生物活性化合物的再生方法

2023-05-25 06:27:06 4

專利名稱：生物活性化合物的再生方法
技術領域：
本發明涉及一種對從蔬果材料獲得的生物活性化合物進行分離的方法。本發明同 樣涉及一種從蔬果材料提取生物活性化合物的方法。
背景技術：
植物和蔬果物質含有一些在人體內具有生物活性的化合物，這些化合物能夠提供 有益的生理效應，包括降低發生癌症、心臟疾病和關節炎的風險。在大量的植物和蔬果原料中都可以找到一些生物活性化合物。例如，柑橘類水果 所含有的生物活性化合物可以包括在兩大類中檸檬苦素類化合物和黃酮類化合物。檸檬苦素類化合物屬於三萜類化合物，通常存在於柑橘類水果中。檸檬苦素類化 合物可以以苷元的形式存在，或者連結於一個葡萄糖分子(葡萄糖苷)。最近發現，檸檬苦 素類葡萄糖苷在動物體內具有強大的抗癌性能。黃酮類化合物是一組苯並吡喃衍生物，廣泛存在於植物中。典型地，黃酮類化合物 是由一個苯環並上一個含氧原子的六元雜環組成的。許多黃酮類化合物也可以以糖苷的形 式存在。在柑橘類水果中，最主要的黃酮類化合物是黃烷酮、芸香柚皮苷以及橘皮苷(橘子 中)和柚皮苷(柚子中)。這些化合物能夠降低高血脂個體的血液膽固醇水平。柑橘中的黃酮類化合物同樣包括多甲氧基黃酮。這組化合物以甲氧基取代黃酮為 代表，並且只存在於柑橘中。多甲氧基黃酮具有廣泛的生理效應，包括非常高的抗氧化能 力，這提示了人們研究其作為有效的抗癌劑和抗炎劑的潛在用途。多酚類化合物，如柑橘的檸檬苦素類化合物和黃酮類化合物，與其在能夠提取果 汁的內果皮中的濃度相比，其在果皮組織中具有極高的濃度。這些化合物在果皮組織中具 有較高的濃度，有助於形成植物抵禦細菌、真菌、酵母菌和昆蟲的保護機制的基礎。柑橘皮是苦的，這通常是因為檸檬苦素類化合物以其苷元形式存在，而榨汁操作 中除去的果皮通常會用石灰水處理、並通過壓榨、脫水、制粒，用作原料進給。最近，使用一些設備從柑橘類水果的果皮中提取水溶性化合物的柑橘加工行業已 經在商業實踐中興起。所得到的稀釋的水提取物(「果汁」)是苦的，通過流經一個合成的 聚合物吸附劑進行淨化(或部分淨化)後，果汁可脫去苦味。這樣，被聚合物吸附了的苦素 能夠與未被聚合物吸附的天然的糖類、酸性物質和一些風味化合物分離開。然而，大多數的 檸檬苦素類化合物和黃酮類化合物同樣可以與這些苦素一起被聚合物優先吸附。使用苛性 鈉溶液對聚合物進行處理，可以使這些化合物解吸附，從而使聚合物再生。然而，這種處理 同樣會破壞這些生物活性化合物，與沒用的苛性鈉溶液一起作為廢液排走。國際專利申請PCT/AU01/01113(W0 02/20112)已經公開了一種從柑橘類水果中 提取生物活性化合物的方法。在該方法中，原始的柑橘提取物流經一個聚苯乙烯一二乙烯 基苯聚合物，原料中的生物活性化合物會吸附在聚合物上。隨後通過醇一水混合物的連續 梯度洗脫，將這些生物活性化合物從脫苦味聚合物吸附劑上洗脫下來。由此可以從聚合物 吸附劑上收集到三種不同的醇提取物，分別含有檸檬苦素類葡萄糖苷、黃烷酮糖苷和多甲氧基黃酮。雖然這種方法能夠從吸附劑聚合物中回收有價值的生物活性化合物，但是洗脫餾 分中的生物活性化合物可能會發生混合，導致不同的生物活性化合物之間，特別是檸檬苦 素葡萄糖苷與黃烷酮糖苷之間，沒有完全分離開。這會引致較低的純度，令配方困難。解決這些問題中的部分或全部，並提供一種改進的方法用以從蔬果材料，如柑橘 類水果中獲得生物活性化合物，成為一種迫切的需要。

發明內容
本發明一方面涉及一種選擇性分離生物活性化合物的方法，該方法包括以下步 驟(a)使若干種生物活性化合物與一種聚合物吸附劑接觸，其條件是至少一種生物 活性化合物吸附在該吸附劑上，而至少一種生物活性化合物不吸附在該吸附劑上；以及(b)收集含有至少一種未被該吸附劑吸附的生物活性化合物的溶液。本發明另一方面涉及一種純化生物活性化合物的方法，包括使生物活性化合物與 一種離子交換樹脂接觸的步驟，其條件是生物活性化合物與該樹脂之間發生離子相互作 用，從而使生物活性化合物吸附在該樹脂上。本發明再一方面還涉及一種從蔬果材料中選擇性提取生物活性化合物的方法，該 方法包括使蔬果材料與一種溶劑接觸的步驟，其條件是從蔬果材料中提取至少一種水溶性 的生物活性化合物，由此提供一種含有該水溶性生物活性化合物的提取物以及含有至少一 種水不溶性生物活性化合物的蔬果殘渣。本發明的又一方面是提供由上述方法製得的生物活性化合物。本發明的再一方面是提供一種混合物，該混合物包括純度在10%、50%或70%以 上的檸檬苦素糖苷。


圖1是從橙皮中獲得的一種典型原始提取物的HPLC色譜圖，說明了其所含的化合 物。圖2是橙皮提取物流經本發明的一個實施例所述的丙烯酸類聚合物吸附劑後，所 收集的一個洗脫液餾分的HPLC色譜圖，說明其含有糖類和有機酸類化合物。圖3是所收集的一個洗脫液餾分的HPLC色譜圖，說明其含有檸檬苦素葡萄糖苷 (LG)。圖4是所收集的一個洗脫液餾分的HPLC色譜圖，說明其含有檸檬苦素葡萄糖苷、 相關的檸檬苦素、諾米林葡萄糖苷和黃柏酮葡萄糖苷。圖5是所收集的一個洗脫液餾分的HPLC色譜圖，說明其含有黃酮類橙皮苷和芸香 柚皮苷。圖6是所收集的一個洗脫液餾分的HPLC色譜圖，說明其含有黃酮類橙皮苷、芸香 柚皮苷和新枳屬苷。圖7是含有檸檬苦素類葡萄糖苷的溶液流經本發明的另一個實施例所述的陰離 子交換樹脂後，所收集的一個洗脫液餾分的HPLC色譜圖，說明其並不含有檸檬苦素類葡萄糖苷。圖8是用一種鹽溶液將陰離子交換樹脂上的檸檬苦素類葡萄糖苷置換出來後，所 收集的一個洗脫液餾分的HPLC色譜圖，說明其含有檸檬苦素類葡萄糖苷。圖9是在本發明的一個實施例所述的方法中，從丙烯酸類聚合物吸附劑(柱A)洗 脫得到的橙皮提取物(OPE)餾分的HPLC色譜圖，說明其含有檸檬苦素類葡萄糖苷。圖10是在本發明的一個實施例所述的方法中，從丙烯酸類聚合物吸附劑(柱A) 洗脫得到的各個OPE餾分中，所獲得的不同檸檬苦素類葡萄糖苷的相對含量曲線圖。圖11是在本發明的一個實施例所述的方法中，採用40%的乙醇溶液對丙烯酸類 聚合物吸附劑(柱A)進行洗脫後，所收集的一個洗脫液餾分的HPLC色譜圖，說明其含有黃 酮類化合物。圖12是在本發明的一個實施例所述的方法中，從丙烯酸類聚合物吸附劑(柱A) 解吸附後獲得的各個洗脫液餾分中，不同黃酮類化合物的相對含量曲線圖。圖13是在本發明的一個實施例所述的方法中，從聚苯乙烯一二乙烯基苯聚合物 吸附劑(柱B)洗脫下一個OPE餾分後，所得到的殘留果汁餾分的HPLC色譜圖，說明其並不 含有黃酮類化合物和檸檬苦素類葡萄糖苷。圖14是在本發明的一個實施例所述的方法中，採用30%的乙醇溶液對聚苯乙 烯一二乙烯基苯聚合物吸附劑(柱B)進行洗脫後，所收集的一個洗脫液餾分的HPLC色譜 圖，說明其含有檸檬苦素類葡萄糖苷化合物。圖15是在本發明的一個實施例所述的方法中，從聚苯乙烯一二乙烯基苯聚合物 吸附劑(柱B)解吸附後獲得的各個洗脫液餾分中，不同的檸檬苦素類葡萄糖苷化合物的相 對含量曲線圖。圖16是在本發明的一個實施例所述的方法中，採用0. 5M的氯化鈉溶液對一個弱 鹼性陰離子交換樹脂(柱C)進行洗脫後，所收集的一個洗脫液的HPLC色譜圖，說明其含有
檸檬苦素類葡萄糖苷。圖17是在本發明的一個實施例所述的方法中，從弱鹼性陰離子交換樹脂(柱C) 解吸附後獲得的各個洗脫液餾分中，不同的檸檬苦素類葡萄糖苷化合物的相對含量曲線 圖。圖18是在本發明的一個實施例所述的方法中，採用50%的乙醇溶液對聚苯乙 烯一二乙烯基苯聚合物吸附劑(柱D)進行洗脫後，所收集的洗脫液餾分的HPLC色譜圖，說 明其含有檸檬苦素類葡萄糖苷化合物。圖19是通過本發明的一個實施例所述的方法所獲得的原始橙皮提取物(各個色 譜圖中的下方譜線)與濃縮的檸檬苦素類葡萄糖苷餾分(各個色譜圖中的上方譜線)中， 各成分的疊加的HPLC色譜圖。圖20是本發明的一個實施例所述的，用於實現生物活性化合物的選擇性分離的 系統的示意圖。
具體實施例方式本發明一方面涉及一種選擇性分離生物活性化合物的方法。本發明的該方法能夠 將生物活性化合物從其它化合物中選擇性地分離出來。
本文中所使用的術語「生物活性化合物」是指對活的有機體、組織或細胞具有某種 效應的化合物或物質。本領域的技術人員可以理解，在大量的食物原料以及其它自然存在 的物質中都能夠找到生物活性化合物。根據本發明的一個實施例，生物活性化合物是從蔬 果材料中獲得的。本文中所使用的術語「蔬果物質」和「蔬果材料」是指來源於植物的材料。在大量 不同的蔬果物質或蔬果材料中都可以找到一些生物活性化合物。獲得生物活性化合物的蔬 果材料可以以任何形式存在。在一個實施例中，蔬果材料來源於一種可食用的水果。可食用的水果包括西紅柿、 蘋果、梨、葡萄、莓、核果和柑橘類水果。水果，例如葡萄，會含有大量的生物活性化合物，包 括白藜蘆醇等均二苯代乙烯，槲皮素和楊梅酮等黃烷酮，J L茶酚以及花青素。其它水果，例 如蘋果，也可以是兒茶酚、黃烷酮和二氫查爾酮等生物活性化合物的來源。此外，柑橘類水 果會含有具有生物活性的檸檬苦素類化合物、黃酮類化合物以及多甲氧基黃酮。來源於可 食用性水果的蔬果材料可以從水果的各個部分中獲得，包括水果的果皮、果汁、內果皮、種 子和果肉。在另一個實施例中，蔬果材料來源於不屬於可食用性水果的植物材料。這種植物 材料包括植物的花、根、葉和莖。例如，甘蔗是一種非可食用性水果的植物材料，其含有多甲 氧基黃酮和酚酸等生物活性化合物。在另一個實施例中，蔬果材料是一種來源於植物材料的蔬果提取物。典型地，該蔬 果提取物是含有從植物材料中回收的主要成分的液體或溶液。例如，該蔬果提取物為來源 於橘皮的橘皮提取物。儘管下文對本發明的詳細論述將主要集中在從柑橘類水果中獲得的生物活性化 合物，應當理解的是，本發明並不限制於此，其同樣適用於從其它植物和植物材料中獲得的 生物活性化合物。特別地，本發明可以用於分離具有不同物理特性的生物活性化合物。本發明的一個方面提供一種分離生物活性化合物的方法，該方法包括步驟(a)，使 若干種生物活性化合物與一種聚合物吸附劑接觸，其條件是至少一種生物活性化合物吸附 在該吸附劑上，而至少一種生物活性化合物不吸附在該吸附劑上。若干種生物活性化合物 是指至少包括兩種，優選的是包括兩種以上的生物活性化合物。這些生物活性化合物優選 的是以溶液的形式提供，這可以採用任何技術來製備。在一個實施例中，該溶液是一種從蔬 果材料獲得的提取物。在一個實施例中，蔬果材料來源於一種柑橘類水果，例如橙子、檸檬、萊蒙、柚子、 柑桔、橘子等。柑橘類水果的各個部分，包括水果的果皮和內果皮都可以提供這種蔬果材 料。優選地，蔬果材料來源於柑橘皮。在按照本發明的一個方面所述的方法進行處理前，也 可以採用任何合適的方法對蔬果材料進行預處理。通過使蔬果材料與一種溶劑接觸，將生物活性化合物從蔬果材料中提取出來，即 可獲得一種含有若干種生物活性化合物的溶液。這可以採用任何合適的溶劑。優選的溶劑 是水。通過溶劑對蔬果材料的提取，可以採用本領域公知的任何合適的方法進行。對於來 源於柑橘類水果的提取物溶液，該溶液將包含由檸檬苦素類和黃烷酮生物活性化合物、天 然的糖類以及有機酸形成的混合物。若有需要，在按照本發明所述的方法進行處理前，可以 先對該溶液進行預處理。例如，可採用的預處理有離心和過濾。這種預處理可以使溶液中
