表達豬β幹擾素的CHO細胞系及其應用的製作方法

2023-05-12 22:48:46

專利名稱：表達豬β幹擾素的CHO細胞系及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及表達脊椎動物P幹擾素的CHO細胞系，其含有編碼所述 動物(3幹擾素的基因。更具體地，本發明公開了表達豬(3幹擾素的CHO 細胞系。本發明還涉及利用上述CHO細胞系生產豬P幹擾素標準品的方 法以及通過該方法獲得的的豬(3幹擾素，其具有極高的比活性和穩定性， 可用作豬卩幹擾素生物學活性檢測時的標準品和用於豬傳染性疾病的預防 和治療。
背景技術：
I型幹擾素是脊椎動物天然免疫系統的重要組成部分，為現代醫學的 重要研究領域。如今，病毒感染宿主時逃避幹擾素等天然免疫的機製成為 研究熱點[1—3]，這為病毒防治在理論上提供有力支持。豬生殖與呼吸綜合症 病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) [4'5]、 偽狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV)[6，7〗、豬動脈炎病毒(swine arterivirus ， PoAV) [8]、豬瘟病毒(swine fever virus) [9"1]和豬傳染性胃腸炎病毒 (transmissible gastroenteritis virus, TGEV ) [12]等病毒在感染宿主時，破 壞I型幹擾素系統都為它們突破宿主免疫系統的一個重要的機制。
I型幹擾素在人的慢性B型肝炎(chronic hepatitis B) [13'14]、慢性丙型 肝炎(chronic hepatitis C) [15]、多發性硬化症(multiple sclerosis) [16]、腫 瘤疾病[17'18]及其它疾病[19'2]的治療中發揮了重要作用。豬I型幹擾素對 TGEV[21]、豬瘟病毒[22]、 PRV^^等常見病毒病的治療具有良好的前景。 目前，國內豬I型幹擾素的生產主要採用原核[25'26]和酵母表達系統[27，28]。
因此，不管是I型幹擾素相關的基礎研究還是臨床使用，都需要高活 性、天然的I型幹擾素樣品，此外還需要對其生物學活性進行準確、便捷 的定量。幹擾素的定量需要穩定的標準品，目前農業部頒布的獸用生物制 品質量標準中的脊椎動物天然豬白細胞幹擾素是以雞新城疫病毒誘導豬白細胞獲得的，製作工藝和產品成分複雜，最終產品的活性較低，約為
10000 AU， mL'1。哺乳動物細胞表達的脊椎動物幹擾素是與其它表達系統 相比能夠正確摺疊、糖基化和翻譯後修飾，因此更穩定、比活性更高、更 適合作為標準品，尤其對於IFN-p，而目前缺乏源於哺乳動物細胞的脊椎 動物豬的IFN-(3標準品。綜上，獲得高水平哺乳動物細胞表達的脊椎動物 豬I型幹擾素具有重要的基礎研究和應用研究意義。

發明內容
本發明的目的為建立高效表達豬IFN-(3的CH0-K1細胞表達系統。 具體地，本發明涉及如下各項
1. 一種表達豬卩幹擾素的CHO細胞系，其含有編碼豬(3幹擾素的基因。
2. 根據以上l所述的CHO細胞系，其中所述豬P幹擾素的胺基酸序 列如SEQ IDNO:2所示。
3. 根據以上1所述的CHO細胞系，其中所述編碼豬(3幹擾素的基因 如SEQIDNO: 1所示。
4. 根據以上1-3任一項所述的CHO細胞系，其中在所述編碼豬卩幹 擾素的基因之前加入了 Kozak序列。
5. 根據以上1所述的CHO細胞系，其是保藏號為CGMCC No. 2412 的CHO細胞系。
6. —種生產豬(3幹擾素標準品的方法，該方法包括
1) 培養根據以上1至5中任何一項所述的CHO細胞系；
2) 從所述的CHO細胞系的培養液中提取(3幹擾素，用作豬p幹擾素 的標準品。 一
7. 根據以上6的方法，其中所述CHO細胞系是保藏號為CGMCC No. 2412的CHO細胞系。
8. 根據以上6或7的方法生產的豬(3幹擾素標準品。
9. 一種試劑盒，其包含根據以上6或7的方法生產的豬卩幹擾素標準 品。所述試劑盒可以用於豬傳染性疾病的預防和治療。
10. 根據以上1至5中任何一項所述的CHO細胞系生產的豬|3幹擾素
4在製備藥物中的應用，所述藥物用於豬傳染性疾病的預防和治療。所述疾 病例如是豬生殖與呼吸綜合症病毒、偽狂犬病毒、豬動脈炎病毒、豬瘟病 毒和豬傳染性胃腸炎病毒等病毒引起的疾病。
