重組抗表皮生長因子受體抗體組合物的製作方法
2023-05-15 00:31:56 3
重組抗表皮生長因子受體抗體組合物的製作方法
【專利摘要】本發明是關於適用於人類癌症治療的重組抗體領域。更特定言的，本發明提供能夠結合人類EGFR的抗體的組合物或混合物。具有3種或3種以上抗體的抗體組合物展示使代表性癌細胞系增殖減少的協同作用。使用包含兩種不同嵌合抗hEGFR抗體的組合物亦獲得有利結果，其在動物模型中展示基於迅速及有效受體內化、誘導終末分化及後續腫瘤根除的新的作用機制。本發明的抗體可在一生物反應器中以多克隆抗體形式製備。
【專利說明】重組抗表皮生長因子受體抗體組合物
[0001] 本申請是中國申請號為200880006835. 0、發明名稱為"重組抗表皮生長因子受體 抗體組合物"且申請日為2008年2月27日的專利申請（PCT申請號為PCT/DK2008/050047) 的分案申請。
[0002] 【發明所屬的【技術領域】】
[0003] 本發明是關於適用於人類癌症治療的重組抗體領域。
[0004] 發明背景
[0005] 表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)在細胞增 殖以及細胞凋亡、血管生成及轉移性擴散（對腫瘤發展至關重要的過程）中發揮重要 作用（Salomon 等人，Crit. Rev. Oncology/Haematology, 19:183-232 (1995) ;Wu 等人， J.Clin. Invest. ,95:1897-1905(1995) ;Karnes 等人，Gastroenterology, 114:930-9 39(1998) ;Woodburn 等人，Pharmacol. Therap. 82:241-250(1999) ;Price 等人，Eur. J. Cancer，32A: 1977-1982 (1996))。實際上，研究已證明在包括非小細胞肺癌、前列腺癌、 乳癌、胃癌及頭部及頸部腫瘤的多種實體瘤中，EGFR介導細胞生長增加 （Salomon DS等 人，Critical Reviews in Oncology/Haematology, 19:183-232(1995))。此外，現已知癌 細胞表面上EGFR的過度活化與晚期疾病、轉移性表型的發展及癌症患者的不良預後相關 (Salomon DS 等人，Critical Reviews in 0ncology/Haematologyl9:183-232 (1995))。
[0006] 此外，EGFR表達時常伴隨EGFR表達腫瘤細胞中EGFR配體，尤其TGF-α及 EGF的產生，此表明自分泌環參與該等細胞的發展（Baselga等人（1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154 ;Modjtahedi 等人（1994) Int. J. Oncology. 4:277-296)。因此阻 斷該等EGFR配體與EGFR之間的相互作用可抑制腫瘤生長及存活（Baselga等人，（1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154)〇
[0007] EGFR為分子量為約170kDa的膜結合醣蛋白。EGFR由以短的23個胺基酸跨膜接頭 連接的糖基化外部配體結合域￠21個殘基）及細胞質域（542個殘基）組成。EGFR的細胞 外部分含有25個雙硫鍵及12個N連接糖基化位點，且通常認為由四個子域組成。EGFR的X 射線晶體結構表明該受體採用不能結合EGF的自抑制約束構形（tethered-conformation) (Ferguson等人，Mol Cell, 2003,第11卷：507-517)與可介導EGF配體結合及受體二聚的 活性構形（Garret 等人，Cell2002,第 110 卷：763-773 ;0giso 等人，Cell, 2002,第 110 卷： 775-787)。具體的，已暗示域I及域III為高親和力配體結合位點的形成提供附加貢獻。域 II及域IV為富含半胱氨酸的層粘連蛋白樣區域，其使蛋白質摺疊穩定且含有可能的EGFR 二聚界面。
[0008] 已知EGFR以多種不同構形在細胞表面上存在，其中約束（tethered)構形或鎖定 構形最常見。約束構形不能二聚且因此無活性。已知治療抗體艾比特思（Erbitux)通過與 域III結合且在空間上妨礙受體達成非約束狀態來使約束構形穩定。然而，一些受體可能 仍能夠接受非約束構形、結合配體且二聚。單克隆抗體（mAb)通常僅有效結合該等構形中 的一者，且因此不能有效靶向展現其它構形的癌細胞或展現多種構形的癌細胞。
[0009] 針對EGFR配體結合域的單克隆抗體（mAb)可阻斷與EGFR配體的相互作用且隨之 阻斷所得細胞內信號轉導路徑。
[0010] 艾比特思?(Erbitux?)(西妥昔單抗（Cetuximab))為與人類（EGFR)胞外域特異 性結合的重組、人類/小鼠嵌合單克隆抗體。艾比特思包含鼠類抗EGFR抗體的Fv區域與 人類IgGl重鏈及κ輕鏈恆定區且分子量約為152kDa。艾比特思是在哺乳動物細胞培養 物（鼠類骨髓瘤）中產生。艾比特思經批准用於治療患有轉移性結腸直腸癌且其腫瘤表達 EGFR的患者。此外，艾比特思與放射性療法組合用於治療患有不能通過手術移除的頭頸鱗 狀細胞癌的患者，或用作標準鉬基療法已失敗的頭頸鱗狀細胞癌的第二線治療。
[0011] 維克替比?(Vectibix?)(盤尼圖單抗（panitumumab))為與人類EGFR特異性結 合的人類IgG2K單克隆抗體的重組。維克替比的分子量約為147kDa。盤尼圖單抗是在遺 傳工程化的哺乳動物細胞（中國倉鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary))中產生。維克替比 經批准用於治療患有轉移性結腸直腸癌且其腫瘤表達EGFR，且疾病在含氟嘧啶、奧賽力鉬 (oxaliplatin)及伊立替康（irinotecan)的化學療法方案治療中或治療之後仍發展的患 者。
[0012] 已在人類腫瘤細胞上鑑別出多種突變型EGF受體。此等突變型受體可使受體活性 獨立於配體結合（EGFRvIII)，從而導致致瘤性增強。可產生針對突變型EGFR的單克隆抗 體，但該單克隆抗體將不必有效針對非突變型EGFR。
[0013] 已在人類癌症患者中鑑別出EGFR的突變，其影響該等患者對針對EGFR的化學療 法的反應。W02006/110478(Novartis)揭示EGFR開放閱讀框架中的43個突變以及18個 SNP。在兩種或兩種以上類型的腫瘤類型中鑑別到一些錯義突變。W02006/091899 (Amgen) 揭示在各種癌細胞中鑑別出的八個其它突變。該等突變中的一或多者可位於由目前批准的 單克隆抗體中的之一結合的表位中或影響該表位的結構。攜帶該等突變的患者將不能由單 克隆抗體治療。
[0014] 此外，文獻中有報導展示糖基化位點中的至少一者的糖基化的異質性（Whitson 等人，2005Biochemistry44:14920-31 ;Zhen 等人，2003Biochemistry42 ;5478_92)。該異質 性可直接或間接引起在腫瘤細胞之間不同的表位的差異暴露。
[0015] 抗體依賴性細胞毒性（antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)為抗 體介導殺死腫瘤細胞的替代性機制。ADCC的程度視若干因素而定，該等因素包括IgG亞型 (IgM>IgGl>IgG2)、目標細胞上的抗體密度、抗體糖基化模式以及目標本身的特性。
[0016] Friedmann等人（PNAS2005, 102:1915-20)已證明就通過結合有區別的EGFR表位 來抑制EGF與EGFR結合的能力而選擇的兩種鼠類單克隆抗體，其能夠協同地調降瞬時表達 EGFR的KB細胞及CH0細胞中的受體表達。交叉競爭性EGF抑制抗體並不展現任何協同作 用。
[0017] Modjtahedi 等人（Cell Biophysics 第 22 卷，1993, 129-146)已測試若干大鼠抗 EGFR抗體與不重疊的表位的組合。該等抗體具有不同同種型。在任何情況下，使用兩種抗 體的效果介於單獨使用類似量的兩種單克隆抗體的效果的中間。在體內與體外均證實該結 果。
[0018] W02004/032960 (Merck Patent)揭示組合使用兩種單克隆抗體Mab425與 Mab225(西妥昔單抗），與單獨使用類似量的該等單克隆抗體中的每一者相比，產生增加量 的與EGFR表達癌細胞表面結合的抗體。該公開案亦揭示當使用抗體組合時，與使用兩種單 克隆抗體相比，EGFR的下調會增加。
[0019] Perera 等人（Clin Cancer Res2005:11 (17) :6390-99)揭示以兩種鼠類單克隆 抗體的組合治療帶有U87MG.de2-7異種移植物的小鼠的協同效果。該等抗體中的一者 (mAb528)結合所有對西妥昔單抗具有類似特異性的EGFR亞型。另一者（mAB806)僅結合 de2-7EGFR。U87MG.de2-7細胞係為經de2-7EGFR轉染的細胞系。U87MG.DK細胞系表達 de2-7EGFR的激酶失活變異體。當對帶有U87MG. DK異種移植物的小鼠使用該等兩種抗體時 未觀察到協同作用。在具有表達野生型EGFR的A431細胞系的異種移植模型中，作者未提 供協同作用的證據。de2-7EGFR僅存在於有限量的癌症類型中，該等癌症類型諸如神經膠質 瘤，（在某種程度上）乳癌及肺癌。
[0020] 雖然該等研究已表明在某些情況下協同作用可存在於兩種鼠類單克隆抗體之間， 但其亦展示在許多情況下未發現協同作用。該等研究亦未提供有效針對多種臨床相關癌細 胞系的抗EGFR抗體組合物。
[0021] 因此，對在以低劑量給與時能有效治療和/或預防與EGFR過度表達相關的疾病的 改良的針對EGFR的治療抗體存在需要。亦對廣泛適用的治療性癌症抗體存在需要，其可在 對由所述癌細胞表達的EGFR結構不具有詳細認識的情況下使用。
【發明內容】
[0022] 在一個方面，本發明涉及重組抗體組合物，其包含至少3種有區別的抗EGFR抗體 分子，其中所述抗體結合EGFR的有區別的第一、第二和第三表位。
[0023] 在進一步的方面，本發明涉及重組抗體組合物，其包含至少兩種有區別的EGFR 抗體分子，其中一種有區別的抗EGFR抗體分子選自以下抗體組成的組：992、1024、1030、 1042、1208、1229、1254、1257、1260、1261、1277、1284、1308、1320、1344 和 1347,或具有這些 抗體的⑶R的抗體。
