開發動物模型的方法

2023-05-17 15:53:26

專利名稱：開發動物模型的方法
技術領域：
本發明涉及開發突變動物作為人類疾病模型的方法，所述動物包括被基因改造的動物和攜帶自發突變的那些動物。本發明特別提供完整技術，包括嚴格的說明和質量控制，用來開發在生物醫學研究和開發人類治療劑中可用的活體分析系統的動物模型。
背景技術：
突變動物，包括基因改造的動物例如轉基因小鼠，和帶有自發突變的動物，它們最初在分子生物學領域用作動物模型。近年來，這種動物的用途已經擴展到很多生命科學的其它分支，包括鑑定並研究疾病相關性基因，並且開發靶向這些基因的藥物。
儘管生物學的基礎研究者在過去二十年已經產生並廣泛應用了超過10,000種基因操縱的動物，如轉基因小鼠，敲除(knock-out)小鼠和敲入(knock-in)小鼠，絕大多數的基因改造的動物作為研究工具和藥物開發工具具有嚴重缺陷。大多情況下，基因改造動物的生產者不能使所述動物通過全面的，嚴格的並且可靠的確認過程，結果是不能確保所述動物在遺傳和微生物學方面上相同。這是個嚴重問題，因為轉基因動物的遺傳背景以及它們所暴露的環境因素的不同，對它們的體內行為影響很大。每項遺傳或環境不同都導致所述基因改造動物的整體特徵的很大不同。另外，因為基於專業知識選擇並確定遺傳和微生物學控制，通常不由了解所述受試的人的疾病的專家來操作，基因改造的動物作為可靠疾病模型的用途受限。

發明內容
本發明一方面涉及的方法建立突變動物系(line)，其包含如下步驟(a)在性不成熟突變起始(founder)動物(G0)中誘導超數排卵(superovulation)；(b)使所述超數排卵的性不成熟突變起始動物受精；
(c)完成妊娠過程來傳送第一代突變動物(F1)；(d)確認第一代突變動物中所述突變的穩定性，基因型，以及遺傳背景的同一性；並且如果需要，(e)對突變動物的一或多代後代重複步驟(a)-(d)，其中在每步驟中監視所有動物的遺傳和環境因素並嚴格保證其相同。
在一實施方案中，通過自然交配進行受精。
在其它實施方案中，受精通過如下進行(b.1)使從所述超數排卵的未成熟突變起始動物獲得的卵母細胞在體外受精；(b.2)體外培養所述受精的卵母細胞到早期胚胎階段；並且(b.3)將所述胚胎引入受體動物。
在優選實施方案中，在上述步驟(b.2)中，將所述受精的卵母細胞培養到兩細胞胚(two-cell embryo)階段。所述早期胚胎在引入受體動物前，通常以液氮溫度儲藏在胚胎庫中。
本發明不限於任何具體突變動物，並具體包括，不限於，所有非人突變哺乳動物，包括小鼠，大鼠，兔子，貓，狗，豚鼠及其它通常用於實驗室試驗的動物。所述優選突變動物為突變小鼠，包括轉基因的，敲入的，敲除的和自發突變小鼠。在優選實施方案中，所述突變動物為轉基因小鼠。
常見方案中(但不限於)，所述起始動物在實現超數排卵時為三到四周齡。超數排卵可用任何傳統方法誘導，所述方法包括，例如，使用懷孕的純(mere)血清促性腺激素(PMSG)和人類絨毛膜促性腺激素(hCG)。
在優選實施方案中，在前述方法的步驟(d)中如下確定基因型(d1)用從轉基因和相應的非-轉基因動物分離的基因組DNA進行PCR反應，所用PCR引物如下(i)染色體特異性引物及轉基因特異性引物，其以相反方向結合到5′轉基因/基因組接點(junction)附近的染色體及轉基因，來確認所述5′轉基因/基因組接點；和(ii)兩轉基因特異性引物，其以相反方向結合到5′末端附近的轉基因片段來確認轉基因/轉基因的接點，(d2)根據大小分離所述擴增的PCR產物，並且(d3)基於所述擴增的PCR產物的大小類型來確定基因型，其中所述PCR產物的大小類型表明整合的轉基因拷貝數。
所述方法還可包含在步驟(d1)中，用轉基因特異性引物及染色體特異性引物，以相反方向，結合到3′轉基因/基因組接點附近的所述轉基因及基因組，來確認所述3′轉基因/基因組接點。
在其它實施方案中，所述方法還可包含在步驟(d1)中，用兩染色體特異性引物，以相反方向，結合到染色體/轉基因接點附近的染色體，來確認所述預整合位點。
在常見方案中，所述突變例如轉基因的動物的每代都受到計劃的(scheduled)遺傳監視和抽查。優選，遺傳監視包括監視遺傳背景中的一或多基因。
優選，突變動物的每代受到環境因素的計劃的監視和抽查，其中所述環境因素包括發育和周圍環境的因素。最優選地，只有與起始動物具有相同基因型，表型及演出型(dramatype)的動物被包括在突變的，例如轉基因的動物的後代的生產中。
在另一方面，本發明涉及由前述方法產生的突變動物。所述突變動物能例如，為轉基因小鼠，如攜帶人c-Ha-ras轉基因的Tg-rasH2小鼠，或攜帶人類脊髓灰質炎病毒受體(PVR)基因的TgPVR21小鼠。
附圖簡述

圖1是圖示了影響動物試驗結果的主要因素。
圖2圖示了本發明遺傳和環境因素的控制。
圖3顯示在開發本發明動物試驗系統作為部分質量保證實驗(qualityassurance test)進行控制的因素。
圖4圖示了本發明的「超速」同類系(congenic)方法。
圖5根據所述目標闡述兩種遺傳質量實驗。
圖6顯示通過雙鏈(duplex)PCR對轉基因動物的基因分型(genotyping)。
圖7顯示由FISH方法確定整合到N15和N20的Tg-rasH2小鼠的轉基因的染色體定位。在兩種情況下在染色體15E3區域觀察到指示轉基因位置的成對螢光信號。所述Tg-rasH2小鼠是半合子，所以僅在一對姐妹染色單體中發現所述雜交信號。
圖8顯示整合到Tg-rasH2小鼠的轉基因的Southern印跡分析(Southernblot analysis)的結果。(A)Tg-rasH2小鼠中的轉基因(人c-Ha-ras基因的7.0kbBamHI片段)的限制酶切圖譜和結構。開放的盒子表示四種編碼人c-Ha-ras蛋白質的外顯子(Ex1到Ex4)。識別XbaI的上遊區域的DIG-標記的5′-探針用開放的圈和柱表示。(B)來自N15和N20的非-轉基因和Tg-rasH2小鼠的基因組DNA用BamHI消化，在0.6％瓊脂糖凝膠上電泳，並轉移到尼龍膜。所述膜與DIG-標記的隨機引物探針雜交。從非-轉基因小鼠(第1道)，N15的Tg-rasH2小鼠(第2和3道)及N20的Tg-rasH2小鼠(第4和5道)獲得DNA樣品。(C)用限制性核酸內切酶消化來自N20的Tg-rasH2小鼠的基因組DNA(第1道；BamHI，2；HpaI，3；XhoI，4；XbaI，5；NcoI，6；BglII，7；SacI，8；HindIII)，在0.6％瓊脂糖凝膠上電泳，並轉移到尼龍膜上。所述膜與DIG-標記的5′-探針雜交。所述信號用化學發光鹼性磷酸酶底物並在X-射線相片上檢測。
圖9顯示Tg-rasH2小鼠的整合的Northern印跡分析(Northern blotanalysis)結果。在N15和N20的人c-Ha-ras mRNA在Tg-rasH2小鼠表達。在福馬林-瓊脂糖凝膠上分級分離10微克總RNA樣品(B，L和F分別表示腦，肺和前胃)，並將其轉移到尼龍膜。所述膜與[α-32P]-dCTP標記的人c-Ha-ras基因(c-Ha-ras)探針雜交，然後與[α-32P]-dCTP標記的人甘油醛-3-磷酸脫氫酶cDNA(GAPDH)探針再次雜交。nTg和Tg顯示分別從非-轉基因和Tg-rasH2小鼠獲得的樣品。在X-射線相片上檢測所述信號。
圖10顯示Southern印跡雜交的結果，其確定整合到Tg-rasH2小鼠的人c-Ha-ras基因的精確拷貝數。用BamHI(第1道)和HindIII(第2道)完全消化來自N20的Tg-rasH2小鼠的基因組DNA。將HindIII消化的基因組DNA用多種濃度的BamHI(第3-5道)進一步消化。然後將消化後的DNA在0.4％瓊脂糖凝膠上電泳該並轉移到尼龍膜上。所述膜與DIG-標記的隨機引物探針雜交。用化學發光的鹼性磷酸酶底物並在X-射線相片上檢測所述信號。標記泳道的M，Expand TM DNA分子量標記物(molecular weightmarker)(Roche Diagno stics GmbH)。
圖11說明PCR確認基因組/轉基因接點的結果。(A)用如下引物組進行來自Tg-rasH2(T)和非-轉基因(N)小鼠的基因組DNA的PCR確認5』基因組/轉基因接點；確認3′轉基因/基因組接點的染色體特異性引物A和轉基因特異性引物C；鑑定預整合位點的轉基因特異性引物D和染色體特異性引物B；確認轉基因/轉基因接點的染色體特異性引物A和B；轉基因特異性引物D和C。(B)用限制性核酸內切酶BamHI消化用D和C引物產生的PCR產物，來確認轉基因/轉基因接點的完整性。用100-bp DNA梯(ladder)作為DNA大小標記物。(C)三個轉基因在小鼠基因組上的間斷位點。所述人c-Ha-ras轉基因以從頭至尾的串聯排列存在(實心盒子顯示外顯子)。箭頭指示了所用寡核苷酸的位置和方向，箭頭尖端表示所述寡核苷酸的3′末端。
圖12表示在Tg-rasH2小鼠的基因組/轉基因接點的序列分析結果。也顯示非-轉基因小鼠DNA及注射的DNA的對應區域用來比較。星號表示相同的核苷酸，盒子的區域表示與在重組位點的核苷酸的同一性。水平箭頭表示拓撲異構酶I共同序列(5′-A/T-G/C-T/A-T-3′)。
圖13從微生物控制和有計劃生產方面說明胚胎庫設備(facility)。
圖14解釋說明了替代的微生物學控制方法(AlternativeMicrobiological Control Method)。
圖15圖示說明了本發明的有計劃的生產和供給系統(Blanned Productionand Supply System)。
圖16顯示整合到TgPVR21小鼠的PVR轉基因的FISH分析和染色體定位的結果。
圖17顯示TgPVR21小鼠的PVR轉基因Southern印跡分析的結果。
圖18表示RNA印跡，RT-PCR和直接序列分析的結果，其來確定PVRmRNA在TgPVR21小鼠中的基因表達的圖譜。
圖19表示PVR-α，-β，和-γmRNA的結構，和探針，引物及測序的位點。
圖20表示TgPVR21轉基因小鼠中5′基因組/轉基因接點的結構。
圖21表示TgPVR21轉基因小鼠中5′基因組/轉基因接點的限制性酶切圖譜。
圖22表示TgpVR21轉基因小鼠中5′基因組/轉基因接點的測序結果。
圖23顯示相對於克隆2833685確定TgPVR21小鼠中所述轉基因/小鼠基因組接點區域的上遊位點的結構。
圖24用圖說明本發明的生產和確認系統。
圖25表示N-甲基-N-硝基脲(MNU)陽性對照的腫瘤發病率；前胃乳頭狀瘤(單次腹腔內注射(i.p.)/75mg/kg)。
圖26表示MNU陽性對照的腫瘤發病率；惡性淋巴癌(單次腹腔內注射/75mg/kg)。
表A是表示用於本申請試驗的材料和方法的圖表。
發明內容定義術語「突變」動物以最寬的範圍使用，並具體包括基因改造的(基因操縱的)動物，如轉基因，敲除和敲入動物，以及攜帶自發突變和人工誘變產生的一或多種基因突變的動物。
術語「遺傳改造的」和「基因操縱的」互換使用，並指轉基因，敲入和敲除動物。
本文術語「卵」在對於哺乳動物的卵時，指被透明帶和大量丘細胞(濾泡細胞)及其相伴的蛋白聚糖所包圍的卵母細胞。術語「卵」指從卵巢中的濾泡腔回收的卵(這些卵包含未成熟卵母細胞)，以及已經從濾泡腔(破裂的濾泡)釋放的卵。
本文術語「卵母細胞」指雌性配子細胞並包括初級卵母細胞，次級卵母細胞和成熟的、未受精的卵子。卵母細胞是具有為卵細胞質所包圍的大細胞核(即生發泡(germinal vesicle))的大細胞。所述卵細胞質包含無核胞漿內容物，包括mRNA，核糖體，線粒體，卵黃蛋白質等。所述卵母細胞的膜在本文稱為「漿膜」。
術語「半合子」對於轉基因動物指所述轉基因動物攜帶野生型基因的單倍體和轉基因的單倍體(或在整合了超過一個拷貝的轉基因時，指轉基因組(set)的單倍體)。
術語「生殖體」指性染色體。在哺乳動物，X和Y染色體確定個體的性別。雌性有兩條X染色體，而雄性有一條X和一條Y染色體。
術語「半合子的」對於遺傳修飾的，如轉基因的本文的動物來說，指對於所述基因如轉基因是半合子。
術語「純合子」指二倍體基因型，其中給定基因的兩個等位基因相同。對於轉基因動物，該術語指所述動物攜帶二倍體的所述轉基因(或當整合了所述轉基因的一個拷貝以上時，為轉基因的組的二倍體)。
術語「雜合子」指二倍體基因型，其中給定基因的兩個等位基因不同。
術語「轉基因動物」指經人類幹預通過引入重組DNA而改變的動物。這包括具有可遺傳的種系DNA的改變的動物，及帶有體細胞非-遺傳性改變的動物。術語「轉基因」指核酸(DNA)，其(1)被引入體細胞細胞，或(2)穩定整合到其動物宿主品系的種系，並可傳遞至後代。
術語「基因型」指所有生物體攜帶的「內部編碼的，可遺傳的信息」。此儲存的信息被用作「藍本(blueprint)」或用於構建並維持活生物體的指令組。差不多在所有細胞(「內部」部分)內發現這些指令，其以編碼語言(遺傳密碼)記錄，它們在細胞分裂或繁殖時複製，並從一代傳到下一代(「可遺傳的」)。這些指令與細胞或生物體的生命的所有方面有密切關係。所述「基因型」控制從蛋白質大分子形成到代謝及合成的調節的任何事。
術語「表型」指生物體的「外向，物理表現」。這些是物理部分，原子，分子，大分子，細胞，結構，代謝，能量利用，組織，器官，反射和行為的總和；是生物體的可觀察結構，功能或行為的任何部分。
術語「演出型」指在試驗動物的單次生理反應中的行為表現類型。所述反應的變異是兩種因素的共同產物表型自身，和檢測動物的周圍環境狀況，如，溫度，溼度，飲食，研究者和動物保護人員等。對於同樣的演出型，檢測動物的環境狀況必須嚴格控制。
術語「同類系動物」指通過與近交(背景)的品系重複回交(back-cross)，選擇來自供體品系的具體標記物產生的動物品系(strain)。
術語「雜種動物」指動物，例如小鼠或大鼠，它是兩個近交品系的後代，在相同方向雜交(cross)，它在遺傳上是相同的，並用兩個親代的大寫縮寫來命名(先列母本(maternal)品系，然後是F1。
術語「有計劃的監控」指規律進行的檢查，並且通過標準方法來確保已經限定的動物的遺傳和微生物學的質量在整個時間內是穩定的。這通過比較所限定的小鼠及相應的近交品系的遺傳和微生物學圖譜來完成。此種有計劃的監控提供的信息不僅關於保持動物健康而且關於保持特定的質量。結果是，試驗動物可視為「活體測量工具」。它們的獨特性在於，與物理化學測量所用的工具相反，它們天天都在改變。所以，監控試驗動物的質量對它們的目的用途是必需的。此需要與寵物或養殖(farm)動物無關。
術語「抽查」指非計劃性的動物檢查，它以不規律的間隔進行來確定所述動物是否已經經歷任何感染或遺傳汙染。
術語「兩層(layer)監控」指將有計劃的監控和抽查結合起來的監控系統。
術語「悉生生物」指衍生自無菌外科手術或從卵無菌孵化的動物品系，它用無菌技術在隔離器環境飼養並保持，並且其中相關的動物志和菌群組分(如果有的話)，用可接受的現有方法完全限定。
發明內容本發明涉及完整的生產及供給系統來設計並使突變體如基因改造的動物或帶有自發突變的動物發育，其能用作生物醫學研究和藥物開發的可靠工具。如上所述，所述突變的試驗動物必須所有性狀完全相同，哪怕是多種遺傳和/或環境因素的最輕微的不同也會顯著影響動物試驗的結果。具體的是，所有動物必須具有相同的基因型，表型和演出型，並必須經歷相同的發育環境(母體影響)及周圍環境。顯著影響動物試驗結果的這些因素的說明見圖1。為了實現這個目標，已經開發了新的生產和確認系統來使突變例如基因改造的動物模型發育，它可被看作活體分析系統(體內試驗系統)，正像完備建立的物理化學分析系統一樣是可再現的(reproducible)。圖24圖示了新的生產和確認系統。在此系統中，所有影響所述動物性狀的因素被嚴格控制。這包括了對該動物自身的嚴格控制(例如，種，品系，及它們的混合生殖以產生雜交動物，性別，年齡，窩(litter)大小，及體重)，它們的生境(habitat)(例如，墊料(bedding)，動物室等)，物理化學因素(例如，氣味，光照，噪音)，氣候(例如，流速，溼度，溫度)，營養(例如，飲食，水，暴露於致癌物質)，微生物(例如，感染，正常菌群的質量)，及人類因素(例如，動物看管者，研究者等)。另外，試驗動物學的專家和受試動物疾病的專家已經設計、選擇並確定了遺傳控制的背景品系和遺傳多樣性之間的平衡。這些因素見圖2圖示。