10懸浮的固體或者其它不想要的材料最少化。這些生物活性化合物與聚合物吸附劑接觸。該聚合物吸附劑至少對一種存在於該 混合物中的生物活性化合物具有選擇親和力。由此，該生物活性化合物大量地吸附在該聚 合物吸附劑上，從而被該吸附劑保留。再者，該聚合物吸附劑至少對一種存在於該混合物中 的其它生物活性化合物不具有親和力。因此，根據本發明，至少一種生物活性化合物不吸附 在該吸附劑上。可以使用任何合適的、能夠選擇性吸附至少一種生物活性化合物的聚合物吸附 劑。解除理論的約束，相信有利的相互作用，例如離子或氫鍵作用，能增強給定的生物活性 化合物在聚合物吸附劑上的吸附能力。在一個實施例中，該聚合物吸附劑為丙烯酸樹脂。在 一個實施例中，合適的聚合物吸附劑為丙烯酸酯。例如，聚甲基丙烯酸甲酯是其中的一種丙 烯酸酯。聚甲基丙烯酸甲酯可以與一種合適的交聯劑相交聯，如乙二醇。優選的是，該聚合 物吸附劑是非離子型的。其中一種適用於本發明的聚合物吸附劑是由Bucher Foodtech公 司提供的 Alimentech P495 惰性吸附聚合物(Inert Adsorbent Polymer)。聚合物吸附劑可以採用任何合適的形式和排布方式。在一個實施例中，該聚合物 吸附劑是一種珠子狀的丙烯酸樹脂。這些珠子可以採用任何合適的形狀或尺寸。該聚合物 吸附劑可以採用任何合適的方法排布。在一個優選的實施例中，聚合物吸附劑排布在通道 中，可以是柱子、容器或導管。例如，合適的排布方式有重力送料柱和快速色譜柱。也可以 使用其它排布方式，例如移動床色譜裝置。柱子的長度與其直徑的比例至少為4 1，優選 地，至少為8 1。該通道可以包含任何合適體積的吸附劑。在一個實施例中，含有若干種生物活性化合物的溶液，施加在一個垂直排布的含 有丙烯酸類聚合物吸附劑的柱子的頂部。儘管本發明所述的實施例，是將不同的溶液施加 在一個垂直排布的柱子的頂部，本領域的技術人員可以理解，其它的排布方式以及引入溶 液的方法，同樣可以使用。例如，溶液可以從一個垂直排布的柱子的底部進料。可選地，若 柱子是以完全水平的方式排布，則溶液可以從該水平柱的一端進料。隨後，溶液可滲透流過吸附劑。吸附劑上可以施加任意用量的溶液，而相關領域的 技術人員可以理解，溶液的用量會取決於所使用的吸附劑的柱型和類型。溶液可以以任意 的流速流過通道，只要能夠使溶液與吸附劑充分接觸。本領域的技術人員可以理解，合適的 流速會取決於許多因素，包括裝置的尺寸以及該方法是在實驗室執行的還是在工業規模上 執行的。隨著含有若干種生物活性化合物的溶液流經含有聚合物吸附劑的柱子，至少一種 生物活性化合物充分吸附在聚合物吸附劑上。通過該吸附劑對至少一種生物活性化合物的 保留，從而將該化合物從溶液中除去。溶液流過柱子後，流出柱子並被收集。存在於溶液中的至少一種未被聚合物吸附 劑吸附的生物活性化合物，同樣隨著該溶液流出柱子。洗脫並流出柱子的溶液也就是洗脫 液。因此本發明的這一方法還包括步驟(b)，收集含有至少一種未被吸附劑吸附的生物活性 化合物的溶液。該至少一種未被吸附劑吸附的生物活性化合物，可以收集在一個單一的洗 脫液餾分中或者收集在多個餾分中。其它未被聚合物吸附劑吸附的成分，也會存在於所收 集的餾分中。可以通過任何合適的方法對所收集的溶液(洗脫液)進行分析，判斷其中是 否存在生物活性化合物。優選的方法包括使用高效液相色譜法(HPLC)。如下文所述，所洗脫的生物活性化合物可以進行附加的處理，以進一步純化該生物活性化合物。在一個實施例中，該若干種生物活性化合物包含由黃酮類和檸檬苦素類生物活性 化合物組成的混合物，而該聚合物吸附劑是一種能夠分離黃酮類和檸檬苦素類化合物的吸 附劑。優選地，該聚合物吸附劑是一種丙烯酸樹脂，更優的是一種丙烯酸酯，而甚至更優的 是聚甲基丙烯酸甲酯。已經發現，丙烯酸類聚合物吸附劑能選擇性結合具有生物活性的黃 烷酮及其衍生物，例如黃烷酮糖苷，其結合力遠強於與檸檬苦素類化合物的結合力，例如檸 檬苦素類葡萄糖苷。這種選擇性吸附使得黃烷酮能夠充分保留在吸附劑上，而檸檬苦素類 葡萄糖苷化合物則不被該吸附劑所保留。在這種方法中，兩組生物活性化合物被充分分離 開。在該方法的一種形式中，這兩組生物活性化合物被完全分離開。其它化合物，如天然的 糖類和有機酸，也不被該吸附劑所保留。因此，當丙烯酸樹脂吸附劑設置在一個柱子中，天 然的糖類和有機酸會在檸檬苦素類葡萄糖苷之前，快速地流出該柱子，而黃酮類化合物則 不流出該柱子。因此，根據本發明的一個方面，黃烷酮糖苷與檸檬苦素類葡萄糖苷可充分地 分離開。在另一個實施例中，除了黃酮類化合物和檸檬苦素類葡萄糖苷以外，該若干種生 物活性化合物還可以包含其它的生物活性化合物，例如多甲氧基黃酮和檸檬苦素苷。在本 實施例中，該聚合物吸附劑能夠連同黃酮類化合物一起吸附多甲氧基黃酮和檸檬苦素苷。 因此，本發明的這一方法能夠將這些化合物與檸檬苦素類葡萄糖苷以及天然存在的糖類和 有機酸等極性小分子成分充分地分離開。根據本發明的一個方面，該方法可包括步驟(C)，使吸附在步驟(a)的聚合物吸附 劑上的至少一種生物活性化合物與一種洗脫劑接觸，其條件是至少一種生物活性化合物能 從該吸附劑上解吸附下來；以及步驟(d)，將至少一種生物活性化合物從該吸附劑上洗脫 下來。當聚合物吸附劑被排布在一個通道中，例如一個柱子中時，洗脫劑通常是以等分 試樣或者作為一種連續蒸汽，被引入到柱子的頂部，並滲透流過吸附劑。引入等分試樣時， 可以採用洗脫劑的一個或多個等分試樣。洗脫劑將至少一種生物活性化合物從該吸附劑上 解吸附下來，並攜帶該生物活性化合物流出柱子。優選地，以一個預設的流速將洗脫劑送進 通道中，該流速可以在每小時1-5倍床體積之間變動，優選的流速是每小時1-2倍床體積。洗脫劑可以包括任何合適的溶劑或混合溶劑。優選的是，選用那些可允許用於食 物產品中的溶劑或混合溶劑。一種優選的溶劑是水溶性溶劑。在一個實施例中，洗脫劑包 括醇和水。洗脫劑含有醇時，任何濃度的醇都可以使用。在一個實施例中，洗脫劑中的醇濃度 大約在10% (ν/ν)至80% (ν/ν)之間的範圍內。本領域的技術人員可以理解，所使用的醇 濃度可以根據生物活性化合物的性質以及所希望獲得的效果而進行變動。此外，任何合適 的醇都可以使用在洗脫劑中。在一個實施例中，所使用的醇為乙醇。在一個實施例中，將至少一種生物活性化合物從吸附劑上解吸附下來的過程中， 洗脫劑中的醇濃度是基本保持不變的。一個優選的醇濃度約為40% (ν/ν) 0在另一個實施 例中，將至少一種生物活性化合物從吸附劑上解吸附下來的過程中，洗脫劑中的醇濃度是 遞增的。優選地，醇濃度從約為20% (ν/ν)遞增至約為80% (ν/ν) 0醇濃度可以以一個基 本不變的速率遞增，或者以一個階梯式的方式遞增。當洗脫劑設有梯度變化的醇濃度時，醇
12含量逐步遞增的洗脫劑等分試樣可以連續引入到柱子的頂部。流出柱子後，所得到的洗脫液隨後可以收集在多個餾分中。至少收集一個對應於 含有解吸附的生物活性化合物的餾分，優選的是收集多個這樣的餾分。儘管在本方法的一些實施例中，強調分級收集法是有利的，然而非分級收集法也 包括在本發明的範圍內。例如，目標生物活性化合物可吸附在聚合物吸附劑上，而雜質分子 則簡單地流過柱子成為廢棄物。當所有雜質分子都從聚合物吸附劑基質上除去以後(例如 採用一種不會解吸附目標生物活性化合物的溶液對基質進行洗滌)，可以應用一種適當的 溶液將目標生物活性化合物解吸附下來，目標化合物批量收集在一個單一的容積中。對餾分或批量收集的容積進行分析，測定其中的生物活性化合物的量。優選的分 析方法包括使用高效液相色譜法(HPLC)。在一個實施例中，黃烷酮及其衍生物吸附在聚合 物吸附劑上，因此所收集的餾分含有解吸附的黃酮類化合物。除了具有生物活性的黃酮類化合物以外，多甲氧基黃酮和檸檬苦素苷同樣吸附在 聚合物吸附劑上時，用於除去黃酮類化合物的洗脫劑不會將多甲氧基黃酮和檸檬苦素苷從 吸附劑上解吸附下來。由此，在黃酮類化合物的解吸附過程中，多甲氧基黃酮和檸檬苦素苷 會保持結合在聚合物吸附劑上。因此，根據本發明的另一個方面，黃酮類化合物可以與多甲 氧基黃酮和/或檸檬苦素苷充分地分離開。若有需要，在黃酮類化合物解吸附以後，可以採用一種合適的溶液對聚合物吸附 劑進行洗滌，以將任何吸附在其上的多甲氧基黃酮和檸檬苦素苷除去，從而使聚合物吸附 劑再生以再次使用。任何合適的溶液都可以用於除去吸附在聚合物吸附劑上的多甲氧基黃 酮和檸檬苦素苷。一種可以用於解吸附多甲氧基黃酮和檸檬苦素苷的溶液是0. 5M的氫氧 化鈉溶液。在本發明的另一個方面，未被聚合物吸附劑所吸附的生物活性化合物可以作進一 步的純化。根據本發明的這個方面，該方法可以包括步驟(e)，使從步驟(b)獲得的含有至 少一種生物活性化合物的溶液與一種聚合物吸附劑接觸，其條件是至少一種生物活性化合 物吸附在該吸附劑上；以及步驟(f)，收集從該聚合物吸附劑上洗脫下來的溶液。與之前使用的聚合物吸附劑不同，用於步驟(e)中的聚合物吸附劑是選用那些能 夠與溶液中存在的生物活性化合物相結合的任何聚合物吸附劑。