蛭弧菌混合體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用的製作方法

2023-05-17 05:14:36

專利名稱：蛭弧菌混合體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及細菌的應用，特別涉及蛭弧菌蛭質體和遊泳體混 合菌液在消除蔬菜致病菌中的新應用。
背景技術：
近年來，全球食品安全惡性事件頻發，食源性疾病已成為影響 公共健康的重要問 題，往往是致人非正常死亡的主要原因。我國每年向衛生部上報的數千件食物中毒中，大部 分都是致病微生物引起的。蔬菜常汙染腸出血性大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃 色葡萄球菌等，而我國食品汙染物監測網數據顯示，蔬菜中沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌、 單核細胞增生李斯特氏菌3種常見食源性致病菌檢測陽性率逐年上升，是三種主要控制致 病菌。蔬菜富含各種維生素和膳食纖維，是人們日常生活必不可少的食品。近幾年，市面 上出現一種即食蔬菜，這種蔬菜產品不僅滿足了現代人快節奏工作需求，而且更迎合了市 民講究保健和方便休閒的心理。這種即食蔬菜原料可以採用除葉菜類的各種蔬菜，包括冬 筍、藕、土豆、香芹、胡蘿蔔等等。其加工生產流程主要是新鮮蔬菜_清洗_加工_真空包裝。生產過程中現有的清洗除菌方法主要通過酸液、鹼液、加熱除菌，即化學除菌和熱 殺菌。化學除菌極易導致化學殘留而對人體產生極大危害，而熱殺菌不僅破壞了蔬菜中的 維生素等營養物質，一些致病菌芽孢的強耐熱性還易造成殺菌不徹底，最終導致食物中毒 的發生。而一些生食蔬菜像生菜、蔥、番茄、黃瓜等由於人們經過簡單清洗後就直接食用，所 以同樣容易造成細菌性食物中毒。除此之外，由於一些化學殺菌劑的使用，像二氧化氯、次 氯酸、漂白粉、過氧化物等，使得排放的廢水、廢渣中含有大量的氯，對環境造成極大危害。噬菌蛭弧菌是一類專門以捕食細菌為生的寄生性細菌。其菌體大小比通常細菌還 小，為0. 2 0. 6X0. 8 1. 2微米，有類似細菌噬菌體的作用，但不是病毒，而是真正的細 菌，即具有一般細菌所有的各種特性。寄生和裂解細菌是蛭弧菌獨特的特性。也是它維持 自己生命活動最突出的功能。我們的最新研究表明，有的蛭弧菌菌株可以裂解包括大腸杆 菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等一些常見食源性致病菌。蛭弧菌生活史分兩個階段自由生活，能運動，不進行增殖的遊泳體階段和在特定 宿主細菌的周質空間內進行生長繁殖的蛭質體階段。蛭弧菌在遊泳體階段，識別並與宿主 發生不可逆結合，然後侵入宿主。蛭弧菌進入宿主菌細胞周質空間後，宿主細菌在30分鐘 內即停止呼吸作用，死亡；而蛭弧菌則分泌多種酶，通過降解宿主細胞的大分子成為單體， 然後攝入用於其生物大分子的合成。隨著細胞增殖和水解酶產生，使宿主細胞壁膜被破壞， 從而裂解釋放出蛭弧菌。而遊泳體和蛭質體的混合菌液可兼具遊泳體起效快，活力強和蛭 質體製備、保存容易，殺菌作用時間更久和環境耐受力更強的優點。已有的研究表明，作為一種有益微生物製劑，無論是在食品工業還是在(海洋) 水產養殖等領域，蛭弧菌的應用均是安全的。例如在國外，Lenz and Hespell (1978)研究發現，蛭弧菌及對動物及人的細胞不具侵染性[Lenz R. W. , Hespell R. B. Attempts to growbedelIovibrios micurgically-injected into animal cells.Archives ofMicrobiology, 1978,119 (3) =245-248] 在國內，林茂等(2006)研究了蛭弧菌對魚類細 胞的作用，發現它對魚類細菌沒有侵染作用[林茂，楊先樂，薛暉，曹海鵬，邱軍強。