開始開發用作「活體實驗工具」的標準化的實驗動物，其第一步驟是根據同樣的遺傳和微生物學質量說明製備參照(reference)動物，之後第二步驟是通過建立有計劃的生產系統來獲得足夠數量的相同動物，來評估它們在任何具體的動物試驗中的可用性和局限性。在此步驟後，可建立成百或者甚至上千標準化的動物，並使其接受全面評估來確定它們在建立基因改造的動物模型之前用作模型系統的可用性和局限性。在標準化的基因改造的動物模型的實際開發中重要的第三步驟，涉及使用特徵明確的可靠動物模型來建立完整的「體內試驗系統」，來使基因改造的動物，如轉基因小鼠被用作人類疾病或生物醫學和藥理研究的其它領域的可靠模型。通常，實驗動物學家對第一步驟負責，醫學或藥理研究者用所述動物模型完成第三步驟，而兩組研究者都參與第二步驟。儘管參照轉基因動物來說明此系統，本發明不應如此受限。本發明方法對其它突變動物，包括所有類型的基因改造的(基因操縱的)動物以及攜帶一或多種自發突變的動物是同樣適用的。
步驟1用同樣的遺傳和微生物學質量標準製備參照動物傳統上，開發轉基因動物包括如下步驟(1)通過顯微注射將DNA引入小鼠的卵，或通過逆轉錄病毒載體或其它方法引入胚胎幹細胞(ES細胞)；(2)用可靠的基因型分析檢測，例如通過PCR或Southern印跡(起始動物)來確認所述轉基因已被整合併轉移；(3)通過克隆或有性生殖來增殖；以及(4)質量控制，其包括遺傳質量控制(遺傳圖譜監控)，所述質量控制使用生物化學標記物和微生物質量控制，之後是微生物監控系統。因為即使是小的變化也可使動物在實驗室試驗中如何表現產生顯著不同，所以監控並保證每步驟的質量，以及保持這些繁殖群體(breeding colony)的優異，對於突變的例如基因改造的動物模型的可靠性都是必需的。本發明在此整體過程的每個步驟中有明顯改進。
本發明特別提供了群的規範(specification)，其包括在開發用於體內試驗的實驗動物過程中的(1)遺傳質量保證(超速同類系方法)以及(2)微生物學保證(兩層監控)。生殖過程的此部分被稱為「群(population)階段」。另外，本發明提供了「有計劃的生產和供給系統」，其包括(1)實時(ongoing)監控突變體例如轉基因的穩定性和功能，(2)風險管理系統(大量保存(bulkpreservation))，(3)增殖性改造技術，及(4)為所述模型的具體目的選擇背景品系，並且如果必要，拓寬遺傳背景來使遺傳多樣性變寬但可再現並可重複。
遺傳質量保證(開發同類系動物的超速方法)本發明的遺傳質量保證步驟，包括用相同的遺傳和微生物學質量標準，以及加速(speed)同類系的方法和技術，製備並確認參照突變的如轉基因的動物，例如小鼠，之後通過在有計劃的基礎上的遺傳監控，來確保保持所期望的質量。在此步驟中，本發明不僅確保在轉基因動物的情況下適當插入所述轉基因，而且確保所述小鼠或其它突變動物的背景基因的同一性。確保突變動物的遺傳背景也是相同的，其重要性在於在遺傳背景不是100％同一時，所述突變動物可能失去親代動物的表型。例如，p53+/-小鼠由於此原因已經顯示了複雜的表型。本發明此步驟所帶來的主要改進在於使該過程加速，即縮短建立同類系動物所必需的時間，而且應用了兩層遺傳監控系統。
開發新的如轉基因，敲除或敲入的突變動物系通常需要小心地回交至少5代，更常見至少9代，通常多到12代來在具體的近交(in-bread)動物，如小鼠品系中建立遺傳操縱或自發突變。此方法的結果是在數代後，在固定的遺傳背景下，建立例如轉基因，敲除或敲入的突變動物模型，稱為「同類系的」。接受體外受精的動物通常至少大約兩月齡，並且懷孕期是19天，這表示每代的生產需要差不多三個月。所以，建立同類系動物品系是很長的過程，它通常需數年。本發明提供了建立同類系動物種系的高速方法。根據本發明，處理每代雌性動物例如小鼠來使其超數排卵，並在大約4周齡接受體外受精。通常給16日齡的雌性小鼠注射PMSG之後在第28天注射hCG來使其超數排卵。第29天，所述小鼠自然交配或接受體外受精。第30天，收集兩細胞胚並移植到假孕受體。因為懷孕周期是19天，所以在第49天出現分娩。可以容易地看到，在每代使用非典型性幼齡(約4周)的動物會顯著縮短建立同類系種系所需要的時間。此方法用圖4圖示，並更具體地在實施例1中對其進行描述。
類似方法可用於從表現為低排卵能力的種系生產同類系動物。
微生物學質量保證-替代的微生物質量控制方法所述微生物環境是影響實驗動物演出型的主要因素之一。公知的事實是爆發微生物感染改變了實驗動物的健康，結果是實驗結果如生殖及血液化學表現(Nornura，T.Genetic and microbiological control.InImmune-DeficientAnimals(Sordat，B.等著)，S.Karger AG，Basel，1984.；Itoh，T.等，Expr.Anim.，30491-495，1981；Itoh，T.等，Jpn.J.Vet.Sci.40615-618，1978；Iwai，H.等，Expr.Anim.26205-212，1977)。並且Narushima等(Narushima等，Exp Anim47(2)111-7(1998))闡述腸細菌在轉基因rasH2小鼠中改變對致癌物質的反應。這些發現強有力地表明嚴格控制微生物環境對於確保實驗動物演出型質量是不可缺少的。另外，應特別注意遺傳改造的動物的微生物質量控制，因為動物的遺傳改變可導致免疫感受態(competence)的修飾。也存在表現為裸鼠獨特的(peculiar)感染。所以，嚴格的微生物控制是開發實驗動物模型的必需部分。
根據上述發明，使精製的(refined)腸細菌菌群在動物即小鼠中建群，並在嚴格屏障系統中飼養所述小鼠。如果動物來自其它研究所(institution)，其中動物被保留在傳統設施中而無嚴格控制的微生物監控，那麼所述動物必須用替代的微生物質量控制方法(AMQCM)來清潔，該方法是本發明的一個完整部分。通過應用所述AMQCM，可以顯著減少動物模型開發階段的微生物控制的花費和時間。進行所述兩層監控來確保此微生物質量。
本發明相應地提供了計劃性生產遺傳改造動物並嚴格確保它們的腸細菌菌群的微生物質量的新方法。體外受精(IVF)，胚胎深低溫保藏，胚胎轉移，由受體和/或代孕母親餵養的步驟都包含在本方法中。
具體地，對來自疑似有微生物感染的動物的卵子和精子進行IVF來獲得無菌胚胎。將所述胚胎轉移到受體小鼠的子宮。來自感染小鼠的精子和卵子的IVF-胚胎的乳鼠(Pup)在微生物學上是潔淨的。嚴格控制的小鼠原種(stock)提供了受體和代孕母親小鼠，其中精製的腸細菌菌群在所述原種小鼠中(AC原種)建群，從而使乳鼠在哺乳階段具有相同的菌群。
在替代的微生物質量控制方法中，除了順序的(ordinal)屏障動物飼養系統如乙烯基隔離器(vinyl isolator)，還使用一種現代的新設計的胚胎庫設備。所述胚胎庫設備包含三個單元1)檢疫單元(QU)，2)胚胎操縱及冷凍單元(EMFU)，和3)回收單元(RU)。所述胚胎庫設備的實施例以圖13圖示。此QU包含暫存(moor)微生物上不確定的供體的動物室，及收集配子(gamate)(卵子和精子)的無菌儀器。所述EMFU包括提供給微生物上潔淨的供體的動物室，為收集配子的無菌設備，無菌的IVF和冷凍設備，及存放液氮罐(tank)的室。所述RU包括給受體，胚胎轉移，餵養並飼養的室。所述EMFU和RU裝備了用QU隔離的屏障系統(過濾的正壓(positive)氣體調節，高壓滅菌(autoclave)，更衣室，等)。在帶有過濾正壓氣體調節的QU中使用乙烯基隔離器或負壓動物飼養儀器。在RU的每個室之間，以及屏障區外部(outside)與RU每個室之間裝備無菌鎖以便於轉移受體和代孕母親，胚胎等。在配子收集及IVF設備之間裝備傳遞(Pass)盒子，以及便於轉移無菌管。
除了這些設備，還為無菌和悉生生物動物裝備了隔離系統，其中精製的腸細菌菌群在這些動物(AC原種)中建群。用乙烯基隔離系統將這些動物通過無菌鎖帶入RU。
所述替代的微生物質量控制方法見圖14圖示。將疑似爆發或微生物上不確定的動物即小鼠置於QU，而將微生物學上確定的動物即SPF(無特殊病原體(Specific Pathogen Fee))保存在EMFU中。處死供體小鼠並滅菌小鼠表面。在無菌條件收集卵子和精子，並通過傳遞盒子轉移到IVF設備。進行無菌IVF並培養成為兩細胞胚。在液氮中冷凍所述胚胎，或直接用其移植。將所述兩細胞胚通過無菌鎖轉移到RU，並無菌移植到受體小鼠。
分娩的乳鼠由受體母親天然餵養。有時，通過剖腹產分娩的乳鼠由代孕母親餵養。在這兩種情況，都在餵養時使腸細菌菌群(AC原種)在乳鼠的腸道建群。
在實施例2中進一步說明此方法。
遺傳質量檢驗(testing)為用突變的如基因改造的動物如小鼠作為動物模型，必須生產大量遺傳上同源的動物。據此目的，圖4說明了兩種遺傳質量檢驗。如果此目的是為明確所述基因改造動物的遺傳特徵，那麼要進行抽查來在具體時間更加具體地確定給定品系的遺傳特徵。另一方面，保證穩定的遺傳質量需要監控所述動物，包括周期性檢驗預先確定的一套質量標準來確認質量無變化。
大多文獻中，所述轉基因和/或其整合位點的分子分析通常包括不超過五代。對整合到小鼠宿主基因組的轉基因的種系轉移穩定性從未做過具體研究。關於轉基因整合和穩定性的觀察報導是相互矛盾的，並表現為基因特異性的。明顯的是，所述整合的轉基因的廣泛分子分析不僅對於確認穩定整合，而且對消除或防止遺傳不穩定性都是必要的。
所述遺傳改變的動物(對於轉基因是純合子或半合子)的基因型通常和同品系的培育者對(breeder pair)的基因型不同。本發明提供新的方法來監控不同代的轉基因穩定性，以及轉基因整合位點周圍的基因組結構。本發明所述「早期基因檢測方法」通常能在兩天內區分純合子和半合子轉基因動物例如小鼠。與此相反，依賴於同胞交配(sibling mating)的傳統方法通常需要超過一個月。
檢測任何一代中的轉基因的遺傳穩定性通常從確定染色體位置開始，例如使用螢光原位雜交(FISH)方法。(Matsuda等，Cytogenet.Cell.genet.61282-285(1992)；Evans EP.Standard G-banded karyotype，InLyon MF，Rastan S.，Bround SDM，eds.，Gene Variations and Stains of the LaboratoryMouse.New YorkOxford University Press；1996，p.1446-1449)。通常其後是Southern印跡分析來製備整合的轉基因位點周圍的限制性片段圖譜，它提供了關於轉基因結構的重要信息。所述轉基因的表達可通過Northern印跡分析來確認。最後，通過對插入基因和周圍基因的逆轉錄PCR(RT-PCR)直接測序來完成此分析，例如來鑑定可能出現在所述轉基因動物下一代的點突變。
根據本發明，用新的和有效的PCR方法來對轉基因動物作基因分型。設計基因特異性PCR引物，使其從相反方向結合到靶DNA的互補鏈上，該靶DNA從所述轉基因動物和相應的非-轉基因(野生型)動物分離。如圖6具體說明，用分離自轉基因和非-轉基因動物的基因組DNA進行PCR，其所用引物對如下(1)染色體特異性引物A和轉基因特異性引物C，來確認5』轉基因/基因組接點；(2)轉基因特異性引物D和染色體特異性引物B，來確認3』轉基因/基因組接點；(3)染色體特異性引物A和B，來鑑定預整合位點；並且(4)轉基因特異性引物C和D，來確認轉基因-轉基因接點。用這些引物對生產的PCR擴增產物可根據大小分離，例如在瓊脂糖凝膠上，根據其提供的帶型鑑定任何具體動物的基因型。因此，半合子會產生兩條帶，一條對應於野生型等位基因，另一條對應於轉基因。與此相對，純合子只顯示對應於轉基因的帶。另外，由染色體特異性引物對A和B得到的PCR產物的不同會表明動物遺傳背景的不同。
可選或者另外，也可用信號區分來分離或分辨所述PCR產物，如根據螢光染料標記的產物顏色來區分。例如，當所述轉基因特異性引物用FITC螢光染料標記，染色體特異性引物用HEX染料標記時，轉基因特異性引物的產物會呈發綠的顏色而染色體特異性產物呈發紅的顏色，並能根據此性質用螢光成像探測器(fluorescence imaging detector)來分辨。在此具體實施例中，來自半合子DNA的所述產物被檢測為帶由綠和紅結合而得的發黃的顏色。
步驟2有計劃的生產和供給系統另外，本發明提供了有計劃的生產和供給系統，其包括(1)實時監控轉基因的穩定性和功能，(2)風險管理系統(大量保藏)，(3)增殖性改造技術，及(4)使遺傳背景加寬來拓寬遺傳多樣性(見圖15)。所述有計劃的生產在如上四個步驟後進行。所述過程用核(nuclear)，擴展(expansion)，和生產集群(colonies)來實現逐步生產，並冷凍保藏胚胎。使用集群對於風險管理是重要的。對於提供足夠數量的試驗動物(生產系)來評估它們在指定的靶人類疾病或生理功能中的可用性和局限性上，逐步擴展生產是必要的。
在核集群(nuclear colony)階段，通過深低溫保藏來保藏同胞交配(sib-mating)的受精卵。在擴展和/或生產階段，所述卵子在體外受精後深低溫冷凍成批保藏。從多隻雌性小鼠收集卵子，而從成批保藏的一隻雄性小鼠收集精子。通常需數十個月來通過自然受孕(impregnation)建立生產集群。核集群中譜系(pedigree line)的深低溫保藏系統，以及在擴展和生產集群中的成批保藏系統都降低了偶然的風險，如有計劃的生產中的汙染，或其它使生產間斷的問題。
應用本發明的新方法時，通過有計劃的生產和供給系統，可在比通常更短的時程中，建立核集群並確定所述動物的基因型。事實上，在一天內檢查每代的轉基因穩定性和基因型。因此，根據使用者說明書，本發明可快速提供任何期望體重或年齡的試驗動物。這比提供嬰兒(infant)動物很困難的傳統方法有了顯著改進。
步驟3評估所述動物模型的可用性和局限性必須限定對於人類疾病真正有用的動物模型，只有符合如下需要的動物才被認為是限定的動物模型與人類相象的生理或病理表型必須有與人類相同的遺傳原因，並且必須限定所述動物模型的可用性和局限性。這些要求等同地用到用作人類疾病的動物模型的所有基因改造的動物。
證明此步驟重要性的一個實施例是一種已經在日本開發的的動物模型，其用作Duchénne-型肌營養不良的模型。項目開始時，收集了差不多在全世界用作肌營養不良模型的所有動物並將其提供給臨床研究組來作評估(見例如，Gordon等，PNAS USA 777350-7384(1980)；Sugita和Nonaka，AnimalModel utilized in research on muscular diseases in Japan，p.271-286 inJ.Kawamata and E.C.Melby(ed.)，Animal Modelassessing the scope of their usein Biomedical research.Alan R.Liss，Inc.，New York；Bulfield等，PNAS USA811189-1192(1984)；Tanabe等，Acta Neuropathol.6991-95(1986))。來自自發突變體的這些肌營養不良模型對于澄清所述疾病的病因十分有用，但在Duchénne-型肌營養不良的研究中用處很少。隨研究進展發現，這些患有疾病的模型只表現出與人類肌營養不良相似的那些病徵。在評估所有基因改造的動物模型(包括轉基因，敲除和敲入動物)的可用性上進行類似考慮。更多細節見，例如，Nomura，Laboratory Animal Science 47113-117(1997)。