更具體地，在本發明的一個實施方案中，把豬(3幹擾素(PoIFN-p)的 ORF基因克隆至真核穩定表達載體pCI-neo (PoIFN-|3在高效啟動子CMV 控制下表達)，並穩定轉染至CH0-K1細胞，經G418壓力篩選和2次單 克隆，篩選出可穩定表達重組PoIFN-p的CH0-K1細胞克隆 (CHO-PoIFN-p)。本發明的一株陽性CHO細胞克隆(CHO-PoIFN-P，分 類命名中國倉鼠卵巢細胞(C7n'"e化//amww Ova^ CW/))於2008年3月 25日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC， 中國，北京)，保藏號為CGMCCNo.2412。在25cr^的細胞瓶(5ml培養 液)中，重組PoIFN-卩的累積表達水平達到7.7Xl5AU (antiviral units) /ml，每天的表達量可達4.6Xl5AU/ml或0.46AU/個細胞。CHO-PoIFN-p 細胞可在無G418壓力篩選下穩定表達至少20代。表達的重組PoIFN-P 可以誘導PK15細胞表達豬Mx蛋白。此外，其還可以完全保護PK15細 胞抵抗1000 TCID5Q的豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和偽狂犬病毒(PRV) 的感染。綜上，本研究中CHO-PoIFN-P細胞穩定、高效表達的重組PoIFN-卩 具有天然豬I型幹擾素的生物學活性，具有良好的基礎和應用研究價值。
本發明的專利性
新穎性
與已經使用的表達脊椎動物豬P幹擾素的技術相比(目前幹擾素表達 所採用的表達系統主要是原核、酵母表達系統，使用CHO表達脊椎動物 豬|3幹擾素的國內外未見報導)，表達的技術路線完全不同。表達的產物 在摺疊、糖基化、翻譯後修飾、穩定性、比活性上要大大優於已有的技術 手段(原核、酵母)。
創造性
1、 與己有的原核和酵母表達系統比較，本發明CHO表達系統表達出 的幹擾素在蛋白的摺疊、糖基化等翻譯後修飾上最接近於天然幹擾素，比 活性更高，約是原核的10倍；
2、 由於我們的目的是表達最接近天然活性的幹擾素，而農業部頒布的獸用生物製品質量標準中的天然豬白細胞幹擾素是以雞新城疫病毒誘導 豬白細胞獲得的，製作工藝和產品成分複雜，最終產品的活性約10000AU
mU1。與此相比較，本發明的表達系統的PoIFN-P的表達水平是其70 倍或以上，且工藝簡單、產品成分容易控制，具有極大的優越性。
綜上因此以CHO表達的豬P幹擾素與原核和酵母表達的相比較具 有極大的優越性和創造性。
附圖簡述


圖1. pCA-PoIFN-J3 (A至D)禾卩pCAGGS (E)轉染BHK-21上清的 抗病毒活性滴定。表達pCA-PoIFN-P和pCAGGS的轉染的BHK-21的上 清分別被命名為PoIFN-卩pCA和mockpCA， PoIFN-卩pCA稀釋IOM咅(A), 105倍 (B)， 16倍(C), 10M咅(D)， mockpCA稀釋IOM咅(E),並且不含IFN但加入病毒 對照的孔被設定為病毒對照(F);
圖2.重組PoIFN-(3在CHO-PoIFN-(3細胞中的表達；
圖3.傳代次數對CHO-PoIFN-(3細胞表達重組PoIFN-(3的影響；
圖4.免疫印跡檢測PoIFN-PcHo誘導MDBK細胞Mx蛋白的表達。在 用PoIFN-(3cho刺激後在MDBK細胞中的Mx蛋白的表達是劑量依賴型的。 在缺少(0)或存在(0.37至3.67xl04 AU/ml， A至F)的PoIFN-|3CHO下刺激 MDBK細胞，並通過Western blotting分析。A, 0.37; B， 3.67; C, 36.7; D， 3.67xl02; E, 3.67xl03; F, 3.67xl04;
圖5. CHO-PoIFN-p細胞表達的重組PoIFN-P體外抗病毒活性；用10 倍稀釋的PoIFN-Pcho (366745 AU/ml)處理PK15細胞24小時，用1000 TCID50 TGEV (A至D)和PRV (W至Z)攻擊，當病毒對照孔(D和W)形 成90_100% CPE時，稀釋104倍的PoIFN-(3cho(A)可以完全抵抗TGEV 的感染，但105 (B)和106 (C)倍稀釋不能。稀釋10M音的PoIFN-I3cho(X)可 以完全抵抗PRV的感染，但是10"B)和1s(C)倍稀釋不能。不含幹擾素 和病毒的孔被設定為空白孔(O);
