造血前體的擴增的製作方法

2023-05-13 04:34:21 4

專利名稱：造血前體的擴增的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種向有需要的對象移植造血前體細胞的方法，其包括在存在富集 STRO-Ibright細胞的細胞群的條件下培養造血前體細胞。本發明的所述方法可用於治療血液 疾病。
背景技術：
十多年來，對於缺乏HLA-匹配骨髓供體的患者的同種異基因移植，臍帶血(CB)已 被作為造血祖細胞的可選擇來源進行臨床研究。相較於骨髓，在CB中較少的T-細胞和/或 更少發育的T-細胞，使得存在CB移植將會產生更少的移植物抗宿主病(GVHD)的可能性， 該病是在同種異基因移植環境中發病率和死亡率的主要原因。考慮到相較於從活著的供體 收集骨髓或外周血祖細胞(PBPC)，在胎盤的處理之前從胎盤的靜脈收集CB的可用性和方 便，其他潛在的優勢包括顯著增加可提供的同種異基因移植物數量和增加因此可能被移植 的患者數量的能力。這個造血祖細胞的新來源允許CB庫靶向收集帶有例如少數非洲裔美 國人和西班牙人群的人白細胞抗原(HLA)類型的個體，它們在國家骨髓捐贈項目庫中的代 表人數缺乏。自從1988年第一個CB移植完成，世界範圍內超過5000個患者因為種種惡性或 非惡性疾病而接受相關或非相關的CB移植。大多數CB接受者是兒童，不過當HLA-匹配 供體不可用時成年人正越來越多地接受CB移植。報告的無進展生存率到目前為止與按照 同種異基因骨髓移植獲得的結果相當(Barker JN et al. , (2001)) 0而且，與骨髓移植相 關的GVHD相比，許多報告顯示CB移植看起來更少GVHD，儘管使用CB移植具有比骨髓或 PBPC同種異基因移植的接受者中耐受的實質上更多的供體-受體HLA差異。CB的主要缺 點是低的細胞劑量，當與骨髓移植相比時，它導致植入的時間更慢和更高比率的植入失敗 (Kernan NA et al. , (1993))。在由 Kurtzberg (Kurtzberg J. , (1996))、Gluckman (Gluckman et al. , (1997) )、Rubinstein (Rubinstein P. , (1998))、Rizzieri (Rizzieri DA et al., (2001))和 Laughlin(Laughlin MJ et al.，(2001))公開的 CB 移植的研究中，到嗜中 性粒細胞絕對計數值(ANC)彡0.5X109/L的中位時間範圍為22至34天。到不輸血 (transfusion-independent)血小板計數彡20X 109/L的中位時間為56天到超過100天， 有12-18%的植入失敗率。然而，在那些系列內成年患者(> 18歲和/或> 的植入 失敗率基本上更高，為10-62%。這些更大、成年的患者，其從CB祖細胞的離體擴增可能獲 益最多。從在上面引用的研究中，注入的未操作CB的總有核細胞(TNC)劑量和植入時間中 似乎存在一種閾值效應。在Gluckman的研究中，在接受彡3. 7X107TNC/Kg的患者中植入 和存活較好。這個大細胞劑量對於體重超過45kg的患者一般不可用。對於成年患者，看起 來> 1.0X107TNC/Kg的接受者比較低細胞劑量的接受者有更有利的植入。Kurtzberg等報 告了在非相關CB移植環境中CB有核細胞注入的數量與嗜中性粒細胞植入時間之間的線性 相關(P < 0. 002)。這些數據暗示供給更多的CB細胞可以導致更快的嗜中性粒細胞植入。發明概述CN 102144028 A
說明書
2/15 頁本發明人已經開發了一種用於通過與富集STRO-Itoight細胞的細胞群或其子代共 培養來擴增造血祖細胞(HPC)的方法。擴增的HPC可以用於移植到有需要的對象中，如患 有血液疾病的個體。因此，本發明提供一種移植造血前體細胞到有需要的對象中的方法，該方法包 括在存在富集STRO-Itoight細胞的細胞群或從此衍生的上清液或子代的條件下培養 造血前體細胞，其中這樣的STRO-Itoight細胞是間充質前體細胞(MPC)，其包含能產生成纖維 細胞集落形成單位(CFU-F)的間充質前體細胞，以擴增該造血前體細胞；和把該擴增的造血前體細胞施用於對象。在本發明的一個實施方案中，富集STRO-Itoight細胞的細胞群是同種異基因細胞。