[0024] 優選至少一個有區別的抗EGFR抗體分子選自下組：抗體992、1030、1024、1347、 1277、1254、1320、1260、1261和1284或具有這些抗體的CDR的抗體。在本發明的特別優選 的實施方案中，抗體組合物包含抗體992和1024或基於它們的CDR3序列的兩抗體、或基於 它們的\和V H序列的抗體，或包含兩種具有基本上相同的結合特異性的抗體。
[0025] 已經證實本發明的代表性抗體組合物在抑制代表性癌細胞系增殖中有效，這 指出了一種在癌症治療中的體內用途。這些結果已經在用癌細胞球形體（cancer cell spheroid)進行的測定中得到了確認，癌細胞球形體可以更好地代表體內情況，其中癌細胞 形成腫瘤。另外，本發明的抗體組合物表現出使來自癌球形體的細胞運動性降低，並由此降 低形成轉移的傾向。也已經證明了代表性抗體組合物在異種移植模型中的體內效力。這些 結果已經確認了由抗體992和1024組成的特別優選的抗體組合物。
[0026] 在小鼠中的人癌症異種移植模型中，本發明的代表性抗體組合物與可以通過商業 方法獲得的單克隆抗體Vectibix和Erbitux相比產生了顯著更高的腫瘤細胞終末分化程 度。看起來本發明的優選抗體組合物通過一種不同於單克隆抗體的作用機制工作，因為在 用本發明的抗體組合物進行的處理終止後沒有觀察到腫瘤的再生。在用單克隆抗體進行的 處理終止後觀察到腫瘤再生。
[0027] 在結合研究中，發明人證明了一些本發明提供的抗體表現出促進另外的抗體的結 合，由此增加結合至受體的抗體總量。也已經證明結合三種結構域III抗體可促進後續的 另外抗體的結合。這些觀察結果明顯支持了使用具有至少3種有區別的抗EGFR抗體分子 的組合物的概念，其中抗體結合EGFR的有區別的第一、第二和第三表位。該效果也可以藉 由選擇提供這種特定效果的多個抗體，通過使用本發明的兩種抗體的特定組合來獲得。這 些抗體是用於與其它抗體混合的優選候選。
[0028] 本發明的組合物可以提供數種其它優勢。癌細胞表達多種的EGFR。變異出現在構 象中、糖基化中和一級結構（突變和SNP)中。單一的單克隆抗體可以靶向這些EGFR變異 中的一些但不是全部。EGFR突變體可能是單克隆抗體的逃逸突變體。包含本發明的兩種 抗體的抗體或包含三種或更多種結合不同EGFR表位的不同抗體的抗體對突變體、SNP、缺 失突變體和糖基化中的變異較不敏感。其證據為本發明的抗體混合針對一組代表多種多樣 EGFR構象和變異的人癌細胞系的廣泛效力。
[0029] 施用一種單克隆抗體還可能不完全關閉EGFR的激酶活性。對信號傳導更有效的 抑制可以通過抗體的組合來實現。
[0030] 因此可能有益的是，在抗體混合物中包括與不同EGFR構象（例如，無束縛構象 (untethered conformation)和受體二聚體）結合的抗體。這樣的抗體混合物可能在抑制 EGFR活性方面比僅結合多種構象之一的單克隆抗體更有力。
[0031] 另外，通過使用在組合物中含有三種或更多種抗EGFR抗體的方法，可能可以提高 抗體在腫瘤細胞表面的密度，從而與單克隆抗體相比增加經由ADCC的殺傷。
[0032] 在進一步的方面中，本發明涉及用於製備抗體組合物的方法，包括：
[0033] a)用第一表達構建體轉染第一真核細胞群體，所述第一表達構建體編碼包含能夠 結合第一有區別的EGFR表位的第一 ^^和^^鏈關聯對（cognate pair)的第一抗體；
[0034] b)用第二表達構建體轉染第二真核細胞群體，所述第二表達構建體編碼包含能夠 結合第二有區別的EGFR表位的第二VH和 '鏈關聯對的第二抗體；
[0035] c)任選地對第三或其他的群體、表達構建體、關聯對和EGFR表位重複步驟b);
[0036] d)選擇經轉染的第一、第二和任選地其他的細胞群體；
[0037] e)將經轉染的群體在一個器皿（pot)中組合以獲得細胞庫（cell bank);
[0038] f)在允許抗體表達的條件下培養來自所述細胞庫的細胞；和
[0039] g)從上清液回收並純化抗體組合物。
[0040] 為了便於製備、下遊加工和表徵，所有抗體包含相同的重鏈恆定區。
[0041] 在進一步的方面中，本發明涉及包含至少兩種真核細胞亞群的細胞庫；每種亞群 用一種編碼抗體的表達構建體轉染或轉導，所述抗體包含能夠結合有區別的EGFR表位的V H 和 '鏈關聯對。優選地，使用位點特異性整合來轉染細胞。
[0042] 另外，本發明涉及降低EGFR信號傳導的方法，包括向表達EGFR的細胞的組合物施 用本發明的抗體組合物並降低EGFR信號傳導。
[0043] 本發明還涉及殺死表達EGFR的細胞的方法，包括向表達EGFR的細胞的組合物施 用任何本發明的抗體組合物並殺死表達EGFR的細胞。
[0044] 還提供在表達EGFR的細胞中誘導凋亡的方法，包括向表達EGFR的細胞的組合物 施用本發明的抗體組合物，從而誘導凋亡。
[0045] 進一步的方面涉及抑制表達EGFR的細胞增殖的方法，包括向表達EGFR的細胞的 組合物施用本發明的抗體組合物，從而抑制增殖。
[0046] 本發明涉及在體內誘導腫瘤細胞分化的方法，包括向患有癌症的個體施用本發明 的抗體組合物，從而誘導腫瘤細胞的分化。這個方面是基於在曝露於本發明的抗體組合物 時觀察到的對癌細胞體內終末分化的影響。
[0047] 在進一步的方面中，本發明涉及藥物用品，其包含本發明的抗體組合物和至少一 種能夠誘導癌細胞分化的化合物作為一個組合用於在癌症治療中同時、分開或相繼施用。 通過將本發明的抗體組合物與已知誘導癌細胞終末分化的作用劑（agent)結合，能夠進一 步改進效果。
[0048] 在更進一步的方面中，本發明涉及藥物用品，其包含本發明的抗體組合物和至少 一種化療或抗腫瘤化合物作為組合用於在癌症治療中同時、分開或相繼施用。本發明的抗 體組合物很有可能能夠用於二線治療，即在使用常規化療或抗腫瘤劑治療之後或與之同時 進行，或在放射療法和/或外科手術之後或與之同時進行。
[0049] 在另一方面，提供選自下組的多核苷酸：具有圖23(SEQ ID N0100)中所示核酸 序列的核酸；編碼具有圖23(SEQ ID N0100)中所示胺基酸序列的多肽的核酸；具有圖 34A(SEQ ID N0102)中所示核酸序列的核酸；和編碼具有圖34A(SEQ ID N0102)中所示氨 基酸序列的多肽的核酸。另外還提供包含圖23 (SEQ ID N0101)中所示胺基酸序列的多肽 和包含圖34B(SEQ ID N0103)中所示胺基酸序列的多肽；包含如上定義的所述核酸可操作 地連接於能夠指導所述核酸表達的啟動子序列的表達載體；和用所述表達載體轉染或轉導 的細胞。
[0050] 這些序列構成稱猴（Cynomolgous)(即來自食蟹猴（Macaca fascicularis)的） EGFR多核苷酸和多肽序列。這個種的猴是廣泛用於毒理學研究的動物。對於在包括針對人 自身抗原的抗體的毒理學研究中具有任何價值的動物物種，關鍵是所述抗體也結合該毒理 動物（tox-animal)中的祀蛋白，優選以大約相同的親和力結合。藉助本發明人的貢獻，現 在已使測試抗體與獼猴EGFR的結合成為可能。獼猴和人EGFR是高度同源的蛋白質，但令 人驚奇的是發現了大量對人和獼猴EGFR的親和力差異很大的抗體。這強調了使用準確的 獼猴EGFR蛋白進行篩選的重要性，這種蛋白已由本發明人提供。
[0051] 另外還提供用於篩選抗體對獼猴EGFR的結合的方法，包括步驟
[0052] -提供至少一種測試抗體；
[0053] -實施測定法以測定抗體與獼猴EGFR胞外結構域（圖23, SEQ ID N0101)或全長 獼猴EGFR(圖34B，SEQ ID N0103)的結合；或抗體與表達獼猴EGFR胞外結構域或表達全長 獼猴EGFR的細胞表面的結合；
[0054] -和選擇至少一種結合獼猴EGFR胞外結構域的抗體。
[0055] 所述方法可以進一步包括篩選與人EGFR胞外結構域的結合或與表達人EGFR的細 胞的結合。
[0056] 在進一步的方面中，本發明涉及用於鑑定抗EGFR抗體的方法，該抗體能夠增強另 一抗EGFR抗體對EGFR的同時結合，所述方法包括
[0057] a.在第一測定中，測定第一抗體對於固定量EGFR抗原的最大結合能力，
[0058] b.在第二測定中，用第二抗EGFR抗體使固定量EGFR抗原飽和，
[0059] c.將EGFR-抗體複合物與所述第一抗體接觸，並測定最大結合能力，和
[0060] d.比較結合能力以測定步驟c的最大結合能力是否超過步驟a的最大結合能力。
[0061] 本申請還涉及以下方面：
[0062] 項1. 一種重組抗體組合物，其包含至少3種有區別的抗EGFR抗體分子，其中所述 抗體結合EGFR的有區別的第一、第二和第三表位。
[0063] 項2.項1的抗體，其中所述表位不重疊。
[0064] 項3.項1的抗體，其中至少一種有區別的抗體分子能夠抑制EGF結合。
[0065] 項4.項1的抗體，其中至少一種有區別的抗體分子能夠防止EGFR磷酸化。
[0066] 項5.項1的抗體，其中至少一種有區別的抗體分子能夠增強EGFR的內化/降解。 [0067] 項6.項1的抗體，其包含至少一種其它有區別的抗EGFR抗體分子，其中該其它抗 體結合第四有區別的表位。
[0068] 項7.項6的抗體，其包含至少一種其它有區別的抗EGFR抗體分子，其中該其它抗 體結合第五有區別的表位。
[0069] 項8.項7的抗體，其包含至少一種其它有區別的抗EGFR抗體分子，其中該其它抗 體結合第六有區別的表位。
[0070] 項9.項1的抗體，其包含至少一種域III抗體和至少一種域I/II抗體。
[0071] 項10.項1的抗體，其包含至少兩種域III抗體和一種域I抗體。
[0072] 項11.項1的抗體，其包含至少兩種域III抗體，諸如至少三種域III抗體。
[0073] 項12.項1的抗體，其包含至少一種能夠增強至少一種其它抗體與不同有區別的 表位結合的抗體。
[0074] 項13.項1的抗體，其中所述抗體為具有鼠類可變鏈與人類恆定鏈的嵌合抗體。
[0075] 項14.項13的抗體，其中該人類恆定鏈為IgGl或IgG2。
[0076] 項15.項1的抗體，其中至少一種抗體為人源化抗體。
[0077] 項16.項1的抗體，其中至少一種抗體為人類抗體。
[0078] 項17.項1的抗體，其中EGFR選自由人類EGFR、突變人類EGFR和人類EGFR的缺 失變異體組成的組。
[0079] 項18.項17的抗體，其中EGFR為人類EGFR與非人類靈長類EGFR兩者。