優選地，該聚合物吸附劑 能夠吸附非極性的化合物。一種優選的聚合物吸附劑是聚苯乙烯一二乙烯基苯。可能同時 存在於該溶液中的極性成分，如天然的糖類和簡單的有機酸，不會被該聚合物吸附劑所吸 附，並隨著溶液一起流出該聚合物吸附劑，被洗脫出來。一種市售的聚苯乙烯一二乙烯基苯 聚合物吸附劑是由羅門哈斯(Rohm and Haas)公司生產的Amberlite XAD-16。用於步驟(e)中的聚合物吸附劑，可以採用任何合適的形式和排布方式。在一個 實施例中，該聚合物吸附劑是一種珠子狀的聚苯乙烯一二乙烯基苯聚合物。這些珠子可以 採用任何合適的形狀或尺寸。這些珠子可以採用任何合適的方法排布。優選的是將這些珠 子排布在通道中，也就是將珠子包裹在柱子、容器或導管中。該通道可以包含任何合適體積 的吸附劑。在本發明的一個優選的實施例中，用於步驟(e)中的聚合物吸附劑的床體積與 用於上述步驟(a)中的聚合物吸附劑的床體積相等。例如，若用於步驟(a)中的聚合物吸 附劑的床體積至少約為250升，則用於步驟(e)中的聚合物吸附劑的床體積同樣至少約為 250升。然而，相關領域的技術人員可以理解，用於步驟(e)中的聚合物吸附劑的體積，可以根據生物活性化合物的性質以及所希望獲得的效果而進行變動。在一個實施例中，從步驟(b)獲得的含有至少一種生物活性化合物的溶液，被施 加在一個含有聚合物吸附劑的柱子的頂部，並滲透流過該吸附劑，再與步驟(e)中的聚合 物吸附劑接觸。在一個實施例中，當溶液含有具有生物活性的檸檬苦素類化合物及其衍生 物，如檸檬苦素類葡萄糖苷時，在溶液流過該聚合物吸附劑通道的過程中，檸檬苦素類化合 物會與該聚合物吸附劑結合，並由此從溶液中除去。溶液穿過該通道，流出該通道和聚合物 吸附劑後，收集為一個洗脫液。在一個實施例中，所收集的溶液(或洗脫液)含有糖類和簡 單的有機酸，洗脫的溶液可以稱為一個純化的「果汁」成分。已經發現，根據本發明的方法 所獲得的果汁是中性的而且沒有苦味。預期的是，該純化的「果汁」成分可以被離析，並且 若有需要，可以作進一步的處理，以用作食物產品中的增補劑，例如飲料。根據本發明的一個實施例，一旦溶液從吸附劑洗脫下來，可以將至少一種生物活 性化合物從步驟(e)的聚合物吸附劑上解吸附下來。由此，本發明可進一步包括步驟(g)， 使吸附在步驟(e)的聚合物吸附劑上的至少一種生物活性化合物，與一種洗脫劑接觸，其 條件是至少一種生物活性化合物從該吸附劑上解吸附下來；以及步驟(h)，將至少一種生 物活性化合物從該吸附劑上洗脫下來。洗脫劑的一個或多個等分試樣，或者洗脫劑的一個 連續蒸汽，都可以用於將至少一種生物活性化合物從聚合物吸附劑上解吸附下來。與上述將生物活性化合物從步驟(C)中的聚合物吸附劑上解吸附下來所使用的 洗脫劑類似，步驟(g)所使用的洗脫劑可以包括任何合適的溶劑或混合溶劑。優選的是，選 用那些可允許用於食物產品中的溶劑或混合溶劑。一種優選的溶劑是水溶性溶劑。在一個 實施例中，洗脫劑包括醇和水。洗脫劑含有醇時，任何合適濃度的醇都可以使用。在一個實 施例中，洗脫劑中的醇濃度大約在10% (ν/ν)至80% (ν/ν)之間的範圍內。本領域的技術 人員可以理解，所使用的醇濃度可以根據生物活性化合物的性質以及所希望獲得的效果而 進行變動。此外，任何合適的醇都可以使用。一種優選的醇是乙醇。在一個實施例中，將至少一種生物活性化合物從吸附劑上解吸附下來的過程中， 洗脫劑中的醇濃度是基本保持不變的。優選的是，洗脫劑約含40% (ν/ν)的乙醇。在另一個 實施例中，將至少一種生物活性化合物從吸附劑上解吸附下來的過程中，洗脫劑中的醇濃 度是遞增的。優選地，醇濃度從約為10% (ν/ν)遞增至約為80% (ν/ν) 0醇濃度可以以一 個基本不變的速率遞增，或者以一個階梯式的方式遞增。當洗脫劑設有梯度變化的醇濃度 時，醇含量逐步遞增的洗脫劑等分試樣可以連續引入到含有聚合物吸附劑的柱子的頂部。根據步驟(h)，從聚合物吸附劑上洗脫下來的生物活性化合物通常收集在一個洗 脫液餾分中。洗脫液餾分是指一種由生物活性化合物以及用於將該生物活性化合物從聚合 物吸附劑上洗脫下來的溶劑所組成的溶液。至少收集一個對應於含有該生物活性化合物的 餾分，優選的是收集多個這樣的洗脫餾分。在本發明的一個優選的實施例中，所收集的洗脫 餾分含有檸檬苦素類化合物，例如檸檬苦素葡萄糖苷。若收集多個洗脫餾分，這些洗脫餾分 可以合併在一起以形成一個單一的餾分。此外，如上所述，若有需要，也可以使用非分級收 集法，使得目標生物活性分子收集在一個單一的總容積中。在含有檸檬苦素類化合物的情況下，若需要將所選擇的檸檬苦素類化合物彼此分 離開，則使用一種醇濃度在檸檬苦素類化合物的解吸附過程中逐步遞增的洗脫劑會較有 利。不同的檸檬苦素類化合物具有不同的化學結構，因此擁有不同的極性。因此，使用濃度梯度變化的醇，會有助於根據檸檬苦素類化合物的不同極性而將它們分離開。根據洗脫劑 中的醇濃度遞增的順序，極性最大的檸檬苦素葡萄糖苷最先從聚合物吸附劑上洗脫下來， 隨後為諾米林葡萄糖苷、諾米林酸葡萄糖苷和黃柏酮葡萄糖苷。相關領域的技術人員可以 調整洗脫劑中的醇濃度，並通過採用HPLC等分析方法對檸檬苦素類化合物的洗脫進行監 控，判斷是否達到理想的分離。在本發明的一些實施例中，從聚合物吸附劑上洗脫下來的生物活性化合物，可以 作進一步的處理，以純化和濃縮這些生物活性化合物。在另一個方面，本發明涉及一種純化生物活性化合物的方法，該方法包括使生物 活性化合物與一種離子交換樹脂接觸的步驟，其條件是生物活性化合物與樹脂之間發生離 子相互作用，從而使生物活性化合物吸附在樹脂上。根據本發明的一個方面所述的方法，至少一種生物活性化合物從一種聚合物吸附 劑上洗脫下來，該方法可進一步包括使所洗脫的生物活性化合物與一種離子交換樹脂接觸 的步驟，其條件是至少一種生物活性化合物與樹脂之間發生離子相互作用，從而使至少一 種生物活性化合物吸附在樹脂上。在一個實施例中，需要純化的生物活性化合物是在上述的步驟(h)中，從聚合物 吸附劑洗脫下來的生物活性化合物。在該實施例中，生物活性化合物通常是與洗脫液溶劑 一起，以溶液的形式提供的。這是本發明的一個優點，該含有生物活性化合物的溶液(或洗 脫液)可以直接施加在離子交換樹脂上，在該生物活性化合物暴露於該離子交換樹脂前， 無需通過蒸發或者其它方法將多餘的乙醇從溶液中除去。在一個實施例中，該離子交換樹脂是一種陰離子交換樹脂，優選的是一種弱鹼性 陰離子交換樹脂。例如，可用於本發明的弱鹼性陰離子交換樹脂有Supelo公司提供的 Diaion WA-30 樹脂。該離子交換樹脂可以採用任何合適的形式和排布方式。一些合適的形式和排布方 式對相關領域的技術人員來說是顯而易見的。該樹脂可以排布在通道中，也就是可以將樹 脂包裹在一個柱子中，例如重力送料柱或快速色譜柱。該通道可以包含任何合適體積的樹 脂。在一個實施例中，該離子交換樹脂的床體積約為用於上述步驟(a)中的聚合物吸附劑 的床體積的20%。例如，若用於步驟(a)中的聚合物吸附劑為100升，則該離子交換樹脂可 僅需要20升。然而，本領域的技術人員可以理解，該離子交換樹脂所需要的體積，可以根據 生物活性化合物的性質以及所希望獲得的效果而進行變動。在一個實施例中，含有該生物活性化合物的溶液被引入到一種填裝在柱子中的樹 脂的頂部，並滲透流過該樹脂。在該方法中，可實現生物活性化合物與離子交換樹脂之間的 接觸。樹脂與生物活性化合物之間的離子相互作用，使得例如檸檬苦素類葡萄糖苷的生 物活性化合物選擇性吸附在該樹脂上。可能存在的，但不能參與這種離子相互作用的其它 成分，將不會結合在該樹脂上。由此，該生物活性化合物可以被濃縮，並且進一步與任何可 能會汙染這些生物活性化合物的、不想要的成分分離開。吸附在離子交換樹脂上的生物活性化合物，可以通過使離子交換樹脂與一種含有 合適溶質的溶液接觸來進行回收，其條件是能將生物活性化合物從樹脂上置換出來。溶質 可以選用那些能夠與生物活性化合物競爭離子交換樹脂上的結合位點的物質。一種優選的
15溶質是鹽，例如氯化鈉。溶質可以以任何合適的濃度存在。在一個實施例中，該溶液是0. 5M 的氯化鈉溶液。在一個實施例中，該生物活性化合物為檸檬苦素類葡萄糖苷，一種含有鹽溶質的 溶液流過一個含有離子交換樹脂的通道。該溶液的一個或多個等分試樣，或者該溶液的一 個連續蒸汽，可以被引入到含有離子交換樹脂的通道中。其中的鹽競爭性地結合到該樹脂 上，並將檸檬苦素類葡萄糖苷從該樹脂上置換出來。隨後，隨著溶液流出該通道，可收集到 解吸附的檸檬苦素類葡萄糖苷。解吸附的檸檬苦素類葡萄糖苷可以收集在一個單一的餾分 中或收集在多個餾分中，也可以收集在洗脫溶液的總容積中。收集該生物活性化合物以後，優選的是除去所收集餾分中存在的所有溶質。溶質 可以通過任何合適的方法除去。在一個優選的實施例中，通過使餾分與一個聚合物吸附劑 接觸，將溶質除去，其條件是該生物活性化合物吸附在該吸附劑上。任何合適的聚合物吸附劑都可以使用。優選地，該聚合物吸附劑能夠吸附非極性 的化合物。一種優選的聚合物吸附劑是聚苯乙烯一二乙烯基苯。例如，合適的聚苯乙烯一 二乙烯基苯聚合物吸附劑有羅門哈斯(Rohm and Haas)公司生產的Amberlite XAD-16。與 上文所述的聚合物吸附劑類似，該吸附劑可以呈珠子狀，排布在一個通道中，例如一個柱子 中。該聚合物吸附劑可以採用任何合適的體積。在一個實施例中，該聚苯乙烯一二乙烯基 苯聚合物樹脂的床體積可以約為上述步驟(a)中使用的聚合物吸附劑的床體積的20%。然 而，本領域的技術人員可以理解，該聚合物樹脂所需要的體積，可以根據生物活性化合物的 性質以及所希望獲得的效果而進行變動。在一個實施例中，所收集的含有該生物活性化合物的溶液被施加到柱子的頂部， 並滲透流過吸附劑。若該生物活性化合物含有檸檬苦素類化合物，該檸檬苦素類化合物會 結合於聚合物吸附劑，並充分保留在該聚合物吸附劑上。同時，溶質不會結合於吸附劑並會 從吸附劑上洗脫下來。在該方法中，檸檬苦素類生物活性化合物與不想要的溶質分離開。