樹突狀細胞調節分子的製作方法

2023-05-14 19:47:46

專利名稱：樹突狀細胞調節分子的製作方法
技術領域：
本發明涉及樹突狀細胞(DC)調節分子。本發明特別涉及調節並優選抑制哺乳動物DC(尤其是人類DC)的分化和成熟的分子。能夠從節肢動物唾液、且更具體為蜱唾液中分離出此類分子。本發明還涉及此類分子在治療中的應用，並具體涉及此類分子在治療自身免疫性疾病、過敏及其他超敏反應、移植排斥及移植物抗宿主疾病、傳染病(包括由蜱傳播的傳染病)、癌症(包括血液系統惡性腫瘤)和急性及慢性炎症性疾病(包括與上述疾病相關的炎症)中的應用。
背景技術：
哺乳動物特別是人類的免疫系統由兩部分組成，即先天性免疫系統和適應性免疫系統。先天性免疫系統的細胞以一般方式識別並響應傳染原。雖然先天性免疫系統是抵禦感染的重要直接屏障，但其並不提供特異性的、持久的保護來抵禦外來實體(例如侵入性病原體)。與此相反，適應性免疫系統的細胞識別特定的外來實體，並且在宿主體內誘發對這些特定實體的免疫記憶。在經病原體感染後，DC很快與先天性免疫系統的組成部分接觸，而且還形成哺乳動物適應性免疫響應的核心部分。DC從前體細胞分化為未成熟DC。全身上下都存在未成熟DC ；雖然免疫系統的其他細胞也參與此功能，但是未成熟DC是主要通過其觸發T細胞活化的能力來負責啟動適應性免疫響應的主要細胞類型。未成熟DC通過諸如Toll樣受體(TLR)等模式識別受體(PRR)持續地從其周邊環境中取樣以獲得諸如病毒、細菌和寄生物等傳染原，所述模式識別受體識別外來實體表面 (例如在病原體表面)上的特定化學信號。一旦將實體(例如病原體)鑑定為外來實體，未成熟DC即將該實體或其片段內化，從而將蛋白抗原和脂抗原降解為肽及糖肽或脂片段並將其呈遞至該DC的表面。在響應於外來實體識別和/或細胞內環境的其他信號(例如炎性細胞因子)時， 未成熟DC經歷若干變化(統稱為「成熟」)並且開始發育為成熟DC。成熟中的DC上調主要組織相容性複合體(MHC)和MHC相關分子(例如CDl)的表達，MHC與源自外來實體的肽和糖肽結合併使其呈遞在DC表面，而MHC相關分子與源自外來實體的脂類結合併使其呈現在 DC表面。與此同時，DC上調稱作協同刺激分子的細胞表面受體(包括⑶80、⑶86和⑶40) 的表達，所述細胞表面受體在T淋巴細胞活化中擔任協同受體。此外，DC開始跟隨趨化信號向淋巴組織(例如淋巴結和/或脾)遷移。當處於淋巴組織中時，DC通過向T淋巴細胞呈遞源自外來實體的肽和糖肽或脂片段並傳遞適當的協同刺激信號來活化T淋巴細胞。這種經活化的T細胞負責傳播適應性免疫響應。所述外來實體可以是病原體、過敏原或在自身免疫響應情況下被身體誤鑑定為外來抗原的自身抗原。除了通過抗原呈遞和協同刺激來觸發T細胞活化的作用外，成熟DC還參與T細胞調節(例如將輔助性T細胞極化為Thl、Th2、Thl7或調節性(Treg)細胞)、細胞毒性T細胞的活化和對T細胞歸巢(例如，進入皮膚或腸及其他黏膜部位)的調節。
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DC在適應性免疫響應中所起的核心作用已經引起了對以治療為目的的DC功能調節的興趣，而且動物模型已表明DC調節因子可以用於治療自身免疫性疾病及其他炎性疾病(Subklewe 等，Human Immunology，2007，68 (3)，147-155)。另外已有提示，DC調節因子可以用於治療癌症。顯而易見，有益的是鑑定充當用於治療目的的DC調節因子的其他分子。具體而言，需要對具有DC調節活性特別是具有抑制活性的化合物進行鑑定，並且需要開發所述化合物在治療自身免疫性疾病及其他炎性疾病和癌症中的用途。

發明內容
因此，本發明提供一種分離出的DC調節分子，其中所述分子調節並優選抑制哺乳動物DC的分化和成熟。在一個實施方式中，所述分離出的DC調節分子調節並優選抑制人類DC的分化和成熟。本發明的DC調節分子可以從節肢動物特別是吸血節肢動物中分離出。所述分離出的DC調節分子可以是蛋白質。吸血節肢動物吸附到其宿主(包括諸如人等哺乳動物)上並長期進行吸食。其傳遞到宿主的成分，包括唾液中的成分，能夠潛在地誘發宿主免疫響應。此類響應可能對該節肢動物有害，因此該節肢動物可能需要抑制這些響應。鑑於DC在觸發免疫性中的核心作用，對所述節肢動物而言產生抑制DC功能的分子將是有益的。吸血節肢動物、特別是蜱可以通過對宿主接種多種抗炎成分和免疫調節成分來抑制宿主的免疫系統(Ribeiro 等，Infectious Agents and Disease, 1992，4 (3)，143—152)。已經在蜱唾液中鑑定出若干種免疫調節分子，其中包括巨噬細胞移動抑制因子 (MIF)的同源物(Jaworski 等，Insect Molecular Biology，2001，10 (4)，323—331)、白細胞彈性蛋白酶抑制劑(其由人類巨噬細胞、單核細胞和嗜中性粒細胞所分泌)的同源物 (Leboulle 等，The Journal ofBiological Chemistry，2002，277 (12)，10083-10089)、糖基化的蛋白P36(據認為其抑制絲裂原所促進的小鼠脾細胞體外增殖)(Bergman等，Journal of Parasitology，2000，86，516-525)、B 細胞抑制性蛋白(BIP) (Hannier 等，Immunology, 2004，113,401-408)和 B 細胞抑制因子(BIF) (Yu 等，Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006, 343, 585-590)。然而，這些分子中很多都沒有明確的細胞靶標，而且這些分子中沒有一個經鑑定對哺乳動物DC特別是人類DC的分化和成熟均具有抑制效果。&ilpl5是一種存在於蜱唾液中的蛋白，已發現其作用於未成熟的人類 DC(Anguita 等，Immunity,2002,16,849-859 ；Hovius 等，Vector borne and Zoonotic diseases, 2007，7 (3)，296-302)。然而，涉及在免疫調節刺激物存在時未成熟的人類DC 與&ilpl5的溫育的檢驗已表明，&ilpl5並不抑制協同刺激分子(如⑶86)的上調。因此 Salpl5並不抑制人類DC的成熟。前列腺素^(PGE2)是一種存在於蜱唾液中的非蛋白分子，其可能調節未成熟的小鼠DC的活性，但是對這些小鼠DC的成熟影響甚微(Sa-Nunes等，The Journal of Immunology, 2007,179，1497-1505)。PGE2能夠增進人類DC的成熟，但是尚無證據表明其能夠起到抑制人類DC的分化和成熟的作用。另外已有提示，蜱唾液和唾液腺提取物(SGE)可能能夠調節小鼠DC的分化和成