[0080] 項19. 一種重組抗體組合物，其包含至少2種有區別的EGFR抗體分子，其中一種 有區別的抗EGFR抗體分子是選自由具有以下抗體的⑶R的抗體組成的組：992、1024、1030、 1042、1208、1229、1254、1257、1260、1261、1277、1284、1308、1320、1344 和 1347。
[0081] 項20.項19的重組抗體組合物，其中至少一種有區別的抗EGFR抗體分子是選 自由具有以下抗體的CDR的抗體組成的組：992、1030、1024、1347、1277、1254、1320、1260、 1261 和 1284。
[0082] 項21.項19的重組抗體組合物，其中兩種有區別的EGFR抗體分子是選自由具 有以下抗體的CDR的抗體組成的組合的組：992+1030、992+1024、992+1042、992+1320、 1277+1024。
[0083] 項22. -種抗體組合物，其包含至少2種有區別的抗人類EGFR抗體分子，
[0084] a.其中第一有區別的抗EGFR抗體分子是選自由以下抗體組成的組：抗體992、包 含抗體992的'序列（SEQ ID N072的胺基酸3-109)和VH序列（SEQ ID N040的胺基酸 3-124)的抗體、具有抗體992的CDR3s(SEQ ID N0116和111)的抗體、與抗體992結合相同 表位的抗體、和能夠抑制抗體992與人類EGFR結合的抗體；且
[0085] b.其中第二有區別的抗EGFR抗體分子是選自由以下抗體組成的組：抗體1024、包 含抗體1024的'序列（SEQ ID N073的胺基酸3-114)和￥11序列（SEQ ID N041的胺基酸 3-120)的抗體、具有抗體1024的CDR3s(SEQ ID N0120和114)的抗體、與抗體1024結合相 同表位的抗體和能夠抑制抗體1024與人類EGFR結合的抗體。
[0086] 項23.項22的組合物，其中
[0087] a.該第一有區別的抗EGFR抗體分子是選自由以下抗體組成的組：抗體992、包含 抗體992的 '和VH序列的抗體、具有抗體992的CDR3的抗體、和與抗體992結合相同表位 的抗體；且
[0088] b.該第二有區別的抗EGFR抗體分子是選自由以下抗體組成的組：抗體1024、包含 抗體1024的 '和VH序列的抗體、具有抗體1024的⑶R3的抗體、和與抗體1024結合相同 表位的抗體。
[0089] 項24.項22的組合物，其中
[0090] a.該第一有區別的抗EGFR抗體分子是選自由以下抗體組成的組：抗體992、包含 抗體992的 '和VH序列的抗體、和具有抗體992的⑶R3的抗體；且
[0091] b.該第二有區別的抗EGFR抗體分子是選自由以下抗體組成的組：抗體1024、包含 抗體1024的 '和VH序列的抗體、和具有抗體1024的⑶R3的抗體。
[0092] 項25.項22的組合物，其中
[0093] a.該第一有區別的抗EGFR抗體分子是選自由以下抗體組成的組：抗體992、和包 含抗體992的 '和VH序列的抗體；且
[0094] b.該第二有區別的抗EGFR抗體分子是選自由以下抗體組成的組：抗體1024、和包 含抗體1024的 '和VH序列的抗體。
[0095] 項26.項22的組合物，其包含抗體992和1024。
[0096] 項27.項22的組合物，其中該第一和該第二抗EGFR抗體不抑制彼此與人類EGFR 的結合。
[0097] 項28.項22的組合物，其中所述抗體中的至少一者能夠增加其它抗體對人類EGFR 的最大結合能力。
[0098] 項29.項22的組合物，其中該組合物中的該第一抗體相對於該第二抗體的比例是 介於5%與95%之間，諸如介於10%與90%之間，較優選介於20%與80%之間，更優選介 於30 %與70 %之間，更優選介於40 %與60 %之間，諸如介於45 %與55 %之間，諸如為約 50%。
[0099] 項30.項22的組合物，其中該第一和該第二抗體是同種型的IgGl或IgG2。
[0100] 項31.項22的組合物，其中與抗體992結合相同表位的該抗體是選自包含以下克 隆的抗體群：克隆 1209、1204、992、996、1033 和 1220。
[0101] 項32.項22的組合物，其中與抗體1024結合相同表位的該抗體是選自包含以下 克隆的抗體群：克隆 1031、1036、1042、984、1024、1210、1217、1221 和 1218。
[0102] 項33.項22的組合物，其中包含抗體992的⑶R3的該抗體另外包含抗體992的 VH 和 VL 的 CDR1 與 CDR2。
[0103] 項34.項22的組合物，其中包含抗體1024的⑶R3的該抗體另外包含抗體1024 的 VH 和 VL 的 CDR1 與 CDR2。
[0104] 項35.項22的組合物，其中與抗體992競爭的該抗體是選自由以下抗體組成的 組：抗體 1208、1254 和 1277。
[0105] 項36.項22的組合物，其中與抗體1024競爭的該抗體是選自由以下抗體組成的 組：抗體1042和1320。
[0106] 項37.項22的組合物，其中該組合物除該第一和該第二抗體之外不含有其它抗 EGFR抗體。
[0107] 項38.項22的組合物，其進一步包含第三有區別的抗EGFR抗體，其中該第三有 區別的抗EGFR抗體分子是選自由以下抗體組成的組：抗體1030、包含抗體1030的 '序列 彼〇10勵74的胺基酸3-114(113))和￥11序列彼〇10勵42的胺基酸3-120)的抗體、具 有抗體1030的CDR3s(SEQ ID N0112和119)的抗體、與抗體1030結合相同表位的抗體、和 能夠抑制抗體1030與人類EGFR結合的抗體。
[0108] 項39.項37的組合物，其中該第三抗體使得該第一和/或第二抗體與人類EGFR 的結合增強。
[0109] 項40.項37的組合物，其中與抗體1030結合相同表位的該抗體是選自由以下克 隆組成的抗體群：克隆 1195、1030、1034、1194、980、981、1246 和 1223。
[0110] 項41.項37的組合物，其中包含抗體1030的⑶R3的該抗體另外包含抗體1030 的 VH 和 VL 的 CDR1 和 CDR2。
[0111] 項42.項38的組合物，其中該組合物除該第一、該第二、和該第三抗體之外不含有 其它抗EGFR抗體。
[0112] 項43.項22的組合物，其中所述有區別的抗體經製備用於同時、依次或單獨給藥。
[0113] 項44.項22的組合物，其中該組合物使得受體內化。
[0114] 項45.項22的組合物，其中該組合物使得體內A431NS腫瘤退化。
[0115] 項46.項22的組合物，其中該組合物能夠誘導體內A431NS細胞的終末分化。
[0116] 項47.項22的組合物，其中該組合物能夠上調體內腫瘤內披蛋白（involucrin) 表達。
[0117] 項48. -種雙特異性結合分子，其具有項22的抗體組合物的結合特異性。
[0118] 項49.項48的雙特異性結合分子，其包含抗體992和1024的⑶R。
[0119] 項50.項48的雙特異性結合分子，其為雙重可變域抗體。
[0120] 項51.項48的雙特異性結合分子，其為雙特異性Fab片段或雙特異性scFV。
[0121] 項52. -種製造抗體組合物的方法，其包含：
[0122] a)以編碼第一抗體的第一表達構建體轉染第一真核細胞群體，所述第一抗體包含 能夠結合第一有區別的EGFR表位的VH和VL鏈的第一關聯對；
[0123] b)以編碼第二抗體的第二表達構建體轉染第二真核細胞群體，所述第二抗體包含 能夠結合第二有區別的EGFR表位的VH和VL鏈的第二關聯對；
[0124] c)對於第三或其它群體、表達構建體、關聯對、和EGFR表位任選地重複步驟b);
[0125] d)選擇經轉染的第一、第二和任選地其它細胞群體；
[0126] e)將所述經轉染的群體在一器皿中組合以獲得細胞庫（cell bank);
[0127] f)在允許所述抗體表達的條件下培養來自該細胞庫中的細胞；和
[0128] g)自上清液中回收且純化該抗體組合物。
[0129] 項53.項52的方法，其中該抗體組合物為項1至18中任一的抗體組合物。
[0130] 項54.項52的方法，其中所述細胞是以位點特異性整合方式轉染。
[0131] 項55.項52的方法，其中所述VH和VL鏈是來源於鼠類且所述抗體的恆定區是來 源於人類。
[0132] 項56.項55的方法，其中所有抗體均包含相同重鏈恆定區。
[0133] 項57. -種細胞庫，其包含真核細胞的至少兩種子群體；各子群體是以一編碼包 含能夠結合有區別的EGFR表位的VH和VL鏈的關聯對之抗體的表達構建體轉染或轉導。
[0134] 項58.項57的細胞庫，其中該細胞庫編碼項1至18中任一的抗體組合物。
[0135] 項59.項57的細胞庫，其中所述細胞是使用位點特異性整合方式轉染。
[0136] 項60. -種降低EGFR信號轉導的方法，其包含向表達EGFR的細胞組合物施用項 1至47中任一的抗體組合物、或項48至51中任一項的雙特異性結合分子，和降低該EGFR 信號轉導。
[0137] 項61. -種殺死表達EGFR的細胞的方法，其包含向表達EGFR的細胞組合物施用 項1至47中任一的抗體組合物、或項48至51中任一項的雙特異性結合分子，和殺死所述 EGFR表達細胞。
[0138] 項62. -種在表達EGFR的細胞中誘導細胞凋亡的方法，其包含向表達EGFR的細 胞組合物施用項1至47中任一的抗體組合物、或項48至51中任一項的雙特異性結合分子， 由此誘導細胞凋亡。
[0139] 項63. -種抑制表達EGFR的細胞增殖的方法，其包含向表達EGFR的細胞組合物 施用項1至47中任一項的抗體組合物、或項48至51中任一項的雙特異性結合分子，由此 抑制增殖。
[0140] 項64. -種誘導體內腫瘤細胞分化的方法，其包含向患有癌症的個體施用項1至 47中任一的抗體組合物、或項48至51中任一項的雙特異性結合分子，由此誘導所述腫瘤細 胞分化。
[0141] 項65.項64的方法，其中該分化為終末分化。
[0142] 項66.項64的方法，其中該分化伴隨有內披蛋白表達增加。
[0143] 項67. -種誘導EGFR內化的方法，其包含向表達EGFR的細胞給藥有效量的項1 至47中任一的抗體組合物、或項48至51中任一項的雙特異性結合分子，由此誘導EGFR內 化。
[0144] 項68. -種藥物組合物，其包含呈組合形式用於在癌症治療中同時、單獨或依次 施用的兩種或兩種以上項1至47項中任一的抗體、或項48至51中任一項的雙特異性結合 分子。
[0145] 項69.項68的製品，其進一步包含呈組合形式用於在癌症治療中同時、單獨或依 次施用的至少一種能夠誘導癌細胞分化的化合物。
