使用實時pcr檢測hbv的方法

2023-05-12 13:21:41 1

專利名稱：使用實時pcr檢測hbv的方法
技術領域：
本發明涉及B肝病毒基因的檢測。更具體地，本發明涉及與HBV基因互補的引物 對，包含與HBV基因互補的引物對和探針的HBV檢測用組合物，包含所述組合物的HBV檢測 試劑盒，以及用於檢測HBV基因的方法。
背景技術：
已知B肝病毒(下文稱為HBV)是病毒性肝炎的主要原因，據估計在世界範圍內有 20億人感染HBV。在這些感染人群中，約3. 5億人是慢性攜帶者，且大多數人有逐漸發展 為肝硬化和肝細胞癌的風險。HBV包膜基因由preS區(包含preSl和preS2)以及S區組 成。在全部包膜基因轉錄後，分別通過在三個區中每一個的可變翻譯來合成三個包膜蛋白 (L蛋白、M蛋白和S蛋白)。翻譯起始於preSl區的L蛋白由約400個胺基酸組成，所述氨 基酸包含全部的preSl域、preS2域和S域。翻譯起始於preS2區的M蛋白由約281個氨 基酸組成，所述胺基酸包含preS2域和S域。S蛋白由約226個胺基酸組成，所述胺基酸僅 包含S域，其表達量最大，從而成為病毒顆粒的主要組分。包膜蛋白的S域彼此結合以形成 作為S抗原的顆粒。M蛋白和L蛋白中包含的preSl和preS2域位於所述顆粒的外側，且起 到誘導高免疫應答的PreS抗原的作用。HBV感染的診斷可通過檢測樣品中存在的抗HBV抗體，檢測HBV抗原或檢測HBV基 因來進行。HBV抗原的檢測方法通常使用HBV表面抗原(HBsAg)或HBV e抗原(HBeAg)作為 診斷標記物來檢測其是否存在於血液中。然而，病毒的生命周期會妨礙HBV感染的早期診 斷。在治療期間，HBV感染患者血液中HBsAg或HBeAg的減少或缺失也會妨礙對患者體內 HBV的正確診斷。HBV基因檢測可通過核酸擴增技術(NPT)或DNA探針法進行。目前，這些方法廣泛 地用在臨床實踐中。特別地，PCR是選擇性地將少量靶基因擴增到可檢測水平的方法，因此 得到廣泛的應用。然而，問題在於DNA提取方法不可避免地導致DNA損失。例如，即使樣品 包含足量的靶DNA以作為擴增模板，但由於提取過程中的損失，無法回收到適合用於擴增 的量的DNA，導致模板擴增效率降低。因此，難以充分擴增並檢測樣品中的靶DNA。因此，此 技術產生假陰性結果，且由此而難以保證結果的正確性。即使使用相同的樣品，提取過程中 DNA產量的變化也會產生不同的結果，導致缺乏重複性。也就是說，DNA擴增技術的問題在 於其要求DNA提取過程引起樣品中痕量靶DNA損失，從而使檢測靈敏度降低。此外，當樣品 液體中包含擴增抑制劑(如肝素、表面活性劑、蛋白變性劑、有機溶劑等)時，擴增效率也降 低，從而使檢測靈敏度減小。此外，遺傳變異極低的區，如S蛋白區、前核心區(pre-Core region)或包膜蛋白 可用於通過PCR的HBV檢測。然而，這些區也具有低概率的變異，如突變。如果在鹼基序列 中發生遺傳變異，使用PCR引物和/或探針的擴增步驟失敗。因此，由於擴增效率的降低導 致獲得假陰性的結果或降低檢測靈敏度。因此，難以保證準確的定量。

發明內容
技術問題本發明的發明人已進行了許多努力來解決這些問題。本發明的發明人已經開發出使用樣品中包含的痕量靶HBV基因來準確且快速地檢測並定量HBV基因的方法，以及同時 檢測並定量具有極小遺傳變異(如突變)的HBV基因兩個區的方法。根據這些方法，即使 在基因的一個區中發生通過突變的遺傳變異，也能夠檢測此基因的其它區，從而高靈敏度 和特異性地完成疑似感染HBV患者的正確診斷，從而完成本發明。技術方案本發明的目的是提供與HBV基因互補的引物對，其鹼基序列如SEQ IDN0. 1和2，或 SEQ ID NO. 3 和 4 所示。本發明的另一個目的是提供用於檢測HBV基因的組合物，其包含具有鹼基序列 SEQ ID NO. 1和2的引物對、具有鹼基序列SEQ ID NO. 3和4的引物對和具有SEQ ID NO. 7 和8所示鹼基序列的探針。本發明的另一個目的是提供HBV檢測試劑盒，其包含所述用於檢測HBV基因的組 合物。本發明的另一個目的是提供使用所述用於檢測HBV基因的組合物來檢測HBV基因 的方法。