圖6.豬卩幹擾素的胺基酸序列(SEQIDNO:2);
圖7.編碼豬(3幹擾素的基因(SEQIDNO:l);
圖8.質粒pCN-PoIFN-卩的核苷酸序歹(J，其中1171-1728位(斜體部分)是PoIFN-p基因，1165-1170 (雙下劃線標記部分)是Kozak序列。
具體實施例方式
下文將參考實施例和附圖詳細描述本發明，所述實施例僅是意圖舉例 說明本發明，而不是意圖限制本發明的範圍。本發明的範圍由後附的權利 要求具體限定。
實施例.高效穩定表達重組豬P幹擾素的CHO表達系統的構建及生物活
性檢測
1材料與方法
1.1質粒、細胞株和毒株
PK15細胞(ATCC No. CCL-33)由本實驗室保存，於含有5。％ FBS 的DMEM培養基中培養。豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV )和偽狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV)商購自中國農科院 哈爾濱獸醫研究所，並於PK15細胞上滴定半數組織培養感染劑量(Tissue Culture Infectious Dose50 ， TCID50)。
穩定真核表達載體pCI-neo (pCN)購自Promega公司，neo在SV40 早期啟動子的控制下表達。CHO-K1細胞株商購自ATCC (ATCC No. CCL-61), CHO-K1細胞於含10%FBS的DMEM-Ham，s F12 (DF12)培 養基(invitrogen)中培養。pMD18-T載體購自TaKaRa公司；原核表達質 粒pET-32a(+) (Novagen公司)、傳代牛腎細胞系(MDBK) (ATCC No. CCL-22)禾口BHK-21細胞(ATCCNo. CCL-10)均由本實驗室保存；原代 雞胚成纖維細胞(Chicken embryo fibroblasts, CEFs)採用10日齡的SPF 雞胚常規方法[29]製備；表達增強綠色螢光蛋白重組水皰性口炎病毒 (VSV*GFP)由本實驗室參考文獻通過反向遺傳技術構建[29]; MDBK細 胞系滴定PFU (plaque forming unit)後-70。C保存；新城疫LaSota株病毒 (CCVC NO. AV1615)商購自中國微生物菌種保藏管理委員會組織系統 (CCCCM)下屬的獸醫微生物菌種保藏管理中心(CVCC)，由本實驗室
7保存，CEFs滴定PFU後-7(TC保存備用。 1.2試劑與儀器
T4 DNA聚合酶購自MBI公司。Ni-NTA瓊脂糖親和樹脂、硝酸纖維 素膜購自Pierce公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG、魚皮蛋白購自 Sigma公司；高亮螢光素酉每檢測i式劑(Bright-Glo Luciferase assay system) 購自Promega公司；各種限制性內切酶和Ex-Taq酶都購自TaKaRa公司； T4 DNA連接酶購自MBI公司；質粒中量提取試劑盒購自Qiagen公司； 轉染試劑Fugene6購自Roche公司；96孔白色板(96 well white plate)購 自Coming公司；螢光倒置顯微鏡為LEICA公司產品；Microplate Fluorescence Reader (FLx800)為Bio-Tek公司產品，可檢測發光和螢光； CEQ8000自動測序儀為Beckman公司產品。Grace's培養基、DMEM培養 基、Trizol和M-MLV反轉錄試劑盒購於Invitrogen公司。螢光素(FITC) 標記的羊抗鼠IgG購自北京中杉生物技術公司。DAB顯色試劑盒購自博 士德公司。
1.3幹擾素基因克隆和質粒構建
從GenBank獲取PoIFN-卩的ORF序歹U (Genbank Accession No. S41178),設計引物。上遊引物為5，-TGCCACCATGGCTAACAAGTG CAT C，下遊引物為5，- AGC CAC AGG GGG GAG ATG TTC AGT，上遊 引物在起始密碼子ATG前加入了利於真核表達的Kozak序列。