隨後可以按照前述的步驟，通過使該聚合物吸附劑與一種洗脫劑接觸，並將該生 物活性化合物從該吸附劑上洗脫下來，從而將該生物活性化合物從該聚合物吸附劑上解吸 附下來。一種優選的洗脫劑包括由醇和水組成的混合物。任何合適濃度的醇都可以使用。 在一個實施例中，洗脫劑的含醇量大約在10% (ν/ν)至80% (ν/ν)的範圍內。此外，任何 合適的醇都可以使用。一種優選的醇是乙醇。洗脫劑中的醇濃度可以是基本保持不變的。在一個優選的實施例中，洗脫劑至少 約含有40% (ν/ν)的乙醇，更優的是，約含有70% (ν/ν)的乙醇。可選地，在至少一種生物 活性化合物從吸附劑上解吸附下來的過程中，醇的濃度是遞增的。若醇的濃度在生物活性 化合物的解吸附過程中是遞增的，則醇含量可以以一個基本不變的速率遞增，或者以一個 階梯式的方式遞增。在一個實施例中，在至少一種生物活性化合物從吸附劑上解吸附下來 的過程中，洗脫劑中的醇濃度可以從約為10% (ν/ν)遞增至約為80% (ν/ν) 0所洗脫的生物活性化合物隨後收集在至少一個對應於含有該生物活性化合物的 餾分中，優選的是收集在多個這樣的餾分中。該生物活性化合物的存在可以通過任何合適 的方法進行分析。例如，一種合適的方法是高效液相色譜法(HPLC)。已經發現，所獲得的生 物活性化合物的純度比使用現有方法製得的生物活性化合物的純度更高。在另一方面，本發明涉及由本文所述的方法製得的純化的生物活性化合物。在一個實施例中，該生物活性化合物為檸檬苦素類化合物，更優的是檸檬苦素類葡萄糖苷。在另 一個實施例中，該純化的生物活性化合物為黃酮類化合物，更優的是黃烷酮糖苷。在再一方面，本發明涉及一種從蔬果材料中選擇性提取生物活性化合物的方法， 該方法包括使蔬果材料與一種溶劑接觸的步驟，其條件是從蔬果材料中至少提取一種水溶 性的生物活性化合物，由此提供一種含有該水溶性生物活性化合物的提取物以及至少含有 一種水不溶性生物活性化合物的蔬果殘渣。在一個優選的實施例中，用於接觸該蔬果材料 的溶劑為水。由此，在該實施例中，會形成一種至少含有一種水溶性生物活性化合物的水提 取物。本文所使用的術語「蔬果材料」是指來源於植物的材料。該蔬果材料可以以本文所 述的任何形式存在。在按照本發明所述的方法進行處理前，也可以採用任何合適的方法對 該蔬果材料進行預處理。在一個實施例中，蔬果材料可以來源於一種可食用的水果，例如本 文所述的那些水果。蔬果材料可以來源於一種柑橘類水果，例如橙子、檸檬、萊蒙、柚子、柑 桔、橘子等。柑橘類水果的各個部分，包括水果的果皮和內果皮都可以提供這種蔬果材料。 在一個實施例中，該蔬果材料可以來源於柑橘皮。該蔬果材料也可以是一種來源於植物材 料的蔬果提取物。可以採用任何合適的技術使溶劑與蔬果材料接觸。在一個實施例中，採用一種逆 流提取器使溶劑與蔬果材料接觸，由此從該蔬果材料中至少提取一種水溶性的生物活性化 合物。在另一個實施例中，對該蔬果材料進行處理，使得該蔬果材料以粒狀的形式放置。浸 漬的蔬果材料隨後被滾壓機輾壓，以將含有水溶性生物活性化合物的果汁壓榨出來。在一 個實施例中，該蔬果材料含有檸檬苦素葡萄糖苷等檸檬苦素類化合物以及黃烷酮糖苷等黃 酮類化合物，這些都是水溶性的生物活性化合物。從蔬果材料中提取水溶性的生物活性化合物，可以在任何合適的條件下進行。在 一個實施例中，蔬果材料是在至少70°C的溫度下進行處理，通常是一個短時間的處理。在該 方法的一個實施例中，蔬果材料是在至少70°C的溫度下處理2min。不受理論的約束，我們 認為高溫處理的步驟雖然有助於破壞氧化酶和微生物，但可能對想要的終產物不利。高溫 同樣可以促進蔬果材料的細胞結構的破裂，使得蔬果材料中的水溶性化合物能夠分散到逆 流的溶劑中。隨後，可以將該蔬果材料的溫度降低，從而使目標化合物的提取最優化。從蔬果材料中提取了水溶性的生物活性化合物以後，會留下蔬果殘留物。該蔬果 殘留物可以至少含有一種水不溶性生物活性化合物，該水不溶性生物活性化合物不會在初 始的溶劑提取步驟中被除去。該蔬果殘留物可以是固體的形式或液體的形式，這取決於該 蔬果材料的初始形式。在本發明的另一個方面，所得到的蔬果殘留物可以與一種含有醇的提取溶液接 觸，從而從該蔬果殘留物中至少提取一種水不溶性生物活性化合物。該溶液可以在任意條 件下，與該蔬果殘留物接觸任意時間，只要足以從該殘留物中提取至少一種水不溶性生物 活性化合物即可，由此可提供一種至少含有一種水不溶性生物活性化合物的醇提取物。在 一個實施例中，蔬果材料以及由此獲得的蔬果殘留物，含有作為水不溶性生物活性化合物 的多甲氧基黃酮。可以採用任何合適的技術使提取溶液與蔬果殘留物接觸，並由此從該殘留物中提 取至少一種水不溶性生物活性化合物。在一個優選的實施例中，採用逆流提取器。
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與蔬果殘留物接觸的提取溶液可以含有任何合適含量的醇。在一個實施例中，提 取溶液包括由醇和水組成的混合物。優選地，提取溶液至少約含有10%的醇，而更優的是， 至少約含有20%的醇。任何合適的醇都可以使用。一種優選的醇是乙醇。若有需要，隨後可以使至少含有一種水不溶性生物活性化合物的醇提取物，與一 種聚合物吸附劑接觸，其條件是該水不溶性生物活性化合物吸附在該吸附劑上。這通過將 該水不溶性生物活性化合物與不被吸附劑保留的所有雜質分離開，有助於進一步純化該水 不溶性生物活性化合物。優選地，該聚合物吸附劑吸附非極性的化合物。一種優選的聚合 物吸附劑是聚苯乙烯一二乙烯基苯。例如，一種合適的聚苯乙烯一二乙烯基苯聚合物吸附 劑是由羅門哈斯(Rohm and Haas)公司生產的Amberlite XAD-16。該聚合物吸附劑可以採用任何合適的形式和排布方式。在一個實施例中，該聚合 物吸附劑是珠子狀的聚苯乙烯一二乙烯基苯聚合物。這些珠子可以採用任何合適的形狀或 尺寸。這些珠子可以排布在通道中，也就是將珠子包裹在柱子、容器或導管中。例如，合適 的柱子有重力送料柱和快速色譜柱。該通道可以包含任何合適體積的珠子。本領域的技術 人員可以理解，所採用的聚合物吸附劑的體積會取決於許多因素，例如，需要施加到吸附劑 上的材料的用量。也可以使用其它排布方式，例如移動床色譜裝置。在一個實施例中，含有至少一種水不溶性生物活性化合物的醇提取物，被引入到 一個含有吸附劑的柱子的頂部，並滲透流過該樹脂。在該方法中，至少一種水不溶性生物活 性化合物能夠與聚合物吸附劑接觸。該水不溶性生物活性化合物通常是非極性的，會保留 在吸附劑上，提取物中可能存在的極性成分則不會被保留，而是流過該通道並被收集。在一 個實施例中，該至少一種水不溶性生物活性化合物包括多甲氧基黃酮。因此，該多甲氧基黃 酮被吸附在聚合物吸附劑上。隨後可以通過使該吸附劑與一種洗脫劑接觸，其條件是水不溶性生物活性化合物 能夠從吸附劑上解吸附下來，並將該水不溶性生物活性化合物從吸附劑上洗脫下來，從而 將該水不溶性生物活性化合物從吸附劑上除去。若聚合物吸附劑排布在一個柱子中，洗脫劑可以以等分試樣或者以連續蒸汽的方 式，引入到柱子的頂部，並滲透流過吸附劑。當洗脫劑設有梯度變化的醇濃度時，醇含量逐 步遞增的洗脫劑等分試樣可以連續引入到柱子的頂部。洗脫劑將生物活性化合物從吸附劑 上解吸附下來，並攜帶之流過柱子。優選地，以一個預設的流速將洗脫劑送進通道中，該流 速可以在每小時1-5倍床體積之間變動。然而，本領域的技術人員可以理解，合適的流速 會取決於許多因素，包括裝置的尺寸以及該方法是在實驗室執行的還是在工業規模上執行 的。洗脫劑可以包括任何合適的溶劑或混合溶劑。優選的是，選用那些可允許用於食 物產品中的溶劑或混合溶劑。在一個實施例中，洗脫劑包括醇和水。洗脫劑含有醇時，任何 濃度的醇都可以使用。優選的醇濃度是在10% (ν/ν)至80% (ν/ν)的範圍內。然而，技術 人員應該知道，所使用的醇濃度可以根據生物活性化合物的性質以及所希望獲得的效果而 進行變動。此外，任何合適的醇都可以使用在洗脫劑中。一種優選的醇是乙醇。洗脫劑中的醇濃度可以是基本保持不變的。在一個優選的實施例中，洗脫劑至少 約含有40% (ν/ν)的醇，優選的是至少約含有50% (ν/ν)的醇，而更優的是約含有70% (ν/ ν)的醇。可選地，在至少一種生物活性化合物從吸附劑上解吸附下來的過程中，醇的濃度是遞增的。醇濃度可以以一個基本不變的速率遞增，或者以一個階梯式的方式遞增。在一個 實施例中，在至少一種生物活性化合物從吸附劑上解吸附下來的過程中，洗脫劑中的醇濃 度可以從約為10% (ν/ν)遞增至約為80% (ν/ν)。流出柱子後，洗脫劑被收集。至少收集一個對應於含有解吸附的水不溶性生物活 性化合物的餾分，優選的是收集多個這樣的餾分。此外，也可以使用非分級收集法。可以對 所收集的溶液進行分析，判斷其中是否存在生物活性化合物。一種優選的分析方法包括使 用高效液相色譜法(HPLC)。在一個實施例中，來源於蔬果材料和蔬果殘留物的水不溶性生物活性化合物包括 多甲氧基黃酮。因此，在一個實施例中，從聚合物吸附劑上收集到的餾分含有解吸附的多甲 氧基黃酮類化合物。該多甲氧基黃酮與蔬果材料中存在的其它生物活性化合物分離開。在再一個方面，本發明涉及由本文所述的方法製得的純化的多甲氧基黃酮。根據圖20，顯示了一個用於實現本發明的一個實施例所述的方法的系統示意圖。 在該實施例中，從柑橘皮獲得的蔬果提取物被送進一個逆流提取器(1)中，並與水接觸，從 而將水溶性化合物從柑橘皮提取物中提取出來。水溶性化合物，包括具有生物活性的黃酮 類和檸檬苦素類化合物，被分離在水提取物中。水提取物隨後被送進一個過濾器(2)中，從 而將提取物中的所有固體材料除去。過濾後的水提取物加載在一個填裝有丙烯酸類聚合物 吸附劑(3)的柱子上。黃酮類化合物會吸附在丙烯酸類吸附劑(3)上，而檸檬苦素類化合 物基本不會附著在丙烯酸類吸附劑⑶上，而是流過吸附劑⑶並被收集。通過使含60%乙醇的乙醇一水洗脫劑流過柱子(3)，將所吸附的黃酮類化合物從 丙烯酸類吸附劑(3)上解吸附下來。對應於解吸附的黃酮類化合物的洗脫液餾分隨後被收 集。所收集的餾分流過醇回收蒸發器(4)，將大部分的乙醇除去，以收集純化的黃酮類化合 物。除去的乙醇可以儲存在一個乙醇罐中，若有需要，隨後可進行蒸餾以回收使用。