6_ (Cavassani 等,Immunology,2005,114, 235-245 ；Skallova Journal ofImmunology, 2008，180,6186-6192)。然而，尚未分離出負責提供這些活性的分子，並且至今尚無證據表明蜱唾液具有抑制人類DC的分化和成熟的能力。令人驚奇的是，本發明人現已分離出一種分子，其調節並優選抑制哺乳動物DC特別是人類DC的分化和成熟。術語「分離出」旨在表達所述分子不再處於其自然環境中。該術語包括已經脫離自然環境的分子以及與其相同但是通過合成製得的分子。一般而言，本發明中分離出的分子基本純淨。「基本純淨」意為所述組合物包含至少約50%的所關注的分子。在一些實施方式中，所述組合物可以包含至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約 95%、至少約99%或更多的所述分子。換言之，所述組合物可以包含低於約50%的其他分子。在其他實施方式中，所述組合物可以包含低於約40%、低於約30%、低於約20%、低於約10%、低於約5%、低於約或更少的其他分子。本發明的分子的活性本發明的分子「調節」(即改變)或「抑制」(即減少)哺乳動物DC的分化和成熟。 在一個實施方式中，這些細胞可以是人類DC。下文描述了適當的測試，所述測試用於評估 DC分化和成熟所受到的調節或抑制。對技術人員而言顯而易見的是，本文所述的用於評估分化和成熟所受到的調節或抑制的標記物僅以實例的方式給出，並非試圖進行限制。在一個實施方式中，例如通過下文所討論的測試，經測量本發明的分子將DC的分化和成熟都減少了至少20%。在其他實施方式中，對DC的分化和成熟的抑制可以是30^^40^^50%, 60%、70%、80%、90% 或以上。「DC的分化」意為細胞前體(例如骨髓源祖細胞或血單核細胞)發育為未成熟的 DC。使用本領域已知的標準測試，能夠在表型上並最終在功能上評估對DC分化的調節，例如評估對DC分化的抑制。能夠使用細胞標記物來評估前體在表型上向未成熟DC的分化所受到的抑制，所述標記物的表達隨所述前體細胞分化為未成熟DC而發生改變。舉例而言，如在圖23及所附描述中所述，單核細胞為DC的前體，其呈⑶14陽性和⑶1陰性。未成熟DC呈⑶14陰性和OTl陽性。所以，單核細胞向未成熟DC的分化可以通過⑶14的降低和OTl的升高來檢測。通過CD14陽性且CDl陰性的前體細胞的持續存在，可以檢測到由本發明的分子對前體細胞向未成熟DC的分化的抑制。通過使用根據其活性將前體細胞和已分化的DC區分開的任何測試，能夠評估前體細胞和發育完全的DC在功能上的分化。舉例而言，與前體細胞不同，發育完全的DC(特別是受到如下所述的刺激之後)在體外測試中能夠觸發T細胞的增殖。常見的T細胞增殖測試包括同種異基因的混合白細胞反應(MLR)和氧化性有絲分裂發生。「DC的成熟」是指在前體細胞已分化為未成熟DC之後所出現的過程。具體而言， 該術語涉及在已分化的未成熟DC遭遇刺激物且轉變為成熟DC時所發生的變化。所述刺激物可以是下述物質的成分通過PRR(如TLR)感知的傳染原(如病原體)、某些通過細胞因子受體而起作用的細胞因子、和/或其他細胞類型的特化細胞表面分子(例如活化的T細胞的⑶154)。與未成熟DC的成熟有關的變化通常包括協同刺激分子(例如⑶80和⑶86) 的表達上調以及DC表面的抗原呈遞，所述抗原來自病原體所發源的成分，且其形式通常為肽-MHC複合體和脂質-CDl複合體。未成熟DC的成熟還可能與所述DC向次級淋巴組織的遷移有關。本發明的分子可以對這些與未成熟DC的成熟有關的變化中的任何一種進行調節和抑制。因此可以通過本發明的分子使⑶86和/或⑶80和/或MHC分子的表達下降的能力，來評估其抑制未成熟DC成熟的能力。可以通過本發明的分子使TNF α的表達和/或分泌下降的能力，來評估其抑制未成熟DC成熟的能力。可以選擇性地在進行聚(I:C)、LPS或 IFNy刺激後評估本發明的分子抑制DC成熟的能力。可以選擇性地在進行CD40L、IFNa或者TLR7或TLR8配體(如CL097)刺激後評估本發明的分子抑制DC成熟的能力。在實施例中描述了用於對未成熟DC的成熟的抑制進行評估的實驗。本領域技術人員應知曉對未成熟DC的成熟的抑制進行評估的其他方法。如上所述，本發明的分子調節並優選抑制前體細胞分化為未成熟DC，而且調節並優選抑制隨後發生的未成熟DC成熟為成熟DC。如下文更詳細所述，這種對DC的分化和成熟所進行的調節或抑制可能在整體上對免疫系統具有下遊調節效果。將未經抗原呈遞細胞活化的T淋巴細胞稱為「初始」的。每個T淋巴細胞都特異於特定的抗原，且只能由呈遞同源抗原(cognate antigen)的特化抗原呈遞細胞(例如DC) 來活化。常規的T淋巴細胞通過T細胞受體(TCR)來識別抗原-MHC複合體，所述T細胞受體是包含α鏈和β鏈的異源二聚體。然而，在無協同刺激的情況下，通過TCR進行的信號傳遞導致抗原不響應或無能狀態，或者導致中斷性活化(abortive activation)及細胞死亡。所以，協同刺激分子對於T淋巴細胞的活化至關重要，所述協同刺激分子在成熟過程中在未成熟DC表面受到上調並且由諸如⑶觀(對應於⑶80和⑶86的情況)或⑶巧4 (對應於CD40)等T淋巴細胞表面的受體分子對其進行識別。在本發明的一個方面中，由上述分子所提供的對DC分化和成熟的抑制引起T淋巴細胞活化的下降。「τ淋巴細胞活化」是指輔助性T細胞(包括Thl、Th2、Thl7或Treg細胞)的活化，並且可選地指細胞毒性T細胞的活化，其通常依賴於輔助性T細胞的預先活化。通過本領域已知的方法可以對T細胞活化的下降進行評估。可以通過以下方法來評估T細胞的活化，例如但不限於通過對細胞因子分泌[例如白細胞介素(IL)-2的產生] 或DC觸發的T細胞增殖進行體外測試(例如同種異基因的MLR和氧化性有絲分裂發生)， 或通過在體內測試T細胞在正常或轉基因動物中對模型抗原(例如卵清蛋白)的響應，所述體內測試對在抗原再刺激之前和之後離體分離的T細胞使用類似的測試。