蛭弧菌 BDH2102對魚類細胞及病原菌的作用。微生物學通報，2006，33(1) :7_11]。因此，運用蛭弧菌混合菌液作為清洗除菌劑用於消除蔬菜攜帶菌落總數及致病菌 的這種生物方法就顯得既安全又方便。蛭弧菌作為一類具有裂解致病菌的特殊細菌，不僅 可應用即食蔬菜食用、加工前的殺菌處理，同時又避免了即食蔬菜烹調過程中由於菌量基 數過大、加熱殺菌不徹底造成的危害。而且不會導致細菌出現抗性，也無噬菌體療法中宿主 過於專一的缺點，在殺滅致病菌後就會因為飢餓而死亡，絕不會殘留，在保證食品安全的同 時也有效降低了耗能，起到保護環境的作用。因此蛭弧菌這種綠色除菌方法具有相當大的 優勢。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的弊端，提供蛭弧菌蛭質體和遊泳體混合菌液在 消除蔬菜清洗過程、加工設備及加工環境中致病菌的新應用，其特徵按照綠色無公害蔬菜 微生物標準，減少設備投資成本，提高即食蔬菜加工前的安全性，降低食源性致病菌食物中 毒的發生率。本發明的目的通過下述方案實現蛭弧菌混合體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用。所述蛭弧菌混合體菌液為蛭弧菌蛭質體菌液和遊泳體菌液混合。所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp. )BDFM05，於2009年8月7日保藏於中國 典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC NO =M 209172。所述蛭弧菌混合體菌液為蛭質體菌液與遊泳體菌液按細菌數1 1混合。所述蛭弧菌混合體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用方法為將蔬菜在蛭弧菌混 合體菌液中浸泡15-45min或者在蔬菜的加工環境中噴灑蛭弧菌混合體菌液，噴灑用量為 10 100mL/m2。所述蛭弧菌混合體菌液中混合體菌液濃度至少為IO1PfuAiL,優選IO1 106pfu/
mLo所述蛭弧菌混合體菌液的製備方法如下蛭弧菌蛭質體菌液按照以下方法製備得到接種宿主於營養肉湯液體培養基中， 在35°C和200rpm搖床培養12h，培養液經4°C，5000 8000rpm離心10 20min後，沉澱 加入至DNB液體培養基中，接入蛭弧菌BDFM05，在溫度25 35°C下，以150 300rpm搖 床培養36 48h，得到含蛭弧菌蛭質體和蛭弧菌遊泳體的培養液，培養液在4°C溫度下以 6000 8000rpm離心15 20min後，去除含蛭弧菌遊泳體的上清，得到的沉澱即為蛭弧菌 蛭質體；將蛭弧菌蛭質體用DNB液體培養基、水、生理鹽水或0. 2mol/L pH值為7. 2 7. 6 的磷酸鹽緩衝液懸浮，得到濃度為IO6 109pfU/mL的蛭弧菌蛭質體菌液；蛭弧菌遊泳體菌液按照以下方法製備得到將蛭弧菌蛭質體製備方法中的含蛭弧 菌遊泳體的上清經16000 18000rpm離心15 20min後，沉澱用DNB液體培養基、水、生理鹽水或0. 2mol/L pH值為7. 2 7. 6的磷酸鹽緩衝液懸浮，得到濃度為IO6 109pfu/mL 的蛭弧菌遊泳體菌液。將蛭弧菌蛭質體菌液和遊泳體菌液混合得蛭弧菌混合體菌液。蛭弧菌BDFM05是由野生型蛭弧菌BDS02經紫外誘變得到，蛭弧菌BDFM05進行負 染後於電子顯微鏡下進行形態觀察BDFM05呈單細胞，橢圓形，大小為1. 43 X 0.53 μ m，端 生鞭毛，鞭毛長度至少2 μ m ；所述蛭弧菌BDFM05以雙層平板法於28°C培養三天可形成直徑 2 3mm的透明圓形噬菌斑。本發明相對於現有技術，具有如下的優點及效果