[0146] 項70.項69的製品，其中該化合物是選自由以下各物組成的組：視黃酸、苯基丁酸 鹽/酯、全反式視黃酸、活性形式維生素 D。
[0147] 項71.項68的製品，其進一步包含呈組合形式用於在癌症治療中同時、單獨或依 次施用的至少一種化療或抗腫瘤化合物。
[0148] 項72.項71的製品，其中該化療化合物是選自由以下各物組成的組：阿德力黴 素（adriamycin)、順鉬（cisplatin)、紫杉醇（taxol)、阿黴素（doxorubicin)、拓樸替康 (topotecan)、氟啼陡、奧賽力鉬（oxaliplatin)和伊立替康（irinotecan)。
[0149] 項73. -種多核苷酸，其是選自由以下各物組成的組：
[0150] a.具有顯示於SEQ ID N0100中的核酸序列的核酸；
[0151] b.編碼具有顯示於SEQ ID NolOl中的胺基酸序列的多肽的核酸；
[0152] c.具有顯示於SEQ ID N0102中的核酸序列的核酸；
[0153] d.編碼具有顯示於SEQ ID N0103中的胺基酸序列的多肽的核酸；和
[0154] e.具有a至d中任一者的互補序列的核酸。
[0155] 項74. -種表達載體，其包含項73的核酸，該核酸與能夠指導該核酸表達的啟動 子序列操作性連接。
[0156] 項75. -種細胞，其是以項74的表達載體轉染或轉導。
[0157] 項76. -種多肽，其包含顯不於SEQ ID N0101中的胺基酸序列。
[0158] 項77. -種多肽，其包含顯示於SEQ ID N0103中的胺基酸序列。
[0159] 項78. -種用於篩選與稱猴（cynomolgous)EGFR結合的抗體的方法，其包含以下 步驟：
[0160] a.提供至少一種測試抗體；
[0161] b.實施測定以確定與以下部分結合的抗體：
[0162] i)獼猴 EGFR 的胞外域（SEQ ID N0101)或全長獼猴 EGFR(SEQ ID N0103);或
[0163] ii)表達該獼猴EGFR胞外域（SEQ ID N0101)或表達全長獼猴EGFR(SEQ ID N0103)的細胞的表面；
[0164] c.和選擇至少一種結合獼猴EGFR胞外域的抗體。
[0165] 項79.項78的方法，其進一步包含就與人類EGFR胞外域的結合或與表達人類 EGFR的細胞的結合進行篩選。
[0166] 項80. -種鑑別能夠增強另一抗EGFR抗體與EGFR的同時結合的抗EGFR抗體的 方法，該方法包含
[0167] a.在第一鑑定中，測定第一抗體對於固定量的EGFR抗原的最大結合能力，
[0168] b.在第二鑑定中，以第二抗EGFR抗體飽和固定量的EGFR抗原，
[0169] c.使該EGFR抗體複合物與該第一抗體接觸且測定最大結合能力，和
[0170] d.對比該結合能力以確定步驟c的該最大結合能力是否超過步驟a的最大結合能 力。
[0171] 項81.項80的方法，其中該EGFR抗原為固定在固體表面上的重組蛋白質。
[0172] 項82.項80的方法，其中該EGFR抗原是存在於表達EGFR的細胞的表面上。
[0173] 項83.項82的方法，其中該細胞包含編碼EGFR的表達構建體。
[0174] 項84.項80的方法，其中該第一抗體為免疫球蛋白且該第二抗體為Fab片段。
[0175] 項85.項80的方法，其中所述鑑定為ELISA。
[0176] 項86.項80的方法，其中EGFR抗原包含人類EGFR胞外域（SEQ ID N0108)或獼 猴 EGFR 胞外域（SEQ ID N0101)。
[0177] 【
【發明內容】
】
[0178] 發明概述
[0179] 該鑑定可用於鑑別具有類似於抗體992與1024的特性的其它抗體組合。
[0180] 定義
[0181] 術語「抗體」描述血清的功能性組份且通常指分子集合（抗體或免疫球蛋白）或 一個分子（抗體分子或免疫球蛋白分子）。抗體分子能夠與特定抗原決定簇（抗原或抗原 性表位）結合或反應，此又可引起免疫效果機制的誘導。個別抗體分子通常認為具有單特 異性，且抗體分子組合物可為單克隆（亦即由相同抗體分子組成）或多克隆（亦即由兩種 或兩種以上與相同抗原或甚至有區別的不同抗原上的相同或不同表位反應的不同抗體分 子組成）。各抗體分子均具有使其能夠特異性地與其相應抗原結合的有區別的結構，且所 有天然抗體分子均具有相同總的基本結構：兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈。抗體亦共同稱 為免疫球蛋白。如本文中所使用的術語抗體亦意欲包括嵌合及單鏈抗體以及抗體的結合片 段，諸如Fab、Fv片段或scFv片段，以及多聚形式，諸如二聚IgA分子或五價IgM。抗體可 為人類、鼠類、嵌合、人源化或再成型抗體。
[0182] 術語「關聯VH和VL編碼對」描述來源於（或包含於）相同抗體產生細胞內的VH 和VL編碼序列的初始對。因此，關聯VH和VL對代表最初存在於該細胞所來源的供體中的 VH和VL配對。術語「由VH和VL編碼對表達的抗體」表明抗體或抗體片段是由含有VH和 VL編碼序列的載體、質粒或類似物產生。當關聯VH和VL編碼對表達為完全抗體或其穩定 片段時，其保持最初由其所來源的細胞表達的抗體的結合親和力及特異性。關聯對文庫亦 稱為關聯對的全套（repertoire)或集合，且可個別地保存或匯集。
[0183] 術語「CDR(complementarity determining region)」-互補決定區是如 Lefranc 等人（2003) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev. Comp Immunol27, 55-77 中所定義。
[0184] 術語「重組多克隆蛋白質的有區別的成員」表示包含不同但同源蛋白質分子的蛋 白質組合物中的一種蛋白質分子，其中各蛋白質分子與該組合物中的其它分子同源，且亦 含有一或多段可變多肽序列，其特徵在於多克隆蛋白質中的個別成員之間的胺基酸序列的 差異。
[0185] 術語「頭接頭啟動子（head-to-head promoter)」是指將啟動子對以密切接近方式 安置以使由該等啟動子驅動的兩個基因片段的轉錄以相反的方向進行。頭接頭啟動子亦可 以兩個啟動子之間由不相關核酸組成的填充片段構建。該填充片段可容易地含有多於500 個核昔fe。頭接頭啟動子亦可稱為雙向啟動子。
[0186] 術語「免疫球蛋白」通常用作存在於血液或血清中的抗體的混合物的通用名稱，但 亦可用於表示來源於其它來源的抗體的混合物。
[0187] 術語「免疫球蛋白分子」表示個別抗體分子，例如作為免疫球蛋白的一部分，或任 何多克隆或單克隆抗體組合物的一部分。
[0188] 術語「所關注的變異核酸分子文庫」是用於描述共同編碼「所關注的重組多克隆 蛋白質」的核酸分子的集合。當用於轉染時，所關注的變異核酸分子文庫是含於表達載體文 庫中。該文庫通常具有至少2、3、5、10、20、50、1000、10 4、105或106個不同成員。
[0189] 術語「質量傳遞（mass transfer)」是用於描述所關注的核酸序列自一載體群體傳 遞至另一載體群體，且對各DNA同時如此進行而不藉助於所關注的個別DNA的分離。該等 載體群體可為含有（例如）所關注的可變區、啟動子、前導區或增強組件的文庫。該等序列 可隨後在不預先自（例如）噬菌體載體分離的情況下移至哺乳動物表達載體中。尤其對於 抗體序列而言，該技術確保在將文庫自（例如）選擇載體（例如噬菌體呈現載體）移至哺 乳動物表達載體時不喪失V H與\之間的連接的多樣性。據此保留VH和VL的初始配對。
[0190] 如本文中所使用的術語「操作性連接（operably linked)」是指一片段當置於與另 一片段的功能關係中時與該另一片段連接。舉例而言，編碼信號序列的DNA若表達為參與 多肽轉移至內質網之前導序列則與編碼該多肽的DNA操作性連接。再者，啟動子或增強子 若刺激編碼序列的轉錄則與該序列操作性連接。
[0191] 術語「多克隆抗體」描述能夠與相同或不同抗原上的若干不同特定抗原決定簇結 合或反應的不同抗體分子的組合物。通常認為多克隆抗體的可變性是位於所謂的多克隆抗 體的可變區中。然而，在本發明的上下文中，多克隆性亦可理解為描述個別抗體分子之間的 存在於所謂恆定區中的差異，例如在含有兩種或兩種以上抗體同種型的抗體混合物的情況 下，該等抗體同種型諸如人類同種型IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl及IgA2,或鼠類同種型 IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3及IgA。出於本發明的目的，該多克隆抗體亦可稱為「抗體組合 物」。
[0192] 術語「表位」通常用於描述動物中，較優選哺乳動物中且最優選人類中具有抗原 或免疫原活性的較大分子的片段（proportion)或較大分子的部分（例如抗原或抗原性位 點）。具有免疫原活性的表位為引發動物中抗體反應的較大分子的一部分。具有抗原活性 的表位為較大分子的由此項技術中熟知的任何方法（例如由本文所述的免疫鑑定）所確定 的抗體免疫特異性結合的部分。抗原性表位不必具有免疫原性。抗原為抗體或抗體片段免 疫特異性結合的物質，例如毒素、病毒、細菌、蛋白質或DNA。抗原或抗原位點通常具有一個 以上表位，除非其極小，且通常能夠刺激免疫反應。表位可為線性的或構形的。線性表位由 蛋白質分子上的由抗體識別的約6至10個鄰接胺基酸組成。相反，構形（conformational) 表位由不依次排列的胺基酸組成。此處抗體僅識別3維結構。當蛋白質分子摺疊成三維結 構時，形成表位的胺基酸並置以使抗體能夠識別該序列。在變性蛋白質中僅線性表位可被 識別。根據定義，構形表位須處於摺疊蛋白質的外部。識別構形表位的抗體可能僅在輕微、 未變性程序下結合。與相同抗原上的不同表位結合的抗體視表位的位置而定可對其所結合 的抗原的活性具有不同的效果。與抗原的活性位點中的表位結合的抗體可完全阻斷該抗原 的功能，而在不同表位處結合的另一抗體可能單獨對抗原活性無效果或具有極小效果。然 而該等抗體仍可活化互補序列且因此使抗原消除，且當與一或多種在相同抗原的不同表位 上結合的抗體組合時可產生協同效果。在本發明中，表位較優選為EGFR胞外域的片段。本 發明的抗原較優選為抗體或抗體片段免疫特異性結合的胞外域EGFR蛋白質、多肽或其片 段。EGFR相關抗原亦可為抗體或抗體片段免疫特異性結合的EGFR多肽胞外域或其片段的 類似物或衍生物。