在另一個實施方案中，在起始培養後使富集STRO-Itoight的細胞生長大約4天至> 70%匯合，用於臍帶血共培養。在另一個實施方案中，在共同培養開始時富集STRO-Itoight的細胞與造血前體細胞 的比率為大約1 4，大約1 5，大約1 6，大約1 7，大約1 8，大約1 9或大約 1 10。富集STRO-Itoight的細胞可能來源於任何合適的組織來源。合適的組織來源的例子 包括骨髓、血、牙髓細胞、脂肪組織、皮膚、脾、胰、腦、腎、肝、心、視網膜、大腦、毛囊、腸、肺、 淋巴結、胸腺、骨、韌帶、腱、骨骼肌、真皮和骨膜。在另一個實施方案中，造血前體細胞來源於臍帶血。在擴增之前造血前體細胞可 以或可以不從臍帶血分離。因此，在一個實施方案中該方法包括共同培養未操作的臍帶血 細胞與富集STRO-Itoight細胞的細胞群或其子代。在本發明的另一個實施方案中擴增的造血前體細胞包括CFU-GM細胞。擴增的造 血前體細胞可能包括至少ι χ IO4CFU-GM細胞每kg對象體重。在本發明的另一個實施方案中，在施用擴增的造血前體細胞之後，對象發生造血 重建。例如，對象的造血重建可能發生在施用擴增的造血前體細胞後的30天內，更優選在 25天內，更優選在20天內，更優選在15天內和更優選在10天內。還有另一個實施方案，在不存在不利免疫反應的情況下發生造血重建。在這個實 施方案中，施用擴增的造血前體細胞不導致顯著的移植排斥。可通過許多合適的測量中的任何一種確定造血重建。例如，可通過嗜中性粒細胞 植入、血小板植入、淋巴植入、紅系細胞植入和/或巨核細胞植入確定造血重建。本發明的方法還可以包括給對象施用增強造血前體細胞分化成特定造血譜系細 胞的一種或多種因子。增強分化的因子可以與擴增的造血前體細胞同時施用，或在施用擴 增的造血前體細胞之後獨立施用。由分化產生的造血譜系細胞可能是，例如，B-細胞、T-細胞、樹突細胞、單核細胞、 嗜中性粒細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞、粒細胞、紅細胞、嗜酸性粒細胞、巨核細胞、血小 板、骨髓細胞、脾細胞、真皮細胞或基質細胞。增強分化的因子可能是，例如，幹細胞因子(SCF)、GM-SCF, M-CSF, G-CSF, MGDF, EP0、FLT3-配體、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-IUTNFa 或血小板形成素。擴增的造血前體細胞的移植可能與共培養的MPC或其子代一起實施，和/或與來源於共同培養的MPC或其子代的上清液或一種或多種可溶因子一起實施。在一個實施方案中，當與施用未進行離體擴增的造血前體細胞相比時，施用根據 本發明方法的擴增的造血前體細胞導致移植物抗宿主病的降低的風險。在另一個實施方案 中，當與施用通過本發明以外的其他方法擴增的造血前體細胞相比時，施用根據本發明方 法擴增的造血前體細胞導致移植物抗宿主病的降低的風險。應當理解本發明的方法可用於治療一系列血液疾病。例如，本發明的方法可用於治療血小板數目和/或功能疾病，如血小板減少、特發 性血小板減少性紫癜(ITP)或與病毒感染、藥物濫用或惡性腫瘤有關的疾病。在另一個實施例中，本發明的方法可用於治療紅細胞數目和/或功能疾病，例如 貧血。可被治療的貧血的例子包括再生障礙性貧血、自身免疫性溶血性貧血、失血性貧血、 Cooley' s貧血、Diamond-Blackfan貧血、範可尼貧血、葉酸(folic acid)缺乏性貧血、溶 血性貧血、缺鐵性貧血、惡性貧血、鐮刀細胞貧血、地中海貧血或真性紅細胞增多症。在另一個實施例中，本發明的方法可用於治療淋巴細胞數目和/或功能的疾病， 例如由T-細胞或B-細胞缺乏引起的疾病。淋巴細胞數目和/或功能疾病的例子是AIDS、 白血病、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkins lumphoma)、慢性感染例如粟粒性結核病、病毒感 染、類風溼關節炎、系統性紅斑狼瘡、或遺傳疾病例如血丙種球蛋白缺乏症、DiGeorge異常、 Wiskott-Aldrich綜合症、或共濟失調毛細血管擴張。在另一個實施例中，本發明的方法可用於治療多系骨髓造血功能衰竭的疾病，其 可能是放射線療法或化學療法或者惡性置換(malignant replacement)的結果。