圖1是顯示能夠進行陽性檢測和定量而沒有內標對HBV特異性引物和探針競爭性 抑制的結果；圖2顯示HBV定量標準的線性；圖3顯示PCR結果，其中分別進行HBV S蛋白和前核心區的擴增；和圖4顯示PCR結果，其中同時進行HBV S蛋白和前核心區的擴增。在該情況下，檢 測中同樣沒有競爭性抑制，且定量中無顯著差異。有益效果如上所述，當通過本發明的實時PCR進行HBV感染的檢測和定量時，能夠獲得等於 或大於已知方法的靈敏度和特異性。
具體實施例方式因此，根據一個方面，本發明涉及與HBV基因互補的引物對。優選地，引物為具有 SEQ ID NO. 1和2，或SEQ ID N0. 3和4所示鹼基序列的引物對。如本文所用，術語「引物」是指具有游離3』羥基的短核酸序列，其與互補的模板形 成鹼基對，並充當模板鏈複製的起點。在存在四種不同三磷酸核苷和聚合試劑的適合緩衝 液時，引物能夠在適合溫度下啟動DNA合成。根據本發明的一個方面，引物為特異性擴增 HBV S蛋白或HBV前核心區的引物。因此，本發明的引物包含正向引物和反向引物的引物 對，其與基因互補且具有7-50個鹼基的序列，優選10-30個鹼基的序列。特別地，可通過具 有鹼基序列SEQ ID NO. 1和2的引物對來特異性擴增HBV S基因區，且可通過具有鹼基序列SEQ ID NO. 3和4的引物對來特異性擴增HBV前核心區。本發明的引物可通過亞磷醯胺(phosphoramidite)固相支持法或其它公知方法 來化學合成。也可使用許多本領域的公知方法修飾這些核酸序列。此類修飾的非限定性 實例包括甲基化、包囊化(capsulation)、通過天然核苷酸類似物取代一個或多個天然核苷 酸，和核苷酸間的修飾，例如對不帶電荷的結合物(膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基 甲酸酯等)或帶電荷的結合物(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修飾。核酸可包含一 個或多個其它共價結合的殘基，其實例為蛋白質(如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨 酸等)、插入劑(如吖啶、proralene等)、螯合劑(如金屬、放射性金屬、鐵、氧化性金屬等) 和烷基化劑。也可使用能夠直接或間接提供可檢測信號的標記物來改變本發明的核酸序 列。標記物的實例包括放射性同位素、螢光分子和生物素。當使用本發明提供的具有鹼基序列SEQ ID NO. 1和2以及SEQ ID NO. 3和4的引 物進行PCR時，可以高特異性且高靈敏度檢測各個HBV基因型。在本文中，術語「靈敏度」是 指患病者中經測試為陽性的比例，即識別患者中存在特定疾病的測試能力。術語「特異性」 是指無病個體中經測試為陰性的比例，即識別健康個體的測試能力。因此，所述引物可用於診斷HBV感染、分析感染型HBV基因型、HBV的流行病學分 析，以及評估HBV疫苗的功效和安全性。根據另一個實施方式，本發明涉及用於檢測HBV基因的組合物，其包含具有鹼基 序列SEQ ID NO. 1和2的引物對、具有鹼基序列SEQ ID N0. 3和4的引物對和具有鹼基序 列SEQ ID N0. 7和8的探針。具體地，本發明提供了用於HBV檢測的組合物，其包含特異於HBV S蛋白區的新型 引物和具有鹼基序列SEQ ID N0. 7的探針，所述新型引物由具有鹼基序列SEQ ID NO. 1的正 向引物和/或具有鹼基序列SEQ ID N0. 