[0193] 能夠彼此競爭結合相同抗原的抗體可結合相同或重疊（overlapping)的表位或 可具有彼此密切接近的結合位點，以便競爭主要由空間障礙引起。測定抗體之間的競爭的 方法是描述於實施例中。
[0194] 如本文中所使用的術語「多克隆蛋白質」或「多克隆性」是指包含不同但同源蛋白 質分子的蛋白質組合物，該等蛋白質分子較優選選自免疫球蛋白超家族。因此，各蛋白質分 子與組合物的其它分子同源，且亦含有一或多段可變多肽序列，其特徵在於多克隆蛋白質 的個別成員之間胺基酸序列的差異。該等多克隆蛋白質的已知實例包括抗體或免疫球蛋白 分子、T細胞受體及B細胞受體。多克隆蛋白質可由所定義的蛋白質分子子集組成，所述子 集已由諸如對所需目標的共有結合活性的共同特徵定義，例如在針對所需目標抗原的多克 隆抗體情況下。
[0195] 「蛋白質」或「多肽」意謂任何胺基酸鏈，不考慮長度或翻譯後修飾。蛋白質可以單 體或的多聚體形式存在，包含兩個或兩個以上經組裝的多肽鏈、蛋白質片段、多肽、寡肽或 肽。
[0196] 術語「RFLP」是指「限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism)」，一種在以限制酶裂解之後分析核酸分子片段的位移的膠體模式的方法。
[0197] 術語「不規則性（scrambling)」描述以下情況，其中由個別細胞表達出兩種或兩 種以上包含兩種不同多肽鏈（例如來自免疫球蛋白超家族）的多克隆蛋白質的不同成員。 該情況可在個別細胞整合入一對以上基因片段至基因組中時出現，其中各對基因片段編碼 多克隆蛋白質的不同成員。在該等情況中，可產生由該等基因片段表達的非所需多肽鏈組 合。該等非所需多肽鏈組合可能不具有任何治療效果。
[0198] 術語「VH-'鏈不規則性」為以上定義的不規則性的實例。在該實例中，VH和VL編 碼基因片段構成一對基因片段。該不規則性在由細胞產生非所需VH和VL多肽組合時發生， 其中兩個不同VH和VL編碼基因片段對是整合入同一細胞中。該不規則性抗體分子不太可 能保留其初始特異性且因此可能不具有任何治療效果。
[0199] 術語「轉染」在本文中用作將外來DNA引入細胞中的廣義術語。該術語亦意欲涵 蓋將外來DNA引入細胞中的其它功能等效方法，諸如轉化、感染、轉導或供體細胞與受體細 胞的融合。
[0200] 術語「可變多肽序列」及「可變區」可互換使用。
[0201] 術語「有區別的表位」意謂當兩種不同抗體結合有區別的表位時，存在低於100% 的抗原結合競爭，較優選低於50%的抗原結合競爭，更優選基本上無抗原結合競爭。抗體對 的「有區別的表位」的分析通常通過在飽和抗體條件下使用對表達EGFR的細胞及個別螢光 標記抗體的FACS分析，或如實施例中所述使用捕獲或結合至流動單元（cell)表面的EGFR 抗原的表面電漿共振的結合實驗來測定。
[0202] 術語能夠「抑制EGF結合」當應用於一種抗體分子時意謂該抗體分子對於與EGFR 結合的EGF展現的IC50值小於10nM，較優選小於8nM，更優選小於7nM，更優選小於5nM，更 優選小於4nM，更優選小於3nM，更優選小於2nM，更優選小於2nM，更優選小於InM。
[0203] 術語「表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor)」、「EGFR」及 「EGFR抗原」在本文中可互換使用，且包括人類EGFR的變異體、同功異型物及物種同源物。 在一較優選具體實例中，本發明的抗體與EGFR抗原的結合通過抑制或阻斷EGFR配體與 EGFR的結合抑制表達EGFR的細胞（例如腫瘤細胞）的生長。術語「EGFR配體」包含EGFR 的所有（例如生理學）配體，包括（但不限於）EGF、TGF-α、結合EGF的肝素（ΗΒ-EGF)、雙 調蛋白（amphiregulin ;AR)、和瑞古林（heregulin)、β -細胞調節素（cellulin)及表皮調 節素（epiregulin;EPI)。在另一較優選具體實例中，本發明的抗體與EGFR抗原的結合介 導效果細胞吞噬作用和/或殺死表達EGFR的細胞。
[0204] EGFR域結構：成熟EGFR(SwissProt acc. #P00533)的細胞外部分由621個胺基酸 及四個受體域組成：域I包含殘基1-165,域II包含殘基166-312,域III包含殘基313-481 及域 IV 包含 482-621 (Cochran 等人 2004J immunol. Methods287, 147-158)。已提出域 I 及 域III有助於形成配體的高親和力結合位點。域II及域IV為富含半胱氨酸層粘連蛋白樣 區域，其使蛋白質摺疊穩定且含有可能的EGFR二聚界面。
[0205] 如本文中所使用的術語「抑制生長」（例如提及細胞）意欲包括當使細胞與抗EGFR 抗體接觸時，與未與抗EGFR抗體接觸的相同細胞的生長相比，前者的增殖（細胞數目增加） 或代謝的可測量任何的減少，例如，抑制細胞培養物的生長至少約1 〇 %、20 %、30 %、40 %、 50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%。
[0206] 如本文中所使用的術語「抑制結合」及「阻斷結合」（例如提及抑制/阻斷EGFR 配體與EGFR的結合）可互換使用且包含部分與完全抑制/阻斷。抑制/阻斷EGFR配體與 EGFR結合較優選降低或改變在未抑制或阻斷的情況下EGFR配體與EGFR結合時存在的細胞 信號轉導的正常程度或類型。抑制及阻斷亦意欲包括EGFR配體在與抗EGFR抗體接觸時， 與未與抗EGFR抗體接觸相比，前者與EGFR的結合親和力的可測量任何的減少，例如，阻斷 EGFR 配體與 EGFR 的結合至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99% 或 100%。
[0207] 術語「重組抗體」是用於描述由細胞或細胞系表達的一抗體分子或若干分子，其中 該細胞或細胞系是經包含不與該細胞天然相關的該抗體的編碼序列的表達載體轉染。
[0208] 【圖式簡單說明】
[0209] 圖1 :脾細胞分選（對於詳情請參見實施例1)。製作（描述）以下門：
[0210] ?門1 :活細胞（FSC/碘化丙啶圖）。（左下圖）
[0211] ?門2 :將漿細胞以CD43陽性/CD138陽性形式的門被圈選。（右下圖）
[0212] ?門 3 :雙峰辨別（doublet discrimination)(右上圖）
[0213] 圖2 :鼠類-mSymplex?PCR。用於擴增及同源（cognate)連接來自單一細胞的重鏈 及輕鏈抗體基因的多重重疊延伸RT-PCR。對於詳情請參考實施例1。
[0214] 圖3 :鼠類全套克隆。通過重疊延伸拼接將來自單一漿細胞的編碼VH/\基因對的 mSymplex?PCR產物池拼接至編碼人類κ恆定輕鏈的基因上。將編碼完全人類-小鼠嵌合 抗體的基因池插入表達載體中，繼而插入雙向啟動子盒（2XCMV)。
[0215] 圖4 :哺乳動物全長抗體表達載體00-VP-002的示意性代表圖。Amp及Amp pro， 氨苄青黴素（ampicillin)抗性基因及其啟動子；pUC起點，pUC複製起點；CMV，驅動輕鏈及 重鍊表達的哺乳動物啟動子；IGHV前導區，基因組人類重鏈前導區；Η填充片段，交換重鏈 可變區編碼序列的插入物；IGHG1，編碼基因組免疫球蛋白同種型G1重鏈恆定區的序列（序 列顯示於附錄2中）；兔Β-珠蛋白Α，兔β-珠蛋白polyA序列；IGKV前導區，鼠類κ前導 區；L填充片段，交換輕鏈編碼序列的插入物；SV40term，猿猴病毒40終止子序列；FRT，Flp 識別目標位點；Neo,新黴素（neomycin)抗性基因；SV40poly A，猿猴病毒40poly A信號序 列。
[0216] 圖5 :450-620nm下吸光率差異的群分析。將上清液通過反應性群，如克隆編號之 後的數字（1至4)所指示。深灰色表明代謝活性細胞數目減少，而淡灰色表明代謝活性細 胞數目增加。黑色表明上清液對於代謝活性細胞的數目無影響。
[0217] 圖6A-B :如競爭ELISA中所測定的抗EGFR抗體對所列針對特定EGFR域的參考抗 體的抑制程度。A)抑制計算。B)如下對抑制記分：25-49% :中度競爭（+) ;50-74% :強烈 競爭（++) ;75-100% :極強烈競爭（+++)。顯不顯著抑制（50-100% )的框填入灰色陰影。 艾比特思及維克替比以雙重複展示（四次獨立實驗）以說明鑑定的再現性。Ab2(225)為產 生艾比特思的鼠類前軀物。
[0218] 圖7 :在Biacore3000SPR機器上執行的單表位定位循環的說明圖，其中樣品mAb 與四種不同參考抗體競爭結合EGFR胞外域。
[0219] 圖8A-B :如由使用SPR技術的競爭分析所測定的抗EGFR抗體對所列針對特定 EGFR域的參考抗體的抑制程度。A)抑制計算。B)如下對抑制記分：25-49%:中度競爭（+); 50-74% :強烈競爭（++) :75-1005^:極強烈競爭（+++)。顯不顯著抑制（50-100% )的格為 填入灰色陰影。標記*的克隆1229在該Biacore鑑定中不結合。
[0220] 圖9A-B :通過抗EGFR抗體對的SPR競爭分析對抗EGFR抗體全套內表位群的測定。 將抗體根據假定的EGFR域識別分組。將其中發現抗體組合結合重疊表位產生大於50%抑 制的格填入灰色陰影。將未進行測定的格填成黑色。A)抑制計算。B)如下對抑制記分： 25-49% :中度競爭（+) ;50-74% :強烈競爭（++) ;75-100% :極強烈競爭（+++)。
[0221] 圖10A-B :如通過Biacore分析所測定的針對EGFR胞外域的參考抗體及抗EGFR抗 體的表位定位。A)針對EGFR細胞外域（ECD)的域I或域I/II的抗體的表位定位。B)針 對EGFR E⑶的域III的抗體的表位定位。
[0222] 圖11A-D :針對EGFR上的不重疊表位的抗體的寡克隆混合物的同時結合的研究。 A)依次添加針對域III、域I或未知特異性的抗體。單一樣品mAb對於不同mAb混合物或 單一 mAb測試的抑制值是顯示於填入陰影的框中。亦展示用於計算抑制的Ru最大值。B) 針對EGFR上的不重疊表位的六種不同樣品mAb與含有六種測試抗體的抗體混合物的競爭 分析。不包括測試樣品抗體的抗體混合物充當陽性對照。單一樣品mAb針對不同mAb混合 物測試的抑制值是顯示於填入陰影的框中。亦展示用於計算抑制的Ru最大值。C)B中的分 析的相應感應圖說明抗體阻斷且在某些情況下抗體增強結合。D)對於六種mAb抗體混合物 測試針對域I、I/II及未知特異性的其它抗體。
