋白A或ELISA技術中的其它抗體)，所述反應是通過抗體的可變區以外的序列，具體為該分子的恆定區。測定本發明的抗體的結合特異性的篩選法是本領域已知並常用的。這些方法的詳述見Harlow等(Eds.)，Antibodies A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory；Cold Spring Harbor，NY(1988)，第6章。
非人抗體可以通過本領域已知的任何方法人源化。優選的「人源化」抗體具有人恆定區，而所述抗體的可變區，或至少一個互補決定區(CDR)來自非人物種。人源化非人抗體的方法是本領域已知的(見美國專利5,585,089，和5,693,762)。通常人源化抗體具有一個或多個引入其框架區的來自非人來源的胺基酸。可例如使用Jones等[Nature 321522-525，(1986)]，Riechmann等，[Nature，332323-327，(1988)]和Verhoeyen等[Science2391534-1536，(1988)]所述的方法進行，即通過用人抗體相應區取代至少一部分嚙齒類CDR。多種用於製備改造的抗體的方法例如，在Owens和Young，J.Immunol.Meth.，168149-165(1994)中描述。可將進一步的改變引入所述抗體的框架區來調節其親合力或免疫源性。
本發明還提供了產生本發明的抗體的雜交瘤。本發明的抗體可用於檢測和/或純化本發明的多肽。
本發明的多肽和/或多核苷酸也可用於免疫動物以獲得與所述多肽特異性反應的多克隆或單克隆抗體。這種抗體可使用整個多肽或其片段作為免疫源而獲得。所述肽免疫源還包含位於羧基末端的半胱氨酸殘基，並且可以和例如匙孔血藍蛋白(KLH)的半抗原偶聯。合成這種多肽的方法是本領域已知的，例如見R.P.Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.852149-2154(1963)；J.L.Krstenansky，等，FEBS Lett.21110(1987)。與本發明的蛋白結合的單克隆抗體可用於多肽的免疫檢測的診斷性試劑。與所述多肽結合的中和性單克隆抗體可以是用於與所述多肽相關的疾病的治療劑，以及用於治療涉及該多肽的異常表達的一些形式的癌症。如果是癌細胞或白血病細胞，該多肽的中和性單克隆抗體可用於檢測和防止所述多肽介導的癌細胞的轉移性播散。通常，用於製備多克隆和單克隆抗體的技術以及能夠產生所需抗體的雜交瘤是本領域已知的(Campbell，A.M.，Monoclonal Antibodies TechnologyLaboratory Techniques in Biochemistry和Molecular Biology，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherl和s(1984)；St.Groth等，J.Immunol.351-21(1990)；Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975))，the trioma技術，人B細胞雜交瘤技術(Kozbor等，Immunology Today 472(1983)；Cole等，in Monoclonal Antibodies和Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.(1985)，77-96頁)。
任何已知產生抗體的動物(小鼠，兔子等)可用本發明的肽或多肽來免疫。免疫的方法是本領域已知的。這種方法包括所述多肽的皮下或腹膜內注射。本領域熟練技術人員認識到用於免疫的本發明ORF編碼的多肽的量根據被免疫的動物，肽的抗原性，以及注射的部位不同而變化。所述蛋白用作免疫原，可被修飾或在輔劑中給藥以提高所述蛋白的抗原性。提高蛋白抗原性的方法是本領域已知的，並且包括，但不限於，將所述抗原和異源性蛋白(例如球蛋白或β-半乳糖苷酶)偶聯，或者通過在免疫過程中摻入輔劑。
對於單克隆抗體，來自免疫後動物的脾細胞被取出，與骨髓瘤細胞例如SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞融合，使其成為產生單克隆抗體的雜交瘤細胞。本領域已知的方法中的任何一種可用於鑑定可產生具有所需特徵的抗體的雜交瘤細胞。這些包括使用ELISA試驗，Western印跡，或放射性免疫試驗來檢測雜交瘤(Lutz等，Exp.Cell Research.175109-124.1988)。分泌所需抗體的雜交瘤被克隆，並使用本領域已知的方法確定其類型和亞型(Campbell，A.M.，Monoclonal Antibody TechnologyLaboratory Techniques inBiochemistry和Molecular Biology，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，The Netherl和s(1984))。用於製備單鏈抗體的技術(美國專利4,946,778)可被用來製備本發明的多肽的單鏈抗體。
對於多克隆抗體，含有抗體的抗血清從被免疫的動物中分離出來，並使用上述方法之一篩選具有所需特異性的抗體的存在。本發明還提供了上述抗體的可檢測的標記形式。抗體的可檢測標記可通過使用放射性同位素，親合標記(例如生物素，抗生物素蛋白，等等諸如此類)，酶標記(例如辣根過氧化物酶，鹼性磷酸酶，等等諸如此類)，螢光標記物(例如FITC或羅丹明，等等諸如此類)，順磁性原子，等等諸如此類。獲得這種標記的方法是本領域已知的，例如，見Sternberger，L.A.等，J.Histochem.Cytochem.18315.1970；Bayer，E.A.等，Meth.Enzym.62308(1979)；Engval，E.等，Immunol.109129.1972；和Goding，J.W.J.Immunol.Meth.13215.(1976)。
本發明的標記的抗體可用在活體外，活體內，以及原位試驗中來鑑定表達目的多肽的片段的細胞或組織。所述抗體也可直接用於治療或其它診斷。本發明還提供了固定在固相支持物上的上述抗體。這種固相支持物的實例包括塑料例如聚碳酸酯，複合碳水化合物例如瓊脂糖和瓊脂糖凝膠，以及丙烯酸樹脂例如聚丙烯酸和乳膠珠。將抗體偶聯到這種固相支持物上的技術是本領域已知的(Weir，D.M.等，″H和book of ExperimentalImmunology″″4th Ed.，Blackwell Scientific Publications，Oxford，Engl和，Chapter 10(1986)；Jacoby，W.D.等，Meth.Enzym.34 Academic Press，N.Y.(1974))。本發明的固定的抗體可用在體外，體內以及原位試驗中，還用於本發明的蛋白的免疫親合力純化。
可機讀的序列在該實施方案的一種應用中，本發明的核苷酸序列可記載在可機讀的介質上。本文的「可機讀介質」指任何可被計算機閱讀並直接獲取的介質。這種介質包括，但不限於，磁性儲存介質，例如軟盤，硬碟儲存介質，和磁碟；光學儲存介質，例如CD-ROM；電學儲存介質，例如RAM和ROM；以及這些種類的雜合介質例如磁性/光學儲存介質。熟練技術人員可輕易採用任何已知的將信息記載在計算機可讀的介質上的方法來獲得包含本發明的核苷酸序列的產品。
多種本領域熟練技術人員可得的數據存儲結構可用來產生其上記載了本發明的核苷酸序列的可機讀的介質。數據存儲結構的選擇通常基於所選的獲取存儲的信息的方法。此外，多種數據處理程序和格式可用來將本發明的核苷酸序列的信息存儲在可機讀的介質上。序列信息可存在於文字處理文本文件中，在可購得的例如WordPerfect和Microsoft Word中格式化，或作為ASCII文件的形式，存儲在資料庫應用程式(database application)中，例如DB2，Sybase，Oracle，等諸如此類。本領域熟練技術人員可輕易採用任何數量的數據處理器構建的格式(例如文本文件或資料庫)，來獲得的其上記載了本發明的核苷酸序列的計算機可讀的介質。通過提供SEQ ID NO1-30，45，47，49和51的核苷酸序列或其代表性片段，或者可機讀形式的與SEQID NO1-30，45，47，49和51具有99.9％的序列同一性的核苷酸片段，本領域熟練技術人員可常規地獲取用於多種目的的序列信息。計算機軟體可公開獲得，使得熟練技術人員可獲取計算機可讀介質上的序列信息。下面的實施例顯示了如何在Sybase系統上使用執行BLAST(Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410.1990)和BLAZE(Brutlag等，Comp.Chem.17203-207(1993))搜索算法(search algorithms)的軟體來鑑定核酸序列內的開放閱讀框架(ORFs)。這種ORFs可以是編碼蛋白的片段，並且可用於製備商業上重要的蛋白，例如用於發酵反應中的酶以及製備商業上有用的代謝物。
本文的「基於計算機的系統」指用於分析本發明的核苷酸序列信息的硬體工具，軟體工具，以及數據存儲工具。本發明的基於計算機的系統的最少硬體工具包括一個中央處理單元(CPU)，輸入工具，輸出工具和數據存儲工具。本領域熟練技術人員可輕易理解目前可得的基於計算機的系統中的任何一種都適宜用於本發明中。如上述，本發明的基於計算機的系統包含其中存儲了本發明的核苷酸序列的一種數據存儲工具，以及必要的硬體和軟體工具用於支持和執行搜索工具(means)。
本文的「搜索工具」指一種或多種能夠在基於計算機的系統上執行來比較靶序列或靶結構基序和存儲在數據存儲工具中的序列信息。搜索工具用來鑑定已知序列的片段或區，所述序列與具體的靶序列或靶基序匹配。各種已知的算法已被公開，並且多種可購得的用於進行搜索方法的軟體被用於並且可被用於本發明的基於計算機的系統。這樣的軟體的實例包括，但不限於，MacPattern(EMBL)，BLASTN和BLASTA(NPOLYPEPTIDEIA)。熟練技術人員可容易地理解任何一種可得的用於進行同源性搜索的算法或執行軟體包可用於本發明的基於計算機的系統。本文的「靶序列」可以是6個或更多個核苷酸的核酸或2個或更多個胺基酸的胺基酸序列。熟練技術人員可容易地理解靶序列越長，靶序列在資料庫中作為隨機出現的序列的可能性就越小。靶序列最優選的序列長度是從約10-100個胺基酸或者從約30-300個核苷酸殘基。然而，可以理解搜索商業上重要的片段，例如涉及基因表達和蛋白加工的序列片段可以較短。
本文的「靶結構基序」，或「靶基序」指任何合理選出的序列或序列的組合，其中的序列是基於靶基序的摺疊形成的三位結構。本領域已知多種靶基序。蛋白靶基序包括，但不限於，酶活性位點和信號序列。核酸靶基序包括，但不限於，啟動子序列，髮夾結構，和可誘導的表達元件(蛋白結合序列)。
診斷性試驗和試劑盒本發明還提供了診斷性試驗，以及相關的試劑盒，用於過度增殖和/或增殖低下的例如LEC或BEC的內皮細胞的病症或疾病。這些試驗包括通過使用本發明的核酸探針或抗體鑑定試驗樣品中本發明的ORFs之一或其同源物的存在或表達。
通常，檢測本發明的多核苷酸的方法包括將樣品與結合多核苷酸並形成複合物的化合物接觸足夠長的時間以形成複合物，並檢測所述複合物，使得如果檢測到所述複合物，就表示在樣品中檢測到了本發明的多核苷酸。
這種方法也可包括將樣品在嚴格的雜交條件下和核酸引物接觸，，所述核酸引物在這樣的條件下退火結合本法發明的多核苷酸，然後擴增退火的多核苷酸，使得如果多核苷酸被擴增，本發明的多核苷酸在樣品中被檢測出。
通常，檢測本發明的多肽的方法包括樣品與結合多肽並形成複合物的化合物接觸足夠長的時間以形成複合物，並檢測所述複合物，使得如果檢測到所述複合物，就表示在樣品中檢測到了本發明的多肽。具體而言，這種方法包括將檢驗樣品和本發明的一種或多種抗體或者一種或多種核酸探針一起溫育，並測定核酸探針或抗體與檢驗樣品內的成分的結合。
將核酸探針或抗體與檢驗樣品共同溫育的條件各異。溫育條件有賴於試驗使用的模式，採用的檢驗方法，以及試驗所用的核酸探針或抗體的類型和性質。本領域熟練技術人員可認識到任何一種常用的可得的雜交，擴增或免疫試驗形式可輕易採用本發明的核酸探針或抗體。這種試驗的實例見Chard，T.，An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，The Netherl和s(1986)；Bullock，G.R.等，Techniques in Immunocytochemistry，Academic Press，Orlando，Fla.Vol.1(1982)，Vol.2(1983)，Vol.3(1985)；Tijssen，P.，Practice and Theory ofimmunoassaysLaboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，The Netherlands(1985)。本發明的檢驗樣品包括細胞，細胞的蛋白或膜提取物，或者生物液體例如痰液，血液，血清，血漿或尿液。用於本發明的方法的檢驗樣品可根據試驗模式，檢驗方法的性質，以及被檢測的組織，細胞或提取物而不同。製備細胞的蛋白提取物或膜提取物的方法是本領域已知的，並可被用來獲得與使用的系統相容的樣品。
在本發明的另一個實施方案中，提供了含有必要的反應劑以進行本發明的試驗的試劑盒。在一個實施方案中，本發明提供了隔室試劑盒，來容納緊鄰的一個或多個容器，所述容器包括(a)第一容器，它包含本發明的一種探針或抗體；和(b)一種或多種其它容器，包含一種或多種洗滌劑，能夠檢測結合的探針或抗體的存在的試劑。
具體而言，隔室試劑盒包括任何其中的反應劑包含在分離的容器中的試劑盒。這種容器包括小的玻璃容器，塑料容器或者塑料或紙的條狀容器。這種容器使得技術人員有效地將反應劑從一個隔室轉移到另一個隔室，使得樣品和試劑不被交叉汙染，並且每個容器中的試劑或溶液可以以定量的方式從一個隔室加入另一個隔室中。這樣的容器包括能夠容納檢驗樣品的容器，包含試驗所用的一種或多種抗體的容器，包含洗滌試劑(例如磷酸鹽緩衝的鹽溶液，Tris緩衝液，等諸如此類)的容器，以及含有用於檢測結合的抗體或探針的試劑的容器。檢測試劑的類型包括標記的核酸探針，標記的二級抗體，或者可選地，如果初級抗體被標記，還包括能夠和標記的抗體反應的酶或抗體結合劑。本領域熟練技術人員已知，本發明公開的探針和抗體可併入本領域已知的試劑盒形式中。
實施例用於實施例中的方法如下抗體使用抗VEGFR-3單克隆抗體(克隆2E11D11；見國際申請PCT/US02/22164，由WO 03/006104公開)，PAL-E(MoNOsan)，CD31(Dako)，N-鈣粘著蛋白，VE-鈣粘著蛋白，β-連環蛋白和片珠蛋白和多克隆兔抗人podoplanin(Breiteneder-Geleff，S.，等，Am.J.Pathol.154385-394(1999))。小鼠抗人整聯蛋白9由Dr.Dean Sheppard(University of California at San Francisco，San Francisco)和Dr.Curzio Rüegg(University of Lausanne Medical School，Lausanne，Switzerland)提供。螢光染料偶聯的二級抗體來自JacksonImmunoresearch。
細胞培養和轉染人羊膜上皮細胞在存在5％胎牛血清的Med199培養基中培養。人真皮微血管內皮細胞來自PromoCell(Heidelberg，Germany)。抗Podoplanin抗體，MACS膠質超順磁MicroBeads和山羊抗兔IgG抗體偶聯(Miltenyi Biotech，Bergisch Gladbach，Germany)，根據出廠說明，使用LD及MS分離柱和Midi/MiniMACS分離器(Miltenyi Biotech)進行細胞分類。分離的細胞在纖連蛋白包被的(10μg/ml，Sigma，St.Louis，MO)板上培養(M_kinen，T.，等，EMBOJ.204762-4773.2001)。