將在解釋人類疾病機制中其可用性和局限性已被評估的動物定義為人類疾病的動物模型。以攜帶脊髓灰質炎病毒受體基因的轉基因小鼠(TgPVR小鼠)為例，將TgPVR小鼠對脊髓灰質炎病毒的神經毒力的易感性(susceptibility)與人類疾病脊髓灰質炎(polio)的脊髓灰質炎病毒神經毒力相比較，來確定它們是否相同。將在解釋靶疾病中其可用性和局限性(例如對脊髓灰質炎病毒神經毒力/脊髓灰質炎的易感性)已被評估的動物定義為可用於解釋該疾病的人類疾病模型。
用如下非限制性實施例來說明本發明更多細節。實施例1圖示了超速同類系方法。實施例2說明了本發明的替代的微生物質量控制(AMQCM)。實施例3和4分別闡述了在Tg-rasH2和TgPVR21轉基因小鼠中確定轉基因的穩定性。實施例5描述了分析轉基因/小鼠基因組接點位點的本發明的新方法。實施例6說明了本發明拓寬轉基因動物遺傳背景來使遺傳多樣性變寬的方法。本發明提供了實施例7-9來通過檢測不同轉基因動物模型確認本發明的技術。
實施例1超速同類方法所述超速同類方法在圖4圖示。已經發現性早熟的幼鼠(不成熟小鼠)對外源性促性腺激素敏感。因此，通過注射促性腺激素可誘導這些不成熟小鼠超數排卵。使用超數排卵法來生產動物的方法與基於自然交配的傳統方法相比，顯著縮短了將所述突變小鼠如轉基因(Tg)小鼠的遺傳背景變為其它近交品系的遺傳背景所需要的過程。在此研究中，研究了適合誘導實現超數排卵的條件和不成熟小鼠體外受精後排出的卵母細胞的發育能力。
材料和方法讓不成熟的C57BL/6N雌性小鼠(3-4周齡)接受超數排卵過程，並將同品系的成熟雄性用作體外受精(IVF)的精子供體。
分別用1.25，2.5，5，10，或20IU懷孕的純血清促性腺激素(PMSG)和5IU人類絨毛膜促性腺激素(hCG)以48h間隔分開注射，來誘導23，24，25，26和27日齡的不成熟雌性小鼠實現超數排卵。在hCG後17-20小時估計每組排出的卵母細胞數。來自28日齡的小鼠的一些卵母細胞經過IVF過程並體外培養到2細胞階段。在成熟的Jcl:MCH(ICR)雌性小鼠假孕第1天，將所得的2細胞階段胚轉移到其輸卵管來評估所述胚胎的胚胎發育。
結果及討論被誘導排卵的小鼠比例和排卵的卵母細胞數與所檢測小鼠的年齡無關。在注射了1.25-10IU PMSG時，75-100％小鼠被誘導排卵。每組注射5IUPMSG獲得最多的排卵的卵母細胞數(均值52.3-76.3卵母細胞/小鼠)。注射15或20IU PMSG誘導排卵的效果不如其它劑量的效果。
為評估排卵的卵母細胞的正常性，讓來自28日齡小鼠的卵母細胞接受IVF過程。所述結果顯示超過95％的卵母細胞受精並發育到2細胞階段。胚胎轉移到受體小鼠後，超過50％的所得胚胎產出後代，這提示來自不成熟小鼠的卵母細胞具有正常的發育能力。
這些結果表明通過注射PMSG和hCG，從約4周齡的不成熟小鼠可得到正常的卵母細胞，其中來自不成熟小鼠的卵母細胞數是來自成熟小鼠的3-4倍，並且其卵母細胞具有正常胚胎發育的能力。用此過程，開始用Tg小鼠與其它品系回交來建立新的同類系小鼠品系。如上所述，用不成熟小鼠可每48天進行一次回交。
實施例2替代的微生物質量控制方法(AMQCM)材料和方法小鼠用C57BL/6N小鼠(10周齡)作病毒感染；用JCL:MCH(ICR)小鼠(10-15周齡)作受體。病毒用仙臺病毒(Sendai病毒)(HVJ MN毒株)和小鼠肝炎病毒(MHV Nu-67毒株)。血清學檢測對於HVJ進行酶聯免疫吸附測定(ELISA)和血細胞凝集抑制(HI)實驗，而對於MHV進行ELISA和補體結合(complement fixation)(CF)實驗。通過小鼠的鼻子使C57BL/6N小鼠感染此病毒(在第0天，試驗的當天開始)。將PMSG(第2天)和hCG(第4天)注射到病毒感染的C57BL/6N小鼠來使其排卵。在體外受精(IVF)第5天從所述感染的小鼠收集卵子和精子，並將兩細胞胚轉移到JCL:MCH(ICR)小鼠的輸卵管。在分娩(在25天)後，由代孕母親餵養乳鼠直到斷奶(wean)(第53天)。飼養斷奶的小鼠到第81天，並對其進行血清學檢測。也對受體小鼠和病毒感染的供體小鼠進行血清學檢測。
結果IVF和胚胎轉移從五隻HVJ感染的C57BL/6N小鼠總共收集60個卵子(平均12.0個卵子/小鼠)，並且使44個卵子(73.3％)發育成2細胞卵。將四十個2細胞胚轉移到受體並且生出了22隻乳鼠(55.0％)，最後使20隻小鼠斷奶(90.9％)。另一方面，從五隻HVJ感染的C57BL/6N小鼠總共收集163個卵子(平均16.3個卵子/小鼠)，並且使145個卵子(89.0％)發育成2細胞卵。將八十個2細胞胚轉移到受體並且生出了45隻乳鼠(56.3％)，最後39隻小鼠斷奶(86.7％)。
病毒檢測HVJ感染的供體小鼠(一隻雄性和5隻雌性)接受了ELISA和HI實驗。所有被測樣品在ELISA中顯示了超標(over-scaled)光密度；在CF實驗滴度超過1∶160(1∶320-160)。MHV感染的供體小鼠(一隻雄性和5隻雌性)接受了ELISA和CF實驗。ELISA中所有被測樣品都顯示了超標的光密度；CF實驗中滴度超過1∶20(1∶160-20)。這些證實了供體小鼠確實感染了所述病毒。而來自HVJ感染供體和來自MHV感染的供體的受體小鼠轉移的胚胎(每種3隻)接受了血清學檢測。另外，來自HVJ感染的和MHV感染的供體的精子和卵子的乳鼠(每種5隻)接受了血清學檢測。受體小鼠和乳鼠在任何血清學檢測中都沒有檢測出陽性實驗結果。
實施例3作為短期致癌性實驗(carcinogenicity testing)的動物模型的rasH2小鼠的轉基因穩定性和特性材料和方法動物通過連接人的活化的c-Ha-ras基因的每個正常部分來構建所述轉基因，其在第12個密碼子或第61個密碼子有單個點突變，然後亞克隆到pSV2-gpt質粒的BamHI位點(Sekiya T，等，Proc Natl Acad Sci USA 1984；814771-4775；Sekiya T等，Jpn J Cancer Res 1985；76851-855)。生產本研究所用的轉基因小鼠見上述(Saitoh等，Oncogene1990；51195-1200)。通過使雄性半合子rasH2轉基因小鼠和雌性近交C57BL/6JJic小鼠回交獲得C57BL/6JJic-TgN(RASH2)(Tg-rasH2)小鼠，來保持所述轉基因小鼠的起始集群(foundation coloring)。此研究中，5周齡雄性Tg-rasH2小鼠與N20和得自深低溫保藏的胚胎的N15的Tg-rasH2小鼠自然交配(mate with N20 andTg-rasH2 mice at N15 obtained from cryopreserved embryos)，並使用了12周齡雄性C57BL/6JJic(非轉基因)小鼠。根據日本實驗動物中央研究所(CentralInstitute for Experimental Animals)建立的指南處理所有使用的動物。
DNA探針將一等分試樣的微注射的DNA(7.0kb BamHI片段)亞克隆到pBlueScriptII KS+(pBSIIStratagene，La Jolla，CA)質粒的BamHI位點。用CsCl平衡離心之後在Sepharose CL6B柱(Amersham Pharmacia Biotech Inc.，Buckinghamshire，UK)通過凝膠過濾來純化所述質粒。用BamHI消化從質粒切割的包含人c-Ha-ras基因的7.0kb BamHI片段並從瓊脂糖凝膠回收它。根據生產商說明書(DIG-標記的隨機引物探針)，用DIG DNA標記試劑盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)用洋地黃毒苷(digoxigenin)(DIG)-11-dUTP標記所述7.0kb的BamHI片段。以所述7.0kb的BamHI片段作為模板DNA，用正向引物；5′-CCGACCTGTTCTGGAGGACGGTAACCTCAG-3′(SEQ ID NO1 )，和反向引物；5′-ACCAGGGGCTGCAGCCAGCCCTATC-3′(SEQ ID NO2)，用PCR DIG引物合成試劑盒(Roche DiagnosticsGmbH)製備所述DIG-標記的5′-探針(從位置1,793到2,400)。
螢光原位雜交分析用螢光原位雜交(FISH)方法(Matsuda等，Cytogenet Cell genet，見上文；Evans EP，見上文)確定所述轉基因的染色體位置。用人c-Ha-ras基因的生物素-16-dUTP-標記的7.0kb BamHI片段分析得自N15和N20的Tg-rasH2小鼠的有絲分裂原(mitogen)活化的二十個處於細胞中期的脾細胞。用抗-生物素山羊抗體(Vector Laboratories Inc，Burlingame，CA)和異硫氰酸螢光素標記的抗-山羊免疫球蛋白G(Nordic Immunological Laboratories，Capistrano Beach，CA)來顯示所述生物素-標記的DNA，然後用碘化丙錠(Sigma-AldrichChemie GmbH，Steinheim，Germany)復染。用MICROPHOTO-FXA(NIKONCORPORATION，Tokyo，Japan)進行觀察，並根據G顯帶(banding)標準物(Evans EP，見上文)來鑑定有螢光信號的染色體。
Southern印跡分析根據標準方案(Sambrook J，Russell DW.Molecular Cloning，Third EditionA Laboratory Manual.New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press；2001)，通過用蛋白酶K過夜溫育，之後用苯酚氯仿提取並用乙醇沉澱，來從Tg-rasH2小鼠和非轉基因小鼠的尾部活檢製備基因組DNA。在37℃用3U限制酶/每毫克DNA消化基因組DNA(通常10μg)過夜，並在-20℃用乙醇沉澱。沉澱後，在10μl TE緩衝液(10mM Tris，pH7.5，1mM EDTA)重新溶解所述基因組DNA樣品並在0.6％瓊脂糖凝膠過夜電泳。所述凝膠順序地在75mM HCl中脫嘌呤，在1.5M NaCl/0.5M NaOH中變性，並在pH7.5的1.5MNaCl/0.5M Tris-HCl中中和。在25mM pH7.0的磷酸鈉緩衝液中，通過毛細管轉移將DNA從所述凝膠過夜轉移到尼龍膜(Hybond-N+，AmershamPharmacia Biotech Inc.)。對所述空氣進行乾燥和紫外交聯。在2×標準檸檬酸鹽水溶液(SSC；0.3M NaCl和30mM檸檬酸鈉，pH7.0)中簡單清洗所述膜後，在雜交箱的Church雜交緩衝液中在42℃預雜交所述膜6小時(Church GM，等，Proc Natl Acad Sci USA 1984；811991-1995)。煮5分鐘變性所述探針並將其加入新鮮的Church雜交溶液中的印跡。在42℃雜交所述印跡過夜，再在50℃用2×SSC/0.1％的十二烷基硫酸鈉洗滌兩次，並在65℃用0.2×SSC/0.1％的十二烷基硫酸鈉洗滌兩次。根據生產商說明書用DIG發光檢測試劑盒(Luminescent Detection Kit)(Roche Diagnostics GmbH)檢測所述雜交的探針。為檢測化學發光信號，讓所述印跡暴露於ECL-Plus X-射線膠片(Amersham Pharmacia Biotech Inc.)。
Northern印跡分析用TRIzol(Life Technologies Inc.Gaithersburg，MD)提取總細胞RNA。根據生產商方案用DNase I(Life Technologies Inc.)處理所述RNA溶液。在1％瓊脂糖/6％甲醛凝膠分級分離所述RNA(10μg)，並將其轉移到Hybond-N+尼龍膜上。對所述印跡進行空氣乾燥，紫外交聯並如上述(Maruyama等，Oncol Rep 2001；8233-237)雜交。用隨機引物DNA標記試劑盒(RocheDiagnostics GmbH)用[α-32P]-dCTP標記鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶cDNA和人c-Ha-ras基因的7.0kb BamHI片段並將其用作雜交探針。使所述膜暴露於Kodak AR膠片。
克隆基因組/轉基因接點區域為克隆基因組/轉基因接點，用限制酶HindIII加BamHI完全消化Tg-rasH2小鼠的100μg基因組DNA，然後用標準方法用苯酚氯仿提取並沉澱(Sambrook J，等，見上文)。通過在蔗糖密度梯度上超速離心分級分離雙消化的DNA的6-9kb的片段，並將該片段連接到pBSII質粒的相同位點。用與載體連接的基因組DNA作為模板用重組Taq DNA聚合酶(TaKaRa Inc.Shiga，Japan)根據生產商說明書進行聚合酶鏈式反應(PCR)。PCR引物，pBSII-rev(5′-GGAAACAGCTATGACCATGATTACGC-3′(SEQ ID NO3))和C(5′-GACCGGAGCCGAGCTCGGGGTTGCTCGAGG-3′(SEQ ID NO4))用於擴增5』基因組/轉基因接點；pBSII-rev和D(5′-ATCTCTGGACCTGCCTCTTGGTCATTACGG-3′(SEQ ID NO5))用於擴增3′轉基因/基因組接點。在ABI PCR2400(Applera Corporation，AppliedBiosystems，Foster City，CA)中，將反應混合物加熱到94℃2分鐘，然後以94℃30秒，66℃30秒和72℃3分鐘擴增35個循環，之後將所述混合物在ABIPCR2400(Applera Corporation，Applied Biosystems，Foster City，CA)中保存在72℃5分鐘。用ABI PRISM310基因分析儀(Applera Corporation)用ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready反應試劑盒(Applera Corporation)確定HindIII鄰近區域的核苷酸序列。為分離所述基因組/轉基因接點，基於所述通過PCR克隆方法確定的序列來設計兩種新的引物，A(5′-GGGTCCTCTGGAGCTGGAGTTACAGACTAC-3′(SEQ ID NO6))和B(5′-GCTTGGCTTAAGATACAGCAGCTATCCTG-3′(SEQ ID NO7))。以Tg-rasH2小鼠基因組DNA作為模板，用引物C加A(對於5′基因組/轉基因接點)，和D加B(3′轉基因/基因組接點)進行PCR擴增。為克隆轉基因/轉基因接點，用Tg-rasH2小鼠DNA和引物D及C進行PCR擴增。為明確所述整合過程及由轉基因插入帶來的可能的位置效應，從非轉基因和Tg-rasH2的小鼠DNA用引物A和B擴增所述預整合位點。PCR條件與上述相同。
測序整合的人c-Ha-ras基因從N20的Tg-rasH2通過PCR獲得覆蓋整個整合的人c-Ha-ras基因的五種重疊的PCR產物，其中所用引物為引物D(見上)加E(5′-CACGCACCCAAATTAGAAGCTGCTGGGTCG-3′(SEQ ID NO8))，
F(5′-CCGACCTGTTCTGGAGGACGGTAACCTCAG-3′)加G(5′-CACACGGGAAGCTGGACTCTGGCCATCTCG-3′(SEQ ID NO9))，H(5′-AAACCCTGGCCAGACCTGGAGTTCAGGAGG-3′(SEQ ID NO10))加I(5′-AACCTCCCCCTCCCAAAGGCTATGGAGAGC-3′(SEQ ID NO11))，以及J(5′-TGCGCGTGTGGCCTGGCATGAGGTATGTCG-3′(SEQ ID NO12))加K(5′-GTGCTGGGCCCTGACCCCTCCACGTCTGTC-3′(SEQ ID NO13))。