2的反向引物組成。此外，本發明提供了用於HBV檢 測的組合物，其包含特異於HBV前核心區的新型引物和具有鹼基序列SEQ ID N0. 8的探針， 所述新型引物由具有鹼基序列SEQ ID N0. 3的正向引物和/或具有鹼基序列SEQ IDN0. 4 的反向引物組成。此外，本發明提供了用於檢測內標的組合物，其包含特異於不存在於人和HBV基 因中且作為內標以檢測假陰性反應的新型引物和具有鹼基序列SEQ ID N0. 9的探針組成， 其中所述新型引物由具有鹼基序列SEQ ID N0. 5的正向引物和/或具有鹼基序列SEQ ID N0. 6的反向引物組成。與使用特異於單個基因鹼基序列的引物和探針的技術相比，在本發明中優選通過 使用S蛋白特異性引物和探針以及前核心蛋白特異性引物和探針來實現較高靈敏度和特 異性地檢測血液中的HBV。引物的具體序列描述在下表1中。[表 1] 如本文所用，術語「HBV(B肝病毒)」是一類病毒且導致通常通過輸血傳播的乙 肝。其大體分為急性和慢性肝炎。急性B肝的症狀與A肝或C肝的症狀類似。大多數人無 症狀，或一些人經歷流感樣症狀但無需任何治療即可痊癒。慢性B肝的症狀也與C肝的症 狀類似，包括疲勞、發熱、嘔吐、肌肉和關節痛。症狀持續時間較長，增加了向肝硬化和肝細 胞癌發展的風險。因此，需要不斷的檢查。PCR通常用於B肝的診斷，但是已知的PCR診斷 方法的問題在於這些方法擴增並檢測單個區，因此，此區中的突變會導致低靈敏度和特異 性，從而提供假陽性和假陰性結果。在本發明的診斷方法中，將S蛋白特異性引物和探針連 同前核心區特異性引物和探針一起使用，並將它們的擴增產物用在單一檢測步驟中，從而 提供便利、高特異性和靈敏度以及更高準確性的定量測定。在優選實施方式中，本發明的組合物進一步包含用於檢測由所述引物序列擴增的 核酸的探針序列。如本文所用，術語「探針」是指能夠與另一目標寡核苷酸雜交的寡核苷酸，無論其 或為天然存在或為合成製備，或為重組或為PCR擴增的寡核苷酸。探針可為單鏈或雙鏈。 探針可用於檢測、鑑定和分離特定的基因序列。在優選實施方式中，可使用任何「報告物分 子」標記用於本發明的任何探針，使其在包括螢光、放射性和發光系統在內的任何檢測系統 中都是可檢測的。不希望本發明受限於任何特定檢測系統或標記物。優選地，本發明的探 針為SEQ ID NO. 7或8所示的探針。在本發明的優選實施例中，發現所述引物和探針可用 於高靈敏度且特異性地檢測是否存在HBV，且無交叉反應性。在一個優選實施方式中，本發明的探針可為在其5』和3』端具有螢光分子的探針。 在一個優選實施方式中，所述探針包含分別位於其5』和3』端的螢光報告物和淬滅劑，其中 它們可顯示出相互幹擾。因此，當探針與樣品中存在的S蛋白或前核心區結合時，螢光信號 的產生受限。在進行聚合酶鏈式反應時，探針被降解，5』端的螢光報告物被釋放與3』端的 淬滅劑分離，從而產生螢光信號。可通過螢光信號檢測樣品中存在的HBV。可在5』端標記相關領域中常用的任何螢光分子，如6-羧基螢光素、六氯-6-羧基 螢光素、四氯-6-羧基螢光素、FAM(5-羧基螢光素)、HEX (2，，4，，5，，7，-四氯-6-羧基-4， 7- 二氯螢光素)和Cy5 (花菁-5)，但不限於此。也可在3』端標記相關領域中常用的任何螢光分子，非限制性標記如6-羧基四甲 基-羅丹明、TAMRA(5-羧基四甲基羅丹明)以及BHQ 1、2和3(黑洞淬滅劑(black holequencher) 1、2、3)，但不限於此。在本發明中，探針的鹼基序列SEQ ID NO. 7-9描述在下表2中。[表 2] 本發明的HBV特異性引物和探針能夠產生長度為IOObp的PCR產物，其適用於實 時PCR。特別地，特異於S蛋白和前核心蛋白的探針可用於通過taqman測定或分子信標測 定的PCR定量分析。