例如，所 述疾病可能是骨髓纖維化、急性髓性白血病(AML)、骨髓增生異常症候群(MDS)、急性淋巴 母細胞性白血病(ALL)、慢性粒細胞性白血病(CML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL))、非霍 奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金病(HD)、多發性骨髓瘤(MM)、或散播到骨骼的繼發惡性腫瘤。本發明適用於各種動物。例如，對象可以是哺乳動物如人、狗、貓、馬、母牛或羊。在 一個實施方案中對象是人。在整個說明書中詞語「包括」(comprise)，或如「包括」(comprises)或「包 括」 (comprising)的變化，將被理解為意指包括規定的元素、整數或步驟，或元素、整數或步 驟的集合，但不是排除任何其他元素、整數或步驟，或元素、整數或步驟的集合。發明的優選實施方案的詳細描述本發明提供了通過與間充質前體細胞(MPC)共培養離體擴增源自HPC的臍帶血的 方法。這樣擴增的HPC可用於治療如造血惡性腫瘤的疾病，和用於同種異基因細胞治療中 促進骨髓的再生。如本文所用，術語「擴增(expanding) 」或者「擴增(expansion) 」指細胞增殖的過 程。經歷擴增的細胞保持它們的細胞更新特性。因此本發明提供一種移植造血前體細胞到有需要的對象中的方法，這種方法包 括在存在富集STRO-Itoight細胞的細胞群或從此衍生的上清液或子代的條件下培養 造血前體細胞，其中這樣的STRO-Itoight細胞是間充質前體細胞(MPC)，其包含能產生成纖維 細胞集落形成單位(CFU-F)的間充質前體細胞，以擴增該造血前體細胞；和把該擴增的造血前體細胞施用於對象。
術語「上清液」指包含間充質前體細胞和/或其子代細胞在合適的培養基中，優選 在液體培養基中離體培養後產生的一種或多種可溶因子的非細胞物質。通常，通過在合適 的條件和時間下在培養基中培養細胞，隨後通過一個如離心的過程除去細胞材料來產生上 清液。在施用之前上清液可以或可以不進行更進一步的純化步驟。在一個優選實施方案中， 上清液包含少於IO5細胞，更優選少於IO4細胞，更優選少於IO3細胞以及甚至更優選沒有 活細胞。術語「一種或多種可溶因子」指在培養期間，由MPC和/或其子代細胞所分泌的分 子，通常是蛋白質。本發明的一個實施方案中富集STRO-Itoight細胞的細胞群是同種異基因細胞。同種 異基因細胞可以從與對象有相近HLA匹配的個體中獲得。本發明的一個優勢是，同種異基 因細胞可被商業上大批生產作為在造血前體細胞的離體擴增中的「現貨供應」使用。「現貨供應」來源提供了優於源自家庭成員的STRO-Itoight細胞的主要潛在優勢。首 先，細胞可以被製成適用於立即使用，不需要冗長的處理或沒有在培養期間汙染的可能性。 來自年輕、健康志願者的主細胞庫的開發，提供了一種繞過疾病相關的幹細胞功能降低的 方法，其提供了用於臍帶血共培養的STRO-Itoight細胞的最佳來源。最後，選擇和分離程序的 標準化提供一種非常能夠再生產的產品。本發明的方法的另一優點是，相較於從來自骨髓供體的MPC的從頭生成的以前的 方法，可以相當更迅速的獲得用於與臍帶血細胞共培養的足夠數量的STRO-Itoight富集的細 胞。這使得移植之前處於脆弱的症狀緩解中的患者能更快的被治療，並因此降低復發的可 能。造血前體細胞可來源於任何合適的來源，其中之一是臍帶血。沒有必要在擴增之 前分離造血前體細胞。因此，本發明的方法可能包括共培養臍帶血和富集STRO-Itoight細胞 的細胞群或其衍生的上清液或子代。這一實施方案的優點是，它消除對於在擴增之前從臍 帶血分離⑶34+或⑶133+細胞的需要，因此使造血前體細胞的操作和損失減到最小。共同施用分化因子可促進移植物植入，所述分化因子例如幹細胞因子(SCF)、 GM-SCF、M-CSF、G-CSF、MGDF、EPO、FLT3-配體、IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-IU TNF α或血小板形成素。可在施用HPC時和/或在施用HPC之後以規律的間隔施用分化因 子。