PK15細胞生長至密度為90%左右時，按感染複數(multiplicity of infection, MOI)為1.0接種新城疫LaSota株病毒。8h後收細胞，用Trizol 提取總RNA，以上述引物進行RT-PCR。擴增的PoIFN-(3 PCR產物亞克隆 到pMD18-T載體獲得質粒pMD18-PoIFN-P，測序鑑定。
從質粒pMD 18-PoIFN-卩以I/Sal I雙酶切下PoIFN-卩的ORF片斷， 分別亞克隆至以I/A%e I雙酶切的質粒pCAGGS[3Q'31]，或以T4 DNA聚 合酶平滑化末端後亞克隆至Smal酶切的質粒pCN，獲得瞬時真核表達質 粒pCA-PoIFN-(3和穩定真核表達質粒pCN-PoIFN-P。1.4抗病毒活性滴定
IFN抗病毒活性定量檢測的操作步驟見參考文獻[29]，具體如下MDBK 細胞於96孔細胞板中生長至密度為90%，棄上清，每孔加10倍梯度稀釋 IFN樣品100pl，每個稀釋倍數設3個平行對照孔，37"及5%(302培養條 件下處理24h後，棄上清，用含2。/。FBS的DMEM稀釋VSV*GFP，按每 孔30000 PFU (lOOpl)加入病毒稀釋液，同時設未經轉染上清處理，只加 病毒液的病毒對照(Virus Control, VC)孑L。不加幹擾素和病毒的孔，作 為空白孔(BlankControl, BC)。接毒後至VC孔的CPE (cytopathic effect) 約為100%時，螢光倒置顯微鏡下觀察GFP表達及病毒感染複製情況。最 後所有孔每孔加入50pl細胞裂解液(cell lysis buffer, CLB)
，於搖床上裂解15min釋放細胞內的 GFP，用Microplate Fluorescence Reader(敏感性設置為70，激發光485 nm， 吸收光528 nm)檢測每孔綠色螢光蛋白的相對表達水平。判定以BC孔 校0，以VC孔為參照，每mL中，以表達綠色螢光數減少為VC孔50X 的平均最高稀釋度為一個抗病毒活性抑制單位(Antiviral Unit, AU)，計 算具體如下。
基於VSV*GFP檢測方法是計算半數病毒複製抑制的稀釋倍數，方法 如下若綠色螢光蛋白相對螢光值(Relative Fluorescence Units, RFU)用 F表示，以BC孔校0，則50%病毒複製押制的螢光值(F50) =F (VC) /2，按下面公式計算IFN的抗病毒活性單位logw[每niL中IFN抗病毒活 性單位(AU) ]二[F50—F(小於F50孔)]/[F(高於F50孑L)—F(小於F50孑L)] 十logu)[小於F50孔的稀釋倍數]。
1.5瞬時轉染
按照Fugene 6 (Roche公司)按操作說明書轉染pCN-PoIFN-P和 pCAGGS至BHK-21細胞(ATCCNo. CCL-10)(於含5%FBS的DMEM 中培養，培養條件為37"C及5XC02)，於轉染後16 h換新鮮培養基，繼 續在相同條件下培養48h收穫細胞培養上清，分別命名為PoIFN-(3pCA和 mockDCA，分裝並於—7(TC保存備用。1.6穩定轉染
首先確定篩選培養基中合適的G418 (invitrogen)濃度，方法如下 24孔細胞培養板接種每孔1000個CH0-K1細胞，並加G418使其濃度分 別為100、 200、 300 1200(ig/ml，選擇能在10—14天把細胞徹底殺死的 孔作為G418的篩選濃度。
參照轉染試劑Fugene 6操作說明書轉染pCN-PoIFN-卩至CH0-K1細 胞。轉染後24小時，按1:8的比例進行細胞傳代，用含有800 pg/mlG418 的壓力篩選培養液篩選培養細胞，10 14天後，用克隆環圈住具有新黴素 抗性的細胞克隆集落，胰酶消化下後依次於96孔、24孔和6孔細胞培養 板擴大培養。篩選出的不同細胞克隆按照0.5"06個細胞接種於6孔細胞 培養板中生長至密度為100%後24小時，收取細胞培養上清，分別如上用 VSV*GFP進行抗病毒活性滴定，選擇表達水平最高的克隆按限稀釋法再 進行單細胞克隆，按上述步驟篩選表達量最高的克隆後，擴增並按常規方 法凍存細胞，命名為CHO-PoIFN-卩，含有重組PoIFN-P的細胞培養上清命 名為PoIFN-卩cho。將CHO-PoIFN-卩於2008年3月25日保藏於中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京)，保藏號 為CGMCC No. 2412。