在一個實施方式中，與不存在抑制DC分化和成熟的分子的標準測試相比，本發明的分子使T淋巴細胞的活化下降了至少約20%。在其他實施方式中，對DC分化和成熟的抑制可以使T淋巴細胞的活化下降至少約30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或以上。在本發明的一個方面中，上述分子所提供的對DC分化和成熟的調節或抑制導致對T淋巴細胞調控的調節。特別而言，本發明的分子可以對T淋巴細胞向Thl、Th2、Thl7、 調節性T(Treg)細胞或濾泡樣輔助性T(Thf)細胞的極化進行調節。通過在體外測試中測量源自T淋巴細胞的細胞因子，可以評估本發明的分子對T淋巴細胞極化的調節作用，所述細胞因子通常與不同類型的CD4和CD8T淋巴細胞有關。對於Thl細胞，所述細胞因子包括 IFN- γ ；對於Th2細胞，所述細胞因子包括IL-4、IL5和IL-13 ；對於Thl7細胞，所述細胞因
8子包括IL-17 ；而對於Treg細胞，所述細胞因子包括IL-10和TGF β。通過分別測量T_bet、 GATA-3、ROR- y _t和R)xP3的表達，或者通過針對Thf細胞測量Bcl6的表達，還能夠對各類CD4細胞進行測試。作為另一選擇，能夠對不同細胞的表型進行表型評估，例如可通過評估其所表達的趨化激素受體和其他表型標記物來進行評估。T淋巴細胞是哺乳動物免疫響應中的一種主要促進因子。因此，如上所述，通過本發明的分子對T淋巴細胞的激活的減少，或者該T淋巴細胞的極化的改變，將會導致對免疫響應的整體調節，而且特別會引起與所述免疫響應相關的細胞因子的水平的變化。舉例而言，本發明的分子可以具有一般性免疫抑制效果。對本領域技術人員而言顯而易見的是，使用多種方法中的任何一種都可以對免疫響應中的調節(例如免疫抑制效果)進行測量。通過尋找在響應TLR刺激時最快產生的促炎性細胞因子(例如白細胞介素-1和腫瘤壞死因子α (TNF α)、幹擾素-α、幹擾素-β或通常在感染後立即產生的細胞因子(例如IL-6或IL-U))的水平降低，能夠對整體免疫響應的下降或調節進行測量。本發明的分子還可以使抗炎性細胞因子(例如IL-10或TGF β) 的水平升高。在一個實施方式中，與不存在抑制DC分化和成熟的分子的標準測試相比，本發明的分子使促炎性細胞因子的水平下降或使抗炎性細胞因子的水平上升至少約20%。在其他實施方式中，對DC分化和成熟的抑制可以使促炎性細胞因子的水平下降或使抗炎性細胞因子的水平上升至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或以上。還可以通過多種其他方法來對免疫抑制效果進行評估，例如局部炎症減少或所產生的抗原特異性T細胞和B細胞庫的大小或活性的減少。可以從中分離出本發明分子的節肢動物可以從節肢動物中分離出本發明的分子。「節肢動物」定義為屬於節肢動物門的動物，其包括昆蟲、甲殼類動物和蜘蛛類動物。節肢動物的特徵是分節的軀體和由幾丁質構成的堅硬外骨骼。在本發明的一個方面中，可以從吸血節肢動物中分離出本發明的分子。術語「吸血節肢動物」包括所有從適合的宿主吸食血液的節肢動物。其包括昆蟲、蜱、蝨、跳蚤和蟎。 通常稱其為血液吸食節肢動物，並且這兩種術語在本申請中將會交替使用。在本發明的另一個方面中，隔離出的吸血節肢動物可以是蜱。術語「蜱」是給予蜱總科中的小型蜘蛛類動物的統稱，其包含於吸血節肢動物中。蜱是外寄生物，靠哺乳動物、 鳥類和爬行動物的血液生活。約900個蜱物種存在，且其見於世界各地。不同蜱物種的特徵在於其偏好的棲息場所和其地理分布。大多數蜱物種能夠對多種宿主物種(包括人類)進行吸食。如上文所討論，節肢動物、特別是蜱，可通過對宿主接種多種抗炎成分和免疫調節成分來抑制宿主的免疫系統。可以從任何已知的蜱物種中分離出本發明所分離的DC調節分子，所述蜱物種包括下述群體中的物種硬蜱亞科(Ixodinae)、凹溝蜱亞科(Bothriocrotoninae)、花蜱亞禾鬥(Amblyomminae)、血蝶亞禾鬥(Haemaphysalinae)、扇頭蝶亞禾鬥(Rhipicephalinae)、 璃眼蜱亞科(Hyalomminae)、納蜱科(Nuttalliellidae)、軟蜱亞科(Argasinae)、 殘喙蜱亞科(Otobinae)、匙喙蜱亞科(Antricolinae)、Nothoaspinae,鈍緣蜱亞科
9(Ornithodorinae)，舉例而言，包括任何一種下述蜱物種具尾扇頭蜱(Rhipic^phalus appendiculatus)、血紅扇頭@ (Rhipicephalus sanguineus)扇頭！^ (Rhipicephalus bursa)、美洲純目艮蝶(Amblyomma americanum)、卡延純目艮蝶(Amblyomma cajennense)、 希伯來鈍眼蜱(Amblyomma hebraeum)、彩飾鈍目艮蜱(Amblyomma variegatum)、微小牛 ！^ (Rhipicephalus(Boophilus)microplus)> 具環牛！^ (Rhipicephalus(Boophilus) annulatus)、ff|fe牛！^ (Rhipicephalus (Boophilus) decoloratus)、網紋革！^ (Dermacentor reticulatus)、安氏革！^ (Dermacentor andersoni)、邊緣革 _ (Dermacentor marginatus)、變異革蝶(Dermacentor variabilis)、鐵角血蝶(Haemaphysalis inermis)、 犬血蝶(Haemaphysalis leachii)、亥Ij 點血蝶(Haemaphysalis punctata)、小亞璃目艮蝶 (Hyalomma anatolicum anatolicum)、馬各馬它璃目艮蝶(Hyalomma dromedarii)、邊緣璃目艮蝶(Hyalomma marginatum marginatum)、蓖子硬蝶(lodes ricinus)、全溝硬蝶(Ixodes persulcatus)、肩突 1 lW (Ixodes scapularis)、六角形 1 lW (lodes hexagonus)、波 T 1(Argas persicus) > ^41 (Argas ref lexus) > Sf ^- (Ornithodoros erraticus)、毛白(Ornithodoros moubata moubata) > 1 ^ (Ornithodoros moubataporcinus)禾口薩氏純緣_ (Ornithodoros savigriyi)。