本發明的發明人已經通過鹼基序列分析檢驗了假陽性和假陰性結果的風險。本發 明的發明人發現本發明的引物和探針為能夠僅擴增HBV基因的引物鹼基序列，且在使用由 BBI所提供的基因型套組(Genotype Panel) (PHD201 (M))的測試中顯示出100%的陽性預 測值，表明假陽性和假陰性結果的風險很低。此外，還使用基因型套組來評估其定量結果。 結果，套組間在定量結果上無顯著差異(表5)。因此，使用SEQ ID NO. 1和2的引物，以及 SEQID NO. 3和4和SEQ ID NO. 7和8的探針來進行血液中HBV的高可靠性檢測和定量。在優選實施方式中，本發明可包括作為內標的其它引物和探針序列，以使假陽性 和假陰性結果最小化。以內標組作為直接比較的標記物，從而防止假陽性和假陰性結果。優選地，內標組可以為來自植物的GFP(綠色螢光蛋白)。更優選地，GFP引物序列 可包含SEQ ID N0. 5和6所示的引物(見表1)。作為防止假陰性結果的內標組的引物和探針為這樣的引物和探針，其特異於來自 於植物的GFP (綠色螢光蛋白)基因，且不抑制HBV特異性引物和探針的實時PCR，且單獨形 成PCR產物。特別地，在檢測低水平HBV時，HBV PCR產物的形成不受內標的PCR產物的抑 制，由此能夠有效地防止假陰性結果，改進定量結果的可靠性，並還可在較低的檢測水平下 獲得定量。同時，在檢測高水平HBV時，內標的PCR產物形成不受HBV基因的PCR產物的抑 制，因此有效地保持測試可靠性，以降低由於內標反應抑制所導致的再次測試的可能性，從 而提供了方便性和高效率，以及允許在寬泛的水平上定量測定。如表2所述，內標的探針鹼 基序列為SEQ ID N0. 9。在一個優選實施方式中，本發明的組合物可為用於HBV檢測和定量的組合物，其 進一步包含緩衝液、DNA聚合物、dNTP和蒸餾水。此外，緩衝液、DNA聚合物、dNTP和蒸餾水 可為相關領域中常用的任何溶液和酶，而沒有特別限制。優選地，用於HBV檢測的組合物可 具有表3所示的組成。優選地，其它酶可為HS-Taq。HS-Taq為Taq DNA聚合酶的修飾形式，其通過熱處 理而活化。將化學部分連接到酶的活性位點，從而使得酶在室溫下無活性。因此，在擴增期間，錯啟動的引物(misprimed primer)不延伸。與標準DNA聚合酶相比，結果具有更高的 特異性和更大的產率。本發明的引物、探針、HS-Taq和緩衝液的具體組成描述在下表3中。[表 3] 在本發明中，靶擴增反應可優選為PCR，且PCR條件描述在下表4中。[表 4]實時PCR的反應條件 在另一實施方式中，本發明涉及用於檢測HBV基因的方法，該方法包括以下步驟從受試者中獲得樣品，和使用用於檢測HBV的組合物檢測生物樣品中的HBV基因。本文所用的術語「生物樣品」包括得自於HBV感染個體、疑似感染的HBV個體或接 種HBV疫苗個體的組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、痰液、腦脊液或尿液，但不限於此。優 選得自於疑似感染HBV的個體的血液的樣品。
對用於鑑定HBV存在和基因型的方法沒有特別限制，只要此方法使用上述引物。 此類方法的實例包括使用具有特定鏈的引物作為探針直接鑑定HBV DNA,Southern印跡、斑 點印跡和FISH(螢光原位雜交)。其它方法包括基於使用引物對擴增HBV DNA的方法、基 因型特異性聚合酶鏈式反應(下文稱為PCR)和通用引物PCR。更優選PCR，且最優選實時 PCR。本文所用的術語「聚合酶鏈式反應(PCR) 」是代表性的核酸擴增技術(NAT)，其在 體外通過酶促擴增感興趣的特異DNA區域。如果已知DNA分子片段的邊界序列，由Mullis 等在1985年開發的PCR方法可擴增DNA分子的任何片段。PCR基本上由三個主要步驟組 成變性、退火和延長。