用UltraClean PCR Clean-up DNA純化試劑盒(Mo Bio Laboratories Inc.，Solana Beach，CA)純化PCR產物，並通過引物步測(primer walking)法確定核苷酸序列。
結果檢測Tg-rasH2 小鼠中轉基因穩定性如圖8A所示，通過顯微注射包含人c-Ha-ras基因7.0kb的構建體(BamHI片段)，Saitoh等在1990建立所述轉基因小鼠系rasH2。原來產生的生成小鼠是雜交(C57BL/6J×DBA/2J)系，並與C57BL/6JJic回交，來生成遺傳上同源的群。因為回交已經進行至超過N20，並已經生產了30,000隻以上的轉基因小鼠。在經過很多代的大規模繁殖中，已經檢測了整合到所述Tg-rasH2小鼠基因組的轉基因的遺傳穩定性。通過FISH方法確定在N15和N20的Tg-rasH2小鼠中所述整合的轉基因的染色體定位。表示所述轉基因位置的成對的螢光信號在兩種情況下(圖7)都可在染色體15E3區域觀察到。所述Tg-rasH2小鼠是半合子，所以只在一對姐妹染色單體檢測到所述雜交信號。
進行Southern印跡分析來製備整合的轉基因位點周圍的限制性酶切片段圖譜，它為轉基因結構提供了重要信息。用BamHI消化Tg-rasH2小鼠DNA產生了三條與DIG-標記的隨機引物探針雜交的帶(7.0kb和兩條分子量更高的帶)(圖8B)。在N15(圖8B，第2和3道)和N20(圖8B，第4和5道)的Tg-rasH2小鼠的雜交帶型沒觀察到不同。用BamHI消化的非轉基因小鼠DNA與相同的探針(圖8B，第1道)沒產生任何雜交帶。BamHI-消化的Tg-rasH2小鼠DNA與DIG-標記的5′-探針(圖8C，第1道)或DIG-標記的3』-探針(位置從6,024到6,712；數據未示)雜交也顯示與DIG-標記的隨機引物探針獲得的雜交帶型相同。我們通過Northern印跡分析確認所述轉基因的表達。在Tg-rasH2小鼠的腦(B)，而不是在非轉基因小鼠中觀察到所述人c-Ha-ras基因的表達。除了腦，在每代(N15和N20)Tg-rasH2小鼠(圖9)的肺(L)和前胃(F)都表達所述轉基因。逆轉錄PCR(PT-PCR)直接測序分析表明在Tg-rasH2小鼠的任何一代都看不到在人c-Ha-ras基因的密碼子12和61優先出現的點突變。除了突變熱點(hot spot)，在編碼區域看不到核苷酸改變(數據未示)。
在Tg-rasH2小鼠確定轉基因方向(Orientation)和拷貝數為清楚所述整合的轉基因結構，用數種限制酶(HpaI，XhoI，XbaI，NcoI，NglII)消化Tg-rasH2小鼠基因組DNA並進行Southern印跡分析，其中所述限制酶切割所述轉基因的已知單個位點。如果所述整合的轉基因以頭-y-尾(head-y-tail)構型串聯存在，這些限制酶會產生7kb的片段。用XbaI消化直接重複轉基因拷貝會產生7kb的片段，而反向重複會產生9.1kb(尾-對-尾)或4.9kb(頭-對-頭)的片段。事實上，用XbaI消化的在N20的Tg-rasH2小鼠的基因組DNA產生和DIG-標記的5』-探針(圖8C，第4道)的7kb的雜交帶。切割所述轉基因的已知單個位點的所有其它限制酶也產生與DIG-標記的5』-探針雜交的7kb帶(圖8C，第2，3，5和6道)。這些結果表明所述整合的轉基因的數個拷貝以頭-對-尾構型串聯存在。在N15的Tg-rasH2小鼠中也觀察到相同的雜交帶型(數據未示)。
為確定所述整合的轉基因的拷貝數，用HindIII完全消化Tg-rasH2小鼠DNA，然後用多種濃度的BamHI限制酶部分消化所述等分試樣。在0.4％瓊脂糖凝膠上，對所述消化的DNA進行電泳來清楚分辨分子量高的DNA樣品。見圖10所示，用DIG-標記的隨機引物探針作Southern印跡分析。當用HindIII完全消化基因組DNA時，只有22.2kb的帶與DIG-標記的隨機引物探針雜交(圖10，第2道)。所述22.2kb的片段最多包含三個拷貝的7.0kb的轉基因。HindIII和BamHI雙消化產生與DIG-標記的隨機引物探針(圖10，第5道)雜交的8kb和多個7kb的片段。當HindIII消化的基因組DNA用BamHI(圖10，第3道)進一步部分消化時，除了22.2，8和7kb的帶，14.2和15kb的帶也與DIG-標記的隨機引物探針雜交。這些結果表明Tg-rasH2小鼠在它們的基因組中包含三個拷貝的所述轉基因。
克隆並測序基因組/轉基因接點和它們的相應的預整合位點從Southern印跡分析獲得的結果表明用HindIII和BamHI雙消化Tg-rasH2基因組DNA得到的7和8kb的片段包括基因組/轉基因和/或轉基因/基因組接點區域。為研究Tg-rasH2小鼠基因組中所述基因組/轉基因接點的精細結構，用超速離心在蔗糖密度梯度上分級分離的6-9kb的HindIII-BamHI雙消化的片段連接到pBSII質粒的相同位點。用使用合適引物(pBSII-rev和C；用於擴增5』基因組/轉基因接點，pBSII-rev和D；用於擴增3′轉基因/基因組接點)通過PCR(第1次PCR)來擴增兩PCR引物之間的序列(GenBank登錄號AB072334)，並且用PCR-直接測序來分析。為消除所述擴增的DNA片段為所述PCR-克隆過程的人工產物(artifact)的可能性，所述基因組/轉基因接點的每一端通過第2次PCR用如下引物組(C加A和D加B，圖11C)從Tg-rasH2小鼠基因組DNA進行重新克隆。用引物組C加A，和D加B擴增的每種PCR產物只見於Tg-rasH2小鼠，且具有分別為867-bp(圖11A，第1道)和804-bp(圖10A，第3道)的預測大小。所述第2次PCR產物的核苷酸序列與第1次PCR產物的核苷酸序列一樣。這些結果表明通過PCR-克隆獲得的基因組/轉基因接點序列確實存在於Tg-rasH2小鼠基因組。
從非轉基因和Tg-rasH2小鼠DNA用PCR方法擴增之後並克隆預整合位點。在位於所述轉基因插入位點的側翼的特定序列內用引物A和B擴增所述預整合位點。引物組A加B在非轉基因小鼠和Tg-rasH2小鼠產生2.2kb的PCR產物(圖11A，第5和6道)。另外，也可從DBA/2J小鼠的DNA獲得所述2.2kb的PCR產物(數據未示)。本試驗中，我們使用C57BL/6JJic小鼠作為非轉基因對照來確定所述預整合位點。然而，原來的rasH2小鼠是在C57BL/6J×DBA/2J雜交品系產生的，所以我們不能排除所述微注射的人c-Ha-ras基因整合到所述DBA/2J等位基因的可能性。所述Tg-rasH2小鼠是半合子並且有一個野生型等位基因。發現所述2.2kb的片段包含小鼠基因組DNA序列，而該序列可能已經從Tg-rasH2小鼠基因組缺失了。通過PCR-直接測序，我們確定了所述2.2kb片段的核苷酸序列(GenBank登錄號AB072335)，並將其與所述轉基因/基因組接點的序列(GenBank登錄號AB072334)和微注射的DNA比較。DNA測序分析表明當所述微注射的人c-Ha-ras基因被整合到小鼠宿主基因組時，1,820-bp的序列已經缺失。
圖12將所述5』基因組/轉基因接點(5』J)和3′轉基因/基因組接點(3′J)序列與所述宿主基因組和注射的DNA序列作以比較。兩接點共同的顯著特點是在親本序列間存在短同源序列。在整個(Spanning)5′J，在所注射的序列的5′末端有148-bp的缺失，並且在所述親本序列之間的4-bp同源序列(CCAG)存在於最終整合體(integrant)的5′末端。在整個3′J，在一段序列(stretch)內有90％的同源性，其中在3′末端缺失24-bp的轉基因整合體的3′末端序列和親本序列之間，有10bp(TCCTgCTGCC；所述小寫字表示錯配位置)是同源的。我們的結果支持短的同源性配對(pairing)可能對染色體的整合事件有貢獻作用的假設。發現哺乳動物的拓撲異構酶I的切割位點的共有序列在宿主基因組的5′J和3′J的附近。此序列也出現在5′J和3′J位點附近的注射的DNA中。
對所述轉基因構建體及在Tg-rasH2小鼠中的整合的人c-Ha-ras基因的序列分析用PCR-限制性片段長度多態性和PCR-直接測序來分析在多聯體內的轉基因/轉基因接點。用引物D和C擴增的PCR產物只在Tg-rasH2小鼠觀察到其為預料的大小即1.4kb(圖11A，第7道，和圖11B，第1道)。擴增的1.4kb的片段用BamHI消化分為兩個大小為0.7kb的片段(圖11B，第2道)。所述PCR-直接測序也表明轉基因/轉基因接點保留了Tg-rasH2小鼠基因組的BamHI識別序列，並且在這些接點無序列丟失或重排。
對所述轉基因構建體及在Tg-rasH2 小鼠內整合的人c-Ha-ras基因的序列分析通過連接來自人類黑素瘤和膀胱癌細胞系的c-Ha-ras基因的每個正常部分製備7.0kb的構建體(Sekiya等，PNAS USA 814771-4775(1984)；Sekiya等，Jpn Cancer Res 76851-855(1985))。這些細胞系中的c-Ha-ras基因的核苷酸序列已經在公共資料庫註冊(GenBank登錄號M30539和V00574)。所述7.0kb的構建體是嵌合的和人工的ras基因，所以我們不知道用於顯微注射的此構建體的精確核苷酸序列。因此，我們重新確認等分劑量的微注射的DNA的核苷酸序列。我們確定了嵌合的人c-Ha-ras基因的核苷酸序列(＝7.0kb的BamHI片段，6,992-bp)。當此序列與來自黑素瘤和膀胱癌細胞系的人c-Ha-ras基因序列相比時，在所述嵌合的人c-Ha-ras基因可見數種次要的不同。然而，我們在每個外顯子中不能檢測到任何變化。我們也確定了所述整合的人c-Ha-ras基因的核苷酸序列。使用合適引物(見材料和方法)通過PCR獲得覆蓋了整個整合的人c-Ha-ras轉基因的五種重疊的PCR產物，並通過PCR-直接測序(GenBank登錄號AB072334)進行分析。對於從N20的Tg-rasH2小鼠和微注射的DNA獲得的核苷酸序列，除了所述串聯排列的轉基因兩末端的小缺失外，我們不能檢測到任何差異。
討論原來的rasH2小鼠(C57BL/6J×DBA/2J的雜種)已與C57BL/6JJic品系回交來生產遺傳上同源的群。現在，回交已進行至超過N20。看起來此轉基因系的遺傳背景已差不多被C57BL/6JJic的背景取代(約99.9998％)，(Silver LM，Experimental Mouse.InSilver LM ed.，Mouse Genetics，Concepts andApplications，New YorkOxford University Press；1995，p.46-48)。重要的是考慮用於致癌實驗的動物遺傳背景，這是因為自發和化學誘導的腫瘤發病率在小鼠品系是不同的。對於短期致癌實驗，我們推薦使用通過雌性BALB/cByJ小鼠和雄性Tg-rasH2小鼠繁殖獲得的F1雜種rasH2轉基因小鼠(CB6F1-Tg-rasH2)。此獨特的繁殖系統有兩項優點其一是可能獲得對化學化合物的較寬多樣性反應，並且另一個是可能使用同胞非轉基因(CB6F1-NonTg)小鼠作為檢查的對照。
此研究中，我們發現在Tg-rasH2小鼠中整合的人c-Ha-ras基因逐代穩定傳遞。微注射到培養的細胞或小鼠受精卵的DNA分子通常整合到宿主基因組中的單個位點，並且當這些轉基因以多個拷貝存在時，它們主要以頭-對-尾串聯而較少以頭-對-頭或尾-對-尾方向排列(Filger等，Mol Cell Biol21372-1387(1982)；Gordon和Ruddle，Gene 33121-136(1985)；Palmiter和Brinster，Annu Rev genet 20465-499(1986))。已知Tg.AC轉基因小鼠有對陽性對照化合物12-O-十四烷醯佛波醇13-醋酸酯(tetradecanoylphorbol13-acetate)無反應的群體(Thompson等，Toxicol Pathol 26548-555(1998)；Weaver等，Toxicol Pahthol 26532-540(1998)；B1anchard等，Toxicol Pathol26541-547(1998))，並且此無反應群顯示所述反向重複的頭-對-頭接點頂部附近的基因缺失(Thompson等，Toxicol Pathol見上文；Honchel等，Mol Carcinog 3099-110(2001)。多項研究表明轉基因中帶有回紋結構的反向重複序列使所述基因不穩定(Akgun等，Mol Cell Biol 175559-5570(1997)；Collick等，EMBO J.151163-1171(1996)；Ford和Fried，Cell45425-430(1986))。幸運的是，在Tg-rasH2小鼠基因組中串聯排列的人c-Ha-ras轉基因無回紋結構，但我們不知道在大規模繁殖經過很多代時是否會出現轉基因重排。Aigner等觀察了七個系的酪氨酸酶基因轉基因小鼠，認為繁殖計劃(program)可持續很多代而在建立的純合子轉基因系中不再需要嚴格的分子分析(Aigher等，見上文)。然而，他們指出極少的個體在它們的試驗中受轉基因拷貝丟失的影響。我們這裡要說明在Tg-rasH2小鼠整合的所述轉基因逐代並在大規模繁殖時穩定傳遞(圖7和8)。在450隻Tg-rasH2小鼠的Southern印跡分析中，我們在個體DNA樣品中沒發現任何不同(未公布數據)。然而，我們相信定期間隔檢查用於致癌實驗的Tg-rasH2小鼠中的基因型和表型是需要的，因為起始集群中的無反應者突變體可能造成的汙染會影響致癌實驗結果的可靠性。因此，我們通過仔細的分子遺傳分析應確認每代親本Tg-rasH2(C57BL/6JJic-TgN(RASH2))小鼠的完整性，所述分析包括對所表達的人c-Ha-ras基因的Southern和Northern印跡和PCR-直接測序(近來在N23的結果無明顯變化，未公布數據)。另外，實際實驗模型CB6F1-Tg-rasH2小鼠應接受N-甲基-N-硝基脲作為陽性對照化合物的致癌實驗。
Southern印跡分析結果表明所述整合的轉基因的拷貝數。通常，難以確定整合的轉基因的確切拷貝數，因為微注射的DNA被重複(reiterate)來形成每個位點從大約100-700個拷貝的串聯或反向排列。在Tg-rasH2小鼠，所述微注射的人c-Ha-ras基因的序列沒有任何HindIII識別位點。因此，所述轉基因整合位點用HindIII消化從Tg-rasH2小鼠基因組切出，並用Southern印跡分析檢出為單個22.2kb的帶。如果所述完整的7kb的人c-Ha-ras基因被整合到Tg-rasH2小鼠基因組，所述整合的轉基因不會超過三個拷貝。另外，BamHI消化會產生與覆蓋整個所述7kb的人c-Ha-ras基因的隨機引物探針雜交的三條帶，這表明所述整合的轉基因最少有三個拷貝。然而，如果它已經以環形存在，那麼通過整合所述基因的兩個拷貝，可能獲得類似的帶型。如果這樣，當用覆蓋7kb的人c-Ha-ras基因的位置1,793-2,400的5′-探針(圖8C，第1道)或覆蓋位置6,024-6,712的3′-探針(未公布數據)進行雜交時，BamHI消化會產生兩條雜交帶。所述兩個區域特異性探針都雜交並產生三條帶，所述帶與那些隨機引物探針產生的那些帶類似。這些結果表明所述整合的轉基因有三個拷貝。在兩端存在基因組/轉基因接點的序列(圖12)也不可能以環形整合。