RNA分離，Northern印跡和微陣列分析總RNA被分離並在Rneasy中使用DNAseI處理(Qiagen，Valencia，CA)。32P-標記的和Atlas濾紙雜交的探針(Clontech)使用2-5μg總RNA根據出廠說明製備，但探針使用Nick-25柱(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)純化。雜交並洗滌後，該膜用Fuji BAS 100 phosphoimager分析。對於Affymetrix_分析，四種獨立的BEC和LEC樣品的製備和雜交使用從不同個體中分離的四組細胞提取的RNA進行。對於Affymetrix_表達分析，使用5μg總RNA使用Custom SuperScript ds-cDNA合成試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)來合成雙鏈cDNA。隨後使用Enzo BioArrayTMHighYieldTMRNA轉錄標記試劑盒(Affymetrix，Santa Clara，CA)製備生物素標記的cRNA，並用RNeasy柱(Qiagen，Valencia，CA)去除未結合的核苷酸。人基因組95Av2微陣(用於Prox-1試驗)和9513-E微陣列(主要是非特異性(uncharacterized)的EST序列)的雜交，洗滌以及染色，是根據出廠說明進行的(Affymetrix，GeneChipExpression Analysis Technical Manual)。所述探針陣列在570nm使用AgilentGeneArray_ Scanner進行檢測，並且用Affymetrix_ Microarray Suite version5.0和Data Mining Tool version 3.0分析定量掃描的讀數。使用100的總放大強度(global scaling intensity)計算雜交強度。
差異表達的序列用於搜索the National Center for BiotechnologyInformation和the National Library of Medicine的GenBank資料庫中的EST重疊群。使用NCBI/NLM提供的orf發現軟體預測(NCBI/NLM)和開放閱讀框架。SOSUI系統用於預測來自蛋白序列的跨膜螺旋和信號序列，並且使用P fam(比對和HMMs的蛋白家族資料庫)預測其它蛋白結構域的構建。
免疫螢光和免疫組織化學細胞在蓋玻片上培養，使用4％的多聚甲醛固定，並用磷酸鹽緩衝鹽溶液(PBS)中的Triton-X100透化，並用初級抗體進行染色。對於整聯蛋白9，染色的活細胞和抗體一起在冰上保持15分鐘然後進行固定。細胞可進一步使用FITC或TRITC偶聯的二級抗體進行染色。F-肌動蛋白使用德克薩斯紅(TexasRed)偶聯的鬼筆環肽(Molecular Probes，Eugene，OR)染色。使用Hoechst 33258螢光染料(Sigma)進行復染，並使用Zeiss Axioplan 2螢光顯微鏡觀察。
手術取出的正常人皮膚包埋於Tissue-Tek_(Sakura，The Netherl和s)中，然後進行冷凍和切片。切片(6μm)在冷丙酮中固定10分鐘，然後使用初級抗體進行染色，接著使用Vectastain Elite ABC試劑盒(載體Laboratories，Burlingame，CA)和3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma，St.Louis，MO)進行染色。
實施例1鑑定差異表達的基因血管和淋巴管內皮細胞(分別為BEC和LEC)從人皮膚微血管內皮細胞培養物中，使用微磁珠和抗淋巴管內皮細胞表面標記podoplanin(Breiteneder-Geleff，S.，等，Am.J.Pathol.154385-394(1999)；M_kinen，T.，等，EMBO J.204762-4773(2001))進行分離。分離的BEC和LEC群使用抗VEGFR-3抗體或podoplanin通過免疫螢光評估為大於99％。分離的細胞培養兩代後，從培養物中分離RNA並將其和寡核苷酸微陣列雜交，所述微陣列含有約12000已知的基因，即預期人轉錄物總數的約1/3。
如預期的那樣，podoplanin，粒橋蛋白I/II和巨細胞甘露糖受體(已知的淋巴管內皮細胞標記)，被發現在LEC中特異。見，Breiteneder-Geleff，S.，等，Am.J.Pathol.154385-394(1999)；Ebata，N.，等，Microvasc.Res.6140-48.(2001)；和Irjala，H.，等，J.Exp.Med.1941033-1041(2001)。由於這些結果與已知的體內和體外基因表達模式一致，對基因表達模式進行了進一步的表徵。當在複製分析中選擇的複製的信號與log2的比值為1.0(兩倍差異)時，超過400個基因被發現在LEC和BEC中的表達有差異。表達有差異的基因的一些實例在表1中按其功能分別顯示，並在表2-4中提供了差異表達的基因的完整列表。表3和4提供了差異表達的基因的完整列表，所述列表包括GenBank的保藏號和獨立收穫的BEC和LEC的表達水平之間的差異(信號的log2比值±s.d.)。通過對31個選出的基因的Northern印跡和免疫螢光證實了微陣列的數據(見圖1)。
表3和4中列出的每種基因都通過基因保藏號鑑定，該保藏號與公開的基因組資料庫例如NCBI保管的GenBank資料庫中發現的基因的序列相關。這些序列包含在文中作為參考。
表1選出的在BEC和LEC中差異表達的基因類型



粗體顯示的基因通過Northern印跡或免疫螢光確定，且用星號(*)標記的基因是僅在兩種細胞系之一中特異性表達的基因。
表2已知的LEC特異性基因


*Af＝Affymetrix，S＝對LEC特異，NS＝非特異(也在BEC中表達)，數字代表BEC和LEC之間的信號強度的log2比值值值實施例2參與炎症的基因的BEC-特異性表達基因內皮細胞在炎性反應的多個步驟中起重要作用。它們募集白細胞到炎性灶，並且有專門的內皮細胞(高內皮小靜脈)負責使淋巴細胞回到次級淋巴器官中。此外，內皮細胞調節白細胞的活化，反之亦然，所述內皮細胞通過白細胞分泌的分子被活化。與細胞培養中內皮細胞的活化相一致，BEC表達高水平的前感染淋巴因子和趨化因子(幹細胞因子，白介素-8，單核細胞趨化蛋白1(MCP-1))和受體(UFO/axl，CXCR4，IL-4R)見表1。CXCR4及其配體，基質細胞來源的因子(SDF-1)，在捕獲正常淋巴細胞，單核細胞，以及造血幹細胞和造血祖細胞中起重要作用；CXCR4或SDF-1的靶向活化導致心臟發生，造血作用和血管發育受損(Tachibana，等，Nature 393591-594.1998)。SDF-1b主要是由LEC產生的，表明這一趨化因子可能參與表達CXCR-4的細胞的LEC啟動的趨化作用。此外，CXCR4和SDF-1在BEC和LEC上的表達的交互模式表明這兩種細胞類型使用這些分子進行旁分泌聯絡。
實施例3細胞粘附，細胞-細胞相互作用和細胞骨架分子檢測到BEC和LEC之間的更明顯的差異是參與細胞骨架和細胞-細胞或細胞-基質相互作用的基因的表達(見表3和4)。例如，N-鈣粘著蛋白，它參與內皮細胞和SMCs以及周細胞之間的相互作用(Gerhardt，等，Dev.Dyn.218472-479.2000)，在BEC中被特異性檢測到。這與淋巴毛細管不是被SMCs包圍這一事實一致。在免疫染色中，N-鈣粘著蛋白只在BEC中檢測得到，而VE-鈣粘著蛋白存在於這兩種細胞類型中(圖2a-d)。鈣粘著蛋白的胞質區與β-連環蛋白，片珠蛋白(γ-連環蛋白)和p120ctn反應，並通過α-肌動蛋白，粘著斑蛋白，ZO-1，ZO-2和spectrin將所述胞質區和肌動蛋白骨架相連接(Provost，E. Rimm，Curr.Op.Cell Biol.11567-572.1999)。BEC表達非常高水平的β-連環蛋白(圖2e，f)和粘著斑蛋白，而片珠蛋白主要存在於LEC上(圖2g，h)。LEC和BEC的染色也顯示了顯著不同的肌動蛋白的結構。BEC顯示多種應激纖維，所述纖維在LEC幾乎完全缺失，而在LEC中觀察到了肌動蛋白在真皮中的分布(圖2i，j)。
整聯蛋白是重要的細胞粘附介導物(Giancotti Ruoslahti，Science2851028-1032.1999)。它們是跨膜蛋白，由兩種多肽組成，即α和β亞基。它們的胞外區結合細胞外基質蛋白，而所述胞質區結合細胞骨架和參與信號轉導的蛋白。整聯蛋白α5是纖連蛋白受體的亞基，主要在BEC中表達。反之，整聯蛋白α1和α9，分別為層粘連蛋白和膠原蛋白的受體以及為骨橋蛋白和腱生蛋白的受體提供了亞基，它們在LEC中表達(圖1a和圖2k，l)。在人皮膚中，整聯蛋白α9的抗體特異性染色淋巴毛細管，而血管內皮細胞是陰性的(圖2m-o)。此外，已有報導，在動脈平滑肌細胞中檢測到整聯蛋白α9(Palmer，等，J.Cell Biol.1231289-1297.1993)。有趣的是，整聯蛋白α9已顯示duiyu淋巴系統的正常發育是重要的。缺乏整聯蛋白α9β1的小鼠由於乳糜胸(可能是淋巴)滲出而出現了呼吸衰竭，並在出生後6-12天死亡(Huang，等，Mol.Cell Biol.205208-5215.2000)。
BEC，而不是LEC，產生兩種層粘連蛋白和不同類型的膠原蛋白(表4)。在共培養中，這些基底膜成分對於LEC的粘附和生長是必要的(M_kinen，T.，等，EMBO J.204762-4773.2001)。此外，許多參與基質降解和重塑的蛋白，包括幾種基質金屬蛋白酶，組織型和尿激酶纖溶酶原激活物，以及纖溶酶原激活物I主要在BEC中檢測到，而while基質金屬蛋白酶的組織抑制物-3(TIMP-3)主要在LEC中檢測到(表3和圖1)。和其它可溶的TIMPs不同，TIMP-3是細胞外基質的成分。據報導重組的TIMP-3可對生血因子應答，從而抑制內皮細胞遷移和管形成，如果是在腫瘤模型中表達，重組的TIMP-3可很可能通過抑制腫瘤的擴張，生長因子從細胞外基質的釋放，或者血管生成來抑制腫瘤生長(An和-Apte，等，Biochemistry Cell Biology 74853-862.1996)。
其它以前已知的基因在微陣列中被鑑定為LEC-特異性轉錄因子or跨膜蛋白。見表5和6。
表5鑑定的轉錄因子

*Af＝Affymetrix，S＝對LEC的特異性，NS＝非特異性(也在BEC中表達)，數字代表BEC和LEC之間的信號強度的log2比值值值。
表6鑑定的跨膜蛋白

*A＝Affymetrix，S＝對LEC的特異性，NS＝非特異性(也在BEC中表達)，數字代表BEC和LEC之間的信號強度的log2比值值。
此外，表10和11分別描述了鑑定的已知LEC基因及其保藏號，和差異表達的基因及其保藏號，而表12描述了在掃描中鑑定的其它未知蛋白。
實施例4PROX-1對LEC基因的差異性調節研究了淋巴分化程序的機制。Prox-1同源框轉錄因子被發現在LEC中特異性表達，並且小鼠中Prox-1的靶向破壞被報導導致淋巴管發育的阻抑(Wigle等，Cell，98769-778.1999)。儘管prox-1基因幾乎十年前就發現了，Prox-1靶基因仍沒有被鑑定。為確定同源區轉錄因子Prox-1造成了分化的LEC和BEC基因型，分析上述鑑定的基因在原代BEC和LEC中，存在或缺乏Prox-1過度表達的條件下的表達。
腺病毒介導的原代內皮細胞中的prox-1基因轉移用來在BEC細胞中誘導基因的表達。為了消除腺病毒感染造成的基因表達變化，將AdLacZ(編碼β-半乳糖苷酶)引入BEC作為對照。
prox-1 cDNA通過RT-PCR使用來自人內皮細胞的RNA進行擴增，所用引物為5』-GCCATCTAGACTACTCATG胺基酸GCAGCT-3』(SEQ IDNO61)和5』-GCGCAG胺基酸TTCGGCCCTGACCATGACAGCACA-3』(SEQ ID NO62)。PCR產物被克隆到pAMC表達載體中，產生N-末端Myc-標記的Prox-1。所述構建體隨後被亞克隆入pAdCMV中，以產生AdProx-1來製備腺病毒。AdProx-1和AdLacZ病毒株如所述方法製備(Laitinen等，Hum.Gene Ther.91481-148 6.1998)。腺病毒產生的Prox-1遷移的分子量為約85kDa，並且也被Prox-1 C-末端肽的抗體識別。突變的Prox-1 N625A/R627A，(密碼子625處的天冬氨酸變成了丙氨酸，密碼子627處的精氨酸變成了丙氨酸)是通過使用QuikChange定點誘變試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)和以下引物製備的5』-CTCATC胺基酸GTGGTTTAGCGCTTTCCGTAGTTTTACTAC-3』(SEQ ID NO63)和5』-GTAGT胺基酸胺基酸CTCACGG胺基酸GCGCT胺基酸ACCACTTGATGAG-3.(SEQ ID NO64)。
將人皮膚微血管內皮細胞，冠狀動脈內皮細胞(CAECs)，隱靜脈內皮細胞(SAVECs)，BEC和LEC鋪於板上，24小時後，以8,000細胞/cm2的密度，在不含血清的培養基中以50-100PFU/細胞，用腺病毒感染1小時。孵育期末，洗滌細胞，然後在完全培養基中培養20-24個小時。如上述進行總RNA分離和陣列雜交。
滴定試驗顯示，人微血管內皮細胞感染AdProx-1 or AdLacZ後導致感染24小時後，＞90％的細胞中的腺病毒編碼的蛋白的核表達。為了研究Prox-1誘導的基因表達中的變化，使用了人cDNA濾紙陣列，所述陣列含有約1,000已知對常見細胞代謝重要的基因，以及在調節心血管功能和血細胞生成中特別涉及的基因。AdProx-1上調28LEC基因的表達，而下調63BEC基因的表達(見下表7)，可以通過10個或11個選出的基因Northern印跡確定。與在LEC和BEC中差異表達的基因相比較，Prox調節的15個基因(即，約30％)被被發現在培養的LEC和BEC之間的表達有差異，表明Prox-1是調節內皮細胞身份(identity)。
表7Prox-1調控的LEC/BEC基因基因保藏號1信號對數比2s.d.
AdProx-1誘導的LEC特異性(28種基因)細胞周期蛋白E2 AF091433 NM_577354.95 1.17富含半胱氨酸和甘氨酸的蛋白2 U57646 NM_001321 4.58 0.36Cdk-抑制物p57KIP2 U22398 NM_000076 3.77 0.68親代表達的10AB028974 NM_015068 3.54 0.95血栓烷A2受體D38081 NM_001060 2.32 0.13B-myb X13293 NM_002466 2.11 0.28視網膜母細胞瘤相關蛋白HEC AF017790 NM_061011.86 0.13膽固醇25羥化酶 AF059214 NM_003956 1.86 0.56G蛋白偶聯的受體，家族C，組5，成員B AC004131 1.83 0.32胸腺嘧啶激酶1 M15205 NM_003258 1.80 0.39CREM(cAMP反應性因子調節物) S68134 NM_001881 1.78 0.30α-輔肌動蛋白-2-相關LIM蛋白 AF002282 NM_014476 1.77 0.42
基因 保藏號1信號對數比2s.d.
粒橋蛋白(DPI，DPII) AL031058 1.74 1.03MCM6微型染色體保持缺陷的6(minichromosome maintenance D84557 NM_005915 1.72 0.06deficient 6)紅細胞膜蛋白帶4.9(dematin) U28389 NM_001978 1.71 0.25GTP環化水解酶 1 U19523 NM_000161 1.61 0.04KlAA0186基因產物 D80008 NM_021067 1.47 0.11細胞分裂周期2蛋白X05360 NM_001786 1.35 0.43來自克隆643的假想蛋白AF091087NM_020467 1.25 0.22泛素載體蛋白E2-C U73379 NM_007019 1.23 0.12有絲分裂檢驗點(checkpoint)激酶Mad3L AF053306NM_001211 1.22 0.47V-Erba相關Ear-3蛋白 HG3510-HT3704 1.20 0.20糖原磷酸化酶(PYGL) AF046798 1.16 0.54fms-相關的酪氨酸激酶4，VEGFR-3 X69878 NM_002020 1.10 0.00含BTB(POZ)區3(BTB(POZ)domain containing 3) AB023169NM_014962 1.10 0.08SMC4染色體結構保持4樣1(structural maintenance of AB019987NM_005496 1.09 0.59chromosomes 4-like 1)(酵母)高活動性組的蛋白2(high-mobility group protein 2) X62534 NM_02129 1.07 0.04
基因 保藏號1信號對數比2s.d.
α拓撲異構酶 L47276 1.04 0.49基因 保藏號1信號對數比2s.d.