由分化產生的造血譜系細胞可以是，例如，B-細胞、T-細胞、樹突細胞、單核細胞、 嗜中性粒細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞、粒細胞、紅細胞、嗜酸性粒細胞、巨核細胞、血小 板、骨髓細胞、脾細胞、真皮細胞或基質細胞。因此，本發明的方法也擴展到一種或多種分化因子的任選使用，用於促進注入擴 增的HPC之後的造血重建。富集STR0-1 細胞的細胞在本發明方法的一個實施方案中涉及造血前體細胞與富集STRO-Itoight細胞的細 胞群的共同培養，其中這樣的STRO-Itoight細胞是間充質前體細胞(MPC)，其包含能產生成纖 維細胞集落形成單位(CFU-F)的間充質前體細胞。MPC是能形成大量多能細胞集落的非造血祖細胞。在WO 01/04268中詳細描述了 成人MPC的富集，其全部內容通過引用併入本文。根據本發明的術語「MPC」也被理解為包括如WO 2006/032092中所定義的多能擴增的MPC子代(MEMP)。間充質前體細胞(MPC)細胞是在骨髓、血液、牙髓細胞、脂肪組織、皮膚、脾、胰、 腦、腎、肝、心、視網膜、大腦、毛囊、腸、肺、淋巴結、胸腺、骨、韌帶、腱、骨骼肌、真皮和骨膜中 發現的細胞；並且能分化成不同的生殖系如中胚層、內胚層和外胚層。因此，MPC能分化成 許多細胞類型包括但不限於，脂肪、骨、軟骨、彈性組織、肌肉和纖維結締組織。這些細胞進 入的特定的譜系路線和分化途徑依賴於各種的來自機械的影響和/或內源生物活性因子 的影響，例如生長因子、細胞因子和/或宿主組織建立的局部微環境條件。間充質前體細胞 是非造血祖細胞，其分裂產生子細胞，該子細胞是幹細胞或是前體細胞，前體細胞將適時地 不可逆分化產生表型細胞。在一個實施方案中，本發明中使用的STRO-Γ細胞也是TNAP+、STR0-3+(TNSAP)、 VCAM-r、THY-r、STR0-2+、CD45+、CD146+、3G5+ 或其任何組合。例如，STRO-Ibright 細胞可能又 是 VCAM-1+、ΤΗΥ-Γ、STR0-2+、STR0-3+(TNSAP)和 / 或 CD146+ 中的一種或多種。在一個實施方案中，間充質前體細胞是如WO 2004/85630裡所定義的血管周間充 質前體細胞。如果細胞是給定的標記的低(Io或dim)或高(明亮的(bright)，bri)的表達子 (取決於該標記在細胞表面上呈現的程度)，所述細胞對於給定的標記是「陽性」，其中該術 語涉及螢光強度或其他在細胞顏色分類過程中使用的顏色。lo(或dim或dull)和bri的 區別將在被分類的特定細胞群中使用的標記的上下文中理解。術語「明亮的」，在此使用時，指細胞表面上的一個標記，當被可檢測標記時，該標 記產生一個相對高的信號。當不希望受理論限制時，建議「明亮的」細胞表達更多的靶標記 抗原。例如，當用FITC-共軛的STR0-1抗體標記，由FACS分析測定時，STRO-Ibri細胞產生 與非明亮的細胞(STR0-ldullMm)相比更強的螢光信號。在另一個實例中，STRO-Itoight細胞 相對於同種型匹配的陰性對照有STR0-1表面表達的2個對數級的更高表達。比較起來， STRO-Idim和/或sTRO-丨—iate細胞相對於同種型匹配的陰性對照具有STRO-i表面表達 的少於2個對數級的更高表達，一般為大約1個對數級或更少的更高表達。相對於STRO-Idim和/或stro-P—te細胞，用於本發明的細胞群優選富集 STRO-Γ 細胞。當在此使用時，術語「TNAP」旨在包含組織非特異性鹼性磷酸酶的全部同種型。例 如，該術語包括肝同種型(LAP)，骨同種型(BAP)和腎同種型(KAP)。在一個優選實施方案 中，TNAP是BAP。在一個特別優選的實施方案中，這裡使用的TNAP指能結合由雜交瘤細胞 系產生的STR0-3抗體的分子，該雜交瘤細胞繫於2005年12月19日依據布達佩斯條約的 規定以保藏號PTA-7282在ATCC保藏。優選地，相當多比例的MPC能分化成至少兩種不同的種系。多能細胞可能被誘導 成的譜系的非限制性實例包括骨前體細胞；肝細胞祖細胞，其對於膽汁導管上皮細胞和肝 細胞是多能的；神經限制細胞，其能產生神經膠質細胞前體，然後發展為少突神經膠質細胞 和星形細胞；發展為神經元的神經元前體；心肌和心肌細胞的前體，葡萄糖敏感的胰島素 分泌胰的β細胞系。