從丙烯酸類聚合物吸附劑(3)上洗脫下來的，含有檸檬苦素類化合物的溶液，隨 後加載在一個填裝有聚苯乙烯一二乙烯基苯聚合物吸附劑(5)的柱子上。檸檬苦素類化合 物(以及其它可能存在的非極性化合物，如黃酮類化合物)被吸附在聚苯乙烯一二乙烯基 苯吸附劑(5)上，而極性的成分，例如天然的糖類和簡單的有機酸，不會被吸附，而是從聚 合物吸附劑(5)中流出。含有天然糖類和簡單有機酸的洗脫溶液，形成一種純化的「果汁」 成分並隨後被收集。然後使用一種含30%乙醇的乙醇一水洗脫劑，將所吸附的檸檬苦素類 化合物從聚苯乙烯一二乙烯基苯聚合物吸附劑(5)上除去，並收集對應於含有解吸附的檸 檬苦素類化合物的餾分。從聚苯乙烯一二乙烯基苯聚合物吸附劑(5)解吸附下來以後，含有檸檬苦素類化 合物的餾分，隨後加載在一個含有陰離子交換樹脂(6)的柱子上。陰離子交換樹脂(6)會吸 附檸檬苦素類化合物，而不與該陰離子交換樹脂結合的所有成分，則流過含有樹脂(6)的 柱子並被收集。然後，將一種鹽溶液加載在該陰離子交換樹脂(6)上，以將檸檬苦素類化合 物從樹脂(6)上解吸附下來。收集含有解吸附的檸檬苦素類化合物和鹽的餾分。所收集的 餾分對應於含有檸檬苦素類化合物。含有從陰離子交換樹脂(6)解吸附下來的檸檬苦素類化合物的餾分，隨後加載在 一個含有聚苯乙烯一二乙烯基苯聚合物吸附劑(7)的柱子上。聚合物吸附劑(7)是用於除 去與檸檬苦素類化合物一同存在於溶液中的鹽。檸檬苦素類化合物吸附在聚苯乙烯一二乙烯基苯聚合物吸附劑(7)上，而不被吸附的鹽流過含有該聚合物吸附劑(7)的柱子。然後， 通過使用一種醇溶液流過吸附劑(7)，將檸檬苦素類化合物從聚合物吸附劑(7)上解吸附 下來。隨後收集對應於含有解吸附的檸檬苦素類化合物的洗脫液餾分。所收集的含有解吸附的檸檬苦素類化合物的餾分，可以流過醇回收蒸發器(4)，以 將乙醇從該餾分中除去，並收集純化的檸檬苦素類化合物。所除去的乙醇可以儲存在一個 乙醇罐中，若有需要，隨後可進行蒸餾以回收使用。提取了水溶性化合物以後，可以將柑橘皮提取物送進第二逆流提取器(8)中，並 與10%的乙醇水溶液接觸，對該柑橘皮提取物作進一步的提取，從而將水不溶性化合物從 柑橘皮提取物中提取出來。該方法提供了一種含有水不溶性化合物的醇提取物，包括多甲 氧基黃酮生物活性化合物。該醇提取物加載在一個含有聚苯乙烯一二乙烯基苯聚合物吸附劑(9)的柱子上。 非極性的水不溶性化合物，例如多甲氧基黃酮，會吸附在聚苯乙烯一二乙烯基苯吸附劑(9) 上並被該吸附劑保留，而不能吸附於該聚合物吸附劑的成分則會流過該吸附劑(9)。隨後通過使一種96%的醇一水溶液流過該柱子，將吸附的多甲氧基黃酮從聚苯乙 烯一二乙烯基苯吸附劑(9)中除去。然後將解吸附的多甲氧基黃酮化合物收集在對應於含 有該生物活性化合物的洗脫液餾分中。所收集的洗脫液餾分可以流過醇回收蒸發器(10)， 將乙醇除去以收集純化的多甲氧基黃酮。若有需要，所除去的乙醇可以儲存在一個乙醇罐 中，隨後進行蒸餾以回收使用。上述系統可以作為一個連續的程序進行操作，也可以採用分批處理的方式進行操 作。在一個連續程序中，含有各種必需的聚合物吸附劑和陰離子交換樹脂的柱子，可以連續 排布，這樣，一旦想要的生物活性化合物從一個柱子上洗脫下來，所獲得的洗脫液可直接送 進緊接的柱子上。本發明所獲得的生物活性化合物也可以採用任何合適的方式進行處理，使得這些 化合物的後續使用或儲存更方便。在一個優選的實施例中，該生物活性化合物可以進行蒸 發處理，例如冷凍乾燥，以從該化合物中除去多餘的溶劑，並由此將該生物活性化合物放置 在一個適合於儲存或進一步使用的形式中。本發明的再一方面提供一種由本文所述的方法生產的生物活性化合物。再一方面 提供一種含有檸檬苦素類葡萄糖苷的組合物。本發明可明顯提高從蔬果材料和蔬果提取 物中回收的生物活性化合物的純度。本發明還可以提高純化的生物活性化合物的回收率。 例如，從柑橘類水果中回收的檸檬苦素類葡萄糖苷，其在幹的柑橘類水果中的濃度可約達 50%至70%。在現有技術中，檸檬苦素類葡萄糖苷的回收量通常較低，約為10%至15%，而 本發明與現有技術相比，更為有利。此外，本發明的方法有利地提高了回收的生物活性化合 物的純度。由此，回收的多甲氧基黃酮混合更少的具有苦味的檸檬苦素。由於根據本發明的方法製得的生物活性化合物具有更高的純度，它們更容易配方 成功能性食物，只需更小的總劑量即可達到目標生物活性化合物的有效劑量，因此降低了 不想要的風味劑摻和到食物組方中的可能性。實施例下述的實施例是對本發明進行更詳細的說明，然而，這些實施例並非是對本發明 的保護範圍的限定。
材料和方法橙皮提取物通過朗氏(Lang)的技術，將橙皮提取物(OPE)製備成一種錘度為20. 4的溶液。 錘度是通過測量比重並利用換算表而測定的。簡言之，在一個電子天平上稱量25ml OPE的 質量。通過使用相同體積的去離子水對該質量進行劃分界定，測定其比重，所測得的比重值 為1.085。由換算表可知，該比重值相當於20. 4的錘度。OPE的pH值約為4.0 (默克廣泛 試紙)。圖1是橙皮提取物的一個代表性樣品的HPLC色譜圖。醇用於洗脫溶劑中的醇為95%的未變性乙醇。高效液相色譜法(HPLC)採用HPLC，對生物活性化合物從吸附劑聚合物樹脂上洗脫下來的進程進行監控。 HPLC是在以下條件下進行的 儀器島津VP7HPLC系統，包括低壓混合系統、SPD-MlOA VP 二極體陣列檢測器 以及用於控制梯度和檢測器的VP軟體； 流動相D 0. 1% (ν/ν)的磷酸水溶液； 流動相A 乙腈； 運行時間55分鐘； 柱子帶有保護柱的Alltima Cl 8 5u柱，零件號碼是88056 ； 監控波長210nm和280nm(在200nm至350nm之間每隔2nm採集的數據)； 柱溫30°C; 流速1. 0ml/min(反壓為 2915kgf/cm2)； 進樣體積20μ1; 表1列出了用於判斷是否存在檸檬苦素類化合物的HPLC梯度。
表1:用於測定檸檬苦素苷的HPLC梯度時間(分鐘)溶劑D的濃度
0. 0190. 0%35. 0070. 0%45. 0060. 0%46. 0090. 0%55. 00停止每次運行都對柱反壓進行監控，以保證柱子的性能是一致的。棚列1-棚舌艦☆鵬麵■ 勁勿吸
一個內直徑為40mm、高為540mm、配有聚四氟乙烯活塞的玻璃柱，填裝有350mm 高的非離子型乙二醇交聯聚甲基丙烯酸甲酯吸附劑聚合物樹脂(CAS 25777-18-5)(由 BucherFoodtech公司提供的Alimentech P495惰性吸附聚合物)。該樹脂的床體積為 400ml，其中柱隙死體積為180ml。使用前，該丙烯酸類聚合物吸附劑通常用10倍床體積的 水進行清洗。將三份250ml的OPE等分試樣(總共750ml)施加在含有丙烯酸類聚合物吸附劑 的柱子的頂部，每個等分試樣以4ml/分鐘的速度向下滲透流過該柱子。在該速度下，每個 等分試樣大約需要一個小時洗脫流過該柱子。施加OPE以後，用兩份250ml的水等分試樣 對該柱子進行清洗。然後，以250ml的等分試樣，將含有醇水混合物的洗脫溶劑施加在該柱子的頂部。 洗脫溶劑中的醇濃度，在所施加的每份等分試樣中是逐步遞增的。洗脫溶劑流過該柱子，隨 後收集在若干個餾分中，並通過HPLC進行分析。需要注意的是，洗脫餾分的醇濃度稍低於施加在柱子頂部的洗脫溶劑的醇濃度， 因為洗脫溶劑隨後會與保留在聚合物吸附劑的柱隙「死體積」內的液體相混合。經估算，醇 的濃度約降低當前洗脫餾分與被替代的前一餾分的醇濃度差值的三分之一。因此，例如，若 使用一個醇濃度為10%的溶液後，添加一個醇濃度為20%的溶液，則洗脫液中的醇濃度約 為 17%。一共收集了十二個餾分，通過HPLC進行分析。表2對其進行了說明。
表2:餾分特性1施加第一份250mL的OPE後的洗脫液2施加第二份250mL的OPE後的洗脫液
3施加第三份250mL的OPE後的洗脫液4第--次的水洗液5第二二次的水洗液610%的乙丨淳水溶液720%的乙丨淳水溶液830%的乙丨淳水溶液940%的乙丨淳水溶液 結果圖2至圖6是對應於上述餾分的HPLC分析結果的色譜圖。OPE中的成分通過保留 時間進行鑑別。這些圖表明，流出柱子的餾分中存在多種成分。圖2是從餾分1獲得的色譜圖。如圖2所示，色譜峰都較小，大部分的物質在4分 鍾內洗脫出來。在2分鐘處的第一色譜峰對應於糖類；在4分鐘處的第二色譜峰為根皮苷， 它是橙皮提取物的一個主要構成。餾分2至餾分6也獲得類似的結果。如圖3所示，在餾分7中，色譜峰的大小開始增大。在25. 48處的色譜峰是檸檬苦 素葡萄糖苷(LG)。在餾分8和餾分9中，對應於檸檬苦素葡萄糖苷的色譜峰也在增大。此外，如餾分 9所獲得的色譜圖(圖4)所示，觀察到有4個色譜峰，分別是一個典型的檸檬苦素類似物， 即檸檬苦素葡萄糖苷(25. 39分鐘)，一個相關的檸檬苦素類化合物(29. 9分鐘)，諾米林葡 萄糖苷(NG) (34. 16分鐘)以及在36. 98分鐘處的黃柏酮葡萄糖苷(OG)。在餾分10中，在34分鐘處仍然觀察到明顯的檸檬苦素類化合物，但那些在其之前 洗脫出來的色譜峰，其大小明顯減小了。由於餾分11中的醇濃度增加至60%左右，黃酮類化合物開始洗脫出來，如圖5所 示。此處兩個主要的色譜峰是黃酮類橘皮苷(28. 13分鐘)和芸香柚皮苷(30. 36分鐘)。在餾分12中，醇濃度在80%左右。如圖6所示，餾分12中的主要化合物是橘皮苷 和芸香柚皮苷，以及在40. 04分鐘處出現的另一種黃酮類化合物，推測為新枳屬苷(香蜂草 苷)。檸檬苦素葡萄糖苷濃度的測定由於沒有市售的檸檬苦素葡萄糖苷標準品，檸檬苦素葡萄糖苷的濃度是以檸檬苦 素(Sigma Aldrich)為對照品，通過比較峰面積以及應用一個換算值(1.4)來進行測定的， 應用該換算值是考慮到葡萄糖的分子量。HPLV系統的線性檢查是使用檸檬苦素標準品進行的。表3列出了線性檢查和校準 的結果。表3 線性檢查和校準的結果