1.7雞Mx蛋白多克隆抗體的製備
I型IFN發揮其抗病毒生物學功能的途徑之一是經由JAK-STAT信號 轉導途徑激活Mx啟動子(Mx promoter, Mxp)，表達的Mx蛋白(Mx protein)能夠抑制負鏈RNA病毒複製；Mxp有較好的專一性，它不能被 白細胞介素(Interleukin)、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF) 等其它細胞因子啟動。通過對雞、豬和牛的Mx蛋白胺基酸序列進行同源 性分析，發現有部分同源性，主要位於Mx蛋白的N端，因此設計引物擴 增雞Mx蛋白的N端序列，長810bp，並克隆到原核表達載體pET-32a(+)， 表達的原核蛋白經Ni-NTA免疫小鼠製備的多抗，用於這三種動物的Mx 蛋白的檢測。新城疫病毒MOI為1.0感染細胞密度為約為100X的CEFs，待細胞病 變達60%—80%時收穫細胞，用Trizol提取總RNA，並用括號中的引物 (上遊引物為5，-GGGGATATC AGC AATCAG ATGGCTTTC-3'，引入 V酶切位點；下遊引物為5，-TTT GTC GAC TGG GAT GAC CTC GTT TTG-3，引入I酶切位點)進行RT-PCR，擴增雞Mx蛋白ORF的前半 部分基因片段，PCR產物以EcaR VASW I雙酶切後克隆到同樣雙酶切的 pET-32a(+)上，獲得雞Mx蛋白的原核表達質粒，雞Mx蛋白表達框架與 載體上的His標籤融合。質粒轉化到大腸桿菌BL21中，用0.5mM IPTG 於37'C誘導3小時後，SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白表達。表達產物參照 Ni-NTA瓊脂糖親和樹脂純化說明書純化後，透析除去尿素。
以純化的雞Mx蛋白原核表達蛋白按常規方法免疫BALB/C小鼠(商 購自維通利華公司)，免疫前斷尾採血，分離免疫前小鼠血清，然後按常 規程序免疫小鼠並採血分離血清，於-2(TC保存備用。
1.8 Mx蛋白的誘導表達
MDBK細胞於6孔板中生長至單層匯合，分別加入梯度稀釋的重組 PoIFN-Pcho， 37。C及5XC02孵育24小時後，用胰酶(amresco)消化細胞， 3000rpm離心5min後收集細胞，加入lxSDS上樣緩衝液100(al混勻，於 沸水中煮20min後，進行SDS-PAGE電泳並轉印到硝酸纖維素膜，5%魚 皮蛋白(PBST配製)封閉過夜，以PBST 1:100稀釋雞Mx蛋白小鼠多抗 為一抗，PBST 1:5,000稀釋的辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG為二抗，DAB 顯色3 5分鐘後加去離子水終止。
1.9抗病毒活性研究
PK15細胞於96孔板生長至90%密度時，棄去培養液，加入10倍梯 度稀釋的重組PoIFN-(3cHo40(^1， 37。C及5。/^C02孵育24小時後，棄去培 養液，每孔分別加入1000 TCID5Q (20|il)的TGEV和PRV感作1 h後， 去掉病毒液，加入含2XFBS的DMEM繼續於37'C及5XC02培養，設未 用IFN處理而加入同樣病毒的病毒對照孔(virus control, VC)，和未加幹
ii擾素和病毒的空白對照孔(blank control, BC)，至VC孔的CPE為卯X 100%左右時，觀察幹擾素對TGEV和PRV複製的抑制情況。
2結果
2.1 PoIFN-p穩定表達質粒的構建
PCR產物電泳表明擴增出的PoIFN-P片段為587bp，與預期相符，克 隆至pMD18-T載體後，經測序鑑定證實獲得了 PoIFN-(3的完整ORF基因。 再將PoIFN-(3的完整ORF基因亞克隆至真核表達質粒pCAGGS中，構建 成pCA-PoIFN-卩。以pCA-PoIFN-卩和pCAGGS瞬時轉染BHK-21細胞， 收穫的細胞培養上清分別命名為PoIFN-(3pCA和mOCkpCA，其抗病毒活性用 VSV*GFP於MDBK細胞進行抗病毒活性滴定。結果(圖1)顯示， PoIFN-(3pCA稀釋至106倍仍然有抗病毒活性，結合測序結果可以證實獲得 了正確的PoIFN-(3完整ORF基因，可用於下一步構建重組穩定表達載體。