因為不知道當所述微注射DNA整合到小鼠基因組時，所述轉基因拷貝是否表現任何缺失或重排，我們從Tg-rasH2小鼠DNA克隆所述基因組/轉基因及轉基因/基因組接點，並從所述非轉基因小鼠克隆它們的相應預整合位點。已經報導所述微注射DNA的末端序列相對保守，並通過在轉基因小鼠中缺失或插入最多數個核苷酸來被修飾(Pawlik等，Gene 165173-181(1995)；Hamada等，Gene 1281978-202(1993)；McFarlane和Wilson，Transgene Res5171-177(1996))。從Southern印跡分析結果，我們懷疑在Tg-rasH2小鼠基因組中串聯排列的轉基因拷貝的兩個(5′和3′)末端有一些缺失。如果所述串聯轉基因被完整整合，所述整合的轉基因拷貝在它們的接點就會有保守的BamHI位點，並經BamHI消化會產生僅7.0kb的單體片段。比對所述轉基因/基因組接點和所述微注射的DNA的序列表明，Tg-rasH2小鼠在在轉基因整合的5′末端有148-bp的缺失並在3′末端有24-bp的缺失(GenBank登錄號AB072334)。在兩末端可見的這些缺失提示所述轉基因多聯體整合前以線性而不是環形存在，並且所述線性多聯體的游離末端是重組的優選位點。所述轉基因的整合基因座的核苷酸序列分析表明，在整合接點所述親本序列之間存在短同源序列(在5』末端的4-bp和在3』末端的10-bp中的9bp)。在轉染的成纖維細胞和轉基因小鼠系已經觀察到位於整合接點和宿主基因組的轉基因之間的這些短同源序列(Hamada等，Gene 128197-202(1993)；McFarln\ana和Wilson，Transgene Res 5171-177(1996))。另外，DNA拓撲異構酶I似乎在微注射DNA的整合中起重要作用。據發現，所述哺乳動物拓撲異構酶I切割位點的共有序列(Been和Burgess，Nucleic Acids Res 123097-3114(1984))在多個轉基因系(Hamada等，見上文，McFarlane和Wilson等，見上文)和Tg-rasH2小鼠的整合的轉基因位點附近(圖12)。
在轉基因插入處，視具體情況而定出現宿主基因組的缺失或重排。當所述微注射的人c-Ha-ras基因整合到小鼠宿主基因組時，Tg-rasH2的宿主基因組出現核苷酸缺失(1,820-bp)。用BLAST2程序比較Tg-rasH2小鼠缺失的核苷酸序列(GenBank登錄號AB072335)和GenBank資料庫的那些序列，來鑑定可能的同源性。所述缺失序列與資料庫中的已知功能性基因沒有任何同源性。然而，發現所述缺失區域攜帶與人DNA序列同源的序列，所述序列來自包含RPL7(60S核糖體蛋白質L7，GenBank登錄號AL031589)假基因的染色體22上的克隆RP6-11O7。所述缺失區域序列的312-bp(位置698-1,009)表明與人DNA克隆RP6-11O7(位置9,023-9,334)88％的同源性，但在RPL7的編碼區沒觀察到序列同源性。在所述缺失序列用多種框架和方向翻譯成為相應的胺基酸序列時，沒觀察到胺基酸水平的序列同源性。儘管我們確定的缺失序列可能位於內含子或啟動子區域，將所述人c-Ha-ras基因插入到宿主小鼠基因組不會產生插入突變。基礎基因表達不受插入Tg-rasH2小鼠的轉基因的影響。此結論得到表達圖譜方法的初步證據的支持。我們在比較了9,514個單基因(unigene)的基礎基因表達後未發現Tg-rasH2小鼠的肝和非轉基因小鼠的肝之間有顯著不同(數據未公不布)。
Tg-rasH2轉基因小鼠是一個遺傳上同源的群體，它已經用分子生物分析包括轉基因結構和改變宿主基因組序列來精製，應為短期致癌試驗的有用的齧齒動物模型。
實施例4作為神經毒力實驗(NVT)動物模型的TgPVR21小鼠的轉基因穩定性Nomoto(PNAS，88951-955，1991)製造了攜帶人脊髓灰質炎病毒受體(PVR)基因的轉基因小鼠。已經開發此小鼠作為神經毒力實驗(NVT)的動物模型，來替代日本實驗動物中央研究所的猴神經毒力實驗(MNVT)。所述轉基因的穩定性是確保該TgPVR21轉基因小鼠作為NVT動物模型的生殖質量的關鍵因素。為檢測所述轉基因在TgPVR21小鼠的穩定性，在對IQI品系的同類系過程中在不同代中分析所述轉基因的分子結構。
材料和方法在對IQI品系的回交數為N3，N15和N20時，分析在TgPVR21小鼠的轉基因結構(表A)。如下述，用標準方法進行FISH，Southerrn和Northern印跡，以及RT-PCR分析(表A)。也確定了所述轉基因編碼區的核苷酸序列。
結果FISH(圖16)用生物素-標記的HC5克隆作為探針進行FISH分析並通過抗生物素蛋白-FITC方法觀察。如圖16所示，在N15的轉基因純合子和N20的半合子的第13條染色體(位置13B3)分別見到兩個雙生斑(twin spot)和一個雙生斑。此分析中觀察到的轉基因的染色體定位與以前的結果一致(Nomoto，1991，見上文)。
Southern印跡分析(圖17)用BamHI消化10微克從轉基因純合子的N15小鼠和半合子的N20小鼠獲得的DNA，並進行瓊脂糖凝膠電泳。將DNA轉移到膜上。所述膜與圖17所示的探針雜交(PVR-α的編碼區)。在兩隻小鼠和對照的HC5克隆中發現雜交帶大小為1.2，1.3和10kb。這些發現與以前的結果一致，這表明未出現重排，並且所述轉基因在TgPVR21品系的同類系過程中是穩定的。
基因表達分析進行Northern印跡，PT-PCR和直接測序來檢測TgPVR21品系的基因表達圖譜(圖18)。整合的轉基因基因的結構，及基因剪接產生的三種mRNA產物，Northern分析的探針，引物和部分測序見圖19所示。將總細胞RNA進行凝膠電泳並轉移到膜上。所述膜與圖17所示的探針(PVR-α mRNA的cDNA)雜交。在N15和N20的TgPVR21品系檢測到單一3.3k的帶。這裡所得數據與之前的結果一致(Nomoto，1991，見上文)。從N3，N15和N20的TgPVR21小鼠的腦，腎和腸獲得的RNA進行了PT-PCR分析。用旁路剪接得到的來自整合的PVR基因的三種RNA產物(PVR-α，-β，和-γ)經檢測為預期的大小(149，173和308bp)。用得自N15小鼠腦的RNA獲得的cDNA來進行PCR直接方法測序。結果確認所述整合的轉基因產生與所述PVR基因的編碼區(1,254bp，起始密碼子ATG到終止密碼子TGA)極好匹配的RNA。
實施例5分析轉基因/小鼠基因組接點的位點已確認根據本發明的生產方法能穩定地逐代傳遞轉基因。此事實可開發新方法來對所述小鼠作基因分型。所述轉基因的整合位點包括所述轉基因/小鼠的基因組接點區域。克隆並分析新的轉基因小鼠品系(TgPVR21小鼠-見上實施例4，和rasH2小鼠-上述實施例3)來用這些品系說明新的基因分型方法。該新的基因分型方法的一般概念見圖6說明。此圖中，較暗的箭頭指示了設計用來檢測野生型的PCR引物，而亮的箭頭指示了設計用來檢測所述小鼠的轉基因型的PCR引物。用此方法，可清楚容易地辨別多種基因型，例如野生型純合子，半合子(或雜合子)和轉基因純合子。從TgPVR21小鼠的轉基因純合子獲得DNA。
Southern印跡分析進行Southern印跡分析來獲得所述轉基因/小鼠基因組接點位點的`5區的限制酶圖譜。用BamHI，EcoRI，BglII，NcoI，HindII和XbaI作DNA消化。用所述轉基因的載體部分的700bp的片段作為Southern印跡分析的探針(圖20)。
Southern印跡分析的結果見圖21A所示。計算每條帶的大小並如圖21B所示。通過帶的大小信息獲得所述限制酶圖譜，並見圖21C說明。所述圖譜提供了如下有價值的信息。首先，所述轉基因/小鼠基因組接點的點(point)的不對稱模式表明所述轉基因沒有頭-對-頭構型。第二，每個限制酶消化步驟僅獲得單一條帶的事實表明所述轉基因的單拷貝應整合到TgPVR21轉基因小鼠的小鼠基因組。
克隆並測序所述轉基因/小鼠基因組接點的5′區域用BglII完全消化TgPVR21的轉基因純合子的基因組DNA。在蔗糖密度梯度用超速離心分離包含2.9kb片段的DNA並進行自身連接(圖22A)。用連接的DNA進行反向PCR來擴增所述5′基因組/轉基因接點(圖22B)。直接測序所述PCR產物來獲得所述接點位點(第一次PCR)的核苷酸序列信息。然後，用第一次PCR產物作為探針從基因組DNA克隆包含所述轉基因/小鼠基因組接點區的DNA片段(圖22C)。用所克隆的DNA作為模板進行第二次PCR，並擴增預期為1.5kb的PCR產物(圖22D)。最後，用步測引物進行PCR直接測序來得到轉基因/小鼠基因組接點處上遊1kb的基因組信息(圖22E)。
用所述轉基因/小鼠基因組接點位點獲得的小鼠基因組信息進行BLAST檢索。該BLAST檢索得到註冊的克隆號2833685，它與克隆的片段(PVR基因)的200bp完全同源，並且所述轉基因/小鼠基因組接點區域的上遊位點結構如圖23確定。
實施例6拓寬遺傳背景來使遺傳多樣性變寬如果將實驗動物用於安全試驗(safety test)，拓寬(擴展)它們的遺傳背景來使遺傳多樣性變寬是十分需要的，然後會導致敏感範圍更寬，行為表現多表3

當用戶利用短消息業務控制網絡家電時，可以通過行動電話的顯示屏幕輸入短消息，按上面描述的控制指令的語法來輸入控制指令。例如，第一個字母「C」表示發出控制指令，隨後是受控制對象，控制狀態，和控制參數。例如，如下面的表4所示，指令「C M1 on 4」表示「設置微波爐1加熱時間為4分鐘，並啟動」。表4中還列出了其它例子供參考和理解。
表4

下面描述為了便於用戶利用短消息業務遠程控制網絡家電而設置的系統菜單。
由於直接編輯短消息需要用戶記住控制命令格式，給用戶增添了負擔。為給用戶提供有好界面，在行動電話的SIM卡上安裝一個應用程式，以便可以在行動電話上提供菜單控制的方式。以Java SIM卡為例，只需要利用Java SIM卡開發工具開發出一個應用程式，該程序在行動電話上顯示一個網絡家電控制菜單，同時，接收用戶的菜單命令，把它轉化成相CIEA和日本CLEA出生率＝母鼠數與交配的親代小鼠數之比的％。同胞均數＝同胞總數與分娩的母鼠數之比。斷奶比率＝斷奶的同胞數與同胞總數之比。生殖係數＝斷奶的同胞數與交配的親代小鼠數之比。
表C

表B和C列出的數據結合於下表D內。
表D


實施例7Tg PVR21因為只有靈長類對脊髓灰質炎病毒易感，已經在猴神經毒力實驗(MNVT)中用傳統方法測定了口服脊髓灰質炎病毒疫苗(OPV)的神經毒力安全性和一致性。開發攜帶人脊髓灰質炎病毒受體(PVR)基因的轉基因(Tg)小鼠後，評估了這些小鼠用於取代OPV實驗中猴的適合性。檢驗了兩個系的Tg小鼠，TgPVR1和TgPVR21。在其中進行脊髓接種的TgPVR21小鼠在辨別那些已經通過和未通過所述猴神經毒力實驗的成批的3型和2型OPV上和猴子一樣敏感。用聚合酶鏈式反應的新的分子分析和限制酶切割結果顯示，每批OPV包含病毒基因組中很少量的神經毒性回復體(revertant)。所有未通過猴神經毒力實驗的比通過此實驗的3型OPV有更高百分比的472-C回復體。分析多批3型OPV也顯示在472-C回復體的含量和TgPVR21小鼠實驗的結果之間有好的相關性。大量數據總結表明所述TgPVR21小鼠模型適合評估3型和2型OPV。現正在考慮用TgPVR小鼠試驗檢測1型OPV，三個Sabin品系中的最穩定的一個，的神經毒力的必要性。
只有靈長類對脊髓灰質炎病毒的所有三個血清型易感，所以已經在神經毒力實驗(MNVT)(1)中檢驗了所述口服脊髓灰質炎病毒疫苗(OPV)的安全性及其一致性。每批三價的疫苗用大約100隻猴。在數個國家進行兩次MNVT，一次是由生產者進行，另一次是由國家控制機關進行。除了高成本之外，得自野外的猴通常得自可能將外來疾病傳遞給人。我們描述了替代動物系統的狀態-轉基因小鼠對脊髓灰質炎病毒易感。
兩組科學家通過將編碼脊髓灰質炎病毒的細胞受體的人類基因引入小鼠基因組來衍生攜帶人類脊髓灰質炎病毒受體(TgPVR)的轉基因小鼠(Ren等，Cell63353-362，1990；Koike等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88951-955，1991)。與對猴的觀察類似，當TgPVR小鼠感染了脊髓灰質炎病毒時，它發作了弛緩性麻痺，之後一些小鼠死亡，並且在中樞神經系統有組織學損傷。所述TgPVR小鼠已經廣泛用於研究試驗誘導的脊髓灰質炎的病因和脊髓灰質炎病毒減毒的多種方面(Ren等，Cell63353-362，1990；Koike等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88951-955，1991；Ren etal.，J.Virol.651377-1382，1991；Ren等，J.Virol.66」296-304，1992；Racaniello等，Develop.Biol.Stand.78109-116，1993；Koike等，Develop.Biol.Stand78101-107.1993；Horie等，J.Virol.68681-688，1994；Koike等，Arch.Virol.139351-362，1994)。在1992，世界衛生組織(WHO)推薦用有不同程度神經毒力的3型脊髓灰質炎病毒品系(世界衛生組織，Bull.W.H.O..21233-237，1992)來比較TgPVR小鼠(Koike等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88951-955，1991)和猴的敏感性。美國食物和藥品管理局(FDA)對腦內接種的TgPVR1小鼠系進行的研究顯示，此小鼠系統能區分野生型Leon/37品系，Sabin 3疫苗品系和從糞便分離的疫苗病毒的基本上去減毒(de-attenuated)的克隆(Dragunsky等，Biologicals21233-237，1993)。然而，腦內接種的TgPVR1小鼠不能區分通過和沒通過MNVT的成批OPV。後來Horie等(Horie等，J.Virol.68681-688，1994)發現此小鼠系統不能辨別對於猴有相對低但不同水平的神經毒力的3型脊髓灰質炎病毒品系；成批OPV不包括在它們的研究中。因為TgPVR1小鼠系統不適合檢驗OPV，我們開始注意到其它小鼠系即TgPVR21。如在MNVT中一樣將病毒樣品接種到小鼠脊髓。在MNVT中決定疫苗通過/沒通過是基於對猴中樞神經系統的組織學損傷的評分(世界衛生組織，WHO Tech.Rep.Ser.800；Appendix 3，annex 1，1990)。通過比較，由於評估脊髓灰質炎的臨床症狀而使在TgPVR21小鼠檢測那些未通過MNVT的成批OPV的實驗成為可能。此令人鼓舞的結果導致了WHO在1993開始了合作研究(世界衛生組織，WHO/MIM/PVD/94.1世界衛生組織，Geneva，1993)。此研究的目的是評價TgPVR21小鼠替代猴用在MNVT中的合適性，該研究首先用於3型OPV。實驗動物中央研究所的研究者成功將TgPVR21小鼠從有限的研究工具開發成為大量可得並且限定質量標準的可靠動物來源(Hioki等，Exp.Anim.42300-303(日文)，1993)。在對人類病毒易感的轉基因小鼠的WHO備忘錄(memorandum)(世界衛生組織，Bull.W.H.O..71497-502，1993)中給出維護，保存(containment)，及運輸TgPVR小鼠的建議。所述接種步驟，臨床評分方法，和統計學分析的原理都被描述(Abe等，Virology2061075-1083，1995；Abe等，Virology210160-166，1995；Dragunsky等，Biologicals2477-86，1996)。在那些研究中用的病毒樣品首先在MNVT中試驗，然後利用FDA開發的非常靈敏的分子分析通過聚合酶鏈式反應和限制酶切割檢查在病毒基因組的神經毒性回復體豐度(Chumakoc等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88199-203，1991)。後一種方法在每批單價的3型OPV中檢測位置472(U→C)處很少量的回覆體並檢測位置249(C→U)處較多量的回覆體。在3型OPV的所述472-C回復突變(reversion)已經被記載為提高MNVT中的神經毒力的關鍵促進物。未通過成批MNVT的疫苗包含＞1％的這些回復體。發現在1型和2型OPV批號也有與3型OPV的位置472處的回覆突變(Back-mutation)，但它們對神經毒力的促進作用不那麼強(Rezapkin等，Virology202370-378，1994；Taffs等，Virology209366-373，1995)。在所述1型和2型Sabin病毒的基因組中可能有其它導致神經毒力的突變。