1、本發明所述用蛭弧菌混合濃縮液來清洗新鮮蔬菜，對其攜帶菌落總數及致病菌 的消除效果顯著。如圖1-3所示，蛭弧菌混合菌液對致病菌的消除率可達99%以上。2、本發明所述蛭弧菌混合菌液在消除新鮮蔬菜中菌落總數及致病菌的應用中安 全性好。蛭弧菌混合菌液消除新鮮蔬菜攜帶致病菌的方法是生物的方法，蛭弧菌具有可侵 染、裂解宿主細菌的特性，使之適合作為抑止或清除蔬菜表面致病菌的生物淨化因子，且其 在裂解完宿主細菌後，會因飢餓而自動消亡，因此對人和動物無毒副作用。有效地減少或消 除化學除菌方法造成的化學殘留和加熱殺菌不完全造成的致病菌殘留，確保蔬菜的優質， 從根本上避免蔬菜類產品食物中毒事件的發生。提高了消費者食用蔬菜的安全係數，保護 了消費者的健康。3、本發明所述蛭弧菌混合菌液對新鮮蔬菜的除菌能夠最大程度的保護蔬菜的營 養價值。應用蛭弧菌混合菌液消除新鮮蔬菜攜帶的常見致病菌，避免了一些蔬菜必須高溫 殺菌而對蔬菜中熱敏性維生素等營養成分的破壞，對即食蔬菜的營養保值，具有很大優勢。4、本發明所述蛭弧菌混合體菌液對新鮮蔬菜的除菌方法能夠節約能源，簡化即食 蔬菜加工程序，提高經濟效益，保護環境。5、本發明還可延伸推廣應用於其它蔬菜產品和水果，特別有利於減少或消除化學 藥物如農藥的使用和殘留，確保蔬菜和水果的優質，對提高食用安全性，保障人類健康具 有十分重要的意義；同時為出口貿易保駕護航。6、所用蛭弧菌蛭質體和遊泳體的混合菌液作為消除食用、加工前蔬菜攜帶致病菌 的新方法，同時具備消除效果好，作用持久，耐受力強等優點。


圖1為蛭弧菌混合體液在蔬菜清洗中消除菌落總數時的消除率-蛭弧菌濃度圖。圖2為蛭弧菌混合體菌液在蔬菜清洗中消除其攜帶致病菌時的消除率-時間圖。圖3為加工設備及環境噴灑蛭弧菌混合體菌液時菌落總數殘留率_噴灑量圖。圖4為各常規殺菌劑在蔬菜清洗中消除其攜帶致病菌時各致病菌濃度平均值的 對數值-時間圖。圖5為蛭弧菌混合體菌液在蔬菜清洗中消除其攜帶大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella)、單增李斯特菌(Listeriamonocytohenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)時的致病菌濃度對數值-時間圖。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發明作進一步地詳細說明，但實施方式並不僅限於此。實施例1蛭弧菌蛭質體和遊泳體混合體菌液在番茄清洗時，對其攜帶菌落總數的消除。應用方法包括以下具體步驟及其條件步驟一蛭弧菌混合體菌液的製備蛭弧菌蛭質體的製備在裝有IOOmL N B(營養肉湯)液體培養基(蛋白腖10g，酵 母膏5g，蒸餾水lOOOmL，pH 7.2)的錐形瓶中接種嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila, 購於廣東省微生物所菌種保藏中心，編號GIM1. 172)，200rpm、28°C搖床培養18小時，培養 液分別於4°C、5000rpm離心15min，棄上清。分別將沉澱加入到裝有IOOmL DNB液體培養 基(營養肉湯0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg，溶於IOOOmL蒸餾水中，pH值 為7. 4)的錐形瓶中，再加入從雙層平板上挑取的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05的噬 菌斑。恆溫搖床250rpm、28°C培養36h。