AdProx-1抑制的BEC特異性(63種基因)neuropilin-1 AF016050 NM_03873 -3.99 0.42ras-相關的C3肉毒桿菌毒素底物2，RAC2 M64595 NM_002872 -3.87 0.47含三部分基序的22(tripartite mortif-containing 22) X82200 NM_006074 -3.56 0.28小的可誘導細胞因子A2(單核細胞趨化蛋白 1) M26683 NM_002982 -3.56 0.03鋅指蛋白238 AJ223321 NM_006352 -3.08 0.13uPA X02419 -3.05 0.02轉錄因子ECD43945 NM_12252 -3.04 0.08RNase A，胰腺的 D26129 NM_002933 -2.72 0.02維生素A反應性；細胞骨架調控的 AF070523 NM_006407 -2.51 0.6白介素6 X04430 NM_000600 -2.42 0.63Rho GDP解離抑制物(GDI)β X69549 NM_001175 -2.42 0.03基質金屬蛋白酶14 X83535 NM_004995 -2.37 0.08E3泛素接合酶SMURF2胺基酸 NM_22739 -2.22 0.06
630312死亡受體6 AF068868 NM_014452-2.16 0.61蛋白C受體，內皮(EPCR) L35545NM_006404-2.09 0.14基因保藏號1信號對數比2s.d.
造血和神經膜蛋白(HNMP-1)U87947NM_001425-2.08 0.63KIAA0836AB020643 -2.07 0.44硫酸軟骨素蛋白多糖2(多能聚糖) X15998NM_004385-1.99 0.65G蛋白信號4調節物AI267373 NM_05613 -1.93 0.54磷酸果糖激酶，肌肉 U24183NM_000289-1.93 0.11IGF-IImRNA-結合蛋白 3 U97188NM_006547-1.9 0.23神經元細胞粘附分子Nr-CAM/hBRAVO AB002341 NM_005010-1.89 0.13細胞表面糖蛋白CD44 L05424 -1.84 0.12纖溶酶原激活物-1J03764NM_000602-1.83 0.33AF1Q蛋白U16954NM_006818-1.79 0.23人克隆24674mRNA序列 AF070578 -1.76 0.01煙醯胺N甲基轉移酶 U08021NM_006169-1.74 0.49乳酸脫氫酶B X13794 -1.73 0.08KIAA0537基因產物AB011109 NM_14840 -1.73 0.08
LIM區(domain)蛋白X93510NM_003687-1.670.11淋巴細胞抗原75，DEC-205 AF011333 NM_002349-1.610.08自然殺傷細胞轉錄物4 AA631972 NM_004221-1.590.05磷脂酶A2 M72393 -1.580.41R-rasM14949 -1.560.1腺苷酸環化酶相關蛋白2N90755NM_006366-1.550.08leupaxin AF062075 NM_04811 -1.530.3信號轉導物和轉錄激活物6(STAT6) AF067575 -1.510.45LYL-1M22637 -1.510.14selectin P M25322NM_003005-1.470.37蛋白激酶，不依賴cAMP，催化的，β M34181NM_002731-1.430.49TRAM樣蛋白 D31762NM_12288 -1.420.43鳥苷酸結合蛋白2，幹擾素可誘導的 M55543NM_04120 -1.410.51基因 保藏號1信號對數比2s.d.
細胞間粘附分子2 X15606NM_000873-1.380.13蛋白多糖1，分泌性顆粒X17042NM_02727 -1.350.47原肌球蛋白1(α) Z24727NM_000366-1.320.1成纖維細胞活化蛋白，α亞基 U09278NM_004460-1.250.12
假想蛋白DKFZp564D0462 AL033377-1.25 0.23有絲分裂原活化的蛋白激酶活化的蛋白激酶3 U09578 NM_04635 -1.20.35β澱粉樣蛋白(A4)前體蛋白結合的U62325 -1.20.18AXL受體酪氨酸激酶 M76125 NM_001699 -1.19 0.3整聯蛋白α5 X06256 NM_002205 -1.18 0.02月元病毒蛋白(PrP) U29185 -1.18 0.07TRAF家族成員相關的NFKB激活物(TRAF family U59863 NM_04180 -1.17 0.13member-associated NFKB activator)膜聯蛋白VIY00097 NM_01155 -1.16 0.12鈷胺傳遞蛋白IIL02648 NM_00355 -1.16 0.12含壽司重複(sushi-repeat)的蛋白，X染色體 U61374 NM_006307 -1.13 0.09骨形態發生蛋白6 M60315 NM_01718 -1.13 0.39假想蛋白，來自克隆23549和23762U90908 NM_021226 -1.10.6視網膜cDNA隨機引物亞文庫，EST W28438 -1.09 0.36TU3A蛋白 AF035283-1.06 0.29角蛋白7 AJ238246 NM_005556 -1.05 0.53潛在的轉化型生長因子結合蛋白2 Z37976 NM_00428 -1.04 0.13N-鈣粘著蛋白 M34064 NM_001792 -1.02 0.12
cDNA DKFZp564J0323(來自克隆DKFZp564J0323)AL049957-1.01 0.221所述改變表達為log2的比值。
2表達水平改變的標準偏差。
還研究了重組Prox-1在BEC中(通常是缺失的)表達的能力，所述表達可修飾這些細胞對淋巴管內皮細胞的基因型的轉錄過程。通過寡核苷酸微陣列分析可確定，對照AdLacZ，不顯著改變BEC或LEC特異的轉錄。反之，AdProx-1增強許多LEC特異的mRNA的表達，例如VEGFR-3，p57Kip2，粒橋蛋白I/II和α-肌動蛋白相關的LIM蛋白(見表8)。令人吃驚的是，Prox-1還抑制在BEC中特定表達的基因的表達的大約40％，所述基因例如轉錄因子STAT6，theUFO/axl受體酪氨酸激酶，neuropilin-1(NRP-1)，單核細胞化學吸引劑蛋白-1(MCP-1)和整聯蛋白α5(見表7和表8)。這些基因表達的結果與淋巴管的體內研究一致。例如，在淋巴內皮中發現了VEGFR-3和粒橋蛋白I/II(Ebata等，Microvasc.Res.6140-48.2001；Kaipainen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.923566-70.1995)，並且發現在BEC中由Prox-1表達的VEGF輔受體(co-receptor)NRP-1，在小鼠皮膚中的血管表達，而不在其淋巴管中表達。
表8Prox-1調控的LEC和BEC特異性基因的實例



粗體所示的基因通過Northern印跡或RT-PCR確定。
為確定基因表達中的Prox-1誘導的改變是否細胞類型特異的，分析了其他內皮細胞類型(即冠狀動脈內皮細胞(CAECs)和隱靜脈奶皮細胞(SAVECs))和非內皮細胞類型(即羊膜內皮細胞(AEC))中，AdProx-1 or AdLacZ感染後基因表達的改變。在所有這些細胞類型中，AdProx-1強烈地上調細胞周期蛋白E1和E2，組蛋白H2B，和PCNA。然而，AdProx-1隻在CAECs和SAVECs中誘導VEGFR-3的表達，而不在AECs中誘導該基因的表達。
這些結果和Prox-1胚胎中缺乏淋巴管分化一致。有趣的是，Prox-1在原代內皮細胞中的表達導致VEGFR-3受體酪氨酸激酶的上調，該激酶在孕中期後對淋巴內皮特異，並且對正確的淋巴管生長和功能是必要的(Karkkainen和Petrova，原癌基因195598-5605.2000)。例如，人和小鼠中VEGFR-3的活化突變導致淋巴管發育不全和淋巴水腫(Jeltsch等，Science 2761423-1425.1997；Karkkainen等，Nat.Genet.，25153-159.2000；Karkkainen等，Trends Mol.Med.718-22.2001)。上述結果表明Prox-1對VEGF-3的表達的上調是淋巴管內皮細胞身份的確定中的重要途徑之一，還表明成人血管內皮細胞中不同細胞的基因型是可塑的，並且對轉錄重編(transcriptionalreprogramming)敏感，這對於本發明影響內皮細胞的治療方法是有用的。
實施例5使用ADPROX-1轉染的細胞進行離體細胞刺激和淋巴水腫的基因治療Prox-1調節特異性參與LEC發育的基因的能力為治療顯示LEC疾病的個體或由LEC基因表達水平增加或降低造成的病情提供了方法。Prox-1上調可用於促進LEC發育，治療以例如淋巴管發育較寬為特徵的淋巴管系統發育不良為特徵的LEC疾病，例如淋巴水腫。本領域已知，細胞的離體轉染和隨後將這些細胞轉移到病人體內是有效的上調轉移的特定基因的體內水平的方法，並可緩解由於這些基因的表達較低導致的疾病。(Gelse等，Arthritis Rheum.48430-41.2003；Huard等，基因Ther.91617-26.2002；Kim等，Mol.Ther.6591-600 2002)。
為產生治療LEC發育疾病的療法，將內皮細胞，例如CAEC，SVEC，LEC或BEC從患有LEC疾病(例如淋巴水腫)的個體中分離出來，並隨後將這些細胞置於適當的培養基中(見上文)以促進細胞的生長和存活力。隨後如所述使用上述的AdProx-1載體感染這些細胞，來啟動非LEC在體外的LEC分化，以及促進培養基中LEC的生長。這些轉染後的細胞隨後以有效促進LEC在體內的擴增的數量被轉入患病的病人。在優選的實施方案中，受操作的細胞是自體細胞。這些細胞通過一種或多種通常包括注射的給藥途徑來遞送。這些細胞被地送到LEC疾病或病症例如淋巴水腫的局部位點或者被系統地遞送。
將Prox-1感染的細胞引入患有淋巴水腫的病人提供了補充性的LEC，所述LEC可以併入淋巴系統網絡中來促進淋巴管發育和完成淋巴清除來緩解淋巴水腫的症狀。還涉及一種方法，包括將AdProx-1轉染到內皮細胞內，並給藥轉染的細胞，這種方法對於治療任何以LEC數目或活性為特徵的疾病是有效的，所述疾病例如淋巴水腫，淋巴管瘤，淋巴管骨髓瘤，淋巴管肌瘤病，淋巴管擴張，淋巴肉瘤，和淋巴管硬化。此外，這種方法還可用來緩解與這種疾病相關的症狀(例如，淋巴水腫中由淋巴導致的腫脹)。
實施例6LEC-特異性基因的表徵使用LEC和BEC基因之間的扣除文庫(subtraction library)進一步分析LEC-特異性基因。為構建所述文庫，如上述分離總RNA，並且使用SMARTPCR cDNA合成試劑盒(BD Biosciences Clontech)預擴增5μg of總RNA。使用RsaI消化後，PCR-選擇的cDNA subtraction以兩個方向進行，導致差異表達的序列的選擇性擴增，並且製備了subtracted LEC和BEC cDNA文庫(BD Biosciences Clontech)。使用1(tester)30(driver)的比例以兩個方向進行扣除雜交，並使用PCR擴增扣除後的cDNA庫。50ng純化的PCR擴增產物被克隆入pAtlas載體(基於PUC的載體)用來構建扣除文庫，儘管本領域已知一些其他載體也可用來構建。
扣除的LEC特異性文庫的示差篩選如PCR-Select DifferentialScreening Kit User Manual(BD Biosciences Clontech)所述進行。LEC-特異性扣除文庫經平板培養，並挑出單個的細菌克隆使其生長。DNA提取後，用PCR擴增插入物並進行測序。等分量的PCR擴增插入物也在尼龍膜上進行排列並用來和32P標記的cDNA探針雜交。扣除的LEC特異性(tester)和扣除的BEC特異性(driver)cDNA探針的雜交結果用於差異表達分析。
BLAST (The Basic Local Alignment Search Tool)用來比較核苷酸，蛋白和EST序列資料庫的序列。對於未知的序列，搜索EST重疊群，並使用ORF finder預測開放閱讀框架。蛋白結構域構型用Pfam(Protein families database of alignments和HMMs)和Smart(SimpleModular Architecture Research Tool)分析。
在LEC和BEC中差異表達的克隆的核苷酸序列如上述方式分析。首次篩選中多種EST或未知的基因片段被進一步研究來確定其與已知基因序列的相似性，來確定任何開放閱讀框架以及功能性結構域的類似性。這些結果見表9。
表9

發現多種LEC-特異性基因與KIAA基因序列相對應，KIAA是大的核苷酸EST克隆，編碼未知的人蛋白。(Kazusa DNA ResearchInstitute，1532-3，Yana Kisarazu，Chiba，292-0812，Japan)。這些LEC特異性基因在多種可得的資料庫中進一步分析，以確定物種同源物的存在和這些同源物的相似性百分比，以及揭示顯示與保守的蛋白結構域的相似性的胺基酸序列。
LEC克隆序列的分析使用National Institutes of Health提供的U.S.National Center for Biotechnology Information保存的Homolo基因資料庫，來確定物種同源物和直向同源物以及其與新分離的人LEC特異性基因的相似性百分比。這些序列的分析使用的的資源是curated和計算後的基因同源物，如由Uni基因代表或基因組序列的注釋表示，通常比較EST和來自UniGene的mRNA序列，以及從注釋的基因組序列中提取的轉錄物。(Zhang，等，J.Comp.Biol.7203-14.2000)。一種有機體中的核苷酸序列與另一種有機體中的核苷酸序列的最佳匹配基於這兩個序列之間相似性的程度，其最小比對為100個鹼基對。這兩個序列之間的相似性通過比對值確定。序列對的比對是被比對的兩個序列的部分的相似性得分的總和。
HomoloGene分析表明相應於KIAA0626，KIAA0644，和KIAA0062的人LEC基因，與EST和以下未知的基因序列同源小鼠(所有)，大鼠(KIAA0062，KIAA0644)，牛(KIAA0062)，豬(KIAA0626，KIAA0644)和非洲爪蟾屬(KIAA0644)。所述克隆顯示與被鑑定為Homolo基因的同源物的基因大約80％(±3％)的相似性，KIAA0644顯示與豬EST序列BE233028.1高達86％的同源性，以及與X.laevis基因較低的72％的相似性。
使用Pfam比較分析LEC基因發現，相應於KIAA0626(SEQ IDNO14)，KIAA0644(SEQ ID NO15)，hLyrp(SEQ ID NO16)，XM_084655(SEQ ID NO45)和KIAA0062(SEQ ID NO47)的核苷酸序列顯示以編碼的跨膜結構域為特徵的核苷酸序列，說明相應的多肽(其胺基酸序列分別為SEQ ID NO31，32，33，46和48)在細胞的表面表達。KIAA1673，KIAA0582和KIAA0101不顯示明顯的跨膜區並且據預期是胞質的或核蛋白。Northern印跡測定的組織表達顯示，KIAA0101在腎，胸腺，結腸和小腸中表達，而KIAA0582在心臟，骨骼肌，和卵巢中強烈表達，在腎和胎盤中表達較低，而在腦，肺，胸腺，小腸和前列腺中表達更低。