本發明的蛋白質本發明的分子可以是蛋白質。如在實施例3 實施例18中所詳細討論，發明人已從蜱物種具尾扇頭蜱中鑑定並分離出一種抑制哺乳動物DC分化和成熟的節肢動物蛋白。 本文中將該蛋白稱為Japanin，其胺基酸序列示於圖15和SEQ ID NO :2中。因此，在本發明的一個方面中，本發明的分子可以包括i)包含胺基酸序列SEQ ID NO 2的蛋白；ii)i)中所定義蛋白的同源物iii)上文i)中所定義蛋白的活性片段，或上文ii)中所定義同源物的活性片段； 或iv) i)、ii)或iii)的功能等價物。本發明的分子可以是由SEQ ID NO 2的胺基酸序列構成的蛋白，或者該蛋白的活性片段。本文中的術語「功能等價物」用來描述使用上述測試時具有調節並優選抑制DC 分化和成熟的能力的任何分子，所述分子以對應於包含SEQ ID NO :2的胺基酸序列的 Japanin蛋白全序列的方式起作用。這包括通過合成製得的蛋白、所述蛋白的合成變體、提供對應活性但具有不同序列的蛋白分子、具有對應活性的天然存在的非蛋白分子以及具有對應活性的合成的非蛋白分子。特別地，將設計為模仿Japanin分子的三級結構或活性位點的合成分子視作功能等價物。在一個實施方式中，功能等價物具有調節並優選抑制DC分化和成熟的能力，從而如上所述導致T淋巴細胞活化的減少或對T淋巴細胞極化的調節。在另一實施方式中，功能等價物具有調節並優選抑制DC分化和成熟的能力，從而如上所述導致對免疫響應的抑制。糖基化如在實施例沈中所示，Japanin貌似可能在兩個位點被糖基化。用於天冬醯胺連接糖基化的天冬醯胺殘基屬於共有序列的一部分，且位於Japanin胺基酸序列(SEQ ID N02)的第59位和第155位。在缺少前導肽序列的成熟蛋白中，所述位置等同於第35位和第 131 位。所以，本發明的蛋白可以在一個或多於一個位置發生糖基化。在一個實施方式中， 所述蛋白可以在一個、兩個、三個或更多位置發生糖基化。本發明的蛋白可以發生N-糖基化，但是該蛋白還可以在一個或多於一個位置的位點發生0-糖基化。本發明的蛋白可以發生自然糖基化。在下述情況下尤其如此如果該蛋白是自然產生並分離的，或者如果該蛋白是在宿主細胞中重組產生的且所述宿主細胞真實反映了自然產生所述蛋白的生物體的糖基化模式。作為另一選擇，可能有必要對本發明的蛋白進行人工糖基化。在下述情況下尤其如此如果該蛋白是化學合成的，或者如果該蛋白是在不真實反映所述蛋白自然糖基化模式的生物體中重組產生的。此外，為了變更或改進所述蛋白的性質，可以出現額外的糖基化修飾。脂質運載蛋白的結構及脂質結合性質如在實施例11中所示，本發明人已發現Japanin是脂質運載蛋白(Iip0caIin)tJg 質運載蛋白是共同擁有類似摺疊結構的蛋白家族。特徵性脂質運載蛋白摺疊是八股反平行 β桶，其形成內部配體結合位點。脂質運載蛋白通常含有在間隔分布的位置上的至少2個、 更常見為4個半胱氨酸殘基。這些半胱氨酸殘基形成可以穩定所述脂質運載蛋白摺疊的內部二硫鍵。在本發明的一個方面，所述分子可以是脂質運載蛋白。因此，本發明的範圍所囊括的同源物、片段和功能等價物可以包含常見於蜱脂質運載蛋白中的基序Cys/TyrXLeu Trp0鑑於其推測性脂質運載蛋白結構，Japanin蛋白可能與脂質或脂樣分子聯結。術語 「脂質」旨在涵蓋任何可溶於有機溶劑但不溶於水的疏水性分子或兩性分子，其包括脂肪、 油、三醯甘油、糖脂、磷脂及類固醇、脂醯、脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、醣脂質、聚酮、甾醇脂和異戊烯醇脂。術語「脂樣分子」涵蓋具有與脂質相似或相同性質的任何分子。術語 「脂樣分子」還包括任何與非脂質分子複合的脂質，其包括糖脂、磷脂、磷酸糖脂、經標記脂質和乙醯化脂質。在體內，在本發明的蛋白在內質網中摺疊期間或緊隨其後、或者在從此位置輸出所述蛋白的後續階段，所述蛋白可以與脂質分子結合。在本發明的範圍內，本發明的蛋白可以在其產生過程中與脂質聯結。舉例而言，如果本發明的蛋白從自然來源分離出或通過重組產生，該蛋白可以無需任何幹預而自動與脂質聯結。作為另一選擇，可以將脂質加到包含本發明蛋白的組合物中，從而使所述脂質和所述蛋白之間可以發生複合。特別地，如果蛋白是化學合成的，可以將脂質外源性地加到包含所述蛋白的組合物中來形成複合。如上所述，本發明的蛋白可以與脂質「聯結」或「複合」。在本文中這些術語可互換使用，用來描述脂質和本發明的蛋白之間的任何類型的接觸。特別地，在脂質和本發明的蛋白之間可以存在相互作用。在一個實施方式中，該相互作用可能完全是結構性的，即脂質可以通過鑲嵌關係契合至蛋白內的結合口袋中。在另一實施方式中，脂質可以通過任何引力來與蛋白進行物理相互作用。此類引力可以包括靜電相互作用、疏水相互作用、親水相互作用、範德華力、氫鍵和共價相互作用。脂質和蛋白間的相互作用可以由結構性相互作用和引力的組合形成。