[0223] 圖12A-B :通過對全長EGFR進行抗體滴定及檢測與鏈黴抗生物素 HRP試劑結合的 經生物素標記的EGF配體來測定抗體介導的EGF配體阻斷。分別將艾比特思、維克替比及 西那格思IgG(帕利珠單抗）用作陽性及陰性對照。以測試抗體阻斷所識別的抗體表位之 後,通過添加用於檢測的0. 1 μ g/ml經生物素標記的EGF配體及二級鏈黴抗生物素 -HRP偶 聯物來觀測EGF配體競爭程度。
[0224] 圖13A-B :以指定抗體預處理對HN5細胞中EGF(50ng/ml)誘導的EGFR磷酸化的效 果。將圖中所指定的抗體（10 μ g/ml)與細胞一起培育30分鐘，隨後添加 EGF保持7. 5min。 標記*的數據組顯著地不同於對照（(_) Ctrl)數據組（p〈0. 05)。A. 1208對EGFR磷酸化具 有顯著保護效果。B. 1277及1320顯著地防止EGF誘導的磷酸化。誤差線表示三個獨立實 驗的標準偏差。
[0225] 圖14 :HN5細胞中磷酸化EGFR(pEGFR)及EGFR的細胞內Western分析。混合物 表示992、1030與1042的最終濃度為10 μ g/ml的等摩爾混合物，其它抗體是以各10 μ g/ ml的濃度使用。添加50 μ g/ml EGF保持7. 5min，隨後固定以刺激EGFR磷酸化。誤差線表 示6個獨立（ctlr-)或3個獨立數據點（992、1030、1042、混合物或艾比特思）的標準偏差。 992、1030、混合物及艾比特思對於磷酸化具有顯著（* = p〈0. 05)保護效果。
[0226] 圖15 :培育抗體對EGFR內化的效果。數據是以自細胞表面所移除的受體相對於 初始染色的百分比的形式展示。誤差線對應於SEM。
[0227] 圖16八-(：4431-呢細胞在不同濃度的抗體992、1030及1042及其混合物存在下由 與未經處理的對照相比的代謝活性細胞百分比測量的生長曲線。1001為以類似同種型用作 陰性對照的非功能抗體。
[0228] 圖17 :A431-NS細胞在10μ g/ml抗體992U030及1042及其混合物及不同濃度 EGFR配體EGF存在下由450nm下的吸光率測量的生長曲線。1001為以類似同種型用作陰 性對照的非功能抗體。
[0229] 圖18 :A431-NS細胞在不同濃度的抗體992及992與結合存在於域1、11或III中 的不重疊表位的抗體的混合物存在下的生長曲線。1001為以類似同種型用作陰性對照的非 功能抗體。
[0230] 圖19 :A431NS細胞中的細胞凋亡。以10倍稀釋液測試EGFR-混合物、個別單克隆 抗體、艾比特思及維克替比。使用Roche的ELISA試劑盒測量凋亡細胞的組蛋白-DNA複合 物。
[0231] 圖20 :向每組有10隻裸Balb/C Nu/Nu小鼠的四個組接種1X106個A431NS細胞。 當腫瘤為約100mm3時開始處理。如箭頭所指示，在實驗期間向各組注射lmg/ml抗體五次。 以數位測徑器（callipers)測量腫瘤直徑。結果是以平均腫瘤體積（+/-SEM)形式展示。
[0232] 圖21 :當個別小鼠在圖20中所展示的實驗中被處死時，切除腫瘤且稱重。展示平 均值+/-SEM。星號表明顯著性為P〈0. 05。
[0233] 圖22 :A431_NS球狀體在10μ g/ml抗體1001、艾比特思、維克替比及結合不重疊 表位的三種抗體的混合物992+1030+1042存在下的生長。1001為以類似同種型用作陰性對 照的非功能抗體。
[0234] 圖23A-B :自來源於獼猴皮膚表皮的cDNA克隆的獼猴EGFR細胞外域的DNA(SEQ ID No. 100)及蛋白質序列（SEQ ID NO. 101)。
[0235] 圖24 :所獲得的獼猴EGFR ECD蛋白質序列（SEQ ID NO. 101)與自GENBANK登錄號 X00588獲得的人類EGFR ECD(SEQ ID N0108)的比對。亦展示一致序列（SEQ ID N0109)。
[0236] 圖25A-B :ELISA鑑定辨別結合人類或獼猴EGFR E⑶或兩者的交叉反應性與物種 特異性抗體的實施例。
[0237] 圖26 :來自異種移植小鼠的四個實驗組中的每一者的代表性腫瘤切片的顯微照 片。在200倍放大率下，箭頭指向體內A431細胞終末分化的集落（foci)。注意到在以三種 抗EGFR克隆的混合物（992+1030+1042)處理的腫瘤中具有顯著較大且較多終末分化的集 落（上面兩張圖）。
[0238] 圖27 :A)在添加10 μ g/ml對照抗體（利妥昔單抗（Rituximab)，抗CD-20)或992 與1024的抗EGFR抗體混合物之後24小時以40倍放大率採集的HN5球狀體的圖像。B)使 用軟體Image J對由細胞覆蓋的面積定量（*p〈0. 01)。
[0239] 圖28 :以未經處理對照組的百分比形式展示四個處理組中內披蛋白 (Involucrin)含量的圖〇#C3p〈0. 005,分別與艾比特思、維克替比及陰性對照組相比較）。
[0240] 圖29 :A)以60倍放大率採集的與10 μ g/ml Alexa-488標記的艾比特思或 992+1024 -起培育2小時的HN5及A431NS細胞的圖像。B)以60倍放大率使用小針孔採 集的與10 μ g/ml Alexa-488標記的艾比特思或992+1024 -起培育2小時的A431NS細胞 的圖像。
[0241] 圖30 :A)以60倍放大率採集的與10 μ g/ml Alexa-488標記的艾比特思或 992+1024 -起培育指定時段的HN5細胞的圖像。
[0242] 圖31A-B :通過在ELISA中對A431-NS細胞及經純化全長EGFR進行連續抗體滴定 測定Fab992、1024及1030的抗原呈遞特異性。結合的Fab抗體是通過二級山羊抗人類Fab 特異性HRP偶聯物觀測。A)針對來自A431細胞的經純化全長EGFR測試的Fab抗體。B) 針對表達於A431-NS細胞表面上的EGFR測試的Fab抗體。
[0243] 圖32A-B :通過在ELISA中對三聚甲醛固定的A431-NS細胞進行連續滴定測定抗 體992、1024、1030、艾比特思及維克替比的IgG及Fab片段的功能性親和力。結合的Fab及 IgG抗體是通過二級山羊抗人類Fab特異性HRP偶聯物觀測。抗RSV蛋白質F抗體西那格 思是用作陰性對照抗體，且在所用ELISA鑑定中不展示任何結合。A) IgG抗體與A431-NS細 胞的功能性結合。B)Fab抗體與A431-NS細胞的功能性結合。
[0244] 圖33A-C :預先以結合不重疊表位的Fab片段飽和受體之後對IgG與A431-NS細 胞上的EGFR結合增強的測定。使指定Fab片段飽和在A431-NS細胞上所識別的EGFR表位 30min，之後連續滴定特定IgG抗體，且在添加或不添加 Fab的情況下結合的IgG是通過二 級小鼠抗人類Fc HRP偶聯物觀測。A)預先以或未以指定Fab片段飽和受體的情況下IgG992 與A431-NS細胞的結合特徵。B)預先以或未以指定Fab片段飽和受體的情況下IgG1024與 A431-NS細胞的結合特徵。C)預先以或未以指定Fab片段飽和受體的情況下IgG1030與 A431-NS細胞的結合特徵。
[0245] 圖34A-B :獼猴全長EGFR cDNA(圖34A ;SEQ ID N0102)及所編碼的蛋白質（圖 34B ;SEQ ID N0103)。
[0246] 圖35 :A431NS中以1 μ g/ml指定抗體/組合獲得的細胞凋亡。以來自Roche的 ELISA試劑盒檢測組蛋白-DNA複合物。細胞凋亡程度是與陽性對照（最大細胞凋亡）有 關。
[0247] 圖36 :向Balb/C nu/nu小鼠注射1X106個A431NS細胞。當腫瘤平均為約100mm3 時開始處理。小鼠接受17次抗體注射。第一次處理開始於第8日且最後一次在第34日。 抗體/組合物以每劑〇. 5mg或每劑0. 17mg注射。展示腫瘤體積的平均值+/-SEM。
[0248] 圖37 :A431NS增殖的抑制。X軸展示本發明的3種抗體的不同代表性組合。Y軸 展示呈未經處理的對照（對照）的百分比形式的代謝活性。誤差線表示+/-SEM。對於其它 詳情請參見實施例6。
[0249] 圖38 :兩種不同劑量的992+1024混合物與艾比特思相比在A431NS人類腫瘤異 種移植物中的生長抑制效果。向BALB/c nu/nu小鼠接種106個A431NS細胞。當腫瘤達到 100mm3的平均尺寸時（第8日），將小鼠隨機分成每組9隻的組且開始處理。將指定抗體以 每劑0.5mg或每劑lmg注射，每周兩次總共9次注射。圖上的淡灰區域表明處理階段。開始 的虛線表示給定組中第一小鼠由於過度腫瘤尺寸而進行安樂死的時間點。在第60日計算 每周2mg992+1024與每周2mg艾比特思及每周lmg992+1024與每周2mg艾比特思之間的統 計學顯著差異，其中除每周2mg992+1024組以外，所有組均終止。保留第60日之前排除的 動物的腫瘤尺寸，因此，該圖展示給定組中所有小鼠的累計腫瘤體積。展示平均值+/-SEM。
[0250] 圖39 :以992+1024抗體混合物、艾比特思或對照抗體處理（與圖38中所示相同 的實驗）的小鼠的存活率的Kaplan-Meyer圖。結果以經處理小鼠的存活率百分比形式 呈現。當對比992+1024與艾比特思時，觀察到高劑量（每周2mg，P = 0. 0008)與低劑量 (每周lmg，P = 0. 0004)組中小鼠存活率百分比之間的顯著差異。亦，當與高劑量艾比特 思相比時低劑量992+1024顯著較佳（P = 0.0087)。使用對數等級檢驗（Log-rank test) (Mantel-Cox)計算統計學差異。
[0251] 圖40A-C :通過FACS分析進行IgG992、1024及1320針對經全長人類與獼猴EGFR 轉染的CH0細胞的交叉反應性的分析。結合抗體是以PE標記的山羊F(ab'）2抗人類IgG FC 檢測。對表達EGFR的均勻細胞（SCC/FCS特性）執行的門被圈選。結合是表示為InM濃度 下最大抗體結合％。
[0252] 圖41A-B :992(A)及1024⑶的重鏈與輕鏈的鼠類（chi)與人源化（hu)候選者 可變區的可變區胺基酸序列的Clustalw2比對。將如MGT所定義的⑶R區域加下劃線； 間隙由（_)表示，相同胺基酸由（*)表示，保守突變表示為（:），半保守突變表示為（.）。黑 體胺基酸表明在全人類框架變異體顯示降低的結合親和力的情況執行回復突變為初始鑑 別出的鼠類殘基的胺基酸位置。序列ID如下編號：人源化992VH(SEQ ID N0104)。人源化 992VL(SEQ ID N0105)。人源化 1024VH(SEQ ID N0106)。人源化 1024VL(SEQ ID N0107)。嵌 合992VH(SEQ ID N040 的aa3-124)。嵌合992VL(SEQ ID No72 的aa3-109)。嵌合 1024VH(SEQ ID N041 的 aa3-120)。嵌合 1024VL(SEQ ID N073 的 aa3-114)。