KIAA0626轉錄子的Northern印跡分析表明，KIAA0626在LEC中特異性表達，並且見於心，骨骼肌和腎。原位分析表明KIAA0626在11天的小鼠胚胎(E11)中的肌節間組織和血管周圍的周細胞中，以及卵黃囊血管，內皮細胞以及周圍的周細胞中表達。KIAA0626(SEQID NO14)的多核苷酸序列編碼409個胺基酸(409胺基酸)的蛋白(SEQ ID NO31)，所述蛋白具有一個信號序列(胺基酸1-29)，一個Ig超家族結構域(大約胺基酸61-127)，一個短跨膜區(大約胺基酸153-175)，和一個從大約胺基酸176-409的長234個胺基酸的胞質區。預計Ig結構域可支持所述蛋白與其配體的結合，而長胞質結構域表明KIAA0626可能參與LEC的細胞內信號。
通過Northern印跡分析測定，KIAA0644(SEQ ID NO15)主要在心和腦組織中。E10小鼠胚胎的原位分析表明KIAA0644在整個胚胎中表達。KIAA0644多核苷酸編碼811個胺基酸的多肽(SEQ ID NO32)，顯示共有13個富含亮氨酸的區。富含亮氨酸的區包含一個短的序列基序，約20-28個胺基酸，該區在蛋白中起細胞粘附和受體分子的作用。富含亮氨酸的區，下文稱為LRRNT和LRRCT，通常側接富含半胱氨酸的區。所述KIAA0644蛋白含有一個富含亮氨酸的N末端區(LRRNT胺基酸26-54)，11個內部富含亮氨酸的區(LRR1胺基酸84-107，LRR2胺基酸108-131，LRR3胺基酸132-155，LRR4胺基酸156-179，LRR5胺基酸180-203，LRR6胺基酸204-223，LRR7胺基酸230-253，LRR8胺基酸254-277，LRR9胺基酸278-301，LRR10胺基酸302-325，和LRR11胺基酸326-349)以及一個C末端富含亮氨酸的區(LRRCT)，從大約胺基酸359-404。該KIAA0644跨膜區跨大約亮氨酸696-718，其胞質內區大約95個胺基酸，從胺基酸719-811。KIAA0644基因的富含亮氨酸的區使得該基因參與以細胞粘附或配體結合為特徵的蛋白-蛋白相互作用。
hLyrp(SEQ ID NO16)mRNA可在骨骼肌中檢測到，並且與E11和小鼠胚胎卵黃囊中的Prox-1染色相比，其可通過與淋巴管原位雜交定位。與KIAA0644相似，hLyrp蛋白(SEQ ID NO33)含有一系列富含亮氨酸的區，從富含亮氨酸的N末端區(LRRNT胺基酸27-55)延伸經過5個內部的富含亮氨酸的區(LRR1胺基酸57-80，LRR2胺基酸81-104，LRR3胺基酸105-128，LRR4胺基酸129-153，LRR5胺基酸154-176)，以C末端的富含亮氨酸的區(LRRCT)為終點，從大約胺基酸186-240。hLyrp多肽還含有一個跨膜區，從胺基酸249-272，其具有短的22個胺基酸的胞質區。多個連續的富含亮氨酸的區存在於hLyrp多肽中表明，該多肽的作用是細胞粘附分子和/或細胞表面受體。
使用在LEC中特異性表達的全長mRNA序列分離表3所示的多個附加序列。這些序列的結構域預測表明，KIAA0711(SEQ ID NO81和82)含有一個BPB/POZ結構域，所述結構域長達約胺基酸171-269，該結構域預期在蛋白-蛋白相互作用中起作用。POZ區出現在轉錄輔助因子例如鋅指蛋白中，所述轉錄因子介導轉錄抑制並且與組蛋白脫乙醯基酶複合物的組分相互作用。KIAA0711還具有三個Kelch同上，跨胺基酸386-437，439-480，和484-525，並且Kelch基序與β摺疊結構的形成有關。此外，KIAA0711 mRNA在多種組織中表達。KIAA0711 mRNA從最高表達水平到最低表達水平見於腦和腎，肝，脾；肺，卵巢，胰腺和心；平滑肌和睪丸。由於這種表達模式從一次RT-PCR ELISA中獲得，所述表達模式在循環RT-PCR中可能有變化。相應地，所述表達模式適合篩選以定性的量在組織中特異性表達的基因。如果需要更精確的定量表達模式，應採用在統計學上更加可信的方法(例如，多重RT-PCR ELISA測定，DNA晶片分析，RNA印跡分析，等等)。
對應於cDNA DKFZp5640222(SEQ ID NO93)的結構域圖譜表明，存在N末端信號肽(胺基酸1-23)，兩個內部同上結構域和一個可在蛋白例如myocilin，pancortin，和latrophilin中檢測到的olfactomedin區(胺基酸361-616)。Myocilin中的OLF區與青光眼相關。
KIAA1233(SEQ ID NO111)的結構域圖譜表明KIAA序列含有六個血小板反應蛋白I型同上，該序列見於細胞外基質蛋白並通常參與細胞-細胞相互作用，並更特異性參與補體途徑，抑制血管生成，以及參與凋亡。KIAA1233 mRNA從最高表達水平到最低表達水平，其見於脊髓；心，大腦，肺，腎，胰腺，各種腦組織(杏仁核，胼胝體，尾狀核，海馬，黑質，丘腦和下丘腦核團)和胎肝；胎腦；脾；和睪丸。
KIAA0846(SEQ ID NO188)蛋白含有鳥苷酸交換因子中的基序，並因此可能使細胞內蛋白，可能是信號蛋白。KIAA0846還顯示兩個EF手基序(EF-h和基序s)，見於信號蛋白(例如鈣調蛋白，S100B)(所述蛋白經過依賴鈣的構像改變)和緩衝/轉運蛋白。KIAA0846 mRNA從最高的表達水平到最低的表達水平見於腎；心，腦和肺；肝，脾和卵巢；胰腺，平滑肌和睪丸。
蛋白FLJ13110(SEQ ID NO207和208)包含TB2/DP1，HVA22超家族蛋白結構域和兩個短的跨膜區(SEQ ID NO207的胺基酸4-22和43-65)。HVA22家族包括來自多種真核細胞的成員，包括TB2/DP1(在嚴重的家族性腺瘤樣息肉病中缺失)蛋白，其在嚴重的家族性腺瘤樣息肉病，常染色體顯性的腫瘤性遺傳疾病中缺失。
LEC-特異性基因篩選還鑑定了蛋白KIAA0937(SEQ ID NO211和212)。KIAA0937含有WWE結構域(從SEQ ID NO211的大約胺基酸30-112，和113-189)，該結構域是根據其三個保守的殘基命名的，並被預期介導泛素質和ADP核糖偶聯繫統中的特異性的蛋白-蛋白相互作用。KIAA0937預期含有鋅指結構域(SEQ ID NO211的胺基酸443-501)，並預期其是細胞內轉錄因子。KIAA0937 mRNA從最高的表達水平到最低的表達水平見於，脊髓；下丘腦核團和大腦腦幹；廣泛意義上的腦(包括杏仁核，胼胝體和胎腦)和卵巢；胎肝；心，肺，腎，脾和腦的部分(尾狀核和海馬)；睪丸和胰腺；以及平滑肌。
KIAA0952(SEQ ID NO241和242)含有Broad-Complex，Tramtrack和Bric-a-brac結構域，也稱為POZ(痘苗病毒和鋅指)結構域。這些結構域已知是多種C2H2型轉錄因子的N末端以及Shaw類型鉀通道的蛋白-蛋白相互作用結構域。這些結構域已知的結構顯示緊密地互相纏繞的二體，該二體是通過N末端多肽鏈和螺旋結構之間的相互作用形成的。
命名為KIAA0429(SEQ ID NO391和392)的蛋白與轉移抑制蛋白相似，並含有大約從胺基酸467-484的肌動蛋白-結合WH2區，和從胺基酸348-466的富含脯氨酸的區。
蛋白FLJ23403(胺基酸序列，SEQ ID NO859；多核苷酸序列，SEQ ID NO860)顯示於未知的小鼠蛋白(GenBank Acc.No.XM 129000)大約85％的同源性，並含有一系列四個跨膜區，即胺基酸44-66，86-108，115-137和452-474。
其它LEC-特異性，上調的基因包括以前未鑑定的蛋白KIAA0186(SEQ ID NO221和222)，KIAA0513(SEQ ID NO235和236)和命名為FLJ13910(SEQ ID NO293和294)的蛋白。
淋巴管內皮細胞特異性分子的操作預期可用於治療LEC疾病的與組織水腫相關的病症。為不受理論限制，這種分子的操作預期可調節內皮細胞-細胞或細胞-基質蛋白的相互作用，或者通過改變通過淋巴關閉的液體運輸的狀態類影響跨內皮細胞運輸。此外，這種分子還提供了遞送治療性化合物例如生長因子，有絲分裂原等等諸如此類的靶點，以及遞送本領域已知的細胞抑制劑或細胞毒劑的靶點。這些治療性化合物通過將治療劑與例如LEC表面標誌物的結合配偶體(例如抗體)相連靶向這種細胞。本文鑑定的跨膜蛋白，具體為富含亮基酸蛋白，還提供了調節細胞粘附事件整體到淋巴清除的靶點。
實施例7檢測LEC和淋巴相關病症的微陣列分析本發明鑑定的LEC-特異性基因可用於體內檢測LEC和樣品中檢測淋巴管系統的範圍。該LEC-特異性基因也預期可用於診斷淋巴水腫和其它LEC相關的病症。
本發明的另一方面是一種組合物，包含多個多核苷酸探針，用於檢測以特定細胞類型為特徵的基因表達模式和用於檢測特定細胞類型例如淋巴管內皮細胞的基因表達模式的改變。本文術語「多核苷酸探針」指SEQ ID NO1-30，45，47，49和51之一的核酸序列或其片段，或者編碼SEQ ID NO31-44，46，48，和50之一的胺基酸序列的核酸序列或其片段。優選，所述片段的長度為至少10個核苷酸；更優選，該片段長度至少為20個核苷酸。這樣一種組合物可用於診斷和治療任何一種病情或疾病，所述疾病涉及或可疑淋巴管內皮細胞功能不良或無功能。在一個實施方案中，本發明提供了一種包含多個多核苷酸探針的組合物，其中至少一部分多核苷酸探針各包含一段獨特的序列，所述序列選自SEQ ID NO1-30，45，47，49和51之一。優選，所述組合物包含至少3個多核苷酸子集，每種多核苷酸都具有不同的序列，所述序列選自SEQ ID NO1-30，45，47，49和51之一。優選的組合物還有包含至少5，至少7，至少9，至少15，至少20，或至少25個不同的多核苷酸的組合物，所述多核苷酸具有SEQID NO1-30，45，47，49和51之一的序列。
所述組合物尤其可用作微陣列中的一套可雜交的陣列元件，用來監控多個靶多核苷酸的表達。所述微陣列包括底物和可雜交的陣列元件。所述微陣列可用於，例如由於異常淋巴管內皮細胞活性造成的疾病的診斷和預後，所述疾病例如淋巴水腫，淋巴管瘤，淋巴管骨髓瘤，淋巴管肌瘤病，淋巴管擴張，淋巴肉瘤，和淋巴管硬化。組合物還可用於鑑定一種以上細胞類型並用於一種以上的疾病，病症或病情的診斷和預後。此外，可從產生信號的那些探針和不產生信號的那些探針獲得有用的信息。
包含SEQ ID NO1-30，45，47，49和51之一的多核苷酸可用於診斷SEQ ID NO1-30，45，47，49和51編碼的基因之一的異常表達相關的病情或疾病。例如，包含SEQ ID NO1-30，45，47，49和51之一的序列的多核苷酸可用於雜交或體液或組織(例如從活檢中獲得)的PCR分析，來檢測患有淋巴水腫或另一種淋巴相關的疾病的病人的異常基因表達。此外，包含編碼SEQ ID NO31-44，46，48 or 50之一的胺基酸序列的序列的多核苷酸可用於診斷和具有那些胺基酸序列之一的多臺的異常表達相關的病情或疾病。包含至少10個核苷酸的片段可用於這些診斷方法中。
表達模式可以使用本發明包含SEQ ID NO1-30，45，47，49和51之一的組合物產生。由所述微陣列產生的表達模式可用來檢測疾病涉及的基因的表達的改變實施例8BEC和LEC中的轉錄因子在LEC中差異表達的轉錄因子包括鋅指因子c-maf和MADS家族轉錄因子MEF2C(圖1)。MEF2C的靶向誘變導致胚胎在E9.5-10死亡，這是由於初始脈管系統重構缺陷和心內膜異常(Bi，等，Dev.Biol.211255-267.1999)。據報導MEF2C可結合轉錄因子Sox18並加強其在內皮細胞中的活性(Hosking，等，Biochem.Biophys.Res.Commun.287493-500.2001)。在Sox18中具有破壞MEF2C複合物的純合子突變的幼鼠在一些遺傳背景下出現乳糜性腹水(Pennisi，D.，等，Nat.基因t.24434-437.2000)，表明這兩種蛋白可能都參與淋巴管形成的調節。與這一假設一致，MEF2C-/-胚胎的PCR-RT分析顯示VEGFR-3的表達降低(Bi，等，Dev.Biol.見上文)。
STAT6轉錄因子由IL-4激活，並且在BEC中特異性表達。與這一觀察一致，本文的結果顯示IL-4受體優選在BEC中表達，一些IL-4靶趨化因子和受體例如MCP-1和CXCR4也如此。VEGF刺激和活化VEGFR-2也已知導致STAT6在內皮細胞中磷酸化和活化(Bartoli，等，J.Biol.Chem.27533189-33192.2000)。因此STAT6在LEC中缺乏表明VEGFR-2的下遊信號途徑在BEC和LEC中不同。其他轉錄因子的表達模式見表5。
實施例9SOX18和遺傳性淋巴水腫轉錄因子MEF2C的表達在LEC中上調。Sox18(SEQ ID NO53，以及編碼SOX18的SEQ ID NO54)，據報導與小鼠中的MEF2C反應，並且也顯示在淋巴管內皮細胞發育中可能起作用。為了研究Sox18在淋巴水腫中的作用，研究了人Sox18突變體和人遺傳性淋巴水腫之間的相互關係。
SOX蛋白，SRY轉錄因子家族的類似物，是遍在的轉錄因子，它含有推定的高活動性基團(high-motility group)(HMG)DNA結合區。(Wegner，M.，Nucl.Acids Res.271409-20.1999)。SOX蛋白在七聚的SOX共有結合序列[5′-(A/T)(A/T)C胺基酸(A/T)G-3′](Pennisi等，Mol.Cell Bio.209331-36.2000)結合其靶DNA，並且在雙螺旋的小溝而非大溝處結合DNA，這導致該把基因的轉錄調節。SOX蛋白還可能參與將其它DNA結合蛋白募集到DNA蛋白複合物，從而支持轉錄調節(Wegner，見上文)。SOX18和SOX7以及SOX17具有同源性，它們都是F組Sox基因。
SOX18參與血管發育並且局限於發育的心血管系統和生血活性位點。在Sox18中具有Ragged(Ra)突變的小鼠純合子出現乳糜性腹水和水腫(Pennisi等，Nat.基因t.24434-37.2000)，這和淋巴水腫的Chy小鼠模型相似(Lyon等，Mouse News Lett.7126.1984)。Ra小鼠中的突變被確定為移碼突變，導致反式激活區的截短(Pennisi等，Nat.基因t.24434-37.2000)。Sox18無效小鼠卻顯示毛囊發育中的僅一個微小的基因型變化，並且沒有顯示人和水腫或無規律的血管發育的跡象(Downes和Koopman，Trends Cardio.Med.11318-24.2001)。該基因型可能由於F組Sox成員即SOX7和SOX17過多造成。這些蛋白可以在缺乏SOX18時替代其功能，但不能克服Sox18顯性的陰性突變體例如Ra突變。因此，敲除整個F組家族可能產生與Ragged小鼠類似的淋巴水腫基因型。
小鼠和人SOX18是同源的蛋白，包含一個大約80個胺基酸的DNA結合HMG-盒子(97％的同源性)，一個在小鼠中大約為93個胺基酸的反式激活區(90％的同源性)，以及一個C末端區(92％的同源性)(Downes和Koopman，見上文)。人SOX18 HMG-盒子可定位於核苷酸395-598，對應胺基酸84-151。小鼠HMG盒子由核苷酸320-532編碼，對應胺基酸78-148。目前還沒有關於人反式激活區的描述，但本領域熟練技術人員可輕易使用在小鼠SOX18的胺基酸252-346發現的同源小鼠序列(Hosking等，基因262239-47.2001)獲得人反式激活區。儘管人SOX18蛋白顯示於小鼠SOX18在初級結構水平上相似，人Sox18突變體與疾病或病情例如遺傳性淋巴水腫沒有已知的聯繫。