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在一個實施方式中，本發明的蛋白可以與脂質聯結。在另一實施方式中，脂質可以是類固醇或留醇，例如膽固醇。在又一實施方式中，脂質可以是膽固醇的代謝產物，例如維他命D3。如在實施例23中所示，已顯示Japanin可結合膽固醇。在一個實施方式中，本發明的蛋白可以結合膽固醇的代謝產物。特別的是，本發明由此提供包含或僅包含Japanin 和脂質(例如膽固醇或膽固醇的代謝產物)的複合物。Japanin蛋白、同源物和片段的功能等價物也可以與脂質或包括脂樣分子在內的其他疏水性分子聯結。特別地，Japanin蛋白、同源物和片段的功能等價物可以與膽固醇或膽固醇的代謝產物聯結。由於已顯示Japanin可結合膽固醇，本發明人設想經改造用來運載脂質但未保留Japanin生物活性的分子可能具有有用的性質。因此本發明包括運載分子 (carriermolecule)，其結合脂質並靶向DC表面上的受體。這種運載分子本身並不具有生物活性。在一個實施方式中，可以通過改造Japanin來產生運載分子，從而阻止其生物活性。在另一實施方式中，由運載分子運載的脂質可以通過結合至細胞受體來發揮生物功能。 因此術語「功能等價物」包括運載分子。受體結合如在實施例M中所示，認為Japanin可結合C型凝集素細胞表面受體。這表示 Japanin通過結合靶細胞表面受體並觸發引起抑制的內部細胞信號傳導途徑來起到調節並優選抑制DC分化和成熟的作用。在一個實施方式中，蛋白可以與靶細胞(例如DC)外表面上的受體結合。在另一實施方式中，蛋白可以結合二價陽離子依賴型受體，特別是C型凝集素受體。在一個實施方式中，蛋白可以結合受體並模擬該受體的天然配體。對本領域的技術人員而言顯而易見的是，所述蛋白的任何部分都可能與受體結合。特別是如果蛋白經糖基化和/或與脂質分子結合，與靶細胞上的受體結合的可能是碳水化合物部分或所聯結的脂質。在一個實施方式中，本發明包括一種複合物，所述複合物包含或僅包含本發明的蛋白和受體。在另一實施方式中，所述複合物可以包含或僅包含本發明的蛋白、受體(例如諸如C型凝集素受體等二價陽離子依賴型受體)和脂類(例如膽固醇或膽固醇的代謝產物)。同源物和片段如上所述，本發明包括Japanin蛋白的同源物和活性片段，所述Japanin蛋白顯示為SEQ ID NO :2的胺基酸序列。本發明還包括這些同源物和活性片段的功能等價物。術語「同源物」旨在涉及保留了調節並優選抑制DC分化和成熟能力的Japanin序列的旁系同源物和直系同源物，所述Japanin序列在SEQ ID NO :2中公開。同源物可以具有調節並優選抑制DC分化和成熟的能力，從而如上所述導致T淋巴細胞活化的減少或形成對T淋巴細胞極化的調節。在另一實施方式中，同源物具有抑制DC分化和成熟的能力，從而如上所述形成對免疫響應的抑制。在又一實施方式中，同源物可以具有結合脂質(例如膽固醇或膽固醇的代謝產物)的能力和/或與膜結合受體(例如諸如C型凝集素受體等二價陽離子依賴型受體)結合的能力。同源物可以源自除具尾扇頭蜱之外的蜱物種，包括血紅扇頭蜱、囊狀扇頭蜱、 美洲鈍眼蜱、卡延鈍眼蜱、希伯來鈍眼蜱、彩飾鈍眼蜱、微小牛蜱、具環牛蜱、消色牛蜱、網紋革蜱、安氏革蜱、邊緣革蜱、變異革蜱、鐵角血蜱、犬血蜱、刻點血蜱、小亞璃眼蜱、駱駝璃眼蜱、邊緣璃眼蜱、蓖子硬蜱、全溝硬蜱、肩突硬蜱、六角形硬蜱、波斯銳緣蜱、鴿銳緣蜱、遊走鳥蜱、毛白鈍緣蜱、豬鈍緣蜱和薩氏鈍緣蜱。同源物還可以源自蚊物種，包括屬於庫蚊屬、按蚊屬和伊蚊屬的物種，特別是致乏庫蚊(Culex quinquefasciatus)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和甘比亞按岐(Anopheles gambiae)；跳蚤物種，例如貓櫛首蚤 (Ctenocephalides felis)(貓蚤)；白蛉；墨蚊；舌蠅；蝨；蟎。通常而言，同源物可以源自任何已知的蜱物種，例如屬於硬蜱亞科、凹溝蜱亞科、 花蜱亞科、血蜱亞科、扇頭蜱亞科(包括璃眼蜱亞科)、納蜱科、軟蜱亞科、殘喙蜱亞科、匙喙蜱亞科和鈍緣蜱亞科的物種。對於本文所述的分離出的Japanin蛋白的序列同源物的鑑定方法對本領域的技術人員而言是清楚可見的。舉例而言，可以通過對公共的和私人的序列資料庫進行同源性搜索來鑑定同源物。方便起見，可以使用公用資料庫，但是私人的或商用的資料庫同樣有用，特別是如果其包含未在公共資料庫中呈現的數據。一級資料庫是存有原始核酸或胺基酸序列數據的站點，其可以是公用的或商用的。公用一級資料庫的實例包括GenBank資料庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)、EMBL 資料庫(http://www. ebi. ac. uk/)、DDBJ 資料庫(http://www. ddbj. nig. acjp/)、SWISS-PROT 蛋白質資料庫(http://expasy. hcuge. ch/)、PIR(http ://pir. georgetown. edu/)、TrEMBL (http: //www. ebi. ac. uk/)、TIGR 數據
( #JAL http://www. tigr. org/tdb/index. html)、NRL-3D WiMW- (http://www. nbrfa. georgetown. edu)、蛋白質資料庫(the Protein Data Base) (http://www.rcsb.org/pdb)、 NRDB 資料庫(ftp://ncbi. nlm. nih. gov/pub/nrdb/README)、OWL 資料庫(http://www. biochem. ucl. ac. uk/bsm/dbbrowser/OWL/)，以及二級資料庫 PROS ITE (http: //expasy. hcuge. ch/sprot/prosite. html)、PRINTS (http: //iupab. leeds. ac. uk/bmb5dp/prints. html)、Profiles (http://ulrec3. unil. ch/software/PFSCAN_form. html)、Pfam(http:// www. Sanger, ac. uk/software/pfam)>Identify(http://dna. Stanford, edu/identify/)禾口 Blocks (http://www. blocks, fhcrc. org)資料庫。商用資料庫或私人資料庫的實例包括 PathoGenome(Genome Therapeutics Inc.)禾口PathoSeq(Incyte Pharmaceuticals Inc.)。通常認為，兩個多肽(優選對於特定的區域)間的一致性超過30%即認為表明功能等價性，並且由此表明這兩種蛋白是同源的。在一個實施方式中，同源蛋白與Japanin蛋白序列(SEQ ID NO 2)的序列一致性程度超過60%。在其他實施方式中，同源蛋白與SEQ ID NO 2的分離節肢動物蛋白序列的序列一致性程度分別超過70^^80%,90^^95^^98%或 99%。