培養液分別於4°C 6000rpm離心20min，去除含蛭 弧菌遊泳體的上清，保留沉澱(即蛭弧菌蛭質體)，加入生理鹽水懸浮蛭弧菌蛭質體。製成 濃度為1012pfU/mL的蛭弧菌蛭質體濃縮液，待用；蛭弧菌遊泳體的製備將蛭弧菌蛭質體製備方法中的含蛭弧菌遊泳體的上清經 16000rpm離心20min後，得到的沉澱即是蛭弧菌遊泳體，加入DNB液體培養基(營養肉湯 0.8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg，溶於IOOOmL蒸餾水中，pH值為7.4)懸浮蛭 弧菌遊泳體。製成濃度為1012pfU/mL的蛭弧菌遊泳體濃縮液，待用；蛭弧菌遊泳體菌液和蛭弧菌蛭質體菌液按細菌數1 1混合。步驟二 蛭弧菌混合體菌液在消除蔬菜加工清洗時其攜帶菌落總數的應用實驗(1)致病菌的製備用普通營養肉湯培養基搖床培養，160rpm 28 °C培養12_16h增殖大腸杆 菌(Escherichia coli，購於廣東省微生物研究所，編號GIM1. 137)、鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium,購於廣東省微生物研究所，編號GIM1. 237)、單增李斯特菌 (Listeriamonocytohenes，購於廣東省微生物研究所，編號GIM1. 228)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus,購於廣東省微生物研究所，編號GIM1. 142)，培養液經6000rpm、 4°C離心20min，棄上清液，沉澱菌體用無菌pH7. 2的PBS(磷酸鹽緩衝溶液)懸浮，得到濃度 為109CfU/ml的原液，最後製備上述四種菌的混合液，每種菌的終濃度為105CfU/ml。(2)致病菌的消除取新鮮番茄，試驗設對照組和試驗組。對照組三個番茄，為三個平行樣，剩下番茄 為試驗組，每小組三個，為三個平行樣。所有對照組和試驗組的番茄先經75%酒精殺菌，後 浸泡到(1)中製備好的500mL混合體菌液中lmin，取出浙幹後，將試驗組的番茄直接浸漬 於lOipfu/mLUifpfu/mLUOSpfu/mLUifpfu/mL的500mL蛭弧菌混合體菌液中，每濃度均有 三個平行樣，對照組的番茄用清水(常規方法)浸泡，浸泡時間為30min。具體檢測方法是 從每組試樣中取出番茄放入無菌攪碎機中同時加入50mL的無菌蒸餾水攪碎，震蕩均勻後 取原液依次用無菌蒸餾水進行10倍體積稀釋後，取0. ImL塗布檢測。根據GB4789. 2-2010菌落總數用營養瓊脂培養基檢測。結果如圖1所示，單純的清洗是無法除菌的，只能依靠外加除菌劑的作用。而 30min後各種濃度蛭弧菌混合體菌液對菌落總數的消除率分別為94%、99. 99%,99. 99%, 99. 99%。因此，蛭弧菌濃度越高，消除效果越好。實施例2蛭弧菌混合體菌液應用於芹菜加工過程應用設備、加工環境的消毒殺菌。試驗包括以下具體步驟及其條件步驟一同實施例1的步驟一步驟二致病菌混合濃縮液消毒的應用實驗。(此例是什麼蔬菜？？加工什麼蔬 菜？？)對芹菜加工車間地面和牆體、運輸芹菜的傳送帶及芹菜清洗設備的表面，均勻噴 灑濃度為lOpfu/mL的蛭弧菌遊泳體與蛭質體按1 1混合的混合液，噴灑使用量則按試驗 組的不同分別為10mL/m2、30mL/m2、50mL/m2、70mL/m2、或100mL/m2，每天噴灑一次，連續噴灑 兩天，對照噴灑清水。具體檢測方法是用溼的無菌棉籤在加工設備表面或地面等上面擦塗 取樣，再用平板培養計數。檢測方法同例1。結果如圖2所示，在隨後的環境病菌檢測中，噴灑清水的對照組有各種致病菌檢 出，菌落總數的殘留率仍達78%。而在噴灑蛭弧菌混合體菌液的試驗組中，僅在噴灑量為 10mL/m2組中檢測到2 3cfu/mL的沙門氏菌，其他噴灑量的試驗組沒有檢測到常見致病 菌。