在重複這三個步驟時，特異DNA序列得到擴增。在PCR的第一步(變 性)中，雙鏈模板DNA變性為兩條單鏈。在第二步(退火)中，引物與兩類單鏈DNA退火， 其中待擴增的序列介於引物結合區域之間。在第三步中，耐熱性DNA聚合酶延長引物併合 成互補鏈。此循環重複25-30次。優選地，使用本發明的組合物來擴增由臨床樣品提取的DNA，並對產物進行實時 PCR0此類實時PCR分析可通過任何商購的實時PCR反應器進行，如SLAN實時PCR檢測系統 (LG Life Science，韓國)、LightCycler (Roche，德國)、ABI PRISMTM 7000/7700 (Applied Biosystems,美國)、iCycler (Bio-Rad,美國)、Rotor-Gene (Corbett，澳大利亞)和 0pticon (PharmaTech，美國)，但不限於此。引物是決定PCR結果可靠性的最重要因素。一些引物序列可引起非特異性擴增， 從而導致錯誤的結果。在此方面，本發明提供了可靠的引物對。使用本發明引物對進行PCR 能夠進行HBV基因型的準確檢測和極低量的靈敏定量分析。此外，當使用本發明的引物對 進行PCR時，能夠基於重複的PCR性能獲得一致的結果。也就是說，因為本發明的引物對是 高度有效和可靠的，所以使用本發明引物對獲得的結果是高度可靠的。在另一個實施方式中，本發明涉及用於HBV檢測和定量的試劑盒，其包含用於檢 測HBV的組合物。優選地，可通過包含具有本發明序列的引物和探針，以及內標引物和探針序列來 製備所述試劑盒。所述試劑盒可包括用於HBV檢測和定量的緩衝液、KCl、MgCl2*dNTP。更 優選地，使用具有表3組成的試劑盒來製備用於HBV擴增和檢測的試劑盒。在本發明的優 選實施例中，製備具有上述組成的試劑盒，從而高靈敏性且特異性地檢測和定量HBV。實施例以下，將參照實施例來更詳細地描述本發明。然而，這些實施例僅用於說明，且不 用於限制本發明的範圍。實施例1.引物和探針的構建本發明所用的HBV特異性引物和探針為僅能夠擴增HBV病毒基因的引物序列，這 通過使用來自 Hitachi Software 的DNAsis程序分析GenBank (www, ncbi. nlm. nih. rov)(由 美國國立衛生研究院(NIH)的生物技術信息國家中心(NCBI)管理)中的DNA序列，對此DNA序列進行測序，並隨後使用BLAST (www, ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)再次分析此DNA序 列確認的。在獲得鹼基序列後，使用HS-Taq來測定對HBV檢測用組合物中的HBV特異性引物和探針無競爭性抑制的植物源基因的特異性引物和探針。實施例2.引物的合成使用例如第三版分子克隆(Molecularcloning 3rd, Sambrook and Rusel 1，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2001)中 10. 42 節中所述的「寡核苷酸 的合成」的方法由Metabion(德國)合成實施例1中所分析的引物。實施例3.從臨床樣品中提取HBV RNA從疑似HBV感染患者的血液分離血清或EDTA-血漿，並使用基於矽膠膜的離心柱， 如QIAamp MineElute病毒離心柱(Qiagen)進行提取。起施徹丨4.分析根據表3的組成製備PCR反應溶液，並在表4所示的條件下在SLAN實時PCR檢測 系統(LG Life Science，韓國)中進行PCR。實時測定反應產物，並在完成反應後使用SLAN 8. O程序分析結果。在使用PCR 的 HBV DNA 定量方法中，Cobas Amplicor HBV Monitor 測試(Roche Diagnostics Systems,Meylan,法國)具有高靈敏度，但具有 2. O X IO2 至 2. O X IO5 拷貝 /mL 的窄動態範圍。