使用BLAST(版本2. 1.3)且用NCBI (美國國家生物技術信息中心；http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)所指定的預設參數[Blosum 62矩陣；空位開放罰分(gap open penalty)= 11，空位延伸罰分(gap extension penalty) = 1]來確定本文所指的一致性百分比。只要保留了野生型蛋白序列所展示的對DC分化和成熟的調控(優選抑制)，SEQ ID NO 2的Japanin蛋白序列的同源物包括與野生型序列相比包含胺基酸取代、插入或缺失的突變蛋白。突變蛋白可以具有調節並優選抑制DC分化和成熟的能力，從而如上所述導致T淋巴細胞活化的下降或形成對T淋巴細胞極化的調節。在另一實施方式中，突變蛋白具有抑制DC分化和成熟的能力，從而如上所述導致對免疫響應的抑制。因此突變蛋白包括含有保守胺基酸取代的蛋白，且所述取代不會對蛋白的功能或
13活性造成不利影響。該術語還旨在包括天然生物變異體(例如等位變異體，或本發明分離出的節肢動物蛋白所源自的物種的地理變異)。通過對蛋白序列中的特定殘基進行系統突變或誘發突變，還可以設計出與野生型蛋白序列相比在調節或抑制DC分化和成熟方面活性提高的突變蛋白。如實施例20中所述，本發明人已在安氏革蜱中鑑定出Japanin同源物。如實施例 21中所述，本發明人已分別從下述物種中鑑定出Japanin同源物微小牛蜱0種同源物)、 美洲鈍眼蜱和具尾扇頭蜱。這些序列在圖M 圖四中示出，且與SEQ ID N0:4、6、8、10和 12對應。因此，在本發明的另一方面，本發明所分離出的分子可以包括i)包含SEQ ID NO :4、6、8、10或12中任何一個胺基酸序列的蛋白；ii)i)中所定義蛋白的同源物；iii)上文i)中所定義蛋白的活性片段，或上文ii)中所定義同源物的活性片段； 或iv) i)、ii)或iii)的功能等價物。雖然本發明人不希望受理論束縛，但假定這些序列可以不是全長序列。因此本發明規定在包含胺基酸序列SEQ ID N0:4、6、8、10或12的分子的N端和/或C端可以有其他
胺基酸。本發明還提供分離出的Janapin分子及其同源物的「活性片段」。此定義中包括保留了全長Japanin分子調節或抑制哺乳動物DC分化及調節的能力的任何片段。此類片段不僅包括本文所定義的分離出的節肢動物蛋白(SEQ ID NO :4、6、8、10和 12)的片段，還包括上述蛋白的同源物的片段。這種同源物的片段與分離出的節肢動物蛋白 (SEQ ID N0:4、6、8、10和12)的片段的一致性通常會超過60%，但是更優選的同源物的片段與分離出的節肢動物蛋白(SEQ ID N0:4、6、8、10和12)的片段的一致性程度會分別顯示為超過 70%、80%、90%、95%、98%或 99%。分離出的節肢動物蛋白(SEQ ID NO :4、6、8、10和12)的這些活性片段及其同源物的片段調節並優選抑制DC的分化和成熟。在一個實施方式中，分離出的節肢動物蛋白(SEQ ID N0:4、6、8、10和12)的活性片段及其同源物的片段調節並優選抑制DC的分化和成熟，從而如上所述導致T淋巴細胞活化的下降或對T淋巴細胞極化的調節。在另一實施方式中， 分離出的節肢動物蛋白(SEQ ID N0:4、6、8、10和12)的活性片段及其同源物的片段調節並優選抑制DC的分化和成熟，從而如上所述對免疫響應進行抑制。當然，通過對野生型蛋白序列進行系統突變或片段化並隨後進行適合的活性測試，可以理性地設計出在調節或抑制 DC分化和成熟方面活性提高的片段。在一個實施方式中，同源物可以具有結合脂質(例如膽固醇或膽固醇的代謝產物)的能力和/或結合膜受體(例如諸如C型凝集素受體等二價陽離子依賴型受體)的能力。在一個實施方式中，對於上述分離出的節肢動物蛋白的片段，其長度可以是至少約100個胺基酸。在其他實施方式中，對於上述分離出的節肢動物蛋白的片段，其長度可以是至少約90個、至少約80個、至少約70個、至少約60個、至少約50個、至少約40個、至少約30個、至少約20個、至少約10個或至少約5個胺基酸。
抗體本發明還提供抗體，該抗體結合本發明的分子並特別結合上述Japanin蛋白、同源物、片段及其功能等價物。可以將所述抗體作為檢測所述分子的試劑來使用。所述抗體還可以是中和所述分子調節或抑制DC分化和成熟的活性的抗體，因此如下所述其可用於治療目的。本發明的此方面中所包括的抗體可與本發明範圍所囊括的上述任何功能等價物、 同源物和蛋白片段結合。本發明還包括與本發明的蛋白的碳水化合物部分結合的抗體。特別的是，本發明包括與一種或多於一種天然附著至Japanin的碳水化合物部分結合的抗體。本發明的範圍還包括「Anticalin」，其經改造脂質運載蛋白而得，用來識別並結合特定的蛋白表位。在某些實施方式中，anticalin可以採取肽、糖肽或糖脂的形式。本文中將anticalin包含在術語「抗體」的範圍內。Anticalin不是源自免疫球蛋白的分子，但是其以與抗體類似的方式識別蛋白表位。如果需要多克隆抗體，可以用本發明的分子(例如Japanin蛋白、片段、同源物或其功能等價物)使選定的哺乳動物(例如小鼠、兔、山羊或馬)免疫。如果需要，可以使所述分子與運載蛋白偶聯。常用的運載體包括牛血清清蛋白、甲狀腺球蛋白和鑰孔戚血藍蛋白(keyhole limpet haemocyanin) 0隨後使用所述偶聯分子來使動物免疫。從經免疫的動物收集血清，並按照已知程序(例如通過免疫親和色譜)對其進行處理。本領域的技術人員還能夠容易地製造針對本發明分子的單克隆抗體。使用雜交瘤技術製造單克隆抗體是公知的一般方法(參見例如Kohler，G.和Milstein，C.，Nature 256 :495-497(1975) ；Kozbor 等，Immunology Today 4:72(1983) ；Cole 等，在 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 中第 77-96 頁，Alan R. Liss, Inc. (1985))。本文所用的術語「抗體」包括抗體的片段，例如Fab、F(ab』)2和Fv片段，其也特異性地結合DC調節分子。