濃度2IOnM處的峰面積450293500560039187287504886204構建檸檬苦素的濃度對應峰面積(210nm處)的校準圖表，並用以測定所收集的餾 分中檸檬苦素類化合物的含量。表4列出了餾分7至餾分10中檸檬苦素類化合物含量的原始數據，以及一個對照 例中檸檬苦素類化合物含量的原始數據表4:原始數據(面積)
峰面積餾分LGNGOG724590922459098442766044276618691839723615112693812532814102531755對照例7022709ND通過對照校準圖表，可以獲得橙皮提取物中檸檬苦素類葡萄糖苷含量的估算值。 這些結果在表5中列出。表5 :0ΡΕ中的檸檬苦素類葡萄糖苷的濃度(ppm)
餾分LGNGOG7375368679662869111019338710387對照例1077 由於其它化合物的幹擾，原始材料中的諾米林葡萄糖苷和黃柏酮葡萄糖苷未能測
24定。如本實施例所見，與黃酮類化合物相比，檸檬苦素類化合物在丙烯酸類聚合物樹 脂上的保留能力較弱，較低的醇濃度即可將其從丙烯酸樹脂上洗脫下來。這使得檸檬苦素 類化合物與黃酮類化合物分離開，所收集的餾分不會出現明顯的交叉汙染。棚列2-棚舌十牛僕洽鵬議種麵眺·胃一個直徑為2cm、長度為20cm的柱子，填裝有200mm高的弱鹼性陰離子交換樹脂 (由Supelco公司提供的Diaion WA-30樹脂，其平均粒徑為0. 47mm,總交換容量為1. 5meq/ mL)。該樹脂的床體積為50mL。使用前，該陰離子交換樹脂(WA-30)依次用2倍床體積 (IOOmL)的0. 5M氫氧化鈉溶液、5倍床體積(250mL)的水、2倍床體積的0. 5M鹽酸溶液以及 5倍床體積的水進行清洗，以對其進行調節。最後清洗的水，其PH值為4. 2。對實施例1所獲得的餾分8和餾分9進行處理，以進一步純化這些餾分中的檸檬 苦素類葡萄糖苷。這些餾分，醇含量分別為30%和40%，含有較高比例的檸檬苦素類葡萄 糖苷。將餾分8倒入調節好的弱鹼性陰離子交換樹脂(WA-30)的頂部。該溶液流過該柱 子，收集洗脫液並通過HPLC進行分析。以類似的方式，將餾分9倒入WA-30樹脂的頂部，類似地收集洗脫液並通過HPLC 進行分析。隨後使用250ml 30%的醇溶液對該陰離子交換樹脂進行清洗。然後使三份150mL 0. 5M的NaCl溶液等分試樣流過該陰離子交換樹脂，收集所洗脫的鹽溶液餾分，並通過HPLC 進行分析。結果表6列出了 HPLC所進行的各項分析。
表6:所採用的HPLC梯度時間溶劑D的濃度0.0190.035.0070.045.0060.04690.055.00停止圖7是將餾分9施加在WA-30柱後所獲得的洗脫液的色譜圖。先前在圖4中觀察 到的對應於檸檬苦素類化合物的色譜峰，在餾分9中並未出現，這是因為WA-30樹脂保留了 這些化合物。其它成分則不被該樹脂保留並從該柱子上洗脫下來。將餾分8施加在WA-30 樹脂後，也觀察到類似的結果。這表明，檸檬苦素類化合物結合在WA-30樹脂上。使0. 5M的NaCl溶液等分試樣流過WA-30樹脂，從而將檸檬苦素類化合物從該樹
25脂上解吸附下來。圖8是300ml 0.5M的NaCl溶液流過WA-30樹脂後，所獲得的洗脫液的 色譜圖。如圖8所示，該洗脫液餾分富含檸檬苦素類葡萄糖苷。檸檬苦素類葡萄糖苷的紫 外(UV)消光係數不如黃酮類化合物高，因此，該餾分中的檸檬苦素類葡萄糖苷的純度似乎 高於75%。這一結果表明，可以通過將檸檬苦素類化合物選擇性地吸附在一個離子交換樹脂 上，對其進行純化。然後，鹽溶液可以有效地將所結合的檸檬苦素類葡萄糖苷從該樹脂中除 去。所得到的純化的檸檬苦素類葡萄糖苷，其純度似乎超過50%。此外，純化的檸檬苦素類 葡萄糖苷不會受糖類或者芸香柚皮苷、橙皮苷和新枳屬苷等黃酮類化合物的汙染。實施例3-從橙皮提取物(OPE)中回收牛物活件化合物的方法對一種將生物活性化合物從橙皮提取物(OPE)中分離出來的方法進行說明。該方 法使用了以下4個分離柱柱A 此柱子是一個內直徑為40mm、高為540mm、配有聚四氟乙烯活塞的玻璃柱。其 部分填裝有200mm高的丙烯酸樹脂(由Bucher Foodtech公司提供的Alimentech P495惰 性吸附聚合物)。該樹脂的床體積為250mL，其中柱隙死體積為llOmL。柱B 此柱子是一個內直徑為23mm、高為180mm、配有聚四氟乙烯活塞的玻璃柱。 其部分填裝有180mm高的聚苯乙烯一二乙烯基苯樹脂(由Sigma-Aldrich公司提供的 AmberliteXAD-16，其表面積為800m2/g，平均孔徑為100埃)。該樹脂的床體積為50mL。柱C 此柱子是一個內直徑為23mm、高為180mm、配有聚四氟乙烯活塞的玻璃柱。其 部分填裝有200mm高的弱鹼性陰離子交換樹脂(由Supelco公司提供的Diaion WA-30樹 脂，其平均粒徑為0. 47mm,總交換容量為1. 5meq/mL)。該樹脂的床體積為50mL。柱D 此柱子是一個內直徑為23mm、高為180mm、配有聚四氟乙烯活塞的玻璃柱。其 部分填裝有180mm高的樹脂(由Sigma-Aldrich公司提供的Amberlite XAD-16，其表面積 為800m2/g，平均孔徑為100埃)。該樹脂的床體積為50mL。所提供的OPE和聚合物吸附劑樹脂可直接使用，或者使用前先按照上述的一般程 序進行製備。通過高效液相色譜法(島津VP7 HPLC系統，包括低壓混合系統FCV-10AL、脫氣系 統D⑶-14A、溶劑輸送系統LC-1OAD、自動進樣器SIL-1OAD、二極體陣列檢測器SPD-M1 OA VP 以及VP軟體)，對生物活性化合物在各個柱子上的洗脫進行監控。柱A (丙烯酸類聚合物吸附劑)在本實驗中，採用丙烯酸類聚合物吸附劑將檸檬苦素類葡萄糖苷從黃酮類化合物 中分離出來。以每等分試樣1升，將6升錘度為4. 1的OPE施加在含有丙烯酸類聚合物吸附劑 的柱子(柱A)上。施加各個等分試樣後，OPE可滲透流過該柱子。開始時，1升OPE流過柱子後，並沒有檸檬苦素類或黃酮類化合物從柱子上洗脫下 來。將2升OPE施加在柱子上以後，觀察到有檸檬苦素類化合物從柱子上洗脫下來(主要 是檸檬苦素葡萄糖苷，保留時間為19分鐘)。將總共的3、4和5升OPE施加在丙烯酸樹脂 上以後，觀察到更多的檸檬苦素類化合物從丙烯酸樹脂上洗脫下來，主要是檸檬苦素葡萄 糖苷(LG)、去乙醯諾米林葡萄糖苷(DANG)(保留時間為24. 5分鐘)，諾米林葡萄糖苷(NG) (保留時間為28. 4分鐘)以及諾米林酸葡萄糖苷(NAG)(保留時間為29分鐘)。將6升OPE施加在柱子上以後，除了先前鑑別的檸檬苦素類化合物以外，還觀察到有黃柏酮葡萄糖 苷(OG)從柱子上洗脫下來(保留時間為31分鐘)。圖9是6升OPE洗脫流過柱(A)後所獲得的洗脫液的HPLC色譜圖。可以測定從 丙烯酸類聚合物樹脂上洗脫下來的各個檸檬苦素類葡萄糖苷化合物的相對含量，圖10是 各個檸檬苦素類葡萄糖苷化合物的相對含量曲線圖。在所收集的洗脫液中，並沒有檢測到任何主要的黃酮類化合物。由此表明，丙烯酸 類聚合物吸附劑能夠充分地將黃酮類化合物從OPE中除去，而不被丙烯酸樹脂吸附的檸檬 苦素類化合物可以流過該樹脂。如下文所述，從柱(A)上洗脫下來的OPE餾分隨後可以加載在柱(B)上，從而對檸 檬苦素類葡萄糖苷進行純化，並從存在於OPE中的天然糖類和其它大極性的化合物中製備 出一種美味的「果汁」。一旦OPE流出了該丙烯酸樹脂，即用2倍床體積的水對該柱子進行清洗。進一步 地，大量的檸檬苦素類化合物隨著水從該柱子上洗脫下來，然而，在該水洗脫液中並沒有觀 察到黃酮類化合物。然後將一種乙醇一水洗脫劑溶液施加在該柱子的頂部，以將吸附在該丙烯酸類聚 合物樹脂上的黃酮類化合物洗脫下來。按照表7，所施加的醇的梯度濃度，以一個階梯式的 方式從20% (ν/ν)遞增至60% (ν/ν)。施加後，每個洗脫劑等分試樣滲透流過該柱子，以將 具有生物活性的黃酮類化合物從該丙烯酸樹脂上解吸附下來。隨後收集解吸附的化合物並 通過HPLC進行分析。表 7 採用含有20%乙醇的溶液對丙烯酸樹脂(柱(A))進行解吸附以後，所獲得的洗脫 液不含有任何的黃酮類化合物。然而，當洗脫劑中的乙醇濃度增加至30%時，所得到的洗脫 液確實含有少量的黃酮類化合物。進一步地，洗脫液中的乙醇濃度增加至40%和50%時， 會將大量的黃酮類化合物芸香柚皮苷(保留時間為22分鐘)和橘皮苷(保留時間為24. 35 分鐘)從丙烯酸樹脂上解吸附並洗脫下來。當洗脫劑中的乙醇含量增加至60%時，所得到 的洗脫液含有大量的芸香柚皮苷和橘皮苷以及保留時間為27分鐘的香蜂草苷。
圖11是使用40%的乙醇溶液將黃酮類化合物從柱(A)上解吸附下來後，所獲得的 洗脫液餾分的HPLC色譜圖。可以測定通過各個洗脫劑餾分，從丙烯酸類聚合物樹脂上解吸 附下來的各個黃酮類化合物的相對含量，圖12是隨著醇濃度的遞增，所收集的黃酮類化合 物的相對含量曲線圖。已經發現，丙烯酸類聚合物樹脂會保留黃酮類化合物，而檸檬苦素類葡萄糖苷會 隨著極性更大的多酚、糖類和有機酸一起流出該樹脂。然後可以使用乙醇水溶液將黃酮類 化合物從丙烯酸樹脂上解吸附下來。柱B (聚苯乙烯一二乙烯基苯吸附劑)在本實驗中，採用聚苯乙烯一二乙烯基苯柱，將從柱(A)洗脫得到的檸檬苦素類 葡萄糖苷與天然的糖類和極性更大的化合物分離開。在本試驗中，將從柱(A)獲得的總共6升錘度為4. 1的OPE加載在含有聚苯乙烯一 二乙烯基苯聚合物吸附劑的柱(B)上，其中每1升等分試樣從丙烯酸樹脂柱流出後即加載 在柱(B)上。OPE等分試樣可滲透流過該聚苯乙烯一二乙烯基苯樹脂，收集洗脫得到的等分 試樣並通過HPLC進行分析。將第一和第二份OPE等分試樣施加在柱(B)上後，未觀察到有檸檬苦素類葡萄糖 苷從該柱子上洗脫下來。施加並洗脫第三和第四份OPE等分試樣後，觀察到有少量的檸檬 苦素類葡萄糖苷(但沒有黃酮類化合物)流出該柱子。將第五和第六份OPE等分試樣施加 在柱(B)上後，有一些檸檬苦素葡萄糖苷以及少量其它的檸檬苦素類葡萄糖苷從該柱子上 洗脫下來。然後用4倍床體積的水對該柱子進行清洗，以將天然的糖類和其它大極性的物 質從該柱子上除去。收集各個水餾分，並與洗脫得到的OPE餾分結合，從而形成一種美味 的、不含任何苦味化合物的「果汁」成分。