從質粒pMD18-PoIFN-(3以I/Zkz I雙酶切下PoIFN-卩的ORF片斷， 亞克隆至同樣雙酶切的質粒pCN，獲得穩定真核表達質粒pCN-PoIFN-|3， 其中PoIFN-P在CMV啟動子的控制下表達。
2.2穩定表達重組PoIFN-p的CHO-K1細胞克隆的篩選
為了確定篩選培養基中合適的G418濃度，於24孔板中每接種1000 個CHO細胞，G418濃度在700 800|ig/ml之間時，細胞於10—14天全 部死亡。因此選擇800嗎/ml作為今後實驗中CHO細胞的壓力篩選培養基 的G418濃度。
轉染pCATN-PoIFN-(3至CHO-K1細胞後，只有穩定整合的基因才能 穩定轉錄，用含有800嗎/mlG418的壓力篩選培養基篩選具有新黴素抗性 的細胞集落並擴大培養，通過檢測各細胞克隆培養上清的抗病毒活性，篩 選出表達量最高的克隆。此後再進行一次單細胞克隆篩選，最後獲得單純、 穩定表達的細胞克隆，液氮存種，命名為CHO-PoIFN-(3。此後CHO-PoIFN-P 細胞以含有400嗎/ml G418的壓力篩選培養基進行傳代。將該 CHO-PoIFN-(3於2008年3月25日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京)，保藏號為CGMCCNo.2412。
2.3重組PoIFN-p在CHO-PoIFN-p細胞中的表達
CHO-PoIFN-卩(CGMCC No. 2412)細胞於含有10%FBS的DF12培養基 中培養，按l:7傳代至25cn^底面積的細胞培養瓶(每瓶加培養液5ml， 長滿後約5xlS個細胞)，待細胞長滿後，用3ml PBS洗細胞2次，換新 鮮培養液，然後分別於24、 48和72小時取樣，每次取100pl。所取含有 重組PoIFN-p的細胞培養上清命名為PoIFN-pCHO，每次取的樣品凍存於 陽70。C備用。所有樣品以VSV*GFP在MDBK細胞上於同一批次進行抗病 毒活性滴定，結果如圖2所示，最高的累積表達量可達7.7xl05 AU/ml， 24 48h的表達量可達4.6xlSAU/ml，此時每個細胞每天能夠表達約0.46 AU的重組PoIFN-(3，此後培養液中的重組PoIFN-(3 —直維持在約7.5x105 AU/ml左右，不再增加。
2.4 CHO-PoIFN-p細胞表達水平與傳代次數的關係
CHO-PoIFN-p細胞分別在含有G418 (400嗎/ml)的篩選培養基和不含 有G418的培養基培養傳代，於25 cn^的細胞瓶中、37匸及5%002條件 下培養，每3天到4天傳一代，基本每周傳代2次。分別於第0、 5、 10、 15和20代取樣，每種培養條件下的細胞做3個重複。取樣前，上述兩種 培養條件下的CHO-PoIFN-p細胞以相同細胞密度接種，待細胞形成匯合 單層時，再繼續培養24小時取樣，樣品保存於-7(TC，最後於同一批次進 行抗病毒活性滴定。結果表明(圖3)， CHO-PoIFN-(3細胞的重組PoIFN-卩 表達量水平非常穩定，無論是否有G418壓力存在，可穩定表達至少20代。
2.5重組PoIFN-p的生物學活性研究
把366745AU/ml的PoIFN-(3CHO (以VSV*GFP於MDBK細胞上滴定 其抗病毒活性，同上)進行10倍梯度稀釋(即0.37、 3.67、 36.7、 3.67><102、 3.67xl04n3.67xl04AU/ml)，分別剌激PK15細胞24小時，收穫PK15細
胞。然後以雞Mx蛋白小鼠多抗(製備參見"材料與方法"部分)為一抗，羊抗鼠IgG為二抗進行免疫印跡檢測豬MX蛋白的表達，結果如圖4所示
PoIFN-PcHo能夠誘導出可檢測到的Mx蛋白(分子量約76kDa)下限為3.67 AU/ml，且在3.67 3.67xl04AU/ml範圍內，誘導出的Mx蛋白量和 PoIFN-pcHo活性單位成正相關，顯示了 PoIFN-Pcho具有良好的I型幹擾
素生物學活性。
抗病毒活性滴定結果和Mx蛋白的誘導結果兩者相符合，表明 CHO-PoIFN-卩細胞表達的重組PoIFN-卩具備天然I型幹擾素的生物學功
2.6 CHO-PoIFN-p細胞表達的重組PoIFN-p體外抗病毒活性研究