[0253] 圖42A :992L1024的雙重可變域編碼基因的示意性代表圖；992L1024IGHV(751bp) 自5' AscI限制性位點開始表示，繼而為992IGHV、ASTKGP接頭、1024IGHV，且終止於3' Xhol 限制性位點，992L1024IGKV(1071bp)自5'NheI限制性位點開始表示，繼而為992IGKV、 TVAAP接頭、1024IGKV、IGKC且終止於3' Notl限制性位點。
[0254] 圖42B :1024L992的雙重可變域編碼基因的示意性代表圖；1024L992IGHV(751bp) 自5^8(：1限制性位點開始表示，繼而為102416狀431'1--接頭、99216狀，且終止於3111〇1 限制性位點，1024L992IGKV(1071bp)自5'NheI限制性位點開始表示，繼而為1024IGKV、 TVAAP接頭、992IGKV、IGKC且終止於3' Notl限制性位點。
[0255] 【實施方式】
[0256] 發明詳述
[0257] 抗體混合物
[0258] 在一具體實例中，本發明是關於包含能夠結合至少三個有區別的EGFR表位，較優 選三個不重疊 EGFR表位的抗體分子的抗體組合物。抗體的不重疊性質較優選使用經不同 標記的抗體在使用EGFR表達細胞的FACS分析中確定或通過使用利用經捕獲或接合至流動 單兀表面的EGFR抗原的表面電楽共振確定。亦可使用如實施例中所述的基於ELISA的方 法。結合三個不重疊 EGFR表位的組合物可用於針對較寬範圍的EGFR依賴性癌症類型，因為 與靶向一或兩個表位的單克隆抗體組合物相比，其較不易受EGFR構形差異影響且不易受 突變影響。此外，結合三種不重疊 EGFR表位的抗體組合物與靶向較少表位的組合物相比可 提供優良的功效。詳言的，該抗體組合物可對於體內癌細胞終末分化提供優良功效。圖37 結合三個有區別的hEGFR表位的有效抗體組合物的大量實施例說明該構想的一般適用性。
[0259] 對於單克隆抗EGFR抗體療法而言，特定比例的患者將不能有效地對抗體治療起 反應。對於一些患者而言，此可能歸因於該抗體的迅速清除或由於該抗體在患者中產生針 對該抗體的免疫反應。對於一些患者而言，缺乏反應可能由於其特定EGFR依賴性癌症表達 某一構形的EGFR，在該構形中單克隆抗體不能結合其表位。此可能由於糖基化差異，由於域 缺失或由於突變和/或SNP。
[0260] 再者，對於一些癌症而言，由癌細胞的配體產生引起的自分泌EGFR刺激具有重要 性，而在其它情況下，癌細胞表達EGFR無需配體刺激。對於後者癌症類型而言，能夠抑制配 體結合的抗體可能無效。
[0261] 抗體能夠結合EGFR上的至少三個有區別的表位的抗體組合物將更廣泛適用，因 為所有三個表位相對於抗體所識別的表位均改變的可能性減少。此外，所有抗體均由患者 清除的可能性更小。最終，實施例展示在功能鑑定中，包含三種結合有區別的表位的抗體的 混合物，其優於單克隆抗體且優於包含兩種抗體的混合物。在誘導癌細胞的終末分化方面 已使用結合不重疊表位的三種域III抗體最明確地證明優越性。該有效的抗體誘導癌細胞 終末分化先前未有報導，且在設計有效的基於抗體的癌症療法方面代表顯著進步。隨後的 結果證明類似或更優良的結果可使用兩種抗體的特定組合獲得。
[0262] 為獲得改良的臨床功效及針對更寬範圍的EGFR依賴性癌症類型的更廣泛的效 用，可增加組合物中的抗體數目。因此，該組合物可包含能夠結合四個不重疊表位的抗體。 該組合物可包含能夠結合五個不重疊表位的抗體。該組合物可包含能夠結合六個不重疊 表位的抗體。本申請案的實施例展示至少六種有區別的抗體可同時與EGFR結合（實施例 3)。此並不排除可能或甚至有利地通過謹慎選擇抗體來設計包含能夠結合多於六個（諸如 七個或八個）不重疊表位的抗體的組合物。
[0263] 在另一具體實例中，組合物包含一種以上結合一個表位的抗體分子，諸如兩種結 合不同但重疊的表位的抗體。包括結合重疊表位的抗體可為有利的，因為此提高表位被結 合的可能性。該可能性的一基本原理為：在一些患者和/或一些癌細胞中，表位可能由於構 形變化或突變或SNP而改變。雖然此可能影響一種抗體的結合，但其可能不影響結合重疊 表位的另一抗體的結合。此外，存在以下風險：該等抗體中的一者由於其被視為抗原而由患 者清除。通過包括兩種結合不同但重疊表位的抗體，減少清除兩種抗體中的一者之後果及 表位突變之後果。
[0264] 因此在一具體實例中，組合物包含兩種結合不同但重疊表位的抗體。在另一具體 實例中，組合物包含兩種結合相同表位的有區別的抗體分子。結合相同或重疊表位的抗體 可具有相同或不同的同種型。
[0265] 包含針對三個不重疊表位的抗體的抗體組合物因此包含四種、五種或六種有區別 的抗體分子以便兩種抗體結合兩個重疊表位或同一第一表位，兩種其它抗體結合兩種其它 重疊表位或同一第二表位，且兩種抗體結合兩種其它重疊表位或同一第三表位。當然，組合 物可包含兩種以上（諸如三種或四種）能夠結合重疊表位或能夠結合同一表位的抗體分 子。因此，通過對於各表位具有一種以上抗體或通過具有結合重疊表位的若干抗體，包括於 組合物中的抗體總數可超過6種。保持抗體總劑量恆定，各抗體濃度由於包括於組合物中 的各其它抗體而降低。因此，預期對可包括於組合物中同時保持可接受的功效的抗體數目 存在限制。根據表面電漿共振結合研究及增殖鑑定的觀察結果且考慮到製造挑戰，預期該 限制（若存在）額外優點可通過將抗體數目自6種增加至7種、8種、9種、10種或更多而獲 得。當然，此並不排除該組合物包含多於10種抗體，諸如11種、12種、13種、14種、15種、 16種、17種、18種、19種或20種抗體或更多，諸如25種抗體或更多，例如30種抗體或更多， 諸如40種抗體或更多，諸如50種抗體或更多。
[0266] 雖然較優選在本發明的抗體組合物中包括能夠結合至少三個不重疊 EGFR表位的 抗體，但使用能夠結合兩個不重疊 EGFR表位的抗體的特定組合亦獲得優良結果。該等較 優選「兩種抗體」組合物在下文中連同與如何設計本發明的抗體組合物有關的指導原則一 起進行更詳細地描述。已發現與包含抗體992、1030及1042的三種抗體組合物相比，當 使用僅具有兩種抗體（992及1024)的組合物時可獲得類似或甚至改良的功效。由於抗 體1024與1042屬於同一群且因此具有相同結合特異性，實際上，對於三種抗體組合物所 觀察到的包括對終末分化的效果的結果可歸因於該組合物中的僅兩種結合特異性（992及 1024/1042)。
[0267] 在一具體實例中，組合物中至少一種抗體結合域III表位，更優選組合物包含至 少兩種結合域III表位的抗體，且組合物亦可包含三種結合域III表位的抗體。
[0268] 較優選組合物包含至少一種結合域I表位的抗體且其可包含至少兩種結合域I表 位的抗體。
[0269] 較優選組合物包含至少一種結合域II表位的抗體且可包含結合兩個域II表位的 抗體。
[0270] 組合物亦可包含如本文中所定義的結合域I/II表位的抗體。
[0271] 組合物可包含能夠結合域IV表位的抗體。
[0272] 較優選組合物包含至少一種能夠抑制EGF結合的抗體分子。
[0273] 在另一較優選具體實例中，組合物可包含能夠防止EGFR磷酸化的抗體。
[0274] 此外組合物可包含能夠增強EGFR的內化/降解的抗體。
[0275] 在一較優選具體實例中，組合物包含至少一種域III抗體及至少一種域I/II抗 體。在另一較優選具體實例中，組合物包含至少兩種域III抗體及一種域I抗體。
[0276] 在另一較優選具體實例中，組合物包含至少兩種域III抗體，諸如至少三種域III 抗體。
[0277] 組合物的抗體可為具有非人類可變鏈與人類恆定鏈的嵌合抗體。非人類可變鏈可 來自小鼠、大鼠、綿羊、豬、雞、非人類靈長類動物或其它合適動物。為獲得全人類抗體，抗體 可在具有人類抗體基因的轉基因動物中產生。抗體亦可為所謂的人源化抗體，其中非人類 ⑶R序列已植入人類框架序列中。
[0278] 較優選人類恆定鏈為IgGl或IgG2同種型。更優選組合物中的所有抗體具有相同 同種型以便於製造。然而，在組合物中可有利地包括不同同種型的抗體。
[0279] 較優選本發明的抗體組合物包含能夠與選自由以下EGFR組成的組的EGFR結合的 抗體：人類EGFR、突變人類EGFR及人類EGFR的缺失變異體。較優選抗體能夠結合人類與 非人類靈長類EGFR兩者，以便其可在臨床實驗之前在相關毒物學研究中加以測試。較優選 非人類靈長類動物為稱猴（食蟹猴，Macaca fascicularis)。
[0280] 為支持以上所確定的使用結合多個有區別的表位中的三個的抗體治療EGFR依 賴性癌症的構想，本發明的
【發明者】已鑑別、製造且表徵一系列針對EGFR的嵌合小鼠/人 類抗體。該等嵌合抗體已個別地且以混合物形式與最新技術的單克隆抗體（以艾比特思 TM(ErbituXTM)及維克替比TM(Vectibi XTM)例示）進行對比。
[0281] 表1展示個別嵌合抗體的概述及與其有關的特徵。抗體編號為貫穿本申請案所使 用的參考數字。特異性為抗體所結合的EGFR域，如實施例3中所證實。Λ EGFR為抗體與 EGFR突變體（EGFRvIII)結合的能力，如實施例1中所述。獼猴EGFR為抗體結合獼猴EGFR 的能力（實施例10)。EGF inhib為抗體抑制EGF結合的能力（實施例4)。增殖為抗體抑 制癌細胞系（A431及HN-5)增殖的能力（實施例6)。
[0282] 表1本發明的抗體
[0283]
【權利要求】
1. 一種抗人類EGFR抗體或其抗原結合表位，其包含SEQ ID N0:50中的重鏈⑶R1XDR2 和⑶R3胺基酸序列及SEQ ID NO: 82中的輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3胺基酸序列。
2. 權利要求1的抗體或片段，其中所述抗體為人源化的。
3. 權利要求1的抗體或片段，其中所述抗體包含含有SEQ ID NO: 50的第3-118位氨基 酸的VH和含有SEQ ID NO:82的第3-113位胺基酸的八。
4. 一種抗體，其重鏈具有包含SEQ ID NO: 50的第3-118位胺基酸的VH和包含SEQ ID N0:91的胺基酸序列的恆定區，且其輕鏈包含SEQ ID N0:82的第3-220位胺基酸.