術語「抗體」還包括對本發明的分子特別是對Japanin蛋白、同源物及其片段有特異性的嵌合抗體分子和人源化抗體分子。嵌合抗體是將非人類可變區連接或融合至人類恆定區的抗體(參見例如Liu等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439(1987))。 本文所用的術語「人源化抗體」指其中用非人類供體抗體重鏈和/或輕鏈的可變區中的 CDR胺基酸及選定的其他胺基酸來替換人類抗體中的對等胺基酸而獲得的抗體分子。人源化抗體因此與人類抗體非常相似，但具有供體抗體的結合能力(參見Jones等，Nature, 321,522(1986) ；Verhoeyen 等，kience，239，1534 (1988) ；Kabat 等，J. Immunol.，147， 1709(1991) ；Queen 等，Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86,10029 (1989) ；Gorman 等，Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88，34181 (1991)；以及 Hodgson 等，Bio/Technology, 9,421 (1991))。在一些情況下，例如為了便於檢測，可能需要將標記基團連接到抗體上。所述標記可以是酶、放射性標記、諸如生物素等化合物或螢光染料。融合蛋白本發明還包括融合蛋白，所述融合蛋白含有本發明的分子特別是Japanin蛋白、 同源物、片段及其功能等價物，且所述分子與一種或多於一種的肽、多肽或其他分子遺傳學融合或化學連接。所述額外的肽或多肽或分子的目的可以是對蛋白的檢測、表達、分離或純化進行輔助，或者其可以帶給該蛋白所需的額外性質。潛在的融合伴侶的實例包括半乳糖苷酶、穀胱甘肽-S-轉移酶、螢光素酶、多聚組氨酸標籤、Τ7聚合酶片段和分泌信號肽。融合伴侶還可以延長所述分子(例如Fc片段)在體內的壽命。在實施例15 實施例18 中提供了融合蛋白的實例。其他的潛在的融合伴侶包括潛在的生物藥物，例如開發用作治療特定疾病的藥物的蛋白或其他分子。另外的潛在融合伴侶包括將本發明的分子靶向免疫系統中的細胞(如 DC)的抗原。舉例而言，融合伴侶可以包括可以與所述分子融合的自身抗原或外來抗原或者過敏原，從而在體內將所述分子遞送至DC。另外的融合伴侶可以包括與不同的DC細胞表面成分結合從而便於向DC進行遞送的分子。在一些情況下，可以包含多種融合伴侶。這類抗原的實例將在下文進行更詳細的討論。核酸本發明還包括核酸分子，所述核酸分子包含編碼本發明的分子的核酸序列。術語 「核酸分子」旨在包括DNA分子、RNA分子和混合的DNA-RNA分子。該定義還包括基因組DNA、 cDNA分子、mRNA分子以及含有經修飾的鹼基的DNA和RNA。對本領域的技術人員而言顯而易見的是，遺傳密碼的簡併性決定了會存在多種不同的能夠編碼所定義的蛋白序列的核酸序列，所述蛋白序列是本發明範圍所囊括的所分離的蛋白、蛋白片段或其功能等價物。本發明還包括編碼融合蛋白(例如上述融合蛋白)的核酸分子。在本發明的一個方面中，包含編碼本發明分子的核酸序列的核酸分子可以包含或僅包含SEQ ID NO :1或其簡併序列。在本發明的其他方面，所述核酸分子可以包含SEQ ID NO :3、5、7、9或11中的任何一個序列或其簡併序列。簡併序列的一個實例是核酸分子SEQ ID NO :32，其與核酸分子SEQ ID NO :3編碼相同的安氏革蜱蛋白SEQ IDNO :4。本發明還提供反義核酸分子，其在高度嚴格雜交條件下與包含編碼本發明的分子 (特別是上述分離出的節肢動物蛋白、同源物、片段或其功能等價物)的核酸序列的核酸分子雜交。高度嚴格雜交條件包括在含有50%甲醯胺、5XSSC (150mM氯化鈉，15mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7. 6)、5XDenhardts溶液、10%硫酸葡聚糖和20 μ g/ml經剪切的變性鮭精DNA的溶液中於42 °C過夜溫育，隨後在0. IXSSC中於約65 °C清洗過濾器。反義核酸分子包括反義DNA寡聚核苷酸和包括siRNA在內的RNA寡聚核苷酸。本發明還包括包含核酸分子或反義核酸分子的載體，所述核酸分子包含編碼分離出的節肢動物蛋白、同源物、片段或其功能等價物的核酸序列，所述反義核酸分子在高度嚴格雜交條件下與所述核酸分子雜交。所述載體包括克隆載體和表達載體。所述表達載體可以整合有在結構上與本發明的核酸分子連接的適合的轉錄控制序列和翻譯控制序列，例如增強子元件、啟動子-操縱子區、終止序列、mRNA穩定性序列、起始密碼子及終止密碼子或者核糖體結合位點。這些控制序列僅通過實例給出，而並非試圖對其進行限制。此外，便利的是，重組蛋白從某種宿主分泌。因此，此類載體的其他成分可以包括編碼分泌、信號傳導和加工序列的核酸序列。本發明的載體可以包括質粒和病毒(包括細菌噬菌體和真核生物病毒)，以及其他直鏈或環狀DNA運載體，例如採用轉座因子或同源重組技術的載體。特別適合的病毒載體包括杆狀病毒類、慢病毒類、腺病毒類和牛痘病毒類載體。本發明還包括宿主細胞，該宿主細胞包含編碼本發明的分子的載體、核酸分子或反義核酸分子；所述本發明的分子、特別是節肢動物蛋白、同源物、片段或功能等價物調節並優選抑制DC的分化和成熟。在本發明範圍內，可以使用任何類型的宿主細胞。在一個實施方式中，宿主細胞可以是原核生物宿主細胞。在該實施方式中，所述原核生物宿主細胞可以是大腸桿菌宿主細胞。在另一個實施方式中，宿主細胞可以是真核生物宿主細胞。在該實施方式中，所述宿主細胞可以是真核酵母菌細胞。在又一個實施方式中，宿主細胞可以是哺乳動物宿主細胞。在再一個實施方式中，宿主細胞可以是昆蟲細胞，且在該實施方式中表達系統可以是杆狀病毒表達系統。可以使用多種技術來將本發明的載體或核酸導入宿主細胞。在文獻中充分描述了適合的轉化和轉染技術(Sambrook 等，1989 ；Ausubel 等，1991 ；Spector, Goldman 和 Leinwald, 1998) 0在真核細胞中，根據系統的要求，表達系統可以是短暫的(例如附加體) 或永久的(染色體整合)。