其他譜系包括，但不局限於，成牙質細胞，產牙質細胞和軟骨細胞，和 以下的前體細胞視網膜色素上皮細胞、成纖維細胞、皮膚細胞如角質化細胞、樹突狀細胞、 毛囊細胞、腎的導管上皮細胞、平滑和骨骼肌細胞、睪丸祖細胞、血管內皮細胞、腱、韌帶、軟骨、脂肪細胞、成纖維細胞、骨髓基質、心肌、平滑肌、骨骼肌、周細胞、血管、上皮、神經膠質、 神經元、星形細胞和少突神經膠質細胞。在另一個實施方案中，剛培養時，MPC不能產生造血細胞。本發明也涉及使用從MPC和/或其子代細胞(後者也被稱為擴增的細胞)獲得的 上清液或可溶因子，其由新鮮分離的MPC在體外培養產生。本發明的擴增細胞可以有多種 表型，這取決於培養條件(包括培養基中刺激因子的數目和/或類型)、傳代數目等等。在 某些實施方案中，子代細胞是來自親本群體的大約2次、大約3次、大約4次、大約5次、大 約6次、大約7次、大約8次、大約9次或大約10次傳代之後而獲得的。不過，子代細胞可 能是從親本群體的任何傳代次數之後而獲得的。子代細胞可通過在任何合適的培養基裡培養獲得。術語「培養基」，用於指細胞培 養時，包括圍繞細胞的環境的組分。優選地，用於本發明的共培養方法的培養基是液體培養基。優選地，培養基補充一種或多種生長因子或細胞因子，其支持HPC的擴增。優選 地，細胞因子是早期作用細胞因子，例如，但不限於重組metHu幹細胞因子(SCF)、flt-3配 體(FLT3)、IL-U IL-2、IL_3、IL_6、IL-10、IL-12、α -腫瘤壞死因子和血小板形成素。延遲作用的細胞因子也能被使用。這些細胞因子包括例如，粒細胞集落刺激因子 (G-CSF)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、紅細胞生成素(EPO)、LIF和巨噬細胞 生長因子(M-CSF)。WO 2006/032092中限定了多能擴增的MPC子代(MEMP)。用於製備從其衍生子 代的MPC的富集群體的方法在WO 01/04268和WO 2004/085630中描述。在體外環境中 MPC很少以絕對純的製劑存在，並且一般與其他組織特異性定型細胞(TSCC) —起存在。WO 01/04268涉及在高達大約90%純度的水平上從骨髓收穫這樣的細胞。包括從其衍生子代 的MPC的群體可直接從組織來源收穫，從主細胞庫獲得，或作為選擇的，它可以是已被離體 擴增的群體。例如，子代可從已收穫的、未擴增的、基本上純化的MPC的群體中獲得，包括它們 存在的群體中至少大約 0. 1%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或 95%的總細胞。這個水平可能被取得，例如，通過選擇對於選自TNAP、STRO-Ibright,3G5\ VCAM-I、THY-I、⑶146和STR0-2的至少一種標記是陽性的細胞。MPC起始群體可來源於WO 01/04268或WO 2004/085630中所述的任何一種或多種
組織類型，即骨髓、牙髓細胞、脂肪組織和皮膚，或者也許更寬泛的來自脂肪組織、牙齒，牙 髓、皮膚、肝、腎、心、視網膜、腦、毛囊、腸、肺、脾、淋巴結、胸腺、胰、骨、韌帶、骨髓、腱和骨骼 肌。MEMP可以區別於新鮮收穫的MPC，因為它們對於STRO-Itoi標記是陽性的，對於鹼 性磷酸酶(ALP)標記是陰性的。在一個本發明的優選實施方案中，至少15^^20^^30%, 40%、50%、60%、70%、80%、90%或 95% 的細胞具有 STRO-Ibri, ALP—表型。在另外一個優 選的實施方案中，MEMP對於Ki67、CD44和/或CD49c/CD29、VLA-3，α 3 β 1標記中的一種 或多種是陽性的。在另外一個更優選的實施方案中，MEMP不表現出TERT活性和/或對於 ⑶18標記是陰性的。一旦合適的MPC群體被獲得，它可通過任何合適的手段進行培養或擴增而獲得MEMP。在本發明的一個優選實施方案中，MPC從源自年輕健康的志願者的骨髓中富集的 MPC的主細胞庫獲得。源自這種來源的MPC的使用對沒有一名合適的家庭成員能作為其MPC 供體的對象特別有利。而且，其他對象，尤其患有急性的白血病的那些對象，在移植之前的 脆弱的症狀緩解過程中和在產生MPC和然後進行共培養的冗長的時間內處於復發的高風 險。「現貨供應」的來源提供了優於源自家庭成員的MPC的主要潛在優勢，因為細胞可用於立 即使用而不需要冗長的處理或沒有在培養期間汙染的可能性。主細胞庫的開發提供了一種 繞過疾病相關的幹細胞功能降低的方法，其提供了用於臍帶血共培養的MPC的最佳來源。