為了研究PoIFN-Pcho的體外抗病毒的能力，以10倍梯度稀釋的 PoIFN-(3cho (366745 AU/ml)處理PK15細胞24小時，然後分別感染1000 TCID5g的TGEV和PRV，待VC孔形成90 100%CPE時，觀察PoIFN-(3CHO 對處理孔病毒的抑制情況，結果(圖5)表明104稀釋倍數(36.7 AU/ml) 的PoIFN-Pcho能夠完全抑制1000 TCID5o的TGEV感染PK15細胞(圖5 A D)， 103稀釋倍數(367 AU/ml)能夠完全抑制1000 TCID5Q的PRY感 染PK15細胞(圖5W Z)。並且即使再培養幾天，TGEV和PRV也不能 複製產生CPE (數據未顯示)，說明PoIFN-(3cHo能夠給予PK15細胞充分 的保護，以抵稚P 1000TCID50的TGEV和PRV的感染。
3討論
本實驗建立的CHO-PoIFN-(3細胞能夠穩定高水平表達重組PoIFN-(3， 累積表達的最大水平可達約7.7xl05 AU/ml，每天表達水平可達約4.6xl05 AU/ml，平均每個細胞每天能夠表達約0.46 AU的重組PoIFN-J3。表達重 組PoIFN-P的CHO-PoIFN-p細胞是在G418的壓力篩選下篩出的，但是經 過細胞單克隆篩選出的克隆，無論在有無G418的培養液中傳20代，表達 能力基本不變，表明PoIFN-(3的表達框架已穩定整合至CHO-K1細胞的基 因組中。
CHO-PoIFN-p細胞表達的重組PoIFN-p處理PK15細胞後，以雞Mx蛋白鼠多抗為一抗進行免疫印跡，檢測出豬Mx蛋白被誘導表達，且與重 組PoIFN-p的抗病毒活性單位成正相關。這些都表明了 CHO-PoIFN-卩細 胞表達的重組PoIFN-p具有I型幹擾素的生物功能，具有良好的天然豬 IFN-卩生物學活性。
哺乳動物細胞表達的IFN-p的糖基化和摺疊與天然的完全相同，且正 確的糖基化對於IFN-卩的活性和穩定性至關重要。本研究CHO-Kl細胞穩 定表達的重組PoIFN-(3具有良好的熱及振蕩等穩定性(數據未顯示)，且 具有極高的比活性，既使上清濃縮10倍也不能在SDS-PAGE膠上看到表 達的重組PoIFN-p條帶(數據未顯示)。
此外，本研究表達的重組PoIFN-p的完全抑制1000TCIDso的TGEV (36.7AU/ml)和PRV (367AU/ml)體外感染PK15細胞，表明了其具有 臨床治療應用的價值。此處可以發現，PoIFN-(3對TGEV (冠裝病毒科， 正股單鏈RNA病毒)抗病毒活性是對PRV (皰疹病毒科，雙鏈DNA病 毒)的10倍，表明PoIFN-J3對RNA病毒的抗病毒能力更強。
農業部頒布的獸用生物製品質量標準中的天然豬白細胞幹擾素是以雞 新城疫病毒誘導豬白細胞獲得的，製作工藝和產品成分複雜，最終產品的 活性約10000 AU/ml。與此相比較，本研究表達系統的PoIFN-P表達水平 是其70倍，且工藝簡單、產品成分容易控制，具有極大的優越性。
結論，本發明人建立的CHO-PoIFN-P細胞表達的重組PoIFN-(3具有天 然豬I型IFN相同的生物學功能，表達水平高，抗病毒活性可達 7.7xl05QAU/ml，且具有極高的比活性和穩定性，可作為豬IFN-P生物學活 性檢測時的標準品，在病原一宿主細胞的感染一抗感染天然免疫相關基礎 研究中具有重要的應用價值，同時具有良好臨床應用前景。參考文獻 Weber F, Kochs G， Haller O. Inverse interference: how viruses fight the interferon system [J]. Viral Immunol, 2004， 17(4):498-515 Stetson D B, Medzhitov R. Type I interferons in host defense [J], Immunity, 2006, 25(3):373-381 Sen G C. Viruses and interferons [J], A匪Rev Microbiol, 2001, 55:255-281 Buddaert "W， Van Reeth K， Pensaert M. In vivo and in vitro interferon (IFN) studies
