一種重組α‑半乳糖苷酶基因、載體、工程菌及其應用的製作方法

2023-05-08 23:07:11

(一)
技術領域：
：本發明涉及一種重組α-半乳糖苷酶基因、載體、工程菌及其應用，該菌株或產生的酶可以應用於飼料、食品中的抗營養因子的降解，應用於造紙工業中的紙漿預處理、臨床醫療中的器官移植或血型改造等。(二)
背景技術：
：：大豆是重要的食品原料，可以加工成豆奶等營養豐富的食品。豆粕是大豆工業的主要固態副產物，是我國非常重要的飼料原料之一。但是，大豆中含有大量的難以消化的不良寡糖，如棉子糖、水蘇糖等α-半乳寡糖。這些不良寡糖是抗營養因子，不能很好地被人或動物吸收利用，而在腸道中經過厭氧發酵產生大量氣體，引起腹脹、腹瀉、胃腸痛等現象。甘蔗糖蜜是蔗糖生產過程的副產物，其中含有大量的糖分，常被用作工業微生物發酵的培養基碳源。利用糖蜜發酵生產有用的物質不僅可以解決蔗糖生產汙染環境問題，而且能夠實現資源化利用，具有重要的意義。但是，甘蔗糖蜜還含有一部分不能被釀酒酵母等食品級生物安全微生物利用的糖分，主要由蜜二糖、棉子糖、水蘇糖等構成，通常佔甘蔗糖蜜總重量的5％。α-半乳糖苷酶(ec3.2.1.22)，是一種可以催化α-半乳糖苷鍵的水解的外切水解酶，催化移除不同底物中α-連接的末端非還原d-半乳糖，水解棉籽糖、水蘇糖、半乳甘露聚糖及半乳糖脂等。因此，該酶可以消除豆粕、糖蜜中的棉籽糖和水蘇糖等抗營養因子，可以作為添加劑應用於食品、飼料工業，提高食品或飼料的消化吸收率和營養價值。此外，α-半乳糖苷酶還可以用在醫療、造紙業中。細胞溶酶體內α-半乳糖苷酶酶活降低可以引起一種的罕見的遺傳性疾病fabry病。目前，對該病進行α-半乳糖苷酶替代療法療效可以得到增強。α-半乳糖苷酶還可以用來水解抗原、改造血型，從而降低異種器官移植、輸血過程中的免疫排斥反應。而在造紙工業中，α-半乳糖苷酶可以水解軟木中的半纖維成分半乳葡聚甘露聚糖，分離出其中的α-半乳糖，對紙漿預處理有一定的作用。α-半乳糖苷酶在植物(水稻、豆芽、咖啡豆、葡萄等)、細菌(鏈黴菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、雙歧桿菌和巨大芽孢桿菌)中、真菌(根黴、青黴、黑麴黴、米麴黴)等生物中存在。但是，在釀酒酵母、乳酸菌等常用的食品安全級的微生物中，酶活很低，甚至沒有該酶。因此，將其他生物來源的α-半乳糖苷酶基因克隆，利用基因工程技術轉入酵母菌等，然後進行食品、豆粕的發酵加工，不僅可以去除不良寡糖抗營養因子，還可以提高益生菌的數量，提高食品、飼料品質。此外，轉α-半乳糖苷酶基因的酵母菌在培養的時候，可以充分利用糖蜜中的難發酵糖，提高資源利用率。雖有將α-半乳糖苷酶轉入畢赤酵母的報導(cn105219791a)，但是畢赤酵母不是飼料、食品等加工的生物安全菌(見《飼料添加劑品種目錄(2013)》)，而釀酒酵母是啤酒發酵、釀造、豆粕類加工的可食用生物安全菌。此外，普通的α-半乳糖苷酶熱穩定性差，不便於食品、飼料加工。因此，需要構建轉α-半乳糖苷酶基因的釀酒酵母，還需要克隆熱穩定性好、耐高溫的α-半乳糖苷酶基因並轉入釀酒酵母。(三)技術實現要素：本發明目的是提供一種重組α-半乳糖苷酶基因及其重組基因工程菌釀酒酵母，該工程菌可以產生α-半乳糖苷酶並應用於食品、飼料加工、生產α-半乳糖苷酶等，可以去除不良寡糖等抗營養因子。釀酒酵母被用於豆類食品加工、豆粕飼料加工等，但是釀酒酵母幾乎沒有α-半乳糖苷酶活性，不能去除豆類中的不良寡糖。本發明構建的重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌具有α-半乳糖苷酶活性，可以去除不良寡糖。本發明採用的技術方案是：本發明提供一種重組α-半乳糖苷酶基因，所述基因的核苷酸序列為seqidno.1所示。本發明還提供一種所述重組α-半乳糖苷酶基因編碼的重組α-半乳糖苷酶，所述酶的胺基酸序列為seqidno.2所示。本發明還涉及一種由所述重組α-半乳糖苷酶基因構建的重組載體。本發明提供一種由所述重組載體轉化製備的重組α-半乳糖苷酶基因工程菌，所述重組α-半乳糖苷酶基因工程菌以釀酒酵母為宿主菌構建而成。本發明涉及一種所述重組α-半乳糖苷酶在降解含α-半乳糖苷鍵底物中的應用，所述的應用是將重組α-半乳糖苷酶基因工程菌接種至添加有含α-半乳糖苷鍵的底物和誘導物iptg的ynb篩選培養基，在30℃培養，實現底物的降解，獲得降解產物。進一步，所述的底物為標準檢驗底物(如5-溴-4-氯-3-吲哚-α-d-半乳糖苷(x-α-gal))、含有棉子糖(棉籽糖是一種三糖，由半乳糖、果糖和葡萄糖組成，降解後可能變成二塘、單糖的混合物，徹底降解後變成單糖)、水蘇糖的豆粕、糖蜜、食品原料、紙漿等。