申請人:已經開發了一種現貨供應的離體擴增的同種異基因MPC產品用於慢性局 部缺血的心血管疾病的治療，稱為「間充質前體細胞」或Revascor 。骨髓細胞從健康人類 供體的髂後嵴中採集。使用STR0-3 (TNSAP)單克隆抗體免疫篩選單核細胞以進行基質富集 (Simmons PJ et al, (1991))，隨後擴增，以及低溫保藏而產生細胞庫。濃縮間充質細胞前 體的免疫篩選的骨髓單核細胞的擴增產生了具有規定純度，表達間充質前體特異性標記並 具有有效生物學活性的產品。而且，通過本申請人和其他人的工作確認在各種臨床前和臨 床的同種異基因環境下它們的同種異基因MPC的免疫學耐受性。由於申請人的商購來源的MPC不表達HLA-II (DR)，因此它們是非免疫原性的，並 且提供一種用於本發明的理想的MPC來源。臍帶血可以通過，例如，但是非限制性的，排洩、重力引起的流出、按摩、擠壓、抽吸等等獲 得臍帶血的放血。在一個優選的實施方案中，通過注射器的使用實現臍帶的放血，注射器可 以包括或可以不包括抗凝血劑。用於本發明的方法中的臍帶血可以通過一個商業的來源獲得，例如LifeBank USA(Cedar Knolls, NJ)、ViaCord(Boston MA)、Cord Blood Registry(San Bruno, CA)和 Cryocell(Clearwater, FL)。用於收穫臍帶血細胞的方法是本領域公知的。這樣的方法的例子也描述於專利文 獻中，包括，例如，題目為「臍帶血收集」的US 5916202和題目為「臍帶血和胎盤收集試劑 盒」的 US 7147626。在一個實施方案中，臍帶血與對象的4、5或6/6 HLA I (血清學)和II (分子)類 抗原匹配。在另一個實施方案中，每個對象使用至少兩個臍帶血單位。臍帶血單位可在使 用之前被低溫冷凍或從臍帶中收集後立刻使用。在培養之前，臍帶血細胞可富集⑶34+祖細胞，或它們可基於⑶133標記的表達而 富集祖細胞。在一個實施方案中，臍帶血細胞在添加到MPC之前沒有被操作，。在另一個實施方案中，臍帶血細胞被添加到預建立的MPC或MEMP的匯合單層細胞 中。在另一個實施方案中，臍帶血單位在合適的離體擴增培養基中共培養大約14天。 用於共培養的擴增培養基可以包括胎牛血清、穀氨醯胺和合適的生長因子。在本發明的一個實施方案中，用於治療對象的擴增的HPC的數量在從 彡 1. OXlO7TNCAg 到彡 4. 0X107TNC/kg 的範圍中。
共培養條件在本發明的一個實施方案中，造血前體細胞，或沒有操作的臍帶血細胞，被添加到 已建立的粘附MPC細胞培養物中。可以培養該MPC到匯合，再鋪板和再培養以提供一個滋 養層，添加臍帶血細胞到該滋養層用於共培養。本發明的實施方案的一個優點是，從單個低溫保藏的小瓶(含有在低溫保藏的 彡1.5X107細胞/ml)起始MPC之後大約4天內，可獲得足夠數目的匯合粘附同種異基因 MPC用於共培養。根據本發明的MPC的足夠數目是，其中存在足夠的細胞以在12XT-150cm2 組織培養燒瓶中達到> 70%匯合(每個對象)。這比從骨髓供體重新產生MPC的現有技術 的方法要快得多，其通常花費大約4周。在本發明的一個實施方案中，臍帶血細胞在包含胎牛血清、穀氨醯胺、G_CSF、SCF、 FLT3-配體和血小板形成素的離體擴增培養基中與MPC共培養。細胞可共培養大約14天。將HPC施用於對象根據本發明的所述方法，離體擴增的HPC(其還可以包括或可以不包括共培養的 MPC或MEMP)被移植到患有血液惡性腫瘤的對象。在一個優選實施方案中，所述對象是人。細胞的施用模式包括，但不限於，全身靜脈注射。通過任何適宜途徑施用細胞制 劑，例如通過注入或推注注射以及通過和其他生物學活性劑一起施用。在一些實施方案中，可以實施用於減少HPC的移植排斥和/或與移植物抗宿主疾 病的療法，特別在同種異基因MPC也被提供給對象的情況下。這樣的療法在現有技術中是 已知的。參見，例如Slavin S等，J Clin Immunol. 2002 22:64。通常GVHD預防劑包括抗 胸腺細胞球蛋白(ATG)、黴酚酸酯(mycophenalate mofetil (MMF))和他克莫司。應當理解HPC能與培養基上清液或源自從培養基分離的共培養MPC的一種或多種 因子一起提供，以及以藥學上可接受的載體施用。