人Sox18被定位於染色體20q.13.3(Stanojcic等，Biochem.Biophys.Acta.1492237-41.2000)。闡明與遺傳性淋巴水腫相關的在該染色體上或其附近的位點上的可遺傳的突變可用於確定該疾病的遺傳基礎，篩選具有出現遺傳性或其他形式的淋巴水腫的傾向性的病人，以及作為克服遺傳突變的靶向治療方案的基礎。
為了確定Sox18和淋巴水腫之間的關係，鑑定患有遺傳性淋巴水腫的家族來進行連鎖和位置候選基因分析(linkage and positionalcandidate gene analyses)。家族成員如果顯示一條或兩條腿的不對稱的或明顯的腫脹，或者被診斷為淋巴水腫，或者有個人或家族的四肢腫脹或不對稱的報導，則該家族的成員被認為受到遺傳性淋巴水腫的影響。
從這樣的家族中獲得生物樣品，來進行遺傳分析。使用Miller等的方法(Nucleic Acids Res.161215.1998)，從EDTA抗凝的全血中分離DNA，並使用Puregene DNA分離試劑盒(Gentra Systems，Minneapolis，MN)從cytobrush樣品中分離DNA。用於基因組篩選的標記物的分析通過本領域已知的方法進行。見Browman等，Am.J.Hum.Genetic.，63861-869(1998)；也見the NHLBI MammalianGenotyping Service。
為了探索Sox18在淋巴水腫中可能的角色，通過直接測定Sox18基因的部分的序列來篩選淋巴水腫家族的先證者中的變異。所述測序法使用根據Sox18 cDNA序列(SEQ ID NO53)產生的擴增引物，以及相關的Sox基因的基因組結構的信息(內含子-外顯子數據，鑑定的結構域基序)。可變位置(單核苷酸多形性)和獨特序列引物用於擴增側接每個位於用於分析的結構域中的可變位點的序列。
正常和受淋巴水腫影響的個體的Sox18的基因組DNA被測序，並且通過未受影響的個體對比，得到了在淋巴水腫病人的Sox18基因中檢測到的突變的圖譜。通常在淋巴水腫的病人中檢測到的突變，例如保守的或非保守的核苷酸改變，缺失，或插入，表明特定核苷酸中的突變導致出現淋巴水腫的傾向性。受影響的個體的基因組DNA的分析將Sox18中的基因組序列中的突變和淋巴水腫聯繫起來。
為證實Sox18突變和淋巴水腫的出現之間的相互關係，進行了遺傳關係的研究，如美國專利申請US2003026759和PCT/US99/06133(每篇參考文件都包含在文中作為參考)中描述的鑑定遺傳多態性的方法。
兩點連鎖(Two-point linkage)分析使用常染色體顯性模型進行，所述模型預期在雜合狀態中為80％的外顯率，在純合狀態下為99％的外顯率，和1％的擬表型率。該疾病等位基因的頻率被定為1/10,000，微衛星標記等位基因的頻率是通過計數建立者等位基因(founder alleles)來計算的，還加入了非傳送的等位基因的計數。多點分析是通過使用University of Southampton School of Medicine提供的distances from the Location Database進行的。多點和兩點分析可通過使用VITESSE(vl.1)程序易化(O′Connell，和Weeks，Nature基因t.，11402-408.1995)。
用於基因組掃描的標記物的分析可通過本領域已知的方法進行。(見Browman等，Am.J.Hum.基因tic.，63861-869(1998)；也見the NHLBI Mammalian Genotyping Service和the Center for Moleculargenetics提供的資料庫(Marshfield，WI))。本領域熟練技術人員可輕易選出染色體20(尤其是20q13.3)中鑑定的遺傳連鎖標誌物，Sox18就位於其中(Stanojcic等，見上文)。
連鎖模擬可使用SLINK(Weeks等，Am.J.Hum.基因t.47A204.1990)進行，並且可使用MSIM(Ott，J.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，864175-4178.1989)分析連鎖，來估計兩點連鎖分析在被評估的家族中的潛力。使用可得的個體模型，標誌物基因型被模擬成連鎖的(linked)(θ＝0)和非連鎖的(unlinked)(θ＝0.5)模型。進行模擬使得檢測連鎖的力量大於Z(θ)2.0的LOD分數閾值的90％，並且假陽性率低於5％。
與遺傳性淋巴水腫相關的突變被預期位於SOX18蛋白的功能結構域內。例如，HMG-盒子結構域或者反式激活結構域。示例性的結構域包括導致非保守型替代的錯義突變，導致Sox18編碼區移碼的核苷酸缺失或插入，框架內缺失或插入例如影響功能結構域的那些，或者影響Sox18表達水平的控制序列的改變。
一旦鑑定了Sox18淋巴水腫相關的突變，含有分離的突變的Sox18等位基因的Sox18突變子表達載體就在例如，293T或內皮細胞中表達。Sox18突變體DNA也可以被整合入用於哺乳動物二雜合子系統中的質粒中(例如pGAL4)，來測定SOX18與其結合配偶體例如MEF2C(Hosking等，Biochem.Biophys.Res.Comm.287493-500.2001)的相互作用，或者用來篩選SOX18結合配偶體。例如，pGAL4Sox18載體將Sox18基因連接到酵母Gal4 DNA結合結構域，並且轉錄激活子被連接到分離的載體中的SOX18結合配偶體。將這些載體共引入宿主細胞中將導致由SOX18與該結合配偶體或候選的結合配偶體的相互作用造成的可監測的報導基因的表達。pCMV-BD和pCMV-AD載體分別含有GAL4 DNA結合結構域和NF-κB轉錄結構域，可用於該方法中(BD Biosciences Clontech)來構建和表達基因融合物，並且使用螢光素酶報導系統檢測SOX18的結合活性。
在這樣一個雙因子雜合子分析(dihybrid assay)中，含有通過反式激活區影響SOX18結合的突變的Sox18淋巴水腫-相關的突變體將降低螢光素酶報導活性的量，表明Sox18淋巴水腫相關的突變將通過其通過反式激活區結合其結合配偶體的能力的缺陷導致淋巴水腫。
還通過一些技術評估了Sox18等位基因中HMG-box DNA結合區中的突變。在單雜合子實驗中評估DNA結合，在該實驗中DNA序列與SOX18連接，例如5′-(A/T)(A/T)C胺基酸(A/T)G-3′及其變換，被置於與雙雜合子是嚴重的靶質粒相似的啟動子/報導基因構建體之前(即上遊或5』端)。報導基因試驗隨後檢測了SOX18蛋白及其推定DNA結合序列之間的結合。DNA結合也使用凝膠？實驗(gelshift assay)進行，即將純化的SOX18蛋白和含有SOX18 DNA結合序列的32P末端標記的DNA片段一同溫育。反應產物隨後在非變性的聚丙烯醯胺凝膠上進行分析，來測定DNA結合的或游離的SOX18的移動性。SOX18多肽對推定的結合位點的特異性是通過使用含有SOX18的結合位點的DNA片段或者寡肽，或者其他無關的DNA序列進行競爭試驗確定的。
此外，應用了用於檢測DNA/蛋白結合的基於螢光的試驗。SOX18 DNA結合是通過檢測與DNA或蛋白結合的單個螢光團的螢光測定的。在這些試驗中，蛋白結合是通過DNA-蛋白複合體形成時螢光強度或極性的改變測定的。可選地，兩種各含有半個該蛋白結合位點地DNA片段產生了。這兩個雙鏈DNA片段具有包含部分蛋白結合位點的互補的單鏈突出端。一個DNA片段用螢光供體標記，而另一個用受體標記，其螢光只能在螢光共振能量轉移(fluorescenceresonance energy transfer)(FRET)是檢測到。發生蛋白結合時，兩個DNA片段的突出端退火併使得螢光供體和受體接近，導致螢光能量的轉移，從而使得受體的螢光可被檢測。見Heyduk，等，Nat.Biotechnol.20171-6.2002。
人Sox18基因組合出現淋巴水腫的危險性的關係提供了另一種診斷和/或治療受到遺傳性淋巴水腫影響的個體的方法。闡明與淋巴水腫相關的Sox18突變使得可以確定SOX18蛋白的活性被突變幹擾，即DNA結合或蛋白結合，並提供了治療患有淋巴水腫的病人的指導。
此外，還涉及使用淋巴管生長因子例如VEGF-C和/或VEGF-D治療患有Sox18-誘導的淋巴水腫的病人，來治療受損害的淋巴管發育。例如，使用VEGF-C和/或VEGF-D治療VEGFR-3缺陷的動物克服了VEGFR-3不能起信號作用的缺陷，從而促進了淋巴管生成並緩解了淋巴水腫的症狀。Sox18-誘導的淋巴水腫病人用治療有效量的VEGF-C和/或VEGF-D治療。在另一個實施方案中，將VEGF-C和/或VEGF-D和其他設計為緩解淋巴水腫症狀的治療聯合治療給藥上述病人。
實施例10VEGF-C和VEGF-D敲除小鼠顯示的異常血管發育可以通過給藥外源性VEGF-C和/或VEGF-D多肽克服。為確定Sox18轉錄調節是否能夠由於其與VEGFR-3啟動子的可能的相互作用，以及對VEGFR-3的轉錄影響而克服這一缺陷，VEGF-C or VEGF-D敲除小鼠通過和從細胞特異的啟動子(例如K-14角蛋白啟動子)過度表達Sox18的小鼠進行雜種繁殖，進行遺傳雜交。Sox18活性對淋巴水腫的效果通過入實施例10所述測定淋巴水腫和血管發育進行評估。
基因敲出小鼠的存活和VEGF-C和/或VEGF-D敲除/Sox18-過度表達小鼠中淋巴管發育的檢測表明Sox18誘導VEGFR-3信號並在淋巴管生成中起關鍵作用。
VEGF-C過度表達小鼠(K-14-VEGF-C Tg)顯示廣泛的淋巴管系統網絡，並易於發生腫瘤轉移，還顯示上調的VEGFR-3表達和淋巴水腫症狀(美國專利6,361,946)。為確定Sox18是否通過VEGFR-3調節VEGF-C信號，使K-14-VEGF-C Tg小鼠與表達天然突變的Sox18(Ragged突變)的動物或者實驗室設計的突變體雜交，產生K-14-VEGF-C Tg/Sox18-/-小鼠，所述突變體是使用定點誘變和本領域已知的技術在SOX蛋白的DNA結合或反式激活區中產生突變構建的。
與K-14-VEGF-C Tg單突變動物相比，K-14-VEGF-C Tg/Sox18-/-雙突變動物顯示降低的淋巴管生成，降低的腫瘤轉移範圍，和降低的VEGFR-3水平，表明Sox18分子通過VEGFR-3幹擾VEGF-C信號，而且Sox18突變體中VEGFR-3信號的抑制下調了活化的VEGFR-3的淋巴管生成作用。
可選地，K-14-VEGF-C Tg小鼠與過度表達的Sox18等位基因的轉基因小鼠(見上文)雜交，並測定Sox18上調的作用。與K-14-VEGF-C Tg單突變動物相比，K-14-VEGF-C Tg/Sox18過度表達的雙突變動物顯示的淋巴管生成，降低的腫瘤轉移範圍，和降低的VEGFR-3水平，表明Sox18轉錄調節抑制VEGFR-3信號，並且很可能是淋巴管生成的負向調節中的因子。
表明Sox18是淋巴管生成的負向調節物的結果提供了一種治療由廣泛的淋巴管系統介導的疾病的方法，例如腫瘤生長或淋巴管肉瘤中的淋巴管生成，所述方法通過給藥提供過量的SOX18轉錄因子的載體，來防止淋巴管生成信號的誘導。
實施例11SOx18在淋巴管發育中的作用淋巴管內皮細胞顯示獨特的由例如VEGFR-3和Prox-1的多種LEC特異性基因高度調節的發育模式。Sox18是DNA結合蛋白和轉錄因子，預期參與這些LEC特異性基因的調節，與LEC細胞的命運相關。多條證據表明Sox18參與VEGFR-3轉錄調節，SOX18與小鼠中的轉錄因子MEF2C結合，Sox18突變體和MEF2C缺陷的小鼠顯示於VEGFR-3突變小鼠相似的淋巴水腫症狀，而且VEGFR-3啟動子含有MEF2C結合位點(Iljin等，FASEB J.151028-36.2001)。這些觀察支持SOX18在淋巴管發育中的作用。
為分析SOX18影響LEC特異性生長因子的能力，通過加入AdProx-1載體，誘導血管內皮細胞發育成LEC。Sox18 mRNA和蛋白水平在加入所述Prox-1載體前後測定。Sox-18在加入Prox-1載體之後的上調預期和淋巴管內皮細胞的發育相關，表明Sox-18是LEC分化中的因子。可選地，Sox18的DNA結合和反式激活活性被定點誘變破壞，從而產生顯性陰性或失活的SOX-18蛋白。含有Sox-18破壞的等位基因的質粒和AdProx-1載體一起被共轉染到BEC中，來評估存在無功能Sox-18基因時LEC的發育。LEC特異性標誌物例如LYVE-1和podoplanin的檢測也用於這些試驗中來測定Sox18調節淋巴管發育的能力。此外，突變體Sox-18還和編碼LEC特異性蛋白(例如，VEGFR-3，Prox-1，LYVE-1)的載體共轉染到293T細胞中，並評估了突變的Sox18調節所述基因的活性的能力。例如，存在或缺乏Sox18的條件下，VEGF-C刺激的VEGFR-3共轉染的293T細胞中的信號使用磷酸化試驗評估。
淋巴管系統的發育也可以在Sox-18突變小鼠中評估，所述小鼠包括Ra小鼠，Sox18裸鼠，和具有本文所述的與易患淋巴水腫相關的突變的Sox18轉基因小鼠。顯示淋巴水腫症狀的轉基因Sox-18小鼠，經改造表達與人突變同源的小鼠基因突變，或者被改造表達含有淋巴水腫特異性突變的Sox-18基因。分析了這些動物中淋巴管系統的發育，如美國專利6,361,946(也見Kaipainen等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，923566-70.1995)所述，使用本領域已知的技術，例如原位雜交來檢測VEGF-C和/或VEGFR-3 mRNA的表達，檢測活體內的a VEGF-C和/或VEGFR-3蛋白的抗體，以及使用Evan’s藍染料檢測來測定LEC發育的程度，並顯示活體內有效的琳巴引流。
顯性失活的Sox-18突變體轉染體中的VEGFR-3信號表明，Sox18表達對VEGFR-3介導的活性有損傷效應。本發明涉及克服這種類型的突變的治療，包括給藥例如人類病人的哺乳動物一種包含SOX18抑制物的組合物，例如顯性失活的基因或顯性失活的Sox18配體，所述組合物影響SOX18幹擾VEGFR-3信號的能力。可選地，如果Sox18活化促進VEGFR-3活性，則表明淋巴水腫的治療包含促進SOX18轉錄活性的組合物，例如在活體外給予過度表達Sox18的細胞。
實施例12SOX18介導的淋巴水腫治療本發明的另一方面提供是使用Sox18製備以細胞為基礎的治療組合物，具體是以LEC細胞為基礎的組合物。在一個實施方案中，所述細胞是自體細胞，即接受淋巴管系統疾病或病症的治療的有機體(例如人類病人)的細胞。本發明涉及通過例如同源重組的重組技術增加Sox18的內源性表達，例如通過修飾表達控制區，即啟動子。可選地，所述細胞被分離的Sox18即異源性Sxo18轉化或轉染所述細胞，來進行活體內或者活體外的同源Sox18表達。
例如，SOX18與轉錄因子MEF2C相互作用，形成的複合物與VEGFR-3啟動子結合，從而誘導VEGFR-3轉錄並影響VEGFR-3蛋白表達和信號水平。預期逆轉錄病毒或腺病毒載體驅使SOX18基因插入表達LEC的VEGFR-3，從而上調VEGFR-3介導的信號。
這些Sox18表達細胞隨後用作治療性組合物，治療患有LEC疾病或病症例如遺傳性淋巴水腫或外傷誘導的淋巴水腫的病人。這些細胞用於治療任何與VEGFR-3的表達相關的疾病或病症，例如淋巴管瘤，淋巴管骨髓瘤，淋巴管肌瘤病，淋巴管擴張，淋巴肉瘤，和淋巴管硬化.