進一步，當所述的底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-α-d-半乳糖苷，所述的應用為：將重組α-半乳糖苷酶基因工程菌接種至添加有含α-半乳糖苷鍵的底物和誘導物iptg的ynb篩選培養基，在30℃培養，實現底物的降解，獲得降解產物5-氯-4-溴-3-吲哚；所述底物以4mg/ml二甲基甲醯胺溶液的形式加入，所述底物溶液與iptg體積比為1.5:1，所述ynb篩選培養基中，底物終濃度為0.2mg/ml，iptg終濃度1mmol/l；ynb(ura-)篩選培養基終濃度組成：葡萄糖20g/l、酵母氮鹼(ynb)6.7g/l、腺嘌呤0.04g/l、l-色氨酸0.02g/l、l-亮氨酸0.1g/l、瓊脂粉15g/l，溶劑為蒸餾水，ph自然。當所述的底物為棉子糖，所述的應用為：將重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌接種至ynb篩選培養基，在30℃、180rpm條件下培養到對數期，然後以體積濃度10％的接種量轉接入ypgr誘導培養基中進行表達，30℃培養12h後，將發酵液離心收集細胞後，超聲波破碎(美國sonics公司vcx500超聲波破碎儀，破碎參數：在輸出功率/頻率130w/20khz，時間為10min，工作3s停3s)後，取破碎混合液與棉子糖溶液以體積比1:1混合，60℃水解反應完全，實現對棉子糖的降解；所述棉子糖溶液是以ph5.5、50mm的mes緩衝液為溶劑配製成0.01g/ml；所述ypgr誘導培養基終濃度組成：蛋白腖20g/l，酵母提取物10g/l，棉籽糖20g/l，半乳糖20g/l，溶劑為水，ph自然。本發明根據報導的源於嗜熱真菌米赫根毛黴(rhizomucormiehei)的耐熱α-半乳糖苷酶基因序列，再加上酵母的分泌信號肽序列，組成重組的分泌型α-半乳糖苷酶全基因。根據全基因序列進行化學合成，克隆到釀酒酵母表達載體，利用基因工程技術轉入酵母菌，然後進行豆類、糖蜜的發酵加工，可以去除發酵原料中的抗營養因子不良寡糖，提高食品、飼料的營養價值和消化吸收率，提高資源的利用率。α-半乳糖苷酶是可以催化α-半乳糖苷鍵水解的外切水解酶，催化移除不同底物中α-連接的末端非還原d-半乳糖，水解棉籽糖家族低聚糖、半乳甘露聚糖及半乳糖脂。α-半乳糖苷酶在含上述α-半乳糖苷鍵的底物上反應，可以降解底物。x-α-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-α-d-半乳糖苷)是一種半乳糖苷酶的顯色底物，轉α半乳糖苷酶基因的酵母菌落產生分泌型的α-半乳糖苷酶，在含該酶底物x-α-gal的平板上降解底物分解成半乳糖和深藍色的物質5-溴-4-靛藍。藍色物質可以使整個培養菌落顯藍色，從而說明成功構建了轉α-半乳糖苷酶基因的釀酒酵母，該工程菌可以應用於底物的水解。與現有技術相比，本發明有益效果主要體現在：1)釀酒酵母是食品安全菌，構建的重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌產α-半乳糖苷酶，可以進行豆類、糖蜜的發酵加工，可以去除發酵原料中的抗營養因子不良寡糖，提高食品、飼料的營養價值和消化吸收率，提高資源的利用率。2)α-半乳糖苷酶可以用於醫療、造紙工業。醫療上可以用於抗原、血型改造，降低器官移植、輸血等臨床醫療中的免疫排斥反應。在造紙工業中α-半乳糖苷酶的酶解作用可以增強紙漿預處理效果。3)釀酒酵母中轉入的α-半乳糖苷酶源於嗜熱真菌米赫根毛黴(r.miehei)，有一定的熱穩定性。在釀酒酵母進行飼料添加劑發酵豆粕的加工、食品加工、紙漿處理等過程中，會通過發酵等產生一定的熱量導致體系升溫，現有的釀酒酵母α-半乳糖苷酶活性很低，幾乎檢測不到。雖有報導的重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母，但是轉入的是普通的α-半乳糖苷酶，熱穩定性差，在工業化加工應用的過程中不耐高溫，很容易失活。普通的微生物或酶不能正常發揮催化作用，本發明的工程菌產生的重組α-半乳糖苷酶則有一定的熱穩定性，其最適溫度在60℃，在60℃水浴80min後還可以保持80％的活性。(四)附圖說明圖1釀酒酵母表達載體pyes2圖譜。圖2為轉重組α半乳糖苷酶基因的釀酒酵母。有顏色反應的菌落為轉化子，在圖中顏色較深(a)，無色菌落為對照酵母菌株(b)，在圖中顏色很淺。圖3粗酶液酶活差異，野生代表表野生型菌株，2、4、11、14分別代轉α-半乳糖苷酶基因的不同重組工程菌株。圖4酶的熱穩定性曲線圖。