5. -種分離的核酸分子，其包含編碼權利要求1至4中任一項的抗體的（1)重鏈或其 抗原結合部分，或（2)輕鏈或其抗原結合部分，或（3)所述兩者的核苷酸序列。
6. 權利要求5的核酸分子，其中所述核苷酸序列選自SEQ ID NO:34或66.
7. -種載體，其包含權利要求5或6的核酸分子。
8. -種宿主細胞，其包含編碼權利要求1至4中任一項的抗體的（1)重鏈或其抗原結 合部分，或（2)輕鏈或其抗原結合部分，或（3)所述兩者的核苷酸序列，其中所述宿主細胞 不在人類當中。
9. 一種重組抗體組合物，其包含第一抗人類EGFR抗體分子和區別於第一分子的第二 抗人類EGFR抗體分子，其中所述第一抗EGFR抗體分子是權利要求1至4中任一項的抗體。
10. 權利要求9的組合物，其中所述第一和第二抗人類EGFR抗體分子不抑制彼此與人 類EGFR的結合。
11. 權利要求9或10的組合物，其中所述抗體分子的至少一種能夠增加其它抗體對人 類EGFR的最大結合能力。
12. 權利要求9至11中任一項的組合物，其中所述組合物中的第一抗體分子和第二抗 體分子的量分別為5 %和95%，或者分別為10 %和90%，或者分別為20 %和60%，或者分 別為30 %和70%，或者分別為40 %和60%，或者分別為45 %和55%，或者大約各50%。
13. 權利要求9至12中任一項的組合物，其中所述抗體分子結合有區別的EGFR表位。
14. 權利要求9至13中任一項的組合物，其中所述組合物除了所述第一和第二抗體分 子外不含有其它抗人類EGFR抗體分子。
15. 權利要求9至13中任一項的組合物，其還包含第三有區別的抗人類EGFR抗體分子
16. 權利要求15的組合物，其中所述第三抗體分子導致所述第一和/或第二抗體分子 與人類EGFR增強的結合。
17. 權利要求15或16的組合物，其中所述抗體分子結合三種有區別的EGFR表位。
18. 權利要求13或17的組合物，其中所述表位不重疊。
19. 權利要求9至18中任一項的組合物，其中至少一種抗體分子能夠抑制EGF結合。
20. 權利要求9至19中任一項的組合物，其中至少一種抗體分子能夠防止EGFR的磷酸 化
21. 權利要求9至20中任一項的組合物，其中至少一種抗體分子能夠增強EGFR的內化 或降解。
22. 權利要求15至17中任一項的組合物，其包含至少一種其它抗人類EGFR抗體分子， 其中所述其它抗體結合第四有區別的表位。
23. 權利要求22的組合物，其包含至少一種其它抗人類EGFR抗體分子，其中所述其它 抗體分子結合第五有區別的表位。
24. 權利要求23的組合物，其包含至少一種其它抗人類EGFR抗體分子，其中所述其它 抗體分子結合第六有區別的表位。
25. 權利要求9至24中任一項的組合物，其包含至少一種域III抗體分子和至少一種 域I/II抗體分子。
26. 權利要求15至17和22至24中任一項的組合物，其包含至少兩種域III抗體分子 和一種域I抗體分子。
27. 權利要求9至24中任一項的組合物，其包含至少兩種域III抗體分子。
28. 權利要求9至27中任一項的組合物，其包含至少一種能夠增強至少一種其它抗體 分子與有區別的表位結合的抗體分子。
29. 權利要求9至28中任一項的組合物，其中至少一種抗體分子為具有鼠類可變區與 人類恆定區的嵌合抗體。
30. 權利要求29的組合物，其中所述人類恆定區來自IgGl或IgG2。
31. 權利要求9至28中任一項的組合物，其中至少一種抗體分子為人源化抗體。
32. 權利要求15至17中任一項的組合物，其中所述組合物除了所述第一、第二和第三 抗體分子外不含有其它抗人類EGFR抗體分子。
33. -種試劑盒，其包含權利要求9至32中任一項的組合物，其中所述抗體分子在一個 容器或在獨立容器中調配用於同時、依次或單獨給藥。
34. 權利要求9至32中任一項的組合物，其中所述組合物使得受體內化。
35. 權利要求9至34中任一項的組合物，其中所述組合物能夠誘導體內A431NS細胞的 終末分化。
36. 權利要求9至35中任一項的組合物，其中所述組合物能夠上調體內腫瘤內披蛋白 (involucrin)表達。
37. -種雙特異性結合分子，其包含SEQ ID NO:50中的重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3氨基 酸序列及SEQ ID N0:82中的輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3胺基酸序列。
38. 權利要求37的雙特異性結合分子，其中所述雙特異性結合分子為雙重可變域抗 體。
39. 權利要求37的雙特異性結合分子，其中所述雙特異性結合分子為雙特異性Fab片 段或雙特異性scFv。
40. 權利要求1至4中任一項的抗體、權利要求9至32或34至36中任一項的組合 物、權利要求37至39中任一項的雙特異性結合分子在製備用於在表達EGFR的細胞中降低 EGFR信號轉導的藥物組合物中的用途。
41. 權利要求1至4中任一項的抗體、權利要求9至32或34至36中任一項的組合物、 權利要求37至39中任一項的雙特異性結合分子在製備用於殺死表達EGFR的細胞的藥物 組合物中的用途。
42. 權利要求1至4中任一項的抗體、權利要求9至32或34至36中任一項的組合物、 權利要求37至39中任一項的雙特異性結合分子在製備用於在表達EGFR的細胞中誘導凋 亡的藥物組合物中的用途。
43. 權利要求1至4中任一項的抗體、權利要求9至32或34至36中任一項的組合物、 權利要求37至39中任一項的雙特異性結合分子在製備用於抑制表達EGFR的細胞增殖的 藥物組合物中的用途。
44. 權利要求1至4中任一項的抗體、權利要求9至32或34至36中任一項的組合物、 權利要求37至39中任一項的雙特異性結合分子在製備用於誘導體內腫瘤細胞分化的藥物 組合物中的用途。
45. 權利要求44的用途，其中所述分化為終末分化。
46. 權利要求44的用途，其中所述分化伴隨有內披蛋白表達增加。
47. 權利要求1至4中任一項的抗體、權利要求9至32或34至36中任一項的組合物、 權利要求37至39中任一項的雙特異性結合分子在製備用於誘導EGFR內化的藥物組合物 中的用途。
48. 權利要求1至4中任一項的抗體、權利要求9至32或34至36中任一項的組合物、 權利要求37至39中任一項的雙特異性結合分子在製備用於在受試者中治療癌症的藥物組 合物中的用途。
49. 一種藥物組合物，其包含權利要求1至4中任一項的抗體、權利要求9至32或34 至36中任一項的組合物、權利要求37至39中任一項的雙特異性結合分子和醫藥學上可接 受的稀釋劑、載劑或賦形劑。
50. 權利要求49的藥物組合物，其調配用於癌症治療中的給藥。
51. 權利要求49或50的藥物組合物，其進一步包括至少一種能夠誘導癌細胞分化的化 合物。
52. 權利要求51的藥物組合物，其中所述化合物是選自由以下各物組成的組：視黃酸、 苯基丁酸鹽/酯、全反式視黃酸、活性形式維生素 D。
53. 權利要求49至52中任一項的藥物組合物，其進一步包含至少一種化療化合物或至 少一種抗腫瘤化合物。
54. 權利要求53的藥物組合物，其中所述化療化合物是選自由以下各物組成的組：阿 德力黴素、順鉬、紫杉醇、阿黴素、拓樸替康、氟嘧啶、奧賽力鉬和伊立替康。
55. -種抗體組合物，其包含至少第一抗人類EGFR抗體分子和區別於所述第一分子的 第二抗人類EGFR抗體分子，其中： a) 第一抗人類EGFR抗體分子具有包含含有SEQ ID N0:40的第3-124位胺基酸的VH 的重鏈和包含SEQ ID NO:91的胺基酸序列的恆定區，且具有包含SEQ ID NO:72的第3-216 位胺基酸的輕鏈；和 b) 第二抗人類EGFR抗體分子具有包含含有SEQ ID N0:41的第3-120位胺基酸的VH 的重鏈和包含SEQ ID NO:91的胺基酸序列的恆定區，且具有包含SEQ ID NO:73的第3-221 位胺基酸的輕鏈。
56. -種分離的核酸分子，其包含編碼如下重鏈或其抗原結合部分、輕鏈或其抗原結合 部分或者所述兩者的核苷酸序列： (a) -種抗體，其包含SEQ ID N0:40中的重鏈CDR1、CDR2和CDR3及SEQ ID NO:72中 的輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3 ;或者 (b) -種抗體，其包含SEQ ID N0:41中的重鏈CDR1、CDR2和CDR3及SEQ ID NO:73中 的輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3。
【文檔編號】A61K39/395GK104151430SQ201410211600
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2008年2月27日 優先權日:2007年3月1日
【發明者】米克爾.W.佩德森, 盧西拉.斯泰納, 艾倫.詹森, 克勞斯.凱福德, 珀-約翰.邁傑, 羅伯特.卡爾森, 查爾斯.派克, 拉斯.S.尼爾森 申請人:西福根有限公司