本試驗研究的結果表明蛭弧菌混合體菌液在消除芹菜加工過程中致病菌方面的效果顯 著，可確保芹菜產品品質及安全。由此可見，蛭弧菌作為殺菌劑可以廣泛地推廣應用於芹菜 的清洗加工過程中。實施例3蛭弧菌混合體菌液在香芹清洗中的應用。蛭弧菌混合體菌液製備方法同例1。致病菌混合體菌液製備同例1，濃度為105cfu/mL。取新鮮芹菜，實驗分對照組和實驗組兩大系列，每組三個平行，每個平行一棵芹 菜。所有對照組和試驗組的鮮藕先經75%酒精殺菌，後浸泡到製備好的500mL混合菌液 中lmin，取出浙幹後，實驗組噴灑20mL10pfu/mL蛭弧菌液(混合體菌液？？)，對照組噴等 量清水，室溫放置40min，每隔IOmin取樣檢測一次，具體方法是取經無菌生理鹽水溼潤的 滅菌拭子(棉花籤)在香芹表面上均勻的塗抹4次後，置含無菌生理鹽水的無菌離心管 中振蕩、混勻，然後採用平板塗布方法檢測。具體是根據國標4789. 38-2008大腸桿菌用 VRB-MUG(中性紅-膽鹽培養基)培養基檢測、根據國標4789. 4-2010沙門氏菌用BS (亞硫 酸鉍瓊脂)培養基檢測、根據國標4789. 30-2010單增李斯特菌用李斯特氏菌顯色培養基檢 測、根據國標4789. 10-2010金黃色葡萄球菌用Baird-Parker瓊脂平板檢測。對照組菌數 為各致病菌總數平均值。檢測結果如圖3所示，噴灑清水的對照組，各種致病菌數基本不變，而噴灑BD的實 驗組中致病菌數均呈下降趨勢，各種致病菌的消除率均達99. 99%。實施例4 蛭弧菌混合體菌液與常規蔬菜殺菌劑殺菌效果比較
常規蔬菜殺菌劑有氯系殺菌劑(次氯酸鈉、漂白粉、漂粉精等)、電解酸性離子水、 二氧化氯、臭氧、過氧化物與氯氧化物混合。本例以新鮮小白菜為例，蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)採用BDFM05，蔬菜用75%酒 精殺菌後，先將新鮮蔬菜浸泡到製備好的500mL致病菌混合液中lmin，取出浙幹，將新鮮蔬 菜浸泡到各種殺菌劑及蛭弧菌混合體菌液中，40min。初始每隔Imin檢測一次，IOmin後， 每隔IOmin檢測一次。具體檢測方法同例3，蛭弧菌混合體菌液製備同例1，濃度為IOpfu/ mL。致病菌混合液製備方法同例1。濃度為105cfu/mL。常規殺菌劑殺菌圖中致病菌取各 致病菌數平均值。
結果如圖4-5所示。從圖4中可以看出常規殺菌劑起效快，一般2min內可基本 上殺滅病原菌。從圖5中可以看出單株蛭弧菌混合體菌液30min內可殺滅99%的致病菌， 40min時致病菌已檢測不到。蛭弧菌混合體菌液通過菌裂解消除致病菌需要一個過程，所 以起效慢，但是20min內可殺滅大70%的病原菌。蛭弧菌通過裂解消除致病菌屬於生物防 治，使用安全不會對環境造成汙染，也不會對蔬菜品質造成影響。相比常見殺菌劑更適合蔬 菜殺菌使用。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.蛭弧菌混合體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用，其特徵在於所述蛭弧菌混合體菌 液為蛭弧菌蛭質體菌液和遊泳體菌液混合。
2.根據權利要求1所述蛭弧菌混合體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用，其特徵在於 所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，於2009年8月7日保藏於中國典型培養 物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 209172。