圖13是從柱(B)獲得的「果汁」成分的HPLC色 譜圖。從柱(B)獲得的OPE洗脫液沒有顯著的黃酮類化合物(主要是橘皮苷、芸香柚皮苷 和香蜂草苷)，也不含有檸檬苦素葡萄糖苷、去乙醯諾米林葡萄糖苷、諾米林葡萄糖苷、諾米 林酸葡萄糖苷和黃柏酮葡萄糖苷這五種檸檬苦素類葡萄糖苷。從柱(B)獲得的OPE洗脫液 含有多酚、糖類和有機酸。該洗脫液適合於混合進橙汁等食物產品中，以增補該食物產品。然後採用一種乙醇一水洗脫劑溶液，將保留在柱(B)上的檸檬苦素類葡萄糖苷從 柱子上解吸附下來。如表8所示，洗脫劑設有遞增的乙醇梯度，從10% (ν/ν)遞增至80% (ν/ν)。表8 施加後，每個洗脫劑等分試樣滲透流過該柱子，以將檸檬苦素類葡萄糖苷化合物 從柱(B)上解吸附下來，隨後將其收集並通過HPLC進行分析。採用含有10%乙醇的溶液對聚苯乙烯一二乙烯基苯聚合物樹脂(柱B)進行解 吸附以後，所獲得的洗脫液含有一些檸檬苦素類葡萄糖苷，主要是去乙醯諾米林葡萄糖苷 (保留時間為25分鐘)和諾米林葡萄糖苷(保留時間為29分鐘)。當洗脫劑中的醇濃度增加至20%時，觀察到有其它檸檬苦素類葡萄糖苷化合物， 即檸檬苦素葡萄糖苷、諾米林酸葡萄糖苷和黃柏酮葡萄糖苷，從柱(B)上洗脫下來。當洗脫 劑中的乙醇濃度進一步增加至30%、50%和80%時，從聚苯乙烯一二乙烯基苯聚合物樹脂 上解吸附下來的五種檸檬苦素類葡萄糖苷的含量更高。圖14是將檸檬苦素類葡萄糖苷化合物從柱(B)上解吸附下來後，所獲得的洗脫液 餾分的HPLC色譜圖。可以測定在各個洗脫液餾分中，從聚苯乙烯一二乙烯基苯聚合物樹脂 上解吸附下來的各個檸檬苦素類葡萄糖苷化合物的相對含量，圖15是所收集的各個檸檬 苦素類葡萄糖苷的相對含量曲線圖。柱C (弱鹼性陰離子交換樹脂)本實驗表明，可使用弱鹼性陰離子交換樹脂柱，將從柱(B)洗脫得到的檸檬苦素 類葡萄糖苷與更中性的化合物分離開。合併含有從柱(B)解吸附下來的檸檬苦素類葡萄糖苷的洗脫液，用水稀釋至乙醇 的濃度約為20% (ν/ν) 0然後將合併後的洗脫液施加在柱(C)的頂部，使之以每小時約10 倍床體積的速率滲透流過該柱子。流出該柱子的液體被丟棄。然而，在商業應用中，該液體 可以被轉移，隨後將醇回收。HPLC分析表明，流出柱(C)的液體不含有任何的檸檬苦素類葡 萄糖苷。然後使用0. 5Μ的氯化鈉(鹽水)溶液，將檸檬苦素類葡萄糖苷從柱(C)解吸附下 來。幾乎100%的檸檬苦素類葡萄糖苷都在流過該柱子的8倍床體積的鹽水中洗脫出來。 圖16是鹽水溶液流出柱(C)的陰離子交換樹脂後，所獲得的洗脫液的HPLC色譜圖。圖17 是隨著施加在該樹脂上的鹽水用量的增加，從該陰離子交換樹脂上解吸附下來的各個檸檬 苦素類葡萄糖苷的含量曲線圖。柱D (聚苯乙烯一二乙烯基苯吸附劑)本實驗表明，可使用聚苯乙烯一二乙烯基苯聚合物吸附劑，將從柱(C)洗脫得到 的檸檬苦素類葡萄糖苷化合物中的氯化鈉鹽除去。可觀察到，氯化鈉鹽流過柱(D)的聚苯 乙烯一二乙烯基苯聚合物吸附劑，而檸檬苦素類葡萄糖苷被該聚合物保留。將從柱(C)獲得的含有解吸附的檸檬苦素類葡萄糖苷化合物的鹽水溶液，施加在 柱(D)的聚苯乙烯一二乙烯基苯樹脂的頂部，使之滲透流過該聚合物樹脂。可觀察到，檸檬 苦素類葡萄糖苷吸附在該聚合物吸附劑上，而鹽水中的氯化鈉不發生吸附。然後用4倍床 體積的水對柱(D)進行清洗，以除去氯化鈉鹽。然後採用含50%乙醇的乙醇一水洗脫劑溶液，將檸檬苦素類葡萄糖苷從聚苯乙烯一二乙烯基苯聚合物樹脂上解吸附下來。圖18是解吸附檸檬苦素類葡萄糖苷後，所收集 的洗脫液餾分的HPLC色譜圖。本方法的一個成果是，可獲得濃縮的檸檬苦素類葡萄糖苷餾分。如圖19疊加的 HPLC色譜圖所示，圖中顯示了原始的橙皮提取物(各個色譜圖中的下方譜線)和濃縮的檸 檬苦素類葡萄糖苷餾分(各個色譜圖中的上方譜線)，原始OPE中的檸檬苦素類葡萄糖苷的 總濃度約為lOOOppm，單獨的色譜峰難以觀察到。然而，在所得到的濃縮餾分中，檸檬苦素類 葡萄糖苷的含量總計為濃縮物成分的80%以上。假定錘度為12的OPE總共含有IOOOppm 的檸檬苦素類葡萄糖苷，每1升含有IOOmg純的檸檬苦素類葡萄糖苷。因此，對於本方法的 每一個循環，每1升丙烯酸樹脂可以生產1克檸檬苦素類葡萄糖苷。上述實施例表明，可以採用不同的聚合物吸附劑樹脂，對來源於橙皮提取物的生 物活性化合物進行分離和純化，而不會造成目標化合物的明顯損失。應當理解，在不違背本發明的精神的前提下，可以對本發明進行各種其它的修改 和/或變換。
權利要求
一種生物活性化合物的分離方法，該方法包括以下步驟(a)使若干種生物活性化合物與一種聚合物吸附劑接觸，其條件是至少一種生物活性化合物吸附在該吸附劑上，而至少一種生物活性化合物不吸附在該吸附劑上；以及(b)收集含有至少一種未被該吸附劑吸附的生物活性化合物的溶液。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的聚合物吸附劑為丙烯酸類聚合物 吸附劑。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述的聚合物吸附劑為丙烯酸酯。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述的聚合物吸附劑為聚甲基丙烯酸甲
5.根據權利要求1至4的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的聚合物吸附劑排 布在一個通道中。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述的聚合物吸附劑排布在一個柱子中。
7.根據權利要求1至6的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的若干種生物活性 化合物包括黃烷酮糖苷和檸檬苦素類葡萄糖苷，其中，黃烷酮糖苷與檸檬苦素類葡萄糖苷 被充分地分離開。
8.根據權利要求1至7的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的若干種生物活性 化合物包括黃烷酮糖苷和檸檬苦素類葡萄糖苷，其中，黃烷酮糖苷完全吸附在步驟(a)的 聚合物吸附劑上，而檸檬苦素類葡萄糖苷不吸附在該吸附劑上。
9.根據權利要求1至8的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的聚合物吸附劑將 黃烷酮類化合物與檸檬苦素類化合物充分地分離開。
10.根據權利要求1至9的其中之一所述的方法，還包括以下步驟(c)使吸附在步驟(a)的聚合物吸附劑上的至少一種生物活性化合物與一種洗脫劑接 觸，其條件是至少一種生物活性化合物從該吸附劑上解吸附下來；以及(d)將至少一種生物活性化合物從該吸附劑上洗脫下來。
11.根據權利要求10所述的方法，其特徵在於所述的洗脫劑包括醇和水。
12.根據權利要求11所述的方法，其特徵在於將至少一種生物活性化合物從該吸附 劑上解吸附下來的過程中，洗脫劑中的醇濃度是完全保持不變的。
13.根據權利要求11所述的方法，其特徵在於將至少一種生物活性化合物從該吸附 劑上解吸附下來的過程中，洗脫劑中的醇濃度是遞增的。
14.根據權利要求13所述的方法，其特徵在於將至少一種生物活性化合物從該吸附 劑上解吸附下來的過程中，洗脫劑中的醇濃度從20% (v/v)遞增至80% (v/v)
15.根據權利要求11至14的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的醇為乙醇。
16.根據權利要求1至15的其中之一所述的方法，還包括以下步驟(e)使從步驟(b)獲得的含有至少一種生物活性化合物的溶液與一種聚合物吸附劑接 觸，其條件是至少一種生物活性化合物吸附在該吸附劑上；以及(f)收集從該聚合物吸附劑上洗脫下來的溶液。
17.根據權利要求16所述的方法，其特徵在於步驟(e)的聚合物吸附劑具有吸附非 極性化合物的能力。
18.根據權利要求17所述的方法，其特徵在於步驟(e)的聚合物吸附劑是聚苯乙烯一二乙烯基苯。
19.根據權利要求16至18的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的聚合物吸附劑 排布在一個通道中。
20.根據權利要求19所述的方法，其特徵在於所述的聚合物吸附劑排布在一個柱子中。
21.根據權利要求16至20的其中之一所述的方法，還包括以下步驟(g)使吸附在步驟(e)的聚合物吸附劑上的至少一種生物活性化合物與一種洗脫劑接 觸，其條件是至少一種生物活性化合物從該吸附劑上解吸附下來；以及(h)將至少一種生物活性化合物從該吸附劑上洗脫下來。
22.根據權利要求21所述的方法，其特徵在於步驟(g)的洗脫劑包括醇和水。
23.根據權利要求22所述的方法，其特徵在於將至少一種生物活性化合物從該吸附 劑上解吸附下來的過程中，洗脫劑中的醇濃度是完全保持不變的。
24.根據權利要求22所述的方法，其特徵在於將至少一種生物活性化合物從該吸附 劑上解吸附下來的過程中，洗脫劑中的醇濃度是遞增的。
25.根據權利要求24所述的方法，其特徵在於將至少一種生物活性化合物從該吸附 劑上解吸附下來的過程中，洗脫劑中的醇濃度從10% (v/v)遞增至80% (v/v)
26.根據權利要求22至25的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的醇為乙醇。
27.根據權利要求21至26的其中之一所述的方法，還包括以下步驟(i)使從步驟(h)洗脫獲得的至少一種生物活性化合物與一種離子交換樹脂接觸，其 條件是至少一種生物活性化合物與該樹脂之間發生離子相互作用，從而使至少一種生物活 性化合物吸附在該樹脂上。
28.根據權利要求27所述的方法，其特徵在於所述的離子交換樹脂為陰離子交換樹脂。
29.根據權利要求28所述的方法，其特徵在於所述的離子交換樹脂為弱鹼性陰離子 交換樹脂。