因此，為了在準確定量的線性範圍內測定，需要將樣品稀釋。此外，bDNA方法 是基於信號擴增的DNA定量方法，其中使用各個病毒DNA特異性探針來捕獲存在於患者血 清中的病毒基因，並隨後使捕獲的基因與探針和擴增子(amplifier)反應以定量DNA。此方 法已經在病毒感染的診斷和療效評估中使用了一些年。在本發明中，通過本發明的發明人 發明的實時PCR測量韓國疑似慢性HBV感染患者的血清HBVDNA水平，並與Cobas Amplicor HBV Monitor 測試和bDNA方法比較，以評估其正確性。如表5和圖3所示，發現在使用BBI提供的基因型套組(PHD201(M))的測試中，陽 性預測值為100%，說明假陽性和假陰性結果的風險極低。此外，圖1顯示能夠進行陽性檢 測和定量而無內標對HBV特異性引物和探針的競爭性抑制。[表 5] 為測定HBV檢測的下限，應用HBV國際標準，NIBSC 97/746來補償用於標準化的 基質效應，隨後從無藥物血清(Bio-rad)稀釋的6種不同濃度的HBV血清中提取DNA，用 AdvanSure HBV實時PCR定量，並隨後進行概率值分析和計算95%檢測區間。結果，95%檢 測極限為2. 6IU/mL。
權利要求
與B肝病毒(HBV)基因互補的引物對，其具有SEQ ID NO.1和2，以及SEQ ID NO.3和4所示的鹼基序列。
2.用於檢測HBV基因的組合物，其包含具有鹼基序列SEQID NO. 1和2的引物對、具有 鹼基序列SEQ ID NO. 3和4的引物對和具有鹼基序列SEQID NO. 7和8的探針。
3.如權利要求2所述的組合物，其中所述組合物還包含作為內標且沒有顯示出競爭性 抑制的具有鹼基序列SEQ ID NO. 5和6的引物對和具有鹼基序列SEQ ID NO. 9的探針。
4.如權利要求2所述的組合物，其還包含HS-Taq、緩衝液、dNTP或蒸餾水。
5.如權利要求4所述的組合物，其包含各為IOOyMWSEQID NO. 1_4的引物、各為 100 μ M 的 SEQ ID NO. 7 和 8 的探針、2. 5U HS-Taq 和 2mMdUTP。
6.如權利要求2所述的組合物，其中所述探針包含在5』和3』端的螢光分子。
7.如權利要求6所述的組合物，其中所述在5』端的螢光分子為選自由6-羧基螢光素、 六氯-6-羧基螢光素、四氯-6-羧基螢光素、FAM(5-羧基螢光素)、HEX (2，，4，，5，，7，-四 氯-6-羧基_4，7-二氯螢光素)和Cy5(花菁-5)組成的組中的任意一種。
8.如權利要求6所述的組合物，其中所述在3』端的螢光分子為選自由6-羧基四甲 基-羅丹明、TAMRA(5-羧基四甲基羅丹明)以及BHQ 1、2和3 (黑洞淬滅劑1、2、3)組成的 組中的任意一種。
9.用於檢測HBV的試劑盒，其包含權利要求1-8中任一項所述的組合物。
10.用於檢測HBV基因的方法，所述方法包括以下步驟從受試者獲得樣品；和使用權 利要求1-8中任一項所述的組合物檢測所述生物樣品中的HBV基因。
11.如權利要求10所述的方法，其中通過聚合酶鏈式反應進行所述檢測。
12.如權利要求10所述的方法，其中所述樣品為血液。
全文摘要
本發明涉及B肝病毒(HBV)基因的檢測。更具體地，本發明涉及與HBV基因互補的引物對，包含與HBV基因互補的引物對和探針的HBV檢測用組合物，包括所述組合物的HBV檢測試劑盒，以及用於檢測HBV基因的方法。
文檔編號C12Q1/70GK101870971SQ20101016935
公開日2010年10月27日 申請日期2010年4月21日 優先權日2009年4月23日
發明者姜鎮錫, 樸榮石, 李東煥, 金東鉉 申請人:株式會社Lg生命科學