此外，將SOX18多肽或多肽片段給藥患有淋巴水腫的病人來緩解淋巴水腫的症狀。給藥的含有DNA結合區或反式激活區的全長SOX18多肽或SOX18的片段，將結合其體內的關聯結合配偶體並促進VEGFR-3信號，或者將啟動淋巴管生成過程的下遊事件，從而迴避淋巴水腫相關的VEGFR-3信號或者VEGF-C配體結合的缺陷。
在相關的方面，如果SOX18表達通過降低的轉錄因子結合或者DNA結合抑制VEGFR-3信號，預期SOX18的抑制將導致VEGFR-3的補償性上調，減輕與VEGFR-3表達過低相關的有害症狀。在Sox18負向調節VEGFR-3活性的情形下，給予對Sox18基因特異的反義治療將抑制SOX18的活性，從而使VEGFR-3介導信號和淋巴管生長。但由於F組SOX蛋白(SOX7/17/18)的潛在功能性冗餘(potentialfunctional redundancy)，可能需要通過以至所有F組蛋白的DNA結合活性的機制使所有三種蛋白失活。這一過程是通過例如靶向在所有所述蛋白中高度同源的DNA結合區來實現的。認為重組，表達突變的DNA結合區的SOX7/17/18蛋白作為藥物組合物(含有所有三種突變肽)給藥時，將抑制SOX18對VEGFR-3的下調，並誘導或促進VEGFR-3信號的活性。從上文可見，儘管本發明的具體實施例是為舉例而描述，可進行各種修飾而不偏離本發明的精神和範圍。
本發明所有上述美國專利申請公開出版物，美國專利申請，外國專利，外國專利申請和非專利出版物的全文內容都包含在本文中作為參考。
表3淋巴內皮細胞(187種基因)






















1一種測定，表明轉錄子是否被檢測到(存在，P)，未檢測到(缺失，A)，或勉強檢測到(勉強，M；如果一次試驗中為P，另一次為A也用M表示)。
2兩種獨立採集的BEC和LEC(＝共4組比較)的轉錄子的表達水平的變化。以log2比值表示所述變化。
3所述表達水平(四組比較)變化的標準偏差。
NB＝Northern印記，IF＝免疫螢光表4血管內皮細胞(222基因)


























1一種測定方法，表明轉錄子是否被檢測到(存在，P)，未檢測到(缺失，A)，或勉強檢測到(勉強，M；如果一次試驗中為P，另一次為A也用M表示)。
2兩種獨立採集的BEC和LEC(＝共4組比較)的轉錄子的表達水平的變化。以log2比值表示所述變化。
3所述表達水平(四組比較)變化的標準偏差。
NB＝Northern印記，IF＝免疫螢光表10已知的LEC-特異性基因


*Af＝Affymetrix，S＝對LEC的特異性，NS＝非特異性(也在BEC中表達)，數字代表BEC和LEC之間的信號強度的log2比值。
表11根據保藏號鑑定的差異表達的基因

*Af＝Affymetrix，S＝對LEC的特異性，NS＝非特異性(也在BEC中表達)，數字代表BEC和LEC之間的信號強度的log2比值。
表12其它鑑定的蛋白

*Af＝Affymetrix，S＝對LEC的特異性，NS＝非特異性(也在BEC中表達)，數字代表BEC和LEC之間的信號強度的log2比值。
在表5，6和12中，括號裡的數字表示序列表裡的SEQ ID NO。下表13將這些序列與多肽序列SEQ ID NO31-44和46(開放閱讀框架，ORF’s)。
表13對應於LEC-特異性多核苷酸的多肽

表14表3中序列的序列鑑定物















表15表4中的序列的序列鑑定物














權利要求書(按照條約第19條的修改)(於2003年10月15日(15.10.03)被國際局接受；修改了原始權利要求7，10，15，18，54，55，76和77；加入了新權利要求94-99；餘下的權利要求未改變(7頁))。
1.差異調節血管內皮細胞(BEC)或淋巴管內皮細胞(LEC)的生長或分化的方法，包括使內皮細胞和一種組合物接觸，所述組合物包含差異調節血管和淋巴管內皮細胞的製劑，所述製劑選自以下物質(a)包含BEC多肽或LEC多肽的胺基酸序列的多肽，或者所述多肽的活性片段；(b)包含編碼(a)的多肽的核苷酸序列的多核苷酸；(c)特異性結合(a)的多肽的抗體；(d)包含(c)的抗體的片段的多肽，其中所述片段和抗體與該多肽結合；(e)編碼(a)的多肽的人基因或mRNA的反義核酸；(f)編碼(a)的多肽的人基因或mRNA的幹擾RNA(RNAi)。
2.權利要求1的方法，其中所述內皮細胞與所述組合物在活體外接觸。
3.權利要求1方法，其中所述組合物包含可藥用的稀釋劑，佐劑或載體，且所述接觸步驟包括將所述組合物給藥受試哺乳動物，以差異調節受試哺乳動物的BEC或LEC。
4.權利要求3方法，包括鑑定患有以LEC的過度增生為特徵的病症的人類受試者；和將所述組合物給藥該人類受試者，其中所述製劑差異抑制LEC的生長和BEC的生長。
5.權利要求3方法，包括鑑定患有以LEC的過度增生為特徵的病症的人類受試者；篩選受試者的LEC，以鑑定表3中的多肽的過度表達；和將所述組合物給藥該人類受試者，其中所述製劑通過抑制篩選步驟所鑑定的多肽的表達，差異抑制LEC的生長和BEC的生長。
6.根據權利要求3的調節人類受試者的淋巴管內皮細胞的生長的方法，包括以下步驟鑑定患有增生性淋巴疾病的人類受試者；
篩選受試者以鑑定表3中所述的LEC多肽的低表達或低活性，其中所述蛋白不在表1或2中；將所述組合物給藥人類受試者，其中所述製劑包含篩選步驟鑑定的LEC多肽(a)或者所述多肽的活性片段，或者包含編碼該多肽的核苷酸序列的多核苷酸(b)。
7.一種製劑在製備差異調節血管內皮細胞(BEC)或淋巴管內皮細胞(LEC)的生長或分化的藥物中的用途，所述製劑選自(a)包含BEC多肽或LEC多肽的胺基酸序列的多肽，或者所述多肽的活性片段；(b)包含編碼(a)的多肽的核苷酸序列的多核苷酸；(c)特異性結合(a)的多肽的抗體；(d)包含(c)的抗體的片段的多肽，其中所述片段和抗體與該多肽結合；(e)編碼(a)的多肽的人基因或mRNA的反義核酸；和(f)編碼(a)的多肽的人基因或mRNA的幹擾RNA(RNAi)。
8.權利要求1-7之一的方法或用途，其中所述多肽是選自表3的LEC多肽，而且所述製劑差異調節LEC和BEC的生長或分化。
9.權利要求1-7的方法或用途，其中所述多肽是選自表4的BEC多肽，而且所述製劑差異調節BEC和LEC的生長或分化。
10.權利要求8的方法或用途，其中所述多肽不在表1或2中。
11.權利要求8的方法或用途，其中所述LEC多肽包含選自SEQ ID NO81，187，207，211，221，235，241，293或391的胺基酸序列。
12.權利要求8的方法或用途，其中所述LEC多肽包含選自SEQ ID NO31-34，46或48的胺基酸序列。
13.權利要求12的方法和用途，其中所述製劑包含(c)的抗體或(d)的多肽。
14.權利要求的方法12，其中所述製劑包含(a)的多肽的細胞外區片段，或者編碼所述細胞外區片段的多核苷酸。
15.權利要求1-7之一的方法或用途，其中所述製劑包含反義分子。
16.治療遺傳性淋巴水腫的方法，包括
鑑定患有淋巴水腫的人類受試者，該受試者的編碼表3中鑑定的LEC蛋白的基因的至少一個等位基因中具有突變，其中所述突變和人類受試者中的淋巴水腫相關，並且所述LEC蛋白不是VEGFR-3；且給藥所述受試者一種組合物，所述組合物包含選自VEGF-C多肽，VEGF-D多肽，VEGF-C多核苷酸，或VEGF-D多核苷酸的淋巴管生長製劑。
17.選自VEGF-C多肽，VEGF-D多肽，VEGF-C多核苷酸，或VEGF-D多核苷酸的淋巴管生長製劑在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療表3中鑑定的LEC基因突變造成的遺傳性淋巴水腫，且所述基因不是VEGFR-3。
18.篩選內皮細胞疾病或患該疾病的傾向性的方法，包括從人類受試者獲得含有內皮細胞mRNA樣品；根據樣品中從所述基因轉錄的mRNA的量測定BEC或LEC基因的表達，其中所述BEC或LEC基因編碼表3或4中鑑定的多肽。
19.監測藥物對內皮細胞的效力或毒性的方法，包括以下步驟將藥物給藥受試動物前後，測定受試哺乳動物內皮細胞中至少一種BEC或LEC基因的表達，其中至少一種BEC或LEC基因編碼表3中所述的多肽，並且其中BEC或LEC基因的表達的改變與藥物對內皮細胞的效力或毒性相關。
20.鑑定調節內皮細胞的生長的化合物的方法，包括在存在或缺乏化合物的條件下培養內皮細胞；測定細胞中至少一種BEC或LEC基因的表達，其中的BEC或LEC基因選自編碼表3和4中的多肽的基因；與缺乏該化合物的情況相比，存在該化合物時至少一種BEC基因的表達改變表明該化合物是BEC生長的調節物；且與缺乏該化合物的情況相比，存在該化合物時至少一種LEC基因的表達改變表明該化合物是LEC生長的調節物。
21.權利要求20的篩選選擇性調節BEC或LEC的生長或分化的化合物的方法，其中所述測定步驟包含測定細胞內至少一種BEC基因和至少一種LEC基因的表達，和所述方法包含通過篩選差異調節至少一種BEC基因的表達和至少一種LEC基因的表達的化合物，篩選選擇性地調節BEC或LEC的生長或分化的化合物。
22.一種組合物，包含一種分離的多核苷酸，包含編碼含有選自Q ID NO31-44，46，48，50，52，81，187，207，211，221，235，241，293或391的胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；和可藥用的稀釋劑，載體或佐劑。
23.權利要求22的組合物，包含含有選自Q ID NO14-30，45，47，49，51，82，93，111，188，208，212，222，236，242，294或392的核苷酸序列的多核苷酸，或編碼所述多肽的所述多核苷酸的片段。
24.一種表達載體，包含與一種多核苷酸可操作地連接的表達控制序列，所述多核苷酸包含編碼含有選自SEQ ID NO31-44，46，48，50，52，81，187，207，211，221，235，241，293或391的胺基酸序列的多肽的核苷酸序列。
25.權利要求24的表達載體，是含有該多核苷酸的複製缺陷的腺病毒或腺伴隨病毒載體。
26.一種組合物，包含權利要求24或25的表達載體以及可藥用的稀釋劑，載體或佐劑。
27.一種試劑盒，包含權利要求22，23或26之一的組合物，所述組合物與將其給藥受試哺乳動物來調節該受試動物的淋巴系統的說明包裝在一起。
28.使用權利要求24的表達載體轉化或轉染的宿主細胞。
29.製備LEC多肽的方法，包括在細胞表達該多核苷酸編碼的多肽的條件下，使權利要求28的宿主細胞生長。
30.純化並分離的多肽，包含選自選自Q ID NO31-44，46，48，50，52，81，187，207，211，221，235，241，293或391的胺基酸序列。
31.純化並分離的多肽，其包含的胺基酸序列選自以下序列(a)SEQ ID NO31-34，46，48，207，676，859或861；以及(b)(a)的胺基酸序列的至少10個胺基酸的細胞外區片段。
32.權利要求31的純化並分離的可溶性多肽，包含選自ID NO31-34，46，48，207，676，859或861的胺基酸序列的胞外區片段，其中所述多肽缺乏任何跨膜區。
33.權利要求32的多肽，所述多肽缺乏任何細胞內區。
34.一種融合蛋白，包含權利要求32或33的多肽，所述多肽與包含免疫球蛋白恆定區的免疫球蛋白片段融合。
35.一種組合物，包含權利要求30-34之一的多肽或蛋白，以及可藥用的稀釋劑，載體或佐劑。
36.一種試劑盒，包含權利要求35的組合物，以及將所述藥物組合物給藥受試哺乳動物以調節所述受試動物的淋巴系統的說明。
37.一種抗體，其與權利要求30-34之一的多肽特異性結合。
38.權利要求37的抗體，其是一種人化的抗體。
39.一種蛋白質，包含與權利要求30-34之一的多肽特異性結合的抗體的抗原結合區，其中所述蛋白與該多肽特異性結合。
40.鑑定LEC核酸的方法，包括(a)使含有候選LEC核酸的生物樣品與一種多核苷酸或其互補序列在嚴格的雜交條件下接觸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO1-30，45，47，49，51，82，93，111，188，208，212，236，242，294或392的序列的至少14個連續核苷酸的片段，所述嚴格的雜交條件是(i)42℃，在含有50％甲醯胺，5xSSPE，5x Denhardt′s溶液，0.1％SDS和0.1mg/ml變性的鮭精DNA的溶液中雜交20小時，和(ii)5℃，在1xSSC，0.1％SDS中洗滌30分鐘；和(b)檢測所述候選LEC核酸和所述多核苷酸的雜交，由此鑑定LEC核酸。
41.鑑定LEC蛋白的方法，包括(a)使含有候選LEC蛋白的生物樣品與權利要求37的抗體或權利要求39的蛋白之一的LEC蛋白結合配偶體在適合二者結合的條件下接觸；和(b)檢測所述候選LEC蛋白和所述LEC結合配偶體之間的結合，從而鑑定LEC。
42.鑑定LEC的方法，包括(a)使含有細胞的生物樣品和LEC結合配偶體在適宜兩者結合的條件下接觸，其中所述LEC結合配偶體包含與一種多肽結合的抗體，所述多肽含有SEQ ID NO31-34，46，48，207，676，859或861的序列，或包含所述抗體的抗原結合片段；和
(b)通過檢測細胞和所述LEC結合配偶體之間的結合鑑定LEC，其中LEC結合配偶體與細胞的結合鑑定LEC。
43.測定患遺傳性淋巴水腫的危險性的方法，包括(a)檢測人類受試者的核酸突變，所述突變與遺傳性淋巴水腫基因型相關，並且與相應的野生型等位基因編碼的多肽的胺基酸序列相比，所述突變改變人類受試者的至少一種等位基因編碼的胺基酸序列，其中所述野生型多肽是表3中鑑定的多肽。
44.測定患遺傳性淋巴水腫的危險性的方法，包括(a)檢測人類受試者的核酸中的突變，所述突變與遺傳性淋巴水腫基因型相關，並且與相應的野生型等位基因編碼的多肽的胺基酸序列相比，所述突變改變人類受試者的至少一種等位基因編碼的胺基酸序列，其中所述野生型多肽包含選自SEQ ID NO31-44，46，48，52，54，207，676，859或861的胺基酸序列；(b)使核酸中的所述突變的存在或缺失與患遺傳性淋巴水腫的危險性相關，其中核酸中存在所述突變與患遺傳性淋巴水腫的危險性增加相關，並且核酸中缺乏所述的突變與患遺傳性淋巴水腫的危險性不增加相關。
45.測定患遺傳性淋巴水腫的危險性的方法，包括(a)檢測人類受試者的核酸的突變，其中與野生型等位基因編碼的轉錄因子多肽的轉錄調節活性相比，所述突變改變了該人類受試者的至少一種轉錄因子的等位基因編碼的胺基酸序列，還改變該等位基因編碼的轉錄因子多肽的轉錄調節活性，其中所述野生型轉錄因子多肽包含SEQ ID NO81，SEQ ID NO211，或SEQ ID NO241的胺基酸序列，以及表5中的序列編碼的轉錄因子；和(b)使核酸中所述突變的存在或缺失與患遺傳性淋巴水腫的危險性相關，其中核酸中存在所述突變與患遺傳性淋巴水腫的危險性增加相關，並且核酸中缺乏所述的突變與患遺傳性淋巴水腫的危險性不增加相關。