在本發明另一個實施方式中，提供了本發明的分子、特別是分離出的節肢動物蛋白、同源物、片段或功能等價物的製備方法，所述分子調節並優選抑制DC分化和成熟，所述製備方法包括i)在表達本發明蛋白的條件下培養包含載體的宿主細胞，所述載體含有編碼本發明的分子、特別是分離出的節肢動物蛋白、同源物、片段或功能等價物的核酸序列，根據本發明，所述分子調節並優選抑制DC分化和成熟；和ii)回收由此製得的所述蛋白。在本發明的此方面中，取決於宿主細胞系統、載體和隨後的蛋白回收方法，蛋白表達所需的條件會有所不同。實施例公開了製造和回收本發明所分離的蛋白的特定過程。這些條件的變化對本領域的技術人員而言是顯而易見的。藥物組合物因鑑定出本發明的分子在調節並優選抑制DC分化和成熟中具有活性，故計劃將本發明的分子、蛋白、核酸、反義核酸、載體、宿主細胞和抗體作為治療劑來使用。本發明提供如下的藥物組合物所述組合物包含分離出的DC調節分子(例如調節並優選抑制DC分化和成熟的節肢動物蛋白或其功能等價物)、編碼此類分子的核酸、含有所述核酸的載體、包含所述載體的宿主或結合所述分子的抗體和藥物可接受載劑。只要賦形劑本身並不引發毒性效果或導致產生對接受藥物組合物的個體有害的抗體，本文所用的術語「藥物可接受載劑」包括基因、多肽、抗體、脂質體、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸和無活性的病毒顆粒或者實際上任何其他試劑。藥物可接受載劑還可以包括諸如水、 生理鹽水、甘油、乙醇等液體，或者包括諸如潤溼劑或乳化劑和PH緩衝物質等輔助性物質。 賦形劑可以使藥物組合物能被製成片劑、丸劑、糖錠劑、膠囊劑、液體、凝膠劑、糖漿劑、漿劑、懸浮劑，從而幫助患者進行服用。在Remington，s Pharmaceutical Sciences (MackPub. Co.，N. J. 1991)中全面討論了藥物可接受載劑。在一個實施方式中，藥物組合物可以包括一種或多於一種的與蛋白相互作用的脂質分子。在一個具體實施方式
中，所述脂質分子可以是膽固醇或膽固醇的代謝產物(如維他命D3)。在另一實施方式中，藥物組合物可以包括複合物，所述複合物包含或僅包含 Japanin和脂質(例如膽固醇或膽固醇的代謝產物)。在又一實施方式中，藥物組合物可以包括複合物，所述複合物包含或僅包含Japanin、脂質(例如膽固醇或膽固醇的代謝產物) 和受體(例如諸如C型凝集素受體等二價陽離子依賴型受體)。在本發明的一個方面中，藥物組合物還可以包括一種或多於一種的額外治療劑。
17本發明此方面包括技術人員認為有利於與本發明的分子共同施用的任何額外治療劑。具體而言，所述額外治療劑可以包括抗炎劑、免疫調節劑、免疫抑制劑、細胞因子、細胞因子模擬物或細胞因子結合蛋白。在特定的實施方式中，所述一種或多於一種的額外治療劑可以包括抗炎劑。治療方法本發明提供分離出的分子，例如調節並優選抑制DC分化和成熟的蛋白、編碼所述蛋白的核酸、反義核酸、含有所述核酸或反義核酸的載體、包含所述載體的宿主細胞、與所述蛋白或分子結合的抗體、或者包含所述分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞或抗體的治療用的藥物組合物。本文所用的術語「治療」包括出於人類或動物患者的利益而使用本文所述的蛋白、 分子、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物。具體而言該術語包括治療性治療、預防性治療、診斷和疫苗接種。此列表僅通過說明性的方式給出，並不試圖進行限制。本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物可以用來治療任何動物。在一些實施方式中，所述動物可以是哺乳動物。在另外一些實施方式中，所述動物可以是牛、豬、羊、貓、狗或兔。在其他實施方式中，所述動物可以是人。在另一個實施方式中，提供了分離出的分子在製造用於治療DC活性相關疾病的藥物中的應用，所述分離出的分子調節並優選抑制哺乳動物DC的分化和成熟，例如調節並優選抑制哺乳動物DC的分化和成熟的分離出的節肢動物蛋白、編碼所述蛋白的核酸、與編碼所述蛋白的核酸結合的反義核酸、含有所述核酸或反義核酸的載體、包含所述載體的宿主細胞、與所述蛋白或分子結合的抗體、或者用於製造治療DC活性相關疾病的藥物的包含所述分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞或抗體的藥物組合物。本發明還提供了對患有DC相關疾病的動物的治療方法，所述治療方法包括對所述動物施用調節並優選抑制哺乳動物DC的分化和成熟的分離出的分子，例如調節並優選抑制哺乳動物DC的分化和成熟的分離出的節肢動物蛋白、編碼所述蛋白的核酸、與編碼所述蛋白的核酸結合的反義核酸、含有所述核酸或反義核酸的載體、包含所述載體的宿主細胞、與所述蛋白或分子結合的抗體、或者包含所述分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞或抗體的藥物組合物。在本發明範圍內，可以使用多種施用模式中的任何一種或多種來對患者施用本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物。此類施用方式為本領域所公知， 其可以包括胃腸外注射(例如靜脈內注射、皮下注射、腹膜內注射、肌內注射或注射至組織間隙)，或者通過直腸施用、口服、陰道施用、局部施用、經皮施用、皮內施用、鞘內施用、鼻內施用、眼部施用、耳部施用、肺部施用或其他黏膜施用。可以使用納米貼片(nanopatch)來經皮施用本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物。還可以使用基因槍來施用本發明的核酸、載體或藥物組合物。確切的施用方式將取決於待治療的疾病或病症。在一個實施方式中，可以在治療或預防自身免疫性疾病、過敏症及其他超敏性病症、移植排斥及移植物抗宿主疾病和極性及慢性炎症性疾病中使用本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物。自身免疫性疾病包括但不限於胃酸缺乏性自身免疫性慢性活動性肝炎、艾迪生
18氏病(Addison' s disease)、斑禿、肌萎縮性側索硬化(ALS，Lou Gehrig氏病)、強直性脊柱炎、抗腎小球基底膜腎炎或抗腎小管基底膜腎炎、抗磷脂