因此，本發明的細胞群能以藥學上可接受 的載體或稀釋劑施用，如無菌鹽水和水緩衝溶液。這樣的載體和稀釋劑的使用是本領域公 知的。在一個實例中，擴增的HPC單獨與共培養的MPC或MEMP —起提供。在另一個實施 例中，提供HPC，而沒有MPC或MEMP。用於間充質細胞和造血細胞的分離方法是本領域公知 的，而且包括，但不限於，通過色譜法的親和分離(根據間充質細胞和造血細胞上存在的標 記)、批量分離和/或流式細胞儀(FACS)。MPC、MEMP或從此衍生的上清液能在施用HPC之前、同時或之後施用。造血重建在本發明的一個實施方案中，在施用擴增的造血前體細胞之後對象發生造血重 建。例如，可在施用擴增的造血前體細胞的30天內，更優選在25天內，更優選在20天內， 更優選在15天內和更優選在10天內對象發生造血重建。可通過許多合適的測量中的任何一種確定造血重建。例如，一旦以下的一種或多 種發生嗜中性粒細胞植入、血小板植入、淋巴植入、白細胞植入、紅細胞植入、紅系細胞植 入和/或巨核細胞植入，就認為造血重建已經發生。嗜中性粒細胞植入嗜中性粒細胞植入被定義為持續絕對嗜中性粒細胞計數(ANC)，其連續3天大於或等於 0. 5X109/L。血小板植入血小板植入被定義為連續3天中沒有支撐的血小板計數大於50X 109/L的第一 天。白細胞植入白細胞植入被定義為連續3天中多形核白細胞(PMN)絕對值大於50X 109/L的第一天。紅細胞(RBC)植入可通過使用HbF的測量和觀察血塗片上的F細胞記錄紅細胞(RBC)植入。例如， 紅細胞植入可能當HbF是大約3. 6%和F細胞是大約7-8%時已經發生。根據以下非限制的實施例，本發明現在將被更詳細描述。
實施例實施例1 「現貨供應」同種異基因MPC和自體MSC的比較對從骨髓重新產生的MSC共培養的臍帶血(CB)和與申請人「現貨供應」 MPC共培 養的臍帶血比較(Robinson et al，2007)。MSC是如下所述從骨髓重新產生的。大約SO-IOOml的骨髓被抽吸到無菌、含有 肝素的注射器內，並帶到MDACC細胞治療實驗室中用於產生MSC。用聚蔗糖-泛影葡胺 (hypaque)來分離骨髓單核細胞，並且將其放入每瓶有50ml MSC擴增培養基的兩個T175 燒瓶中，該培養基包括含有慶大黴素、穀氨醯胺OmM)和20%的(ν/ν)胎牛血清(FBS) (Hyclone)的 α 改良的 MEM( α MEM)。細胞在37°C、5%的CO2中培養2-3天，期間非粘附的細胞將被除去；剩下的粘附細 胞將被連續培養直到該細胞的匯合程度達到70%或更高(7-10天)，然後該細胞將被胰蛋 白酶化並且被重新放到有MSC擴增培養基(每隻燒瓶50毫升培養基)的6個T175燒瓶中。 細胞在37°C、5%的0)2中再培養一周。在第14天(+/-5天)這6瓶中有70%或更高匯合 程度的MSC被再次分到12個燒瓶中，並在MSC擴增培養基中如上所述又培養三周。該MSC 單層，這時將有> 70%的匯合程度，然後準備用於應該在化學療法的第-14天起始的CB擴 增。如果MSC在第-14天之前準備好，該MSC單層通過每周更換一次MSC培養基進行保持， 直到準備使用。兩個冷凍的臍帶血單位被解凍、清洗並與來自每個來源(MSC或MPC)的粘附單層 共培養14天，使用生長因子SCF，FLT3-配體，G-CSF和ΤΡ0。如表1中所示，同種異基因MPC 在擴增臍帶血⑶34祖細胞中比同種異基因MSC表現更好。表權利要求
1.一種向有需要的對象移植造血前體細胞的方法，所述方法包括在存在富集STRO-Itoight細胞的細胞群或從此衍生的上清液或子代的條件下培養造血 前體細胞，其中所述STRO-Itoight細胞是間充質前體細胞(MPC)，其包含能產生成纖維細胞集 落形成單位(CFU-F)的間充質前體細胞，以擴增所述造血前體細胞；和 把所述擴增的造血前體細胞施用於對象。
2.權利要求1的方法，其中所述富集STRO-Itoight細胞的細胞群是同種異基因細胞。
3.權利要求1或2的方法，其中所述擴增的造血前體細胞包含CFU-GM細胞。
4.權利要求3的方法，其中所述擴增的造血前體細胞包含1X IO4CFU-GM細胞每kg對象體重。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其中在施用擴增的造血前體細胞之後，對象發生造血重建。