30.根據權利要求27至29的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的離子交換樹脂 排布在一個通道中。
31.根據權利要求30所述的方法，其特徵在於所述的離子交換樹脂排布在一個柱子中。
32.根據權利要求27至31的其中之一所述的方法，還包括以下步驟(j)使吸附在步驟(i)的離子交換樹脂上的至少一種生物活性化合物與一種含有溶質 的溶液接觸，其條件是溶質將至少一種生物活性化合物從該樹脂上置換出來；以及 (k)將至少一種生物活性化合物從該樹脂上洗脫下來。
33.根據權利要求32所述的方法，其特徵在於所述的溶質為鹽。
34.根據權利要求33所述的方法，其特徵在於所述的鹽為氯化鈉。
35.根據權利要求33或34所述的方法，其特徵在於鹽的濃度為0.5M。
36.根據權利要求32至35的其中之一所述的方法，還包括以下步驟(1)使從步驟(k)獲得的至少一種生物活性化合物與一種聚合物吸附劑接觸，其條件 是至少一種生物活性化合物吸附在該吸附劑上。
37.根據權利要求36所述的方法，其特徵在於步驟(1)的聚合物吸附劑具有吸附非 極性化合物的能力。
38.根據權利要求36所述的方法，其特徵在於所述的聚合物吸附劑為聚苯乙烯一二乙煉基苯。
39.根據權利要求36至38的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的聚合物吸附劑 排布在一個通道中。
40.根據權利要求39所述的方法，其特徵在於所述的聚合物吸附劑排布在一個柱子中。
41.根據權利要求36至40的其中之一所述的方法，還包括以下步驟(m)使吸附在步驟(1)的聚合物吸附劑上的至少一種生物活性化合物與一種洗脫劑接 觸，其條件是至少一種生物活性化合物從該吸附劑上解吸附下來；以及 (n)將至少一種生物活性化合物從該吸附劑上洗脫下來。
42.根據權利要求41所述的方法，其特徵在於步驟(m)的洗脫劑包括醇和水。
43.根據權利要求42所述的方法，其特徵在於將至少一種生物活性化合物從該吸附 劑上解吸附下來的過程中，洗脫劑中的醇濃度是完全保持不變的。
44.根據權利要求42所述的方法，其特徵在於將至少一種生物活性化合物從該吸附 劑上解吸附下來的過程中，洗脫劑中的醇濃度是遞增的。
45.根據權利要求44所述的方法，其特徵在於將至少一種生物活性化合物從該吸附 劑上解吸附下來的過程中，洗脫劑中的醇濃度從10% (v/v)遞增至80% (v/v)
46.根據權利要求42所述的方法，其特徵在於步驟(m)的洗脫劑含有70%的醇。
47.根據權利要求42至46的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的醇為乙醇。
48.根據權利要求1至47的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的若干種生物活 性化合物來源於柑橘類水果。
49.根據權利要求48所述的方法，其特徵在於所述的若干種生物活性化合物來源於 柑橘類水果的果皮。
50.一種生物活性化合物的純化方法，包括使生物活性化合物與一種離子交換樹脂接 觸的步驟，其條件是生物活性化合物與該樹脂之間發生離子相互作用，從而使生物活性化 合物吸附在該樹脂上。
51.根據權利要求50所述的方法，其特徵在於所述的離子交換樹脂為陰離子交換樹脂。
52.根據權利要求51所述的方法，其特徵在於所述的離子交換樹脂為弱鹼性陰離子 交換樹脂。
53.根據權利要求50至52的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的離子交換樹脂 排布在一個通道中。
54.根據權利要求53所述的方法，其特徵在於所述的離子交換樹脂排布在一個柱子 中。
55.根據權利要求50至54的其中之一所述的方法，還包括以下步驟使吸附在該離子交換樹脂上的生物活性化合物與一種含有溶質的溶液接觸，其條件是 溶質將該生物活性化合物從該樹脂上置換出來；以及將該生物活性化合物從該樹脂上洗脫下來。
56.根據權利要求55所述的方法，其特徵在於所述的溶質為鹽。
57.根據權利要求56所述的方法，其特徵在於所述的鹽為氯化鈉。
58.根據權利要求56或57所述的方法，其特徵在於鹽的濃度為0.5M。
59.根據權利要求55至58的其中之一所述的方法，還包括使洗脫得到的生物活性化合 物與一種聚合物吸附劑接觸，其條件是該生物活性化合物吸附在該吸附劑上。
60.根據權利要求59所述的方法，其特徵在於所述的聚合物吸附劑具有吸附非極性 化合物的能力。
61.根據權利要求59所述的方法，其特徵在於所述的聚合物吸附劑為聚苯乙烯一二乙煉基苯。
62.根據權利要求59至61的其中之一所述的方法，還包括以下步驟使吸附在該聚合物吸附劑上的生物活性化合物與一種洗脫劑接觸，其條件是該生物活 性化合物從該吸附劑上解吸附下來；以及將該生物活性化合物從該吸附劑上洗脫下來。
63.根據權利要求62所述的方法，其特徵在於所述的洗脫劑包括醇和水。
64.根據權利要求63所述的方法，其特徵在於將至少一種生物活性化合物從該吸附 劑上解吸附下來的過程中，洗脫劑中的醇濃度是完全保持不變的。
65.根據權利要求63所述的方法，其特徵在於將至少一種生物活性化合物從該吸附 劑上解吸附下來的過程中，洗脫劑中的醇濃度是遞增的。
66.根據權利要求65所述的方法，其特徵在於醇的濃度從30%(v/v)遞增至80% (v/v) o
67.根據權利要求63至66的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的醇為乙醇。
68.根據權利要求50至67的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的生物活性化合 物為檸檬苦素類葡萄糖苷。
69.一種從蔬果材料中選擇性提取生物活性化合物的方法，該方法包括使蔬果材料與 一種溶劑接觸的步驟，其條件是從該蔬果材料中提取至少一種水溶性的生物活性化合物， 由此提供一種含有該水溶性生物活性化合物的提取物以及含有至少一種水不溶性生物活 性化合物的蔬果殘渣。
70.根據權利要求69所述的方法，其特徵在於採用一種逆流提取器，使溶劑與蔬果材 料接觸，由此從該蔬果材料中提取至少一種水溶性的生物活性化合物。
71.根據權利要求70所述的方法，其特徵在於所述水溶性生物活性化合物的提取是 在70°C以上的溫度下進行的。
72.根據權利要求69至71的其中之一所述的方法，該方法還包括使蔬果殘渣與一種含 有醇的提取溶液接觸的步驟，其條件是從該蔬果殘渣中提取至少一種水不溶性的生物活性 化合物，並由此提供一種含有至少一種水不溶性生物活性化合物的醇提取物。
73.根據權利要求72所述的方法，其特徵在於所述的提取溶液含有10%的醇。
74.根據權利要求72所述的方法，其特徵在於所述的提取溶液含有20%的醇。
75.根據權利要求72至74的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的醇為乙醇。
76.根據權利要求72至75的其中之一所述的方法，其特徵在於採用一種逆流提取器，使提取溶液與蔬果殘渣接觸，由此將水不溶性生物活性化合物從該蔬果殘渣中提取出來。
77.根據權利要求72至76的其中之一所述的方法，還包括使該醇提取物與一種聚合物 吸附劑接觸的步驟，其條件是至少一種水不溶性生物活性化合物吸附在該吸附劑上。
78.根據權利要求77所述的方法，其特徵在於所述的聚合物吸附劑具有吸附非極性 化合物的能力。
79.根據權利要求77所述的方法，其特徵在於所述的聚合物吸附劑為聚苯乙烯一二乙煉基苯。
80.根據權利要求77至79的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的聚合物吸附劑 排布在一個通道中。
81.根據權利要求80所述的方法，其特徵在於所述的聚合物吸附劑排布在一個柱子中。
82.根據權利要求77至81的其中之一所述的方法，還包括以下步驟使吸附在該聚合物吸附劑上的水不溶性生物活性化合物與一種洗脫劑接觸，其條件是 至少一種水不溶性生物活性化合物從該吸附劑上解吸附下來；以及 將至少一種水不溶性生物活性化合物從該吸附劑上洗脫下來。
83.根據權利要求82所述的方法，其特徵在於所述的洗脫劑包括醇和水。
84.根據權利要求83所述的方法，其特徵在於將至少一種生物活性化合物從該吸附 劑上解吸附下來的過程中，洗脫劑中的醇濃度是完全保持不變的。
85.根據權利要求83所述的方法，其特徵在於將至少一種生物活性化合物從該吸附 劑上解吸附下來的過程中，洗脫劑中的醇濃度是遞增的。
86.根據權利要求85所述的方法，其特徵在於在至少一種生物活性化合物從該吸附 劑上解吸附下來的過程中，洗脫劑中的醇濃度從10% (v/v)遞增至80% (v/v)
87.根據權利要求83至86的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的醇為乙醇。
88.根據權利要求69至87的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的蔬果材料來源 於柑橘類水果。
89.根據權利要求69至88的其中之一所述的方法，其特徵在於所述的蔬果材料含有 作為水溶性生物活性化合物的檸檬苦素類葡萄糖苷和黃烷酮糖苷，以及作為水不溶性生物 活性化合物的多甲氧基黃酮。
90.由權利要求1至89的其中之一所述的方法製得的生物活性化合物。
91.一種含有純度在10%以上的檸檬苦素類糖苷的組合物。
92.一種含有純度在50%以上的檸檬苦素類糖苷的組合物。
93.一種含有純度在70%以上的檸檬苦素類糖苷的組合物。
全文摘要
本發明涉及一種對來源於蔬果材料的生物活性化合物進行分離的方法。本發明還涉及一種從蔬果材料中提取生物活性化合物的方法。
文檔編號B01D15/04GK101888889SQ200880119836
公開日2010年11月17日 申請日期2008年10月9日 優先權日2007年10月10日
發明者蒂姆·朗, 韋恩·辛普金斯 申請人:朗氏科技有限公司