圖5薄層色譜(tlc)法測棉籽糖的降解圖。圖6酶活測定標準曲線。(五)具體實施方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此：實施例11、化學合成重組α-半乳糖苷酶基因序列α-半乳糖苷酶基因開放閱讀框(orf)序列，見ncbi網站genbank登錄號kc357714.1。對α-半乳糖苷酶基因orf序列根據釀酒酵母的密碼子進行優化，在前面加上分泌信號肽的基因序列，信號肽序列源於產朊假絲酵母分泌性酶(見ncbi網站genbank登錄號y12659.1，位置766-843)，組成新的α-半乳糖苷酶重組表達基因序列(下劃線為信號肽序列)seqidno.1所示，即重組α-半乳糖苷酶基因：atgtcgttgacaaaagatgcctcagaggaccaagaagacatcaagagtctcacgatgaacactagtttagttgattccaggttgttgttgatcaccgctatttcctcttccttgttgctattggtcttgttgccttgtgcttatgctgcagcaggattgttatcaacaggcattcataagcacccagatttggatacttggttcttggttaccgagagatctacttacgttgtaggagctacagacgacggttatttgttgaacttgcattggggcgatagattgaacgaattggacaacgacttgaacgctactagaatcttcaccaccactactttcaacccaccaattacctacgctcaagaagaattgccagcttttggaggcttgagatacagagaattggctttgaaggttgaattgccaaacggagttagggaattgaacttgttgtactccggtagatctaacatgacaggcgattcattgttggacttggaattggaagcaggaaactataccggtttgacagttaccttgcactacgaattggacgttgataacgacatcatcaggagatcctacactatcagaaacggcttgaagaagggtaacgttaacttgtctaaggctttgtcagcagcttggcatccaccatcagctatgggtttagacgaagaaagagaattgttgaccttgtcaggcgattgggctcacgaagctattactcaaagaaccagattgagaccaggagtttcacatacagtccaatctccaagaggttttccatctcatcaatcctacccatacttcgctttgagacaagttccaacaggagaaacttctccaggaacttctaacgaagtctactttggagctttggcttggtcaggatcttgggaaattacagttgacaccaccatatatggttactcaagaattaccggaggtattcatcatcaagattttggttggaccttggaaccaggcgaatcttttactactccagttttcgcagcaggttatactaatgaaggtttaccaggagctagaaaaagaatgccaagacacgttaggaagtaccagttgaagaacgttaagacccagcaaaagaaggaagacatgtacaacccagtcctatacaactcttgggaagctttgactttcaacatcacctacgacaagcaaatcgctttagcagataaagcagcagctatgggcattgaattatttgccgttgacgacggttggtttggagctagagataacgattcagcaggtttaggagattggttcgttaacaagagaaagttcccacacggaatgaaaccattggcagatcacgttcataacttgggaatgaagttcggtctttggttcgaaccagaatctttcaacccaaactccgacttgtataggaagcatccagattgggctttttactacgacggtattccaagatacgaagctagaaaccagttgttgatgaacttgggtttgccagaagtcagagaatacttgtacaacaggatctccaccttggttaaggaaattggcatcgacttcatcaagtgggatatgaacagaccattcgcagaagttaccatgcacaactacaaggacagaaaccctagagaagcttgggtattagcagttgaaggcttttactccatcatcgataagttgaagcaggaatttccagacttgatgattgaaacttgcgcttcaggtggaggtagaatggatattggcattttgcaaaaggtcgatcaagcttggacttcagataacactagaccagacgctagattgttcatccaatacggagcttctatgttcttgccacctagaattatgtacggttgggttacagattctccatacgattcccagatcgaaattccattgtccttcaggttccacgtttcctttatgggcggtttaggcgttggttctaatttgaataacatggaggaatccgatatcaaagaagccgcaggttggatcgaattgtacaagcaaatcagacacgtcatacaaaacggcgatttggattggcttgttcaaccatcttgcgttggagatttggttgccgtttctcaaactacttcccaagatagatcagaggcagttgttttggcttacagattcaactccgttttctccgatcagttgaacccattgagattgagatacttagatccaaagcacacctacagagttagagtttaccaggatgatccatctactccatcagacgaatacgaaatgtcaggagctttgttgttgtccagaggtattgttttgccaggcttgaacaacatcatgttcagaagcgcagttgtttgggttcaacaaaaatga。將上述重組序列交商業公司通過化學合成法合成dna。2、重組基因的表達載體構建2.1基因擴增、酶切和表達載體連接以重組α-半乳糖苷酶基因dna(seqidno.1所示)為模板進行pcr(聚合酶鏈式反應)擴增(反應體系和程序見表1、表2)，兩條引物外側分別設計酶切位點(bamhi/xbai)，pcr產物經過純化後進行酶切，酶切產物回收後和用同樣雙酶切開的酵母表達載體pyes2(圖1，購自invitrogen公司)進行連接反應(表3，takara公司ligation試劑盒)。pcr引物：galb-f:cgggatcccgatgtcgttgacaaaagatgcct下劃線為酶切位點bamhi和保護鹼基galb-r:gctctagagctcatttttgttgaacccaaaca下劃線為酶切位點xbai和保護鹼基表1pcr反應體系表2pcr反應程序表3連接反應體系：2.2連接的重組載體轉化大腸桿菌1)取50μl大腸桿菌dh5α感受態細胞，放於冰上進行融化10min。2)加入5μl連接產物並混勻。冰上放置30min。3)42℃熱激90s，立即冰上放置2min。4)加入450μllb培養基(1l：蛋白腖10g，酵母提取物5g，nacl10g，溶劑為水，ph7.2)，使終體積為500μl。37℃，200rpm培養1h。5)取200μl步驟4)培養液塗布於含100μg/ml氨苄青黴素的lb平板(1l：蛋白腖10g，酵母提取物5g，nacl10g，瓊脂15g，溶劑為水，ph7.2)，37℃培養箱中培養12h。2.3表達載體正確構建挑選步驟5)5個轉化子菌落進行質粒測序，選擇序列和構建正確的克隆進行繁殖，提取質粒後保存，進行酵母轉化。含α-半乳糖苷酶基因的釀酒酵母重組表達質粒命名為pyes2-galb。3、釀酒酵母的遺傳轉化3.1釀酒酵母的接種、培養挑取ypd培養基(1l：葡萄糖20g，蛋白腖20g，酵母粉10g，瓊脂15g，溶劑為水，ph自然)上活化的釀酒酵母whu2a單菌落接種於5ml的ypd液體培養基(1l：葡萄糖20g，蛋白腖20g，酵母粉10g，溶劑為水，ph自然)中，28℃、200rpm過夜培養。3.2釀酒酵母擴大培養取2.5ml過夜培養的釀酒酵母菌液，接種於50mlypd液體培養基中，28℃、200rpm培養4h，od600達到0.7-0.9。3.3酵母感受態細胞的製備(1)將培養液裝到已滅菌的離心管中，6000rpm、4℃離心5min。(2)用20ml無菌水洗滌一次，離心去上清，收集細胞。(3)用1ml0.1mol/lliac充分懸浮細胞，並將懸液轉移至1.5ml離心管中，12000rpm、4℃離心1min，棄上清。(4)加入400μl0.1mol/lliac，上下震蕩細胞懸液，取50μl懸液於1.5ml離心管中，12000rpm、4℃離心1min，除去liac，即為感受態細胞，準備轉化。3.4酵母轉化體系(1)在冰上配製轉化混合液(見表4，按照順序依次加入)表4釀酒酵母轉化混合液(2)劇烈振蕩1min，將體系充分混合(3)28℃保溫30min(4)42℃水浴熱激25min(5)12000rpm離心1min，棄上清(6)加1ml無菌水到1.5mlep管中，用移液槍輕輕懸浮，儘量避免劇烈振蕩。