為確定TgPVR21小鼠是否能檢測未通過成批MNVT的3型疫苗，所述WHO研究包括對一個包含3％的472-C回復體的一批疫苗和包含0.5％的472-C回復體的參照疫苗WHO/III進行比較。來自所有參與實驗室的結果顯示，TgPVR21小鼠清楚辨別了所述兩種疫苗(Wood，D.J.，Vaccine(印刷中)，1996)。當用出現感染的臨床症狀的天數(即未通過時間(failure time))和臨床評分作為標準時，會辨別得更好。50％的麻痺劑量和50％的致死劑量不太令人滿意。大部分未通過MNVT的所述3型OPV製品包含＜3％的472-C回復體，其中大多數含＜2％。為簡便起見，後一種疫苗被稱為「邊緣的(marginal)」。在FDA一同檢驗了三支邊緣疫苗(1.3，1.4和1.7％)以及WHO/III和NC-2(分別0.5和0.8％的472-C回復體)(Dragunsky等，Biologicals2477-86，1996)。所有三批邊緣疫苗均未通過所述小鼠實驗，它們有高概率值的兩個神經毒力的主要指示物，即臨床評分和未通過時間。發現另一批只包含1.4％的472-C回復體的疫苗通過了MNVT卻未通過所述小鼠實驗，這可能表明所述小鼠實驗比MNVT有更高的敏感性。
一個有趣的問題是疫苗或試驗樣品中2493-U回復體的含量和其在猴和TgPVR21小鼠中的神經毒力之間的關係。報導這些回復體在猴的神經毒力中的作用是互相矛盾的(Tatem等，J.Virol.663194-3197，1992；Chumakov等，J.Virol.66966-970，1992)。第一篇報導認為此位置的回覆突變在提高猴的神經毒力中最重要，而第二篇文獻的發現卻認為相反。此位置的突變比在位置472的那些出現得更快。因此，472-C的百分比有些增加的成批疫苗通常2493-U含量很高，最多達100％。一些生產者生產的疫苗衍生自所述Sabine 3的克隆，該克隆有100％的2493-U回復體並且472-C的含量很低(0.3％)。無數據顯示這些疫苗對人類的安全性低於2493-U回復體含量低的疫苗。其中之一，在MNVT中與WHO/III和NC-2參照物比較的參照疫苗F313不比所述兩種疫苗毒力更強(16，Dragunsky等，Biologicals2477-86，1996)。然而，在TgPVR21小鼠，F313比WHO/III和NC-2的神經毒力水平都高(Dragunsky等，Biologicals2477-86，1996)。確定是否TgPVR21小鼠實驗能辨別F313及其472-C回復體含量提高的衍生物變得必要，因為所述衍生物會模擬「不好的」疫苗。因此，相對於親本F313疫苗在小鼠中檢驗，來自F313疫苗的並且包含1.8和2.4％的472-C的兩份試驗傳代樣品。所述TgPVR21小鼠實驗區分這些樣品(Dragunsky等，Biologicals2477-86，1996)。Abe等(Abe等，Virology210160-166，1995)接種的TgPVR21小鼠和WHO/III和F313參照物，並將它們與在38℃生長的兩份F313-衍生的製備物進行比較。他們觀察了所述MNVT和小鼠實驗結果的緊密相關性。不幸的是，該兩種在38℃生長的病毒製備物並不被認為與不好的疫苗類似，因為它們包含78％和94％的472-C回復體，並使減毒的體外溫度敏感性標記物從rct40-改變到rct40+。這表明在生產條件下在疫苗中可出現較高的神經毒力。根據OPV生產的需要(世界衛生組織，WHO Tech.Rep.Ser.80046-49，1990)，疫苗病毒在細胞培養中的生長必須不能超過35.5±0.5℃。較高溫度使更多神經毒性病毒顆粒選擇性生長。
在TgPVR21小鼠的OPV-3研究中，所有試驗中辨別最好的病毒劑量是3.5和4.5log1050％組織培養感染劑量(TCID50)。據發現，可靠地辨別邊緣疫苗也能只用這兩種劑量來實現，但用每個劑量接種的小鼠數增加。除了每組的小鼠數要足夠外，其它因素對成功也很重要；MNVT的接種體(inocula)的病毒含量的1.0log10TCID50不同並不重要(Contrearas等，J.Biol.Stand.16195-205，1988)。通過比較，小鼠實驗中較強的劑量依賴性和所述接種體的較小體積(0.5μl)是所述小鼠和猴實驗之間差異最可能的原因。為達到必要的精密度並使實驗室間的結果協調，推薦遵守WHO指南描述的滴定分析方法(世界衛生組織，Document WHO/BLG/95.1，Chap.9，p.67-74，世界衛生組織，Geneva，1995)。
在FDA用2型OPV進行的試驗中(Dragunsky等，Biologicals2477-86，1996)，用三種通過MNVT的成批疫苗和兩種未通過MNVT的成批疫苗，和2型參照疫苗WHO/II接種TgPVR21小鼠。另外，三種試驗樣品來自「好的」成批疫苗。一種樣品通過MNVT並且兩種未通過MNVT。此結果表明MNVT和TgPVR21小鼠實驗的相關性良好。
因為沒有1型OPV批號反覆未通過MNVT，FDA使用一個成批疫苗和有一次未通過MNVT試驗但在重複實驗中通過的實驗傳代製備物(Dragunsky等，Biologicals2477-86，1996)。用所述成批疫苗和未其傳代樣品接種TgPVR21小鼠的脊髓不能辨別這兩種製備物和美國參照疫苗。此陰性結果更可能由於1型OPV的獨特性。首先，所述Sabin 1品系是三種血清型中最穩定的一種，並且可能在小鼠試驗中無「不好的」1型成批OPV。有時，所述1型疫苗批號未通過MNVT，但在重複實驗時，它會通過(Marsden等，J.Biol.Stand.8303-309，1980；Lovenbook，I.，未公布數據)。一些專家甚至質疑所述1型OPV的對猴試驗的必要性。Abe等(16)通過使所述病毒在38℃生長獲得了1型OPV樣品。這些製備物未通過MNVT和TgPVR21小鼠實驗，並且所述rct40標記物從陰性變為陽性，這再次表明，如它們在用3型所進行的工作一樣(Abe等，Virology210160-166，1995)，所述樣品比對任何不好的疫苗所期望的神經毒力要高。對於這些製備物，MNVT和TgPVR21小鼠實驗之間有相關性的事實支持了一種觀點，那就是1型OPV未通過TgPVR21小鼠實驗可能不是由於所述小鼠模型不適合，而是因為所述Sabin 1品系在生產條件下生長的穩定性。
在過去數年積累的數據的大體上的總結表明脊髓(spinal core)接種的TgPVR21小鼠提供了評估3型和2型OPV的神經毒力的合適模型。此小鼠模型可被認為是猴的可能替代物。此1型OPV的小鼠實驗的實用性仍在研究中。已建立的TgPVR小鼠生產，它們無病原體健康狀況，和相對猴的較低開支使它們對於OPV的神經毒力實驗更有吸引力。
實施例8Tg cHa-ras用轉基因(Tg)小鼠人類原型c-HRAS基因，即BALB/cByJ×C57BL/6JF1-TgN(HRAS)2或CB6F1-HRAS2小鼠進行快速致癌性實驗。進行此研究的第一個步驟是評估CB6F1-HRAS2小鼠作為快速致癌性實驗系統的模型。多種基因毒性致癌物的短期實驗結果顯示CB6F1-HRAS2小鼠對這些致癌物比對照非-Tg小鼠更易感。根據第一個步驟的評估研究，在用多種基因毒性致癌物處理後，預期CB6F1-HRAS2小鼠與對照非-Tg小鼠相比更可能以更高的發病率更快發生更惡性的腫瘤。所述CB6F1-HRAS2小鼠看起來是作為開發快速致癌性實驗系統的動物模型的有希望的侯選物。
儘管通過基礎和臨床醫學的途徑以及公共健康的途徑，已經作了持續的努力來攻克癌症，癌症在很多國家仍為頭號致死原因。很多人類癌症被認為是由接觸環境化學致癌物造成的。為降低此風險，已經作了大量努力來鑑定並去除致癌物。用試驗動物的流行病學研究和致癌實驗被用來鑑定人致癌物。儘管流行病學研究十分有希望的並且可能是唯一確認人類致癌物的方法，該途徑還是極為回顧性的，所以只有在出現了很多犧牲品後才能鑑定出致癌物。
當一個人在開發過程中評估藥物安全性並且當其在鑑定環境致癌物時，致癌性實驗必不可少。現在使用試驗動物的致癌性實驗不總是和人類風險評估有關；通常用小鼠和大鼠是因為它們的壽命短並且體積小。因為嚙齒類致癌性實驗延續＞2年並需要大量的動物，所以動物實驗需要大的空間，大量實驗室技術員和巨額開支。當在致癌性實驗中獲得了陽性結果時，人們通常不會意識到開發新藥物中已經浪費的時間，努力和開支。另外我們的環境中還有很多化學品沒有被試驗過，而每年卻合成了數千種新的化學品。很明顯需改進鑑定致癌物的過程從而能評估更多化學品。所以，開發能在短的階段評估致癌性的快速致癌性實驗系統對提高開發新藥物並鑑定環境致癌物的有效性是必要的。
為開發快速致癌性實驗系統，對致癌物易感的動物是必不可少的。預計有原癌基因的轉基因(Tg)動物和/或缺少腫瘤抑制基因的動物會比正常動物對多種致癌物更易感，因為致癌作用是由易感細胞中的遺傳和外遺傳(epigenetic)損害作用的多階段過程，所述細胞獲得選擇性生長優勢，並經過克隆擴增，其可能是活化原癌基因和/或滅活腫瘤抑制基因的結果。
所述ras家族基因參與調控細胞增殖，並被多種人類腫瘤(Lowy等，Annu.Rev.Biochem.62851-891，1993；Bos，J.L.，Cancer Res.494682-4689，1989；Anderson等，Environ.Health Perspect9813-24，1992)及試驗動物模型(Anderson等，Environ.Health Perspect9813-24，1992；Guerrero等，Mutat.Res.185293-308，1987)的體細胞點突變活化。通過點突變活化ras家族基因見於約30％的人類腫瘤。因此，攜帶人類c-HRAS基因的Tg小鼠可以是快速致癌性實驗動物模型的候選物。
合作評估攜帶人c-HRAS基因的Tg小鼠作為快速致癌性實驗動物模型的可用性和局限性的研究正在我們研究所，幾個日本製藥公司和美國國家環境衛生研究中心(National Institute of Environmental Health Sciences)(NIEHS)(Drs.R.R.Maronpot和R.W.Tennant)開展。為評估Tg小鼠的可用性和局限性，用於大規模生產並提供遺傳和微生物學上限定的Tg小鼠的系統是必不可少的。在綜述中，我們介紹了我們現在的評估研究和2年的生物分析結果，我們的研究是通過調查攜帶所述c-HRAS基因的Tg小鼠對多種致癌物的致癌物反應(corcinogenic response)，並將所述反應與對照非轉基因(non-Tg)小鼠比較進行的。
攜帶所述人類原型c-HRAS基因的Tg小鼠的特徵所述攜帶人類原型c-HRAS基因的Tg小鼠最初由Katsuki和其同事在實驗動物中央研究所(CIEA)建立(Saitoh等，Oncogene51195-1200，1990)；所述小鼠攜帶此基因及該基因自己的啟動子區域，所述基因編碼了不能轉化NIH3T3細胞(Saitoh等，Oncogene51195-1200，1990)的原型c-HRAS基因產物(即，p21)。人c-HRAS基因的五或六個拷貝以串聯排列整合到每隻Tg小鼠的基因組中(Saitoh等，Oncogene51195-1200，1990)。轉基因在腫瘤和正常組織表達，並且Tg小鼠中用免疫印跡分析檢測的p21總量比非-Tg小鼠高兩到三倍(Saitoh等，Oncogene51195-1200，1990)。沒有在Tg小鼠的正常組織未檢測到所述轉基因的突變(Saitoh等，Oncogene51195-1200，1990)。約50％的rasH2小鼠(C57BL/6×BALB/cF2)在出生後18個月內患自發腫瘤(Saitoh等，Oncogene51195-1200，1990)。約60％的患有腫瘤的小鼠患血管肉瘤(angiosarcoma)(Saitoh等，Oncogene51195-1200，1990)。肺腺癌，皮膚乳頭狀瘤，哈氏腺腺癌(Harderian gland adenocarcinoma)，和淋巴瘤也見於18月齡，但發病率低很多(Saitoh等，Oncogene51195-1200，1990)。然而，腫瘤和癌前病變(preneoplastic lesion)在6月齡的rasH2小鼠的F2轉基因後代都未觀察到(Saitoh等，Oncogene51195-1200，1990)。
用於此研究中的CB6F1-HRAS2小鼠的遺傳背景是轉基因雄性C57BL/6J和雌性BALB/cByJ小鼠的F1。通過使rasH2小鼠與C57BL/6J小鼠回交八倍以上建立轉基因雄性C57BL/J6小鼠是。攜帶所述轉基因的C57BL/6J雄性與BALB/cByJ雌性小鼠雜交。對所述F1後代進行聚合酶鏈式反應或Southern印跡分析篩選存在的人類原型c-HRAS基因。攜帶所述人c-HRAS基因的F1小鼠，即在CIEA生產的BALB/cByJ×C57BL/6JF1-TgN(HRAS)2(CB6F1-HRAS2)小鼠，在7-9周齡時被用於致癌性實驗。在同窩幼鼠中，用不攜帶所述人c-HRAS基因的小鼠(CB6F1)作為非-Tg對照。因為本研究中需要大量標準化實驗動物形式的的CB6F1-HRAS2小鼠，所以實用型開發是必需的。此開發所用的概念和系統由Nomura本期(issue)的第一綜述中詳述。
雄性和雌性CB6F1-HRAS2小鼠的體重是相應非-Tg小鼠的80-90％。對於所試驗的器官(腦，甲狀腺，心，肺，肝，脾，腎，腎上腺，睪丸和卵巢)，所述Tg小鼠與非-Tg小鼠的器官與體重的比率相似。Tg和非-Tg小鼠的血液生物化學和血液學數據沒有顯著性差別。雄性和雌性CB6F1-HRAS2小鼠在77周齡的存活率分別是53％和32％。約50％的CB6F1-HRAS2小鼠死於血管肉瘤，約20％的死亡動物患有肺腺癌和/或肺腺瘤，這與之前rasH2小鼠的結果一致(Saitoh等，Oncogene51195-1200，1990)。此研究中對於CB6F1-HRAS2小鼠在6個月的致癌性試驗中只觀察到有一些自發的肺腺瘤卻無其它自發的腫瘤，所述實驗最遲在35周齡時終止(CB6F1-HRAS2小鼠在35周齡的存活率為≥95％)。自發的腫瘤在CB6F1-HRAS2小鼠中的低發病率使我們用此小鼠作為快速致癌性實驗的工具。
快速致癌性實驗我們研究所和幾個日本製藥公司已經做了這些快速致癌性實驗的研究(表1)。
表1.在日本用CB6F1-HRAS2小鼠進行的快速致癌性實驗結果

4NQO＝4-硝基喹啉(Nitroquinoline)-1-氧化物；MNNG＝N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(nitrosoguanidine)；MNU＝N-甲基-N′-硝基脲；DEN＝N-甲基-N′-硝基脲；MAM＝甲基氧化偶氮甲醇(methylazoxymethanol)；4HAQO＝4-羥基氨基喹啉(Hydroxyaminoquinoline)-1-氧化物。
1日本國立藥品食品衛生研究所(National Institute of Health Sciences)(NIHS)。2YamanouchiPharmaceutical Co.，Ltd。3Chugai Pharamceutical Co.，Ltd。4Sankyo Co.，Ltd。5CIEA。6美-日共同研究。
a對比文獻9；b未公布數據；c統計學上無顯著性。