3.根據權利要求1所述蛭弧菌混合體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用，其特徵在於 所述蛭弧菌混合體菌液為蛭質體菌液與遊泳體菌液按細菌數11混合。
4.根據權利要求1所述蛭弧菌混合體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用，其特徵在於 所述蛭弧菌混合體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用是將蔬菜在蛭弧菌混合體菌液中浸泡 15-45min。
5.根據權利要求1所述蛭弧菌混合體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用，其特徵在於 所述蛭弧菌混合體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用是在蔬菜的加工環境中噴灑蛭弧菌混 合體菌液，噴灑用量為10 100mL/m2。
6.根據權利要求4或5所述蛭弧菌混合體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用，其特徵在 於所述蛭弧菌混合體菌液中菌液濃度至少為lObfu/mL。
7.根據權利要求6所述蛭弧菌混合體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用，其特徵在於 所述蛭弧菌菌液濃度為IO1 106pfu/mL。
8.根據權利要求1所述蛭弧菌混合體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用，其特徵在於 所述蛭弧菌混合體菌液的製備方法如下所述蛭弧菌蛭質體菌液按照以下方法製備得到接種宿主於營養肉湯液體培養基中， 在35°C和200rpm搖床培養12h，培養液經4°C，5000 8000rpm離心10 20min後，沉澱 加入至DNB液體培養基中，接入蛭弧菌BDFM05，在溫度25 35°C下，以150 300rpm搖 床培養36 48h，得到含蛭弧菌蛭質體和蛭弧菌遊泳體的培養液，培養液在4°C溫度下以 6000 8000rpm離心15 20min後，去除含蛭弧菌遊泳體的上清，得到的沉澱即為蛭弧菌 蛭質體；將蛭弧菌蛭質體用DNB液體培養基、水、生理鹽水或0. 2mol/L pH值為7. 2 7. 6 的磷酸鹽緩衝液懸浮，得到濃度為IO6 109pfU/mL的蛭弧菌蛭質體菌液；所述蛭弧菌遊泳體菌液按照以下方法製備得到將蛭弧菌蛭質體製備方法中的含蛭弧 菌遊泳體的上清經16000 18000rpm離心15 20min後，沉澱用DNB液體培養基、水、生 理鹽水或0. 2mol/L pH值為7. 2 7. 6的磷酸鹽緩衝液懸浮，得到濃度為IO6 109pfu/mL 的蛭弧菌遊泳體菌液。將蛭弧菌蛭質體菌液和遊泳體菌液混合得蛭弧菌混合體菌液。
全文摘要
本發明公開了蛭弧菌混合體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用，應用方法為將蔬菜在蛭弧菌混合體菌液中浸泡或清洗瀝乾後向蔬菜噴灑蛭弧菌混合體菌液，在蔬菜的加工環境內噴灑蛭弧菌混合體菌液，噴灑用量為10～100mL/m2，蛭弧菌混合體菌液中混合體的濃度至少為101pfu/mL，優選101～106pfu/mL，應用中致病菌清除率均在99％以上，本發明適合推廣應用於所有蔬菜和水果。不僅可提高消費者食用即食蔬菜、水果的安全係數，保護消費者的健康，也為蔬菜的綠色加工生產提供保障。
文檔編號C12R1/01GK102038121SQ20101026852
公開日2011年5月4日 申請日期2010年8月31日 優先權日2010年8月31日
發明者李娜, 蔡俊鵬 申請人:華南理工大學