5.塗布取200μl轉化菌液塗布ynb(ura-)篩選培養基，塗布的平板放置在30℃培養箱培養3天。表5ynb(ura-)篩選培養基(1l，溶劑為水，ph自然)4、轉化子的篩選、鑑定在上述篩選培養基上培養後，長出的菌落即為候選轉α-半乳糖苷酶基因的釀酒酵母克隆，這些克隆再經過質粒提取，轉入大腸桿菌後提取質粒進行測序驗證後，獲得重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌。實施例2重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌降解含α-半乳糖苷鍵的底物將20μl誘導物iptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)和50μlα-半乳糖苷酶顯色底物x-α-gal(4mg/ml，溶劑為二甲基甲醯胺)塗布於ynb(ura-)篩選培養基(表5)平板上，放置20min進行充分吸收擴散後，分別劃線接種實施例1製備的重組α半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌和未轉基因的對照菌株(釀酒酵母whu2a)，30℃培養48h後，進行觀察。結果顯示重組α半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌菌落為藍色，對照菌株則不顯藍色(圖2)，結果說明重組釀酒酵母工程菌能夠產生α-半乳糖苷酶。實施例3重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌的α-半乳糖苷酶酶活和熱穩定性測定結果1)、酶活測定發酵方法是先將重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌接種至ynb(ura-)篩選培養基，在30℃、180rpm條件下培養到對數期，然後以體積濃度10％的接種量轉接入ypgr誘導培養基(蛋白腖20g/l，酵母提取物10g/l，棉籽糖20g/l，半乳糖20g/l，溶劑為水，ph自然，115℃滅菌30min)中進行表達，30℃培養12h後，將發酵液離心收集細胞後，通過超聲波破(美國sonics公司vcx500超聲波破碎儀，破碎參數：在輸出功率/頻率130w/20khz，時間為10min，工作3s停3s)碎後，取粗酶液進行酶活測定，並以原始出發菌株為對照，酶活力的差別如圖3表示。α-半乳糖苷酶的酶活測定方法：酶活力測定採用pnpg法。其原理是α-半乳糖苷酶可與底物pnpg等摩爾反應生成黃色的對硝基苯酚(pnp)，通過檢測pnp的生成量從而得出α-半乳糖苷酶的活性。具體操作方法如表6：表6酶活性測定方法根據標準曲線來計算酶活，酶活(u/ml)的定義為：在測定條件下，每分鐘分解pnpg釋放1μmolpnp所需的酶量。由圖3比較可知，工程菌的酶活力在14.5u/ml左右，而出發菌株的酶活力幾乎檢測不到，差異顯著(p<0.05)。說明工程菌成功的表達了α-半乳糖苷酶。標準曲線(圖6)製作：pnp用50mm的mes緩衝液(ph5.5，2-嗎啉代乙磺酸)配置成5mm的溶液，與50mm的mes緩衝液(ph5.5)混合反應後，加入1m的na2co3終止反應，測定od405的吸光度來確定濃度。pnp標準溶液配製如表7。表7pnp標準溶液配製table3-16pnpstandardsolutionprepare以od405的吸光值為橫坐標，以pnp的量為縱坐標製作標準曲線如下：酶活計算公式為：酶活(y)＝(0.1576x-0.0077)×f×100/tx：od405的光吸收值；f：酶液的稀釋倍數；100：反應體系中10μl酶液換算成1ml的換算因子；t：反應時間。2)酶的熱穩定性測定將酶液與ph5.5、50mmmes(2-嗎啉代乙磺酸)緩衝液，以體積比1：3混合，然後在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的溫度梯度下分別放置0、20、40、60、80min，然後測定其酶活，從而得出其相對酶活力曲線。重組α-半乳糖苷酶的最適溫度在60℃，見圖4。該酶可以在在60℃水浴80min後還可以保持80％的活性。實施例4重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌降解棉籽糖重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌進行發酵後，超聲波破碎後離心取上清液作為粗酶液，進行棉籽糖降解能力分析。