4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)是水溶性基因毒性致癌物，已知它在小鼠中誘導皮膚(Nakahara等，Gann48129-136，1957)和口腔(Hawkins等，HeadNeck16424-432，1994)的鱗狀細胞(squamous cell)癌，和肺腫瘤(Inayama，Y.，Jpn.J.Cancer Res.77345-350，1986)。約90％的4NQO-處理的CB6F1-HRAS2小鼠(雄性和雌性)在單次皮下(s.c.)注射15mg的4NQO/kg體重後16周出現皮膚乳頭狀瘤(Yamamoto等，Carcinogenesis172455-2461，1996)。只在4NQO-處理的CB6F1-HRAS2小鼠而不是對照非-Tg小鼠觀察到皮膚的鱗狀細胞癌。在4NQO-處理的非-Tg小鼠和載體-處理的動物未觀察到皮膚腫瘤。4NQO也誘導肺腫瘤。只在4NQO-處理的CB6F1-HRAS2小鼠而不是相應的非-Tg小鼠觀察到肺腺癌(Yamamoto等，Carcinogenesis172455-2461，1996)。在4NQO-處理的CB6F1-HRAS2小鼠中肺腺瘤的發病率也比相應的非-Tg小鼠中的發病率更高(Yamamoto等，Carcinogenesis172455-2461，1996)。環磷醯胺是抗腫瘤藥，它在嚙齒類和人類致癌(國際癌症研究組織(International Agency for Research on Cancer))，IARCvol 26，p165-202，Lyon，France，1981)。主要的靶器官是膀胱，肺，乳腺，和淋巴系統(國際癌症研究組織，IARCvol 26，p165-202，Lyon，France，1981)。一周兩次慢性口服給藥10或30mg的環磷醯胺/kg持續25周來誘導CB6F1-HRAS2和非-Tg小鼠的肺腫瘤(Yamamoto等，Carcinogenesis172455-2461，1996)。只在一隻環磷醯胺-處理的雄性CB6F1-HRAS2小鼠而不是相應的非-Tg小鼠或載體-處理的動物中觀察到腺癌。環磷醯胺-處理的CB6F1-HRAS2小鼠和相應的非-Tg小鼠的肺腺瘤發病率無顯著不同。在其它器官如膀胱，乳腺，和淋巴系統觀察不到腫瘤(Yamamoto等，Carcinogenesis172455-2461，1996)。
N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)是烷化劑，並且在多種動物包括小鼠中致癌(國際癌症研究組織，IARCvol 4，p183-195，Lyon，France，1974)。前胃和食管(esophagus)是口服給藥MNNG後的靶器官(國際癌症研究組織，IARCvol 4，p183-195，Lyon，France，1974)。單次口服給藥2.5mg MNNG/每隻小鼠在100％的雄性和雌性CB6F1-HRAS2小鼠誘導前胃乳頭狀瘤，而只有11％的雌性和0％的雄性非-Tg小鼠在用MNNG處理後13周出現乳頭狀瘤(Yamamoto等，Carcinogenesis172455-2461，1996)。甚至在MNNG給藥後26周，只在MNNG-處理的CB6F1-HRAS2小鼠而未在相應的非-Tg小鼠觀察到鱗狀細胞癌(Yamamoto等，Carcinogenesis172455-2461，1996)。
N-甲基-N-硝基脲(MNU)在多種動物致癌，並且在多個位置如皮膚，前胃，淋巴系統和肺誘導腫瘤(國際癌症研究組織，IARCvol 17，p117-255，Lyon，France，1978)。以劑量75mg/kg一次或以劑量為15mg/kg、五次(每天一次連續5天)腹腔內注射MNU，從在CB6F1-HRAS2小鼠誘導多種腫瘤(Yamamoto等，Carcinogenesis172455-2461，1996)。與相應的非-Tg小鼠相比，CB6F1-HRAS2小鼠在MNU處理後可見皮膚乳頭狀瘤的發病率明顯變高(Yamamoto等，Carcinogenesis172455-2461，1996)。在至少14周的觀察中，MNU以高發病率誘導CB6F1-HRAS2小鼠的皮膚乳頭狀瘤，但不誘導非-Tg小鼠的皮膚乳頭狀瘤和增生。所述MNU-處理的CB6F1-HRAS2小鼠也以高發病率患前胃乳頭狀瘤，而MNU-處理的非-Tg小鼠不出現乳頭狀瘤(Yamamoto等，Carcinogenesis172455-2461，1996)。只在MNU-處理的CB6F1-HRAS2小鼠而不是非-Tg小鼠見到前胃鱗狀細胞癌。Ando等(Ando，等，Cancer Res.52978-982，1992)報導單次腹腔內注射MNU後，與相應的非-Tg小鼠相比，rasH2小鼠的前胃和皮膚乳頭狀瘤的發病率更高。與相應的非-Tg小鼠的反應相比(Yamamoto等，Carcinogenesis172455-2461，1996)，在用75mg的MNU/kg處理一次的雄性CB6F1-HRAS2小鼠中，淋巴瘤的發病率更高。
N，N-二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine)(DEN)在多個動物種類中致癌(國際癌症研究組織，IARCvol 17，p83-124，Lyon，France，1978)。DEN的主要靶器官是肝，肺和前胃(國際癌症研究組織，IARCvol 17，p 83-124，Lyon，France，1978)。早在DEN給藥3個月，單次腹腔內注射90mg的DEN/kg僅在CB6F1-HRAS2小鼠造成前胃鱗狀細胞癌和肺腺癌(Yamamoto等，Carcinogenesis172455-2461，1996)。DEN給藥後六個月，在CB6F1-HRAS2小鼠兩種惡性腫瘤的發病率顯著增加(Yamamoto等，Carcinogenesis172455-2461，1996)。在6個月的觀察過程中，在DEN-處理的非-Tg小鼠中從未觀察到這些腫瘤。在DEN給藥後3個月，CB6F1-HRAS2小鼠的肺腺瘤發病率與非-Tg小鼠的發病率類似。對應於在CB6F1-HRAS2小鼠中肺腺癌發病率的增加(Yamamoto等，Carcinogenesis172455-2461，1996)，DEN給藥後六個月時，非-Tg小鼠腺瘤發病率明顯比CB6F1-HRAS2小鼠更高。
乙烯氨基甲酸酯是氨基甲酸乙酯的代謝物，已知它誘導肺和肝腫瘤(neoplasm)(Massey等，Carcinogenesis161065-1069，1996；Maronpot等，Toxicology101125-156，1995)。在給藥致癌物後16周，單次腹腔內注射60mg的乙烯氨基甲酸酯/kg在100％和50％的CB6F1-HRAS2小鼠中分別誘導肺腺瘤和腺癌(Maronpot等，製備手稿)。儘管非-Tg小鼠也以＞90％的發病率患肺腺瘤，其腫瘤增殖比相應的CB6F1-HRAS2小鼠低。非-Tg小鼠的肺腺癌發病率比CB6F1-HRAS2小鼠低很多。後者約90％患有脾血管肉瘤，但非-Tg小鼠不患有脾血管肉瘤。
甲基氧化偶氮甲醇(MAM)在嚙齒類中致癌，並且誘導結腸腫瘤(Reddy等，J.Natl.Cancer Inst.711181-1187，1984；Deschner等，J.Cancer Res.Clin.Oncol.115335-339，1989)，肺腫瘤(Reddy等，J.Natl.Cancer Inst.711181-1187，1984)，和肛周鱗狀細胞癌(Kumagai等，Gann73358-364，1982)。首次MAM給藥後24周，每周一次皮下注射20mg的MAM/kg持續6周使CB6F1-HRAS2小鼠但不使非-Tg小鼠(Yamamoto等，Carcinogenesis172455-2461，1996)出現皮膚乳頭狀瘤，結腸腺瘤樣息肉病(colon adenomatous polyps)，直腸鱗狀細胞癌，和胃乳頭狀瘤。皮膚乳頭狀瘤限於肛門和陰囊，與以前對不同品系的非-Tg小鼠的報導一致(Kumagai等，Gann73358-364，1982)。在用MAM處理的CB6F1-HRAS2和非-Tg小鼠中觀察到類似的肺腺瘤發病率。
在致癌物處理後至少26周內，單次靜脈內(i.v.)給藥基因毒性致癌物4-羥基氨基喹啉-1-氧化物(4HAQO，10或20mg/kg)在CB6F1-HRAS2小鼠中誘導前胃和皮膚乳頭狀瘤，但在非-Tg小鼠幾乎觀察不到這些腫瘤。儘管所述發病率低，只在Tg小鼠觀察到其它腫瘤(例如，白血病和胸腺瘤(thymoma))。4HAQO-處理的Tg和非-Tg小鼠在胰腺的外分泌部分(已知該處是此致癌物的靶組織)都不出現腫瘤(Rao等，Int.J.Pancreatol.21-10，1987)。這些快速致癌性實驗的結果見上表1總結，並且用於快速致癌性實驗的化學品列表見表2所示。
表2.快速致癌性實驗的化學品列表


黑體化學品＝已完成或現在正進行的快速致癌性實驗a參考文獻9；b美-日共同研究；c在CIEA進行或要進行的快速致癌性實驗在美國國家環境健康衛生研究中心的國家毒理學項目(NationalToxicology program)Environ.Health Perspect.101264-266，1993)中，已知沙門氏菌誘變分析-陰性致癌物乙烯硫脲在大鼠和小鼠誘導甲狀腺腫瘤。只有雌性小鼠用於致癌性實驗。餵食小鼠包含0.1或0.3％的乙烯硫脲持律28周。濃度0.1％的乙烯硫脲不在CB6F1-HRAS2小鼠或非-Tg小鼠誘導甲狀腺腫瘤，而0.3％的乙烯硫脲分別在26％和20％的Tg和非-Tg小鼠誘導甲狀腺腺瘤。甲狀腺腺癌的發病率也類似(Tg9％和非-Tg小鼠4％)，並且在Tg和非-Tg小鼠觀察不到明顯不同。
已知DEN(Ando，等，Cancer Res.52978-982，1992)和乙烯氨基甲酸酯(Maronpot等，Toxicology101125-156，1995)是肝腫瘤可能的誘導物。然而，用這些化合物處理的CB6F1-HRAS2小鼠和對照非-Tg小鼠不患肝腫瘤。已經報導多個遺傳位點控制了小鼠肝腫瘤(Gariboldi等，Cancer Res.53209-211，1993；Manenti等，Genomics23118-124，1994)。與C3H小鼠這一個對致肝癌作用非常易感的品系相比(Diwan等，Carcinogenesis7215-220，1986；Dragani等，Cancer Res.516299-6303，1991)，所述C57BL/6小鼠對化學誘導致肝癌作用的易感性相對低(Diwan等，Carcinogenesis7215-220，1986；Stanley等Carcinogenesis132427-2433，1992)。已知BALB/c小鼠對致肝癌作用十分抵抗，雌性C57BL/6和雄性BALB/c小鼠的F1雜種對致肝癌作用的敏感性低(Maronpot等，Toxicology101125-156，1995，Stanley等Carcinogenesis132427-2433，1992)。所以，雄性C57BL/6和雌性BALB/c小鼠的F1雜種，CB6F1小鼠很可能對致肝癌作用的易感性相對較低。通常在一些小鼠品系如C3H和B6C3F1的肝腫瘤中檢測到HRAS基因活化(Maronpot等，Toxicology101125-156，1995)。然而，在DEN或乙烯氨基甲酸酯誘導的B6CF1小鼠的肝腫瘤中HRAS突變的頻率很低(Maronpot等，Toxicology101125-156，1995)。所述HRAS的突變可能顯著導致對致肝癌作用高敏感性的小鼠品系而不是低敏感性品系中肝腫瘤的誘導(Maronpot等，Toxicology101125-156，1995)。
在CB6F1-HRAS2小鼠中能清楚觀察到皮膚乳頭狀瘤/鱗狀細胞癌，前胃乳頭狀瘤/鱗狀細胞癌和一些其它腫瘤類型的快速腫瘤反應，然而在不考慮致癌物類型的情況下，由環磷醯胺，MNU，DEN或MAM在CB6F1-HRAS2小鼠誘導的肺腺瘤的發病率和多樣性並不明顯高於用相應的致癌物在非-Tg小鼠中誘導的腫瘤的發病率和多樣性。接觸致癌物後多個小鼠品系的肺腫瘤發病率有明顯不同(Malkinson，A.M.，Toxicology54241-271，1989)。A/J(對肺癌發生易感)和C57BL/6J(對肺癌發生抵抗)的重組近交系的遺傳研究結果表明三個遺傳位點促進這些品系對肺腫瘤發生的易感性的不同(Malkinson等，J.Natl.Cancer Inst.75971-974，1985)。已經認為癌基因Ki-ras是這些易感性位點之一(You等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895804-5808，1992；Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA911589-1593，1994)，並且每個小鼠品系對肺腺瘤的易感性(例如，A/J是易感型的，BALB/c是中間型的，C57BL/6是抵抗型的)與Ki-ras基因的多態性相關良好(Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA911589-1593，1994)。此研究中所用的CB6F1小鼠可能有相對高的肺腺瘤易感性。另一方面，只有CB6F1-HRAS2小鼠患肺腺癌而非-Tg小鼠對多種致癌物反應時沒有或很少患肺腺癌，這表明CB6F1-HRAS2小鼠與對照的CB6F1小鼠相比有另外的能力來加快肺腺瘤的惡性進展。
這些導致表明在用多種基因毒性致癌物處理後，預期CB6F1-HRAS2小鼠比對照非-Tg小鼠更可能以更高的發病率更快發生更惡性的腫瘤。這些最初的評估研究顯示CB6F1-HRAS2小鼠似乎是開發快速致癌性實驗系統的動物模型的有希望的侯選物。
前景(Perspective)儘管誘變性(mutagenicity)是致癌性的主要機制決定因素，它對致癌性既不是足夠的也不是必要的。約三分之一的非誘變的化學化學品已經顯示是致癌性的，並且約三分之一的誘變化學品在2年的嚙齒類生物實驗中不致癌(Ashby等，Mutat.Res.257229-306，1992；Zeiger etal，Environ.Mol.Mutagen16(Suppl.18)1-14，1990)。已經提出在兩個齧齒種類中誘導腫瘤的化學品與只在一個種類中誘導腫瘤的化學品相比受到不同種類之間的遺傳變異性的影響較少(Tennant，R.W.，Mutat.Res.286111-118，1993)。所以種間的致癌物對人似乎比單個種的致癌物更有害。
對於種間的致癌物，我們要麼完成要麼已經啟動了15種沙門氏菌誘變分析-陽性致癌物(4NQO，環磷醯胺，MNNG，MNU，DEN，乙烯氨基甲酸酯，MAM，4HAQO，甲基苄肼，噻替哌，NNK，非那西丁，4，4』-二氨基二苯硫醚，4-乙烯基-1-環己烯雙環氧化合物，和2-甲氧基-5-甲基苯胺)以及六種沙門氏菌誘變分析-陰性致癌物(乙烯硫脲，1，4-二噁烷，丙烯酸乙酯，環孢黴素，糠醛，和苯酚的快速致癌性實驗(表2)。這些致癌物中，環磷醯胺，甲基苄肼，噻替哌，非那西丁，環孢黴素，和苯酚被分類為人致癌物(第1組)或在人可能致癌(第2A組)。我們計劃再進行至少兩種沙門氏菌-陽性種類間的致癌物(N-亞硝基苯胲胺和苯丙氨酸氮芥)和再一種沙門氏菌-陰性致癌物(二乙基己烯雌酚)的實驗(表2)。苯丙氨酸氮芥和二乙基己烯雌酚被分類為人致癌物。這些致癌物的6個月致癌性實驗可進一步評估此CB6F1-HRAS2小鼠是否可用作快速和準確鑑定基因毒性和/或非基因毒性致癌物的動物模型。
因為人類致癌物鑑定的假陽性錯誤會阻礙合適的藥物開發並可能造成社會不安，應儘可能地避免過分估計致癌性。因此，必須明確是否所述CB6F1-HRAS2小鼠對非致癌物的反應是陰性的。一種沙門氏菌誘變分析-陽性非致癌物(p-茴香胺)和一種沙門氏菌誘變分析-陰性非致癌物(間苯二酚)的快速致癌性實驗現在正在進行(表2)。其後，我們應對沙門氏菌-陽性和沙門氏菌-陰性非致癌物更關注。我們計劃在CIEA用至少四種沙門氏菌-陽性非致癌物(8-羥基喹啉，4-硝基-o-苯二胺，和2-氯甲基吡啶)和三種沙門氏菌-陰性非致癌物(魚藤酮，二甲苯，二硫代四乙基秋蘭姆)進行研究(表2)。上述化學品中的六種已經或將在日本和美國同時進行實驗(表3)。
表3.美國-日本共同研究用CB6F1-HRAS2小鼠做短期(26周)致癌性實驗


產業1＝Yamanouchi Pharmaceutical Co.，Ltd.產業2＝Kyowa HakkoKogyo Co.