46.權利要求45的方法，其中所述野生型轉錄因子等位基因包含表示為SEQ ID NO54的Sox18胺基酸序列。
47.權利要求46的方法，其中與所述測定鑑定了改變反式激活或Sox18等位基因編碼的蛋白的DNA結合區胺基酸序列的突變。
48.權利要求46的方法，其中與野生型SOX18對所述基因的轉錄活化相比，所述突變減少SOX18應答型基因的轉錄活化。
49.測定患遺傳性淋巴水腫的危險性的方法，包括(a)檢測人類受試者的核酸的突變，其中與野生型等位基因編碼的粘附多肽的結合親合力相比，所述突變改變了該人類受試者的至少一種轉錄因子的等位基因編碼的胺基酸序列，還改變了該LEC等位基因編碼的粘附多肽的結合親合力，其中所述野生型粘附多肽包含SEQ ID NO31-34，46，207，676，859和861之一的胺基酸序列；和(b)使核酸中所述突變的存在或缺失與患遺傳性淋巴水腫的危險性相關，其中核酸中存在所述突變與患遺傳性淋巴水腫的危險性增加相關，並且核酸中缺乏所述突變與患遺傳性淋巴水腫的危險性不增加相關。
50.權利要求43-49之一的方法，其中所述測定鑑定了突變的存在，並且所述相關步驟鑑定了所述病人患遺傳性淋巴水腫的危險性增加。
51.篩選人類受試者患遺傳性淋巴水腫的危險性增加的方法，包括測定人類受試者的核酸突變，所述突變改變了該核酸編碼的至少一種多肽的胺基酸序列，所述多肽包含表3的胺基酸序列。
52.權利要求51的方法，其中所述多肽包含選自SEQ ID NO31-44，46，48，50，52，和54，207，676，859或861的胺基酸序列，並且與患遺傳性淋巴水腫的危險性相關。
53.權利要求52的方法，其中所述多肽包含以SEQ ID NO54表示的SOX18胺基酸序列。
54.權利要求43-49，51，52和53之一的方法，其中所述方法包括以下步驟中的至少一步(a)測定人類受試者的至少一種多核苷酸的至少一種密碼子的核苷酸序列；(b)進行雜交試驗以測定來自人類受試者的核酸具有的核苷酸序列與一種或多種對照序列相同還是不同；(c)進行多核苷酸遷移試驗來測定來自人類受試者的核酸具有的核苷酸序列與一種或多種對照序列相同還是不同；和
(d)進行限制性核酸內切酶消化試驗確定人類受試者的核酸具有的核苷酸序列與一種或多種對照序列相同還是不同。
55.權利要求43-49，51，52和53之一的方法，其中所述方法包括進行聚合酶鏈反應(PCR)來擴增包含所述LEC多核苷酸的編碼序列的核酸，並測定所擴增的核酸的核苷酸序列。
56.篩選人類受試者的遺傳性淋巴水腫基因型，包括(a)提供包括來自所述人類受試者的核酸的生物樣品；和(b)分析所述核酸中突變的存在，與編碼SEQ ID NO31-44，46，48，50，52，54，207，676，859，和861之一的胺基酸序列的人類基因相比，所述突變改變了人類受試者中至少一種基因的至少一種等位基因所編碼的胺基酸序列，其中人類受試者中存在的突變改變上述胺基酸序列的方式與人類受試者的淋巴水腫相關可鑑定遺傳性淋巴水腫。
57.權利要求56的方法，其中所述生物樣品是細胞樣品。
58.權利要求56的方法，其中所述分析包括測定所述核酸的部分序列。
59.權利要求56的方法，其中所述人類受試者具有由篩選法所鑑定的遺傳性淋巴水腫基因型。
60.權利要求49的方法，其中至少一種基因對應於編碼SEQ ID NO54的胺基酸序列的人Sox18基因。
61.抑制淋巴管生成的方法，包括給藥受試者LEC跨膜多肽的抑制物，其中所述LEC跨膜多肽包含選自SEQ ID NO31-34，46 48，207，676，859或861的胺基酸序列，而且其中所述抑制物選自(a)LEC跨膜多肽的可溶性細胞外區片段；(b)與LEC跨膜多肽胞外區結合的抗體；(c)一種多肽，包含(b)的抗體的抗原結合區；和(d)一種反義核酸，與編碼LEC跨膜多肽和其互補物的核酸互補。
62.權利要求61的方法，其中所述抑制物是包含LEC多肽的胞外區片段的多肽，其中所述胞外區的序列選自SEQ ID NO31的胺基酸1-152，SEQ ID NO32的胺基酸1-695或SEQ ID NO33的胺基酸1-248。
63.權利要求61或62的方法，其中所述受試者是患有腫瘤的人。
64.調節哺乳動物受試者的淋巴管生成的方法，包括將LEC多核苷酸的反義分子以有效抑制LEC多核苷酸編碼的多肽的轉錄或翻譯的量，給藥需要調節淋巴管生成的受試哺乳動物，其中所述LEC多核苷酸包含選自SEQ ID NO14-30，45，47，49，51，208，677，860或862的核苷酸序列。
65.治療遺傳性淋巴水腫的方法，包括(a)鑑定患有遺傳性淋巴水腫的人類受試者，與包含SEQ ID NO31-44，46，48，50，52，54，207，676，859，和861之一的胺基酸序列的多肽的胺基酸序列相比，該人類受試者具有的突變改變了其至少一種多肽的胺基酸序列；並且(b)將VEGF-C多核苷酸，VEGF-C多肽，VEGF-D多核苷酸或VEGF-D多肽的淋巴管生長因子給藥所述受試者。
66.調節內皮細胞或者內皮前體細胞的生長的方法，包括將內皮細胞或內皮前體細胞與包含調節細胞內的prox-1轉錄調控的試劑接觸，其中所述試劑選自(a)prox-1多肽；(b)編碼prox-1多肽的多核苷酸；或(c)prox-1的反義分子。
67.權利要求66的方法，其中所述細胞包括培養的內皮細胞或內皮前體細胞，而且接觸是離體進行的。
68.權利要求67的方法，其中所述接觸包括將所述試劑加入培養基中。
69.權利要求66-68之一的方法，其中所述細胞包括內皮前體細胞。
70.權利要求66-69之一的方法，其中所述細胞在接觸步驟之後被引入受試哺乳動物中。
71.權利要求70的方法，其中所述受試者是人。
72.權利要求71的方法，其中的人類受試者患有LEC疾病。
73.提高人類受試者中的LEC的功能的方法，包括從人類受試者中分離內皮細胞或內皮前體細胞；用包含編碼prox-1多肽的核苷酸序列的表達載體轉化或轉染所述內皮細胞，以促進LEC的分化或生長；和轉化或轉染步驟後，將LEC細胞給予人類受試者。
74.權利要求73的方法，其中所述分離和給藥步驟中的人類受試者相同。
75.權利要求73或74的方法，其中所述人類受試者患有淋巴水腫。
76.權利要求73-74之一的方法，其中所述載體和轉化或轉染方法被選用於prox-1的瞬時表達。
77.權利要求73-74之一的方法，其中所述表達載體是複製缺陷的腺病毒載體。
78.分離的多肽，其包含的胺基酸序列與SEQ ID NO31的胺基酸61-127具有至少95％的同一性。
79.權利要求78的多肽，其包含的胺基酸序列與SEQ ID NO31的胺基酸30-152具有至少95％的同一性。
80.一種可溶性多肽，包含SEQ ID NO31中的胺基酸序列的片段，其中所述片段缺乏SEQ ID NO31的跨膜和細胞內胺基酸。
81.一種分離的多肽，包含SEQ ID NO32的至少一個富含亮氨酸的區。
82.權利要求81的分離的多肽，其中所述多肽缺乏SEQ ID NO32的跨膜胺基酸。
83.一種分離的多肽，包含SEQ ID NO33的至少一個富含亮氨酸的區。
84.權利要求81的分離的多肽，其中所述多肽缺乏SEQ ID NO33的跨膜胺基酸。
85.一種分離的多肽，其包含的胺基酸序列與包含SEQ ID NO111的胺基酸序列的多肽的片段具有至少95％的同一性，其中所述片段包含至少一個血小板反應蛋白I型同上序列。
86.權利要求85的分離的多肽，其中所述片段包括SEQ ID NO111的六個血小板反應蛋白I型重複序列。
87.一種分離的多肽，其包含的胺基酸序列與包含SEQ ID NO111的胺基酸序列的多肽的片段具有至少95％的同一性，其中所述片段包括至少一個免疫球蛋白C-2型結構域。
88.權利要求85的分離的多肽，其中所述片段包含SEQ ID NO111的三個免疫球蛋白C-2類型結構域序列。
89.一種融合蛋白，包含權利要求78-88之一的多肽和一種異源性多肽。
90.一種抗體，其特異性地與權利要求78-88之一的多肽結合。
91.一種多核苷酸，其包含編碼權利要求78-89之一的多肽的核苷酸序列。
92.包含權利要求91的多核苷酸的表達載體，其可操作地連接於表達控制序列。
93.權利要求92的表達載體，其是複製缺陷的腺病毒載體。
94.權利要求9的方法，其中所述多肽不在表1或2中。
95.權利要求1-7之一的方法，其中所述試劑包含一個反義分子，且其中的多肽不在表1或2中。
96.權利要求43-49之一的方法，其中所述測定鑑定了所述突變的存在，並且所述相關步驟鑑定了所述患者患遺傳性淋巴水腫的增加的危險性，而且其中所述方法包含至少以下步驟之一(a)測定該人類受試者的至少一種多核苷酸的至少一種密碼子的核苷酸序列；(b)進行雜交試驗來確定該人類受試者的核酸的核苷酸序列於一種或多種對照序列相同還是不同；(c)進行多核苷酸遷移試驗來測定來自人類受試者的核酸具有的核苷酸序列與一種或多種對照序列相同還是不同；和(d)進行限制性核酸內切酶消化試驗確定人類受試者的核酸具有的核苷酸序列與一種或多種對照序列相同還是不同。
97.權利要求43-39之一的方法，其中所述測定鑑定了所述突變的存在，而且該相關步驟鑑定了所述病人出現淋巴水腫的危險性增加，所述方法包括以下步驟進行聚合酶鏈反應(PCR)來擴增包含所述LEC多核苷酸的編碼序列的核酸，並測定該擴增的核酸的核苷酸序列。
98.權利要求73-74之一的方法，其中所述人類受試者患有淋巴水腫，而且其中所選載體以及轉化或轉染方法用於prox-1的瞬時表達。
99.權利要求73-74之一的方法，其中所述人類受試者患有淋巴水腫，而且所述載體包含複製缺陷的腺病毒載體。
權利要求
1.差異調節血管內皮細胞(BEC)或淋巴管內皮細胞(LEC)的生長或分化的方法，包括使內皮細胞和一種組合物接觸，所述組合物包含差異調節血管和淋巴管內皮細胞的製劑，所述製劑選自以下物質(a)包含BEC多肽或LEC多肽的胺基酸序列的多肽，或者所述多肽的活性片段；(b)包含編碼(a)的多肽的核苷酸序列的多核苷酸；(c)特異性結合(a)的多肽的抗體；(d)包含(c)的抗體的片段的多肽，其中所述片段和抗體與該多肽結合；(e)編碼(a)的多肽的人基因或mRNA的反義核酸；(f)編碼(a)的多肽的人基因或mRNA的幹擾RNA(RNAi)。
2.權利要求1的方法，其中所述內皮細胞與所述組合物在活體外接觸。
3.權利要求1方法，其中所述組合物包含可藥用的稀釋劑，佐劑或載體，且所述接觸步驟包括將所述組合物給藥受試哺乳動物，以差異調節受試哺乳動物的BEC或LEC。
4.權利要求3方法，包括鑑定患有以LEC的過度增生為特徵的病症的人類受試者；和將所述組合物給藥該人類受試者，其中所述製劑差異抑制LEC的生長和BEC的生長。
5.權利要求3方法，包括鑑定患有以LEC的過度增生為特徵的病症的人類受試者；篩選受試者的LEC，以鑑定表3中的多肽的過度表達；和將所述組合物給藥該人類受試者，其中所述製劑通過抑制篩選步驟所鑑定的多肽的表達，差異抑制LEC的生長和BEC的生長。
6.根據權利要求3的調節人類受試者的淋巴管內皮細胞的生長的方法，包括以下步驟鑑定患有增生性淋巴疾病的人類受試者；篩選受試者以鑑定表3中所述的LEC多肽的低表達或低活性，其中所述蛋白不在表1或2中；將所述組合物給藥人類受試者，其中所述製劑包含篩選步驟鑑定的LEC多肽(a)或者所述多肽的活性片段，或者包含編碼該多肽的核苷酸序列的多核苷酸(b)。
7.一種製劑在製備差異調節血管內皮細胞(BEC)或淋巴管內皮細胞(LEC)的生長或分化的藥物中的用途，所述製劑選自(a)包含BEC多肽或LEC多肽的胺基酸序列的多肽，或者所述多肽的活性片段；(b)包含編碼(a)的多肽的核苷酸序列的多核苷酸；(c)特異性結合(a)的多肽的抗體；(d)包含(c)的抗體的片段的多肽，其中所述片段和抗體與該多肽結合；(e)編碼(a)的多肽的人基因或mRNA的反義核酸；(f)編碼(a)的多肽的人基因或mRNA的幹擾RNA(RNAi)。
8.權利要求1-7之一的方法或用途，其中所述多肽是選自表3的LEC多肽，而且所述製劑差異調節LEC和BEC的生長或分化。
9.權利要求1-7的方法或用途，其中所述多肽是選自表4的BEC多肽，而且所述製劑差異調節BEC和LEC的生長或分化。
10.權利要求8或9的方法或用途，其中所述多肽不在表1或2中。
11.權利要求8的方法或用途，其中所述LEC多肽包含選自SEQ ID NO81，187，207，211，221，235，241，293或391的胺基酸序列。
12.權利要求8的方法或用途，其中所述LEC多肽包含選自SEQ ID NO31-34，46，或48的胺基酸序列。
13.權利要求12的方法和用途，其中所述製劑包含(c)的抗體或(d)的多肽。
14.權利要求的方法12，其中所述製劑包含(a)的多肽的細胞外區片段，或者編碼所述細胞外區片段的多核苷酸。
15.權利要求1-10之一的方法，其中所述製劑包含反義分子。
16.治療遺傳性淋巴水腫的方法，包括鑑定患有淋巴水腫的人類受試者，該受試者的編碼表3中鑑定的LEC蛋白的基因的至少一個等位基因中具有突變，其中所述突變和人類受試者中的淋巴水腫相關，並且所述LEC蛋白不是VEGFR-3；且給藥所述受試者一種組合物，所述組合物包含選自VEGF-C多肽，VEGF-D多肽，VEGF-C多核苷酸，或VEGF-D多核苷酸的淋巴管生長製劑。
17.選自VEGF-C多肽，VEGF-D多肽，VEGF-C多核苷酸，或VEGF-D多核苷酸的淋巴管生長製劑在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療表3中鑑定的LEC基因突變造成的遺傳性淋巴水腫，且所述基因不是VEGFR-3。
18.篩選內皮細胞疾病或患該疾病的傾向性的方法，包括從人類受試者獲得含有內皮細胞mRNA樣品；根據樣品中從所述基因轉錄的mRNA的量測定BEC或LEC基因的表達，其中所述BEC或LEC基因編碼表3或4中鑑定的多肽。
19.監測藥物對內皮細胞的效力或毒性的方法，包括以下步驟將藥物給藥受試動物前後，測定受試哺乳動物內皮細胞中至少一種BEC或LEC基因的表達，其中至少一種BEC或LEC基因編碼表3中所述的多肽，並且其中BEC或LEC基因的表達的改變與藥物對內皮細胞的效力或毒性相關。
20.鑑定調節內皮細胞的生長的化合物的方法，包括在存在或缺乏化合物的條件下培養內皮細胞；測定細胞中至少一種BEC或LEC基因的表達，其中的BEC或LEC基因選自編碼表3和4中的多肽的基因；與缺乏該化合物的情況相比，存在該化合物時至少一種BEC基因的表達改變表明該化合物是BEC生長的調節物；且與缺乏該化合物的情況相比，存在該化合物時至少一種LEC基因的表達改變表明該化合物是LEC生長的調節物。
21.權利要求20的篩選選擇性調節BEC或LEC的生長或分化的化合物的方法，其中所述測定步驟包含測定細胞內至少一種BEC基因和至少一種LEC基因的表達，和所述方法包含通過篩選差異調節至少一種BEC基因的表達和至少一種LEC基因的表達的化合物，篩選選擇性地調節BEC或LEC的生長或分化的化合物。