6.權利要求5的方法，其中在施用擴增的造血前體細胞後的10至30天內對象發生造血重建。
7.權利要求5或6的方法，其中在不存在不利免疫反應的情況下發生造血重建。
8.權利要求5-7中任一項的方法，其中通過嗜中性粒細胞植入、血小板植入、淋巴植 入、紅系細胞植入和/或巨核細胞植入確定造血重建。
9.權利要求1-8中任一項的方法，其還包括給對象施用增強造血前體細胞向特定造血 譜系細胞分化的因子。
10.權利要求9的方法，其中所述增強分化的因子和擴增的造血前體細胞同時施用。
11.權利要求9的方法，其中在施用擴增的造血前體細胞之後獨立施用所述增強分化 的因子。
12.權利要求9-11中任一項的方法，其中所述造血譜系細胞是B-細胞、T-細胞、樹突 細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞、粒細胞、紅細胞、嗜酸性粒細胞、 巨核細胞、血小板、骨髓細胞、脾細胞、真皮細胞或基質細胞。
13.權利要求10-12中任一項的方法，其中所述增強分化的因子是幹細胞因子(SCF)、 GM-SCF、M-CSF、G-CSF、MGDF、EPO、FLT3-配體、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-11、 TNFa或血小板形成素。
14.權利要求1-13中任一項的方法，其中擴增的造血前體細胞的移植與共培養的MPC 或其子代一起實施。
15.權利要求1-14中任一項的方法，其中擴增的造血前體細胞的移植與來源於共培養 的MPC或其子代的上清液或一種或多種可溶因子一起實施。
16.權利要求1-15中任一項的方法，其中與施用未進行離體擴增的造血前體細胞相 比，施用所述擴增的造血前體細胞降低宿主抗移植物病的風險。
17.權利要求1-15中任一項的方法，其中所述對象患有血液疾病。
18.權利要求17的方法，其中所述血液疾病是血小板數目和/或功能疾病。
19.權利要求18的方法，其中所述血液疾病是血小板減少，特發性血小板減少性紫癜 (ITP)，或與病毒感染、藥物濫用或惡性腫瘤有關的疾病。
20.權利要求17的方法，其中所述血液疾病是紅細胞數目和/或功能疾病。
21.權利要求20的方法，其中所述血液疾病是貧血。
22.權利要求21的方法，其中所述貧血包括再生障礙性貧血、自身免疫性溶血性貧血、 失血性貧血、Cooley』 s貧血、Diamond-Blackfan貧血、範可尼貧血、葉酸(folic acid)缺 乏性貧血、溶血性貧血、缺鐵性貧血、惡性貧血、鐮刀細胞貧血、地中海貧血或真性紅細胞增多症。
23.權利要求17的方法，其中所述血液疾病是淋巴細胞數目和/或功能疾病。
24.權利要求23的方法，其中所述疾病是由於T-細胞或B-細胞缺乏。
25.權利要求23的方法，其中所述疾病是AIDS、白血病、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性感 染例如粟粒性結核病、病毒感染、類風溼關節炎、系統性紅斑狼瘡、或遺傳疾病例如血丙種 球蛋白缺乏症、DiGeorge異常、Wiskott-Aldrich綜合症、或共濟失調毛細血管擴張。
26.權利要求17的方法，其中所述血液疾病是多系骨髓造血功能衰竭疾病。
27.權利要求沈的方法，其中所述血液疾病是放射療法或化學療法的結果。
28.權利要求沈的方法，其中所述血液疾病是惡性置換的結果。
29.權利要求沈的方法，其中所述血液疾病是骨髓纖維化、急性髓性白血病(AML)、骨 髓增生異常症候群(MDS)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性粒細胞性白血病(CML)Vg 性淋巴細胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金病(HD)、多發性骨髓瘤或散播 到骨骼的繼發惡性腫瘤。
全文摘要
本發明涉及一種向有需要的對象移植造血前體細胞的方法，其包括在存在富集STRO-1bright細胞的細胞群的條件下培養造血前體細胞。本發明的所述方法可用於血液疾病的治療。
文檔編號C12N5/071GK102144028SQ200980134570
公開日2011年8月3日 申請日期2009年9月3日 優先權日2008年9月3日
發明者M·D·舒斯特, S·伊泰斯庫 申請人:成血管細胞系統公司