用薄層色譜(tlc)法測棉籽糖的降解情況。測定結果見圖5。從棉籽糖降解情況來看，在處理30min時棉籽糖已經水解了一部分，且隨著時間的加長，降解得越來越多，到2h時已經水解了大部分，說明重組的α-半乳糖苷酶是可以對降解棉籽糖。具體方法：1)重組α-半乳糖苷酶粗酶液的製備重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌按照實施例3中的方法進行發酵後，6000rpm離心10min去除上清液，並用ph5.5的mes緩衝液洗滌後重懸，用超聲波細胞破碎儀進行破碎處理，處理後的樣品6000rpm離心5min，取上清液4℃保存備用。2)薄層色譜分析1)反應原理：根據物質與矽膠板吸附力與分配係數的差異，使樣品中的多種物質得以分離。根據溶解度的不同，以及吸附力的差異，最終混合物將分離，在顯色劑作用下，形成一系列斑點。本次測定用g型矽膠板。2)試劑：展開劑及體積比：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水＝9:10:4:2顯色劑：1g尿素+4.5ml磷酸溶液+48ml水飽和正丁醇3)測定步驟①棉籽糖標樣的配製稱取棉籽糖0.01g溶於1mlmes緩衝液(50mm，ph5.5)中，4℃保存備用。②樣品的處理用粗酶液10μl和棉籽糖10μl(0.01g/ml)混勻後，60℃進行水解反應30、60、90、120min後，tlc測定。③測定方法在矽膠板上1cm處用鉛筆畫一條直線，在直線上進行點樣。待樣品乾燥後，將矽膠板直立於層析缸中展開(注意展開劑要低於直線)，當展開液跑至離頂部1cm處拿出。用吹風機吹乾後，將顯色液噴於矽膠板上，然後立即放入預先調好的溫度為140℃的烘箱中烘至顯色。sequencelisting浙江工業大學一種重組α-半乳糖苷酶基因、載體、工程菌及其應用2patentinversion3.512364dnaunknown人工序列1atgtcgttgacaaaagatgcctcagaggaccaagaagacatcaagagtctcacgatgaac60actagtttagttgattccaggttgttgttgatcaccgctatttcctcttccttgttgcta120ttggtcttgttgccttgtgcttatgctgcagcaggattgttatcaacaggcattcataag180cacccagatttggatacttggttcttggttaccgagagatctacttacgttgtaggagct240acagacgacggttatttgttgaacttgcattggggcgatagattgaacgaattggacaac300gacttgaacgctactagaatcttcaccaccactactttcaacccaccaattacctacgct360caagaagaattgccagcttttggaggcttgagatacagagaattggctttgaaggttgaa420ttgccaaacggagttagggaattgaacttgttgtactccggtagatctaacatgacaggc480gattcattgttggacttggaattggaagcaggaaactataccggtttgacagttaccttg540cactacgaattggacgttgataacgacatcatcaggagatcctacactatcagaaacggc600ttgaagaagggtaacgttaacttgtctaaggctttgtcagcagcttggcatccaccatca660gctatgggtttagacgaagaaagagaattgttgaccttgtcaggcgattgggctcacgaa720gctattactcaaagaaccagattgagaccaggagtttcacatacagtccaatctccaaga780ggttttccatctcatcaatcctacccatacttcgctttgagacaagttccaacaggagaa840acttctccaggaacttctaacgaagtctactttggagctttggcttggtcaggatcttgg900gaaattacagttgacaccaccatatatggttactcaagaattaccggaggtattcatcat960caagattttggttggaccttggaaccaggcgaatcttttactactccagttttcgcagca1020ggttatactaatgaaggtttaccaggagctagaaaaagaatgccaagacacgttaggaag1080taccagttgaagaacgttaagacccagcaaaagaaggaagacatgtacaacccagtccta1140tacaactcttgggaagctttgactttcaacatcacctacgacaagcaaatcgctttagca1200gataaagcagcagctatgggcattgaattatttgccgttgacgacggttggtttggagct1260agagataacgattcagcaggtttaggagattggttcgttaacaagagaaagttcccacac1320ggaatgaaaccattggcagatcacgttcataacttgggaatgaagttcggtctttggttc1380gaaccagaatctttcaacccaaactccgacttgtataggaagcatccagattgggctttt1440tactacgacggtattccaagatacgaagctagaaaccagttgttgatgaacttgggtttg1500ccagaagtcagagaatacttgtacaacaggatctccaccttggttaaggaaattggcatc1560gacttcatcaagtgggatatgaacagaccattcgcagaagttaccatgcacaactacaag1620gacagaaaccctagagaagcttgggtattagcagttgaaggcttttactccatcatcgat1680aagttgaagcaggaatttccagacttgatgattgaaacttgcgcttcaggtggaggtaga1740atggatattggcattttgcaaaaggtcgatcaagcttggacttcagataacactagacca1800gacgctagattgttcatccaatacggagcttctatgttcttgccacctagaattatgtac1860ggttgggttacagattctccatacgattcccagatcgaaattccattgtccttcaggttc1920cacgtttcctttatgggcggtttaggcgttggttctaatttgaataacatggaggaatcc1980gatatcaaagaagccgcaggttggatcgaattgtacaagcaaatcagacacgtcatacaa2040aacggcgatttggattggcttgttcaaccatcttgcgttggagatttggttgccgtttct2100caaactacttcccaagatagatcagaggcagttgttttggcttacagattcaactccgtt2160ttctccgatcagttgaacccattgagattgagatacttagatccaaagcacacctacaga2220gttagagtttaccaggatgatccatctactccatcagacgaatacgaaatgtcaggagct2280ttgttgttgtccagaggtattgttttgccaggcttgaacaacatcatgttcagaagcgca2340gttgtttgggttcaacaaaaatga23642787prtunknown人工序列2metserleuthrlysaspalasergluaspglngluaspilelysser151015leuthrmetasnthrserleuvalaspserargleuleuleuilethr202530alaileserserserleuleuleuleuvalleuleuprocysalatyr354045alaalaalaglyleuleuserthrglyilehislyshisproaspleu505560aspthrtrppheleuvalthrgluargserthrtyrvalvalglyala65707580thraspaspglytyrleuleuasnleuhistrpglyaspargleuasn859095gluleuaspasnaspleuasnalathrargilephethrthrthrthr100105110pheasnproproilethrtyralaglnglugluleuproalaphegly115120125glyleuargtyrarggluleualaleulysvalgluleuproasngly130135140valarggluleuasnleuleutyrserglyargserasnmetthrgly145150155160aspserleuleuaspleugluleuglualaglyasntyrthrglyleu165170175thrvalthrleuhistyrgluleuaspvalaspasnaspileilearg180185190argsertyrthrileargasnglyleulyslysglyasnvalasnleu195200205serlysalaleuseralaalatrphisproproseralametglyleu210215220aspglugluarggluleuleuthrleuserglyasptrpalahisglu225230235240alailethrglnargthrargleuargproglyvalserhisthrval245250255glnserproargglypheproserhisglnsertyrprotyrpheala260265270leuargglnvalprothrglygluthrserproglythrserasnglu275280285valtyrpheglyalaleualatrpserglysertrpgluilethrval290295300aspthrthriletyrglytyrserargilethrglyglyilehishis305310315320glnasppheglytrpthrleugluproglygluserphethrthrpro325330335valphealaalaglytyrthrasngluglyleuproglyalaarglys340345350argmetproarghisvalarglystyrglnleulysasnvallysthr355360365glnglnlyslysgluaspmettyrasnprovalleutyrasnsertrp370375380glualaleuthrpheasnilethrtyrasplysglnilealaleuala385390395400asplysalaalaalametglyilegluleuphealavalaspaspgly405410415trppheglyalaargaspasnaspseralaglyleuglyasptrpphe420425430valasnlysarglyspheprohisglymetlysproleualaasphis435440445valhisasnleuglymetlyspheglyleutrpphegluprogluser450455460pheasnproasnseraspleutyrarglyshisproasptrpalaphe465470475480tyrtyraspglyileproargtyrglualaargasnglnleuleumet485490495asnleuglyleuprogluvalargglutyrleutyrasnargileser500505510thrleuvallysgluileglyileasppheilelystrpaspmetasn515520525argprophealagluvalthrmethisasntyrlysaspargasnpro530535540argglualatrpvalleualavalgluglyphetyrserileileasp545550555560lysleulysglnglupheproaspleumetilegluthrcysalaser565570575glyglyglyargmetaspileglyileleuglnlysvalaspglnala580585590trpthrseraspasnthrargproaspalaargleupheileglntyr595600605glyalasermetpheleuproproargilemettyrglytrpvalthr610615620aspserprotyraspserglnilegluileproleuserpheargphe625630635640hisvalserphemetglyglyleuglyvalglyserasnleuasnasn645650655metglugluseraspilelysglualaalaglytrpilegluleutyr660665670lysglnilearghisvalileglnasnglyaspleuasptrpleuval675680685glnprosercysvalglyaspleuvalalavalserglnthrthrser690695700glnaspargserglual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