22.一種組合物，包含一種分離的多核苷酸，包含編碼含有選自SEQ ID NO31-44，46，48，50，52，81，187，207，211，221，235，241，293，或391的胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；和可藥用的稀釋劑，載體或佐劑。
23.權利要求22的組合物，包含含有選自SEQ ID NO14-30，45，47，49，51，82，93，111，188，208，212，222，236，242，294，或392的核苷酸序列的多核苷酸，或編碼所述多肽的所述多核苷酸的片段。
24.一種表達載體，包含與一種多核苷酸可操作地連接的表達控制序列，所述多核苷酸包含編碼含有選自SEQ ID NO31-44，46，48，50，52，81，187，207，211，221，235，241，293或391的胺基酸序列的多肽的核苷酸序列。
25.權利要求24的表達載體，是含有該多核苷酸的複製缺陷的腺病毒或腺伴隨病毒載體。
26.一種組合物，包含權利要求24或25的表達載體以及可藥用的稀釋劑，載體或佐劑。
27.一種試劑盒，包含權利要求22，23或26之一的組合物，所述組合物與將其給藥受試哺乳動物來調節該受試動物的淋巴系統的說明包裝在一起。
28.使用權利要求24的表達載體轉化或轉染的宿主細胞。
29.製備LEC多肽的方法，包括在細胞表達該多核苷酸編碼的多肽的條件下，使權利要求28的宿主細胞生長。
30.純化並分離的多肽，包含選自SEQ ID NO31-44，46，48，50，52，81，187，207，211，221，235，241，293或391的胺基酸序列。
31.純化並分離的多肽，其包含的胺基酸序列選自以下序列(a)SEQ ID NO31-34，46，48，207，676，859或861；以及(b)(a)的胺基酸序列的至少10個胺基酸的細胞外區片段。
32.權利要求31的純化並分離的可溶性多肽，包含選自SEQ ID NO31-34，46，48，207，676，859或861的胺基酸序列的胞外區片段，其中所述多肽缺乏任何跨膜區。
33.權利要求32的多肽，所述多肽缺乏任何細胞內區。
34.一種融合蛋白，包含權利要求32或33的多肽，所述多肽與包含免疫球蛋白恆定區的免疫球蛋白片段融合。
35.一種組合物，包含權利要求30-34之一的多肽或蛋白，以及可藥用的稀釋劑，載體或佐劑。
36.一種試劑盒，包含權利要求35的組合物，以及將所述藥物組合物給藥受試哺乳動物以調節所述受試動物的淋巴系統的說明。
37.一種抗體，其與權利要求30-34之一的多肽特異性結合。
38.權利要求37的抗體，其是一種人化的抗體。
39.一種蛋白質，包含與權利要求30-34之一的多肽特異性結合的抗體的抗原結合區，其中所述蛋白與該多肽特異性結合。
40.鑑定LEC核酸的方法，包括(a)使含有候選LEC核酸的生物樣品與一種多核苷酸或其互補序列在嚴格的雜交條件下接觸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO1-30，45，47，49，51，82，93，111，188，208，212，236，242，294或392的序列的至少14個連續核苷酸的片段，所述嚴格的雜交條件是(i)42℃，在含有50％甲醯胺，5xSSPE，5x Denhardt′s溶液，0.1％SDS和0.1mg/ml變性的鮭精DNA的溶液中雜交20小時，和(ii)5℃，在1xSSC，0.1％SDS中洗滌30分鐘；和(b)檢測所述候選LEC核酸和所述多核苷酸的雜交，由此鑑定LEC核酸。
41.鑑定LEC蛋白的方法，包括(a)使含有候選LEC蛋白的生物樣品與權利要求37的抗體或權利要求39的蛋白之一的LEC蛋白結合配偶體在適合二者結合的條件下接觸；和(b)檢測所述候選LEC蛋白和所述LEC結合配偶體之間的結合，從而鑑定LEC。
42.鑑定LEC的方法，包括(a)使含有細胞的生物樣品和LEC結合配偶體在適宜兩者結合的條件下接觸，其中所述LEC結合配偶體包含與一種多肽結合的抗體，所述多肽含有SEQ ID NO31-34，46，48，207，676，859或861的序列，或包含所述抗體的抗原結合片段；和(b)通過檢測細胞和所述LEC結合配偶體之間的結合鑑定LEC，其中LEC結合配偶體與細胞的結合鑑定LEC。
43.測定患遺傳性淋巴水腫的危險性的方法，包括(a)檢測人類受試者的核酸突變，所述突變與遺傳性淋巴水腫基因型相關，並且與相應的野生型等位基因編碼的多肽的胺基酸序列相比，所述突變改變人類受試者的至少一種等位基因編碼的胺基酸序列，其中所述野生型多肽是表3中鑑定的多肽。
44.測定患遺傳性淋巴水腫的危險性的方法，包括(a)檢測人類受試者的核酸中的突變，所述突變與遺傳性淋巴水腫基因型相關，並且與相應的野生型等位基因編碼的多肽的胺基酸序列相比，所述突變改變人類受試者的至少一種等位基因編碼的胺基酸序列，其中所述野生型多肽包含選自SEQ ID NO31-44，46，48，52，54，207，676，859或861的胺基酸序列；(b)使核酸中的所述突變的存在或缺失與患遺傳性淋巴水腫的危險性相關，其中核酸中存在所述突變與患遺傳性淋巴水腫的危險性增加相關，並且核酸中缺乏所述的突變與患遺傳性淋巴水腫的危險性不增加相關。
45.測定患遺傳性淋巴水腫的危險性的方法，包括(a)檢測人類受試者的核酸的突變，其中與野生型等位基因編碼的轉錄因子多肽的轉錄調節活性相比，所述突變改變了該人類受試者的至少一種轉錄因子的等位基因編碼的胺基酸序列，還改變該等位基因編碼的轉錄因子多肽的轉錄調節活性，其中所述野生型轉錄因子多肽包含SEQ ID NO81，SEQ ID NO211，或SEQ ID NO241的胺基酸序列，以及表5中的序列編碼的轉錄因子；和(b)使核酸中所述突變的存在或缺失與患遺傳性淋巴水腫的危險性相關，其中其中核酸中存在所述突變與患遺傳性淋巴水腫的危險性增加相關，並且核酸中缺乏所述的突變與患遺傳性淋巴水腫的危險性不增加相關。
46.權利要求45的方法，其中所述野生型轉錄因子等位基因包含表示為SEQ ID NO54的Sox18胺基酸序列。
47.權利要求46的方法，其中與所述測定鑑定了改變反式激活或Sox18等位基因編碼的蛋白的DNA結合區胺基酸序列的突變。
48.權利要求46的方法，其中與野生型SOX18對所述基因的轉錄活化相比，所述突變減少SOX18應答型基因的轉錄活化。
49.測定患遺傳性淋巴水腫的危險性的方法，包括(a)檢測人類受試者的核酸的突變，其中與野生型等位基因編碼的粘附多肽的結合親合力相比，所述突變改變了該人類受試者的至少一種轉錄因子的等位基因編碼的胺基酸序列，還改變了該LEC等位基因編碼的粘附多肽的結合親合力，其中所述野生型粘附多肽包含選自SEQ ID NO31-34，46，207，676，859或861的胺基酸序列；和(b)使核酸中所述突變的存在或缺失與患遺傳性淋巴水腫的危險性相關，其中核酸中存在所述突變與患遺傳性淋巴水腫的危險性增加相關，並且核酸中缺乏所述突變與患遺傳性淋巴水腫的危險性不增加相關。
50.權利要求43-49之一的方法，其中所述測定鑑定了突變的存在，並且所述相關步驟鑑定了所述病人患遺傳性淋巴水腫的危險性增加。
51.篩選人類受試者患遺傳性淋巴水腫的危險性增加的方法，包括測定人類受試者的核酸突變，所述突變改變了該核酸編碼的至少一種多肽的胺基酸序列，所述多肽包含表3的胺基酸序列。
52.權利要求51的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO31-44，46，48，50，52，和54，207，676，859，和861之一的胺基酸序列，並且與患遺傳性淋巴水腫的危險性相關。
53.權利要求52的方法，其中所述多肽包含以SEQ ID NO54表示的SOX18胺基酸序列。
54.權利要求43-53之一的方法，其中所述方法包括以下步驟中的至少一步(a)測定人類受試者的至少一種多核苷酸的至少一種密碼子的核苷酸序列；(b)進行雜交試驗以測定來自人類受試者的核酸具有的核苷酸序列與一種或多種對照序列相同還是不同；(c)進行多核苷酸遷移試驗來測定來自人類受試者的核酸具有的核苷酸序列與一種或多種對照序列相同還是不同；和(d)進行限制性核酸內切酶消化試驗確定人類受試者的核酸具有的核苷酸序列與一種或多種對照序列相同還是不同。
55.權利要求43-53之一的方法，其中所述方法包括進行聚合酶鏈反應(PCR)來擴增包含所述LEC多核苷酸的編碼序列的核酸，並測定所擴增的核酸的核苷酸序列。
56.篩選人類受試者的遺傳性淋巴水腫基因型的方法，包括(a)提供包括來自所述人類受試者的核酸的生物樣品；和(b)分析所述核酸中突變的存在，與編碼選自SEQ ID NO31-44，46，48，50，52，54，207，676，859或861的胺基酸序列的人類基因相比，所述突變改變了人類受試者中至少一種基因的至少一種等位基因所編碼的胺基酸序列，其中人類受試者中存在的突變改變上述胺基酸序列的方式與人類受試者的淋巴水腫相關可鑑定遺傳性淋巴水腫。
57.權利要求56的方法，其中所述生物樣品是細胞樣品。
58.權利要求56的方法，其中所述分析包括測定所述核酸的部分序列。
59.權利要求56的方法，其中所述人類受試者具有由篩選法所鑑定的遺傳性淋巴水腫基因型。
60.權利要求49的方法，其中至少一種基因對應於編碼SEQ ID NO54的胺基酸序列的人Sox18基因。
61.抑制淋巴管生成的方法，包括給藥受試者LEC跨膜多肽的抑制物，其中所述LEC跨膜多肽包含選自SEQ ID NO31-34，46 48，207，676，859或861的胺基酸序列，而且其中所述抑制物選自(a)LEC跨膜多肽的可溶性細胞外區片段；(b)與LEC跨膜多肽胞外區結合的抗體；(c)一種多肽，包含(b)的抗體的抗原結合區；和(d)一種反義核酸，與編碼LEC跨膜多肽和其互補物的核酸互補。
62.權利要求61的方法，其中所述抑制物是包含LEC多肽的胞外區片段的多肽，其中所述胞外區的序列選自SEQ ID NO31的胺基酸1-152，SEQ ID NO32的胺基酸1-695或SEQ ID NO33的胺基酸1-248。
63.權利要求61或62的方法，其中所述受試者是患有腫瘤的人。
64.調節哺乳動物受試者的淋巴管生成的方法，包括將LEC多核苷酸的反義分子以有效抑制LEC多核苷酸編碼的多肽的轉錄或翻譯的量，給藥需要調節淋巴管生成的受試哺乳動物，其中所述LEC多核苷酸包含選自SEQ ID NO14-30，45，47，49，51，208，677，860或862的核苷酸序列。
65.治療遺傳性淋巴水腫的方法，包括(a)鑑定患有遺傳性淋巴水腫的人類受試者，與包含SEQ ID NO31-44，46，48，50，52，54，207，676，859，和861之一的胺基酸序列的多肽的胺基酸序列相比，該人類受試者具有的突變改變了其至少一種多肽的胺基酸序列；並且(b)將VEGF-C多核苷酸，VEGF-C多肽，VEGF-D多核苷酸或VEGF-D多肽的淋巴管生長因子給藥所述受試者。
66.調節內皮細胞或者內皮前體細胞的生長的方法，包括將內皮細胞或內皮前體細胞與包含調節細胞內的prox-1轉錄調控的試劑接觸，其中所述試劑選自(a)prox-1多肽；(b)編碼prox-1多肽的多核苷酸；或(c)prox-1的反義分子。
67.權利要求66的方法，其中所述細胞包括培養的內皮細胞或內皮前體細胞，而且接觸是離體進行的。
68.權利要求67的方法，其中所述接觸包括將所述試劑加入培養基中。
69.權利要求66-68之一的方法，其中所述細胞包括內皮前體細胞。
70.權利要求66-69之一的方法，其中所述細胞在接觸步驟之後被引入受試哺乳動物中。
71.權利要求70的方法，其中所述受試者是人。
72.權利要求71的方法，其中的人類受試者患有LEC疾病。
73.提高人類受試者中的LEC的功能的方法，包括從人類受試者中分離內皮細胞或內皮前體細胞；用包含編碼prox-1多肽的核苷酸序列的表達載體轉化或轉染所述內皮細胞，以促進LEC的分化或生長；和轉化或轉染步驟後，將LEC細胞給予人類受試者。
74.權利要求73的方法，其中所述分離和給藥步驟中的人類受試者相同。
75.權利要求73或74的方法，其中所述人類受試者患有淋巴水腫。
76.權利要求73-75之一的方法，其中所述載體和轉化或轉染方法被選用於prox-1的瞬時表達。
77.權利要求73-75之一的方法，其中所述表達載體是複製缺陷的腺病毒載體。
78.分離的多肽，其包含的胺基酸序列與SEQ ID NO31的胺基酸61-127具有至少95％的同一性。
79.權利要求78的多肽，其包含的胺基酸序列與SEQ ID NO31的胺基酸30-152具有至少95％的同一性。
80.一種可溶性多肽，包含SEQ ID NO31中的胺基酸序列的片段，其中所述片段缺乏SEQ ID NO31的跨膜和細胞內胺基酸。
81.一種分離的多肽，包含SEQ ID NO32的至少一個富含亮氨酸的區。
82.權利要求81的分離的多肽，其中所述多肽缺乏SEQ ID NO32的跨膜胺基酸。
83.一種分離的多肽，包含SEQ ID NO33的至少一個富含亮氨酸的區。
84.權利要求81的分離的多肽，其中所述多肽缺乏SEQ ID NO33的跨膜胺基酸。
85.一種分離的多肽，其包含的胺基酸序列與包含SEQ ID NO111的胺基酸序列的多肽的片段具有至少95％的同一性，其中所述片段包含至少一個血小板反應蛋白I型同上序列。
86.權利要求85的分離的多肽，其中所述片段包括SEQ ID NO111的六個血小板反應蛋白I型重複序列。
87.一種分離的多肽，其包含的胺基酸序列與包含SEQ ID NO111的胺基酸序列的多肽的片段具有至少95％的同一性，其中所述片段包括至少一個免疫球蛋白C-2型結構域。
88.權利要求85的分離的多肽，其中所述片段包含SEQ ID NO111的三個免疫球蛋白C-2類型結構域序列。
89.一種融合蛋白，包含權利要求78-88之一的多肽和一種異源性多肽。
90.一種抗體，其特異性地與權利要求78-88之一的多肽結合。
91.一種多核苷酸，其包含編碼權利要求78-89之一的多肽的核苷酸序列。
92.包含權利要求91的多核苷酸的表達載體，其可操作地連接於表達控制序列。
93.權利要求92的表達載體，其是複製缺陷的腺病毒載體。
全文摘要
本發明提供了在淋巴管內皮細胞和血管內皮細胞中差異表達的多核苷酸和基因。這些基因可用於治療涉及淋巴管的疾病，所述疾病例如淋巴水腫，各種炎性疾病，和通過淋巴管系統進行的癌轉移。
文檔編號A61K38/00GK1653080SQ03810440
公開日2005年8月10日 申請日期2003年3月7日 優先權日2002年3月7日
發明者卡裡·阿利塔洛, 泰加·馬基嫩, 塔蒂亞娜·彼得羅娃, 皮普薩·薩哈裡嫩, 朱亞·薩哈裡嫩 申請人:路德維格癌症研究院, 利森蒂亞有限公司