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中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 〈120〉表達豬e幹擾素的CHO細胞系及其應用 〈130〉 IB083075 <160〉 2
〈170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1
<211〉 561
〈212〉 腿
豬
1
atggctaaca agtgcatcct ccaaatcgct ctcctgatgt gtttctccac cacagctctt 60 tccatgagct atgatgtgct tcgataccaa caaaggagca gcaatttggc atgtcagaag 120 ctxctgggac agttgcctgg gactcctcaa tattgcctcg aagataggat gaactttgag 180 gtccctgagg agattatgca accaccacaa ttccagaagg aagatgcagt attgattatc 240 cacgagatgc tccagcagat cttcggcatt ctcagaagaa atttctctag cactggctgg 300 aatgaaaccg tcattaagac tatccttgtg gaacttgatg ggcagatgga tgacctggag 360 acaatcctgg aggaaatcat ggaggaggaa aatttcccca ggggagacat gaccattctt 420 cacctgaaga aatattactt gagcattctg cagtacctga agtccaagga gtacagaagc 480 tgtgcctgga cagtcgtcca agtggaaatc ctcaggaact tttctttcct taacagactt 540
acagattacc tccggaactg a <210〉 2 <211〉 186 <212〉 PRT <213〉 豬
561<400〉 2
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Ser 160 Phe
權利要求
1.一種表達豬β幹擾素的CHO細胞系，其含有編碼豬β幹擾素的基因。
2. 根據權利要求1所述的CHO細胞系，其中所述豬(3幹擾素的氨基 酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
3. 根據權利要求1所述的CHO細胞系，其中所述編碼豬(3幹擾素的 基因如SEQ ID NO: 1所示。
4. 根據權利要求1-3任一項所述的CHO細胞系，其中在所述編碼豬卩 幹擾素的基因之前加入了 Kozak序列。
5. 根據權利要求1所述的CHO細胞系，其是保藏號為CGMCC No. 2412的CHO細胞系。
6. —種生產豬卩幹擾素標準品的方法，該方法包括1) 培養根據權利要求1至5中任何一項所述的CHO細胞系；2) 從所述的CHO細胞系的培養液中提取(3幹擾素，用作豬(3幹擾素 的標準品。
7. 根據權利要求6的方法，其中所述CHO細胞系是保藏號為CGMCC No. 2412的CHO細胞系。
8. 根據權利要求6或7的方法生產的豬p幹擾素標準品。
9. 一種試劑盒，其包含根據權利要求6或7的方法生產的豬卩幹擾素 標準品。
10. 根據權利要求1至5中任何一項所述的CHO細胞系生產的豬卩 幹擾素在製備藥物中的應用，所述藥物用於豬傳染性疾病的預防和治療。
全文摘要
本發明公開了表達脊椎動物β幹擾素的CHO細胞系，其含有編碼所述動物β幹擾素的基因。更具體地，本發明公開了表達豬β幹擾素的CHO細胞系。本發明還涉及利用上述CHO細胞系生產脊椎動物β幹擾素標準品的方法以及通過該方法獲得的豬β幹擾素，其具有極高的比活性和穩定性，可用作豬β幹擾素生物學活性檢測時的標準品和用於豬傳染性疾病的預防和治療，具有重要的應用前景和市場前景。
文檔編號A61K38/21GK101603032SQ20081010994
公開日2009年12月16日 申請日期2008年6月11日 優先權日2008年6月11日
發明者步志高, 陳偉業 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所