在歐盟，美國和日本現有評估化學品致癌可能性的管理(regulatory)要求規定要在兩種嚙齒類進行長期嚙齒類致癌性研究。因為長期生物分析的開支大，使用大量動物，機制基礎缺乏和與人風險評估的相對低的相關性，人用藥品註冊技術要求國際協調會(International Conference on Harmonization ofTechnical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for HumanUse)(ICH)已經考慮用兩種嚙齒類的2年致癌性實驗的需要是否能夠降低而不危及人類的安全性。近來Tennant及其同事在NIEHS已經研究了使用p53-敲除小鼠或TG.AC小鼠(v-Ha-ras轉基因小鼠)作為鑑定致癌物的短期生物分析模型的可行性(validation)(Tennant等，Environ.Health Perspect.103942-950，1995)。因為已經積累了相當數量的顯示可能的可用性的數據，所以現在在多種轉基因動物中，p53-敲除小鼠，CB6F1-HRAS2小鼠和TG.AC小鼠似乎是鑑定化學致癌物的短期生物分析模型的最有希望的的侯選物。儘管還未完全評估用Tg小鼠的快速致癌性實驗系統的可用性和局限性，用Tg小鼠檢測可能致癌物是部分ICH指南的討論話題。現在將用一種嚙齒類，可能是大鼠進行2年的實驗，加上短期生物分析和機理性研究來取代用兩種嚙齒類的2年致癌性實驗。
實施例9rasH2小鼠中再現和可重複的致癌物反應

為確認rasH2小鼠模型在演出型水平具有再現和可重複的行為表現，在多個研究所檢查對一些致癌物的致癌物反應，並在研究所間比較患腫瘤的發病率。
材料和方法致癌物N-甲基-N-硝基脲(MNU)是烷化劑和基因毒性致癌物，它被用作陽性對照致癌物。用75mg/kg溶於檸檬酸鹽緩衝鹽水(pH4.5)的MNU以單次腹腔內注射給予陽性對照組中的小鼠。基於以前的劑量探索研究確定75mg/kg的劑量。
小鼠在1997年，使rasH2品系的核集群中的小鼠與C57BL/6回交並且回交代超過N14。本研究中使用了在1997-1999年中在實驗動物中央研究所(CIEA)產生的CB6F1-Tg-rasH2小鼠。
研究所將小鼠提供給11個不同的研究所(Sankyo，Tanabe，Eisai，Teikoku-Zoki，Daiichi，Shionogi，Dainippon，Mitsubishi，Fujisawa，Wyeth，andShinyaku)。每個研究所的所有工作作為ILSI，ACT項目(國際生命科學學會(International Life Science Institute)，致癌性實驗)由CIEA的Usui進行的取代實驗。
結果在MNU-處理的rasH2小鼠中，諸如前胃，皮膚和陰道的鱗狀細胞腫瘤，哈氏腺中的癌，肺的腺瘤，和惡性淋巴瘤的腫瘤發病率增加。在研究所間觀察到前胃腫瘤(圖25)和惡性淋巴瘤(圖26)發病率高而且一致。基於多個研究所得到的腫瘤特徵譜的定性和定量的一致的和強的陽性反應，判斷rasH2小鼠對作為陽性對照的MNU的致癌物反應的整體表現是足夠的(Usui，T.，等，Toxicologic Pathology 29(Suppl.)90-108，2001)。
所有本說明書通篇引用的參考文獻和其中所引用的參考文獻都引入作為參考。本發明已經參考具體實施方案進行了描述，本發明技術人員應該理解，只要不違背本發明的真實精神和範圍，可作多種改變和等價替換。另外，可作多種修改來適應具體條件，材料，物質組成，過程等等。所有此類修改都在附帶的權利要求書範圍內。
序列表110野村達次(Nomura，Tatsuji)120開發動物模型的方法130APGI.001A16013170FastSEQ for Windows Version 4.0210121130212DNA213人(Homo sapiens)4001ccgacctgtt ctggaggacg gtaacctcag 30210221125212DNA213人(Homo sapiens)4002accaggggct gcagccagcc ctatc 25210321126212DNA213人工序列220
223與pBKS II克隆載體同源的合成引物4003ggaaacagct atgaccatga ttacgc26210421130212DNA213人(Homo sapiens)4004gaccggagcc gagctcgggg ttgctcgagg30210521130212DNA213人(Homo sapiens)4005atctctggac ctgcctcttg gtcattacgg30210621130212DNA213鼠(Murine)4006gggtcctctg gagctggagt tacagactac30
210721129212DNA213小鼠(Mus musculus)4007gcttggctta agatacagca gctatcctg 29210821130212DNA213人(Homo sapiens)4008ccgacctgtt ctggaggacg gtaacctcag 30210921130212DNA213人(Homo sapiens)4009cacacgggaa gctggactct ggccatctcg 302101021130212DNA213人(Homo sapiens)40010aaaccctggc eagacctgga gttcaggagg 302101121130212DNA213人(Homo sapiens)40011aacctccccc tcccaaaggc tatggagagc 302101221130212DNA213人(Homo sapiens)40012tgcgcgtgtg gcctggcatg aggtatgtcg 302101321130212DNA213人(Homo sapiens)40013gtgctgggcc ctgacccctc cacgtctgtc 30
110健康及生物科學促進中心(CENTER FOR THE ADVANCEMENT OF HEALTH AND BIOSCIENCE)野村達次(NOMURA，Tatsuji)120開發動物模型的方法13039764-0001PCT140未指定的1412003-06-2315010/1796391512002-06-2416013170FastSEQ for Windows Version 4.0210121130212DNA213人(Homo sapiens)4001ccgacctgtt ctggaggacg gtaacctcag 30210221125212DNA213人(Homo sapiens)4002accaggggct gcagccagcc ctatc25210321126212DNA213人工引物220
223與pBKS II克隆載體同源的合成引物4003ggaaacagct atgaccatga ttacgc 26210421130212DNA213人(Homo sapiens)4004gaccggagcc gagctcgggg ttgctcgagg 30210521130212DNA213人(Homo sapiens)4005atctctggac ctgcctcttg gtcattacgg 30210621130212DNA213鼠(Murine)
4006gggtcctctg gagctggagt tacagactac30210721129212DNA213小鼠(Mus musculus)4007gcttggctta agatacagca gctatcctg 29210821130212DNA213人(Homo saDiens)4008ccgacctgtt ctggaggacg gtaacctcag30210921130212DNA213人(Homo sapiens)4009cacacgggaa gctggactct ggccatctcg302101021130212DNA213人(Homo sapiens)40010aaaccctggc cagacctgga gttcaggagg302101121130212DNA213人(Homo sapiens)40011aacctccccc tcccaaaggc tatggagagc302101221130212DNA213人(Homo sapiens)40012tgcgcgtgtg gcctggcatg aggtatgtcg302101321130212DNA213人(Homo sapiens)40013gtgctgggcc ctgacccctc cacgtctgtc30
權利要求
1.建立突變動物系的方法，其包含如下步驟(a)在性不成熟突變起始動物(G0)中誘導超數排卵；(b)使超數排卵的性不成熟突變起始動物受精；(c)通過完成妊娠過程得到第一代突變動物(F1)；(d)在第一代突變動物中確認突變的穩定性，基因型及遺傳背景的同一性；且如果需要，(e)用突變動物的一或多代後代重複步驟(a)-(d)，其中在每步驟中監視所有動物的遺傳和環境因素並嚴格保證其相同。
2.權利要求1的所述方法，其中所述受精通過自然交配進行。
3.權利要求1的所述方法，其中所述受精通過如下進行(b.1)使從超數排卵的未成熟突變起始動物獲得的卵母細胞體外受精；(b.2)將所述受精的卵母細胞體外培養到早期胚胎階段；並(b.3)將所述胚胎引入受體動物。
4.權利要求3的所述方法，其中在步驟(b.2)中的受精的卵母細胞被培養到兩細胞胚階段。
5.權利要求3的所述方法，其中所述早期胚胎在引入受體動物前被儲藏在胚胎庫。
6.權利要求5的所述方法，其中所述早期胚胎被儲藏在液氮溫度。
7.權利要求1的所述方法，其中所述突變動物是轉基因動物。
8.權利要求7的所述方法，其中所述轉基因動物是小鼠。
9.權利要求8的所述方法，其中所述轉基因起始動物在實現超數排卵時是3-4周齡。
10.權利要求8的所述方法，其中所述轉基因起始動物在實現超數排卵時是4周齡。
11.權利要求8的所述方法，其中所述超數排卵是通過懷孕的純血清促性腺激素(PMSG)和人類絨毛膜促性腺激素(hCG)來誘導的。
12.權利要求7的所述方法，其中步驟(d)中的基因型通過如下來確定(d1)對分離自轉基因和相應的非-轉基因動物的基因組DNA進行PCR反應，使用如下PCR引物(i)染色體特異性引物和轉基因特異性引物，其以相反方向結合到5′轉基因/基因組接點附近的染色體和轉基因，來確認所述5′轉基因/基因組接點；和(ii)兩種轉基因特異性引物，其以相反方向結合到5′末端附近的轉基因的片段來確認轉基因/轉基因接點，(d2)根據大小或信號不同分離擴增的PCR產物，並(d3)基於所述擴增的PCR產物的大小或信號類型來確定基因型，其中所述PCR產物的大小或信號類型表明整合的轉基因的拷貝數。
13.權利要求12的所述方法，其還包括在步驟(d1)中使用轉基因特異性引物和染色體特異性引物，其以相反方向，結合到3′轉基因/基因組接點附近的轉基因和基因組，來確認所述3′轉基因/基因組接點。
14.權利要求13的所述方法，其還包括在步驟(d1)中使用兩種染色體特異性引物，其以相反方向結合染色體/轉基因接點附近的染色體，來確認所述預整合位點。
15.權利要求12的所述方法，其中所述大小或信號類型通過Southern印跡來確定。
16.權利要求1的所述方法，其中所述每代突變動物接受有計劃的遺傳監視及抽查。
17.權利要求16的所述方法，其中所述遺傳監視包括監視遺傳背景中的一或多種基因。
18.權利要求17的所述方法，其中所述遺傳監視包括確保每代中突變動物的遺傳背景與起始動物的遺傳背景相同。
19.權利要求1的所述方法，其中所述每代突變動物接受對其環境因素的有計劃監視及抽查。
20.權利要求19的所述方法，其中所述環境因素包括發育環境和周圍環境的因素。
21.權利要求11的所述方法，其中在突變動物的後代的產生過程中，只包括只有具有與起始動物相同的基因型，表型和演出型的動物。
22.權利要求1的所述方法，其中對所述F1突變動物的背景品系的選擇根據所述品系對靶疾病的敏感性及生殖指數來進行。
23.權利要求22的所述方法，其中所述遺傳背景被拓寬以便使遺傳多樣性更廣泛。
24.權利要求22的所述方法，其中對所選擇的背景品系在構建靶疾病的模型中的有用性在最終選擇前要予以確認。
25.用權利要求1所述的方法產生的突變動物。
26.用權利要求1所述的方法產生的轉基因動物。
27.用權利要求12所述的方法產生的轉基因動物。
28.權利要求27所述的轉基因動物，其為小鼠。
29.權利要求28所述的轉基因小鼠，其為攜帶人c-Ha-ras轉基因的Tg-rasH2小鼠。
30.權利要求29所述的轉基因小鼠，其可用於毒理學和致癌性的實驗。
31.權利要求28所述的轉基因小鼠，其為攜帶人類脊髓灰質炎病毒受體(PVR)基因的TgPVR21小鼠。
32.權利要求31所述的轉基因小鼠，其可用於評估3型或2型口服脊髓灰質炎病毒疫苗(OPV)的神經毒力。
全文摘要
本發明涉及開發突變動物的方法，其包括基因改造和那些攜帶自發突變的動物，來作為人類疾病模型。本發明具體提供了完整的技術，包括嚴格的特化和質量控制，來開發在生物醫學研究和開發人類治療劑使用的、用作活體分析系統的動物模型。
文檔編號C12N15/09GK1678189SQ03820050
公開日2005年10月5日 申請日期2003年6月23日 優先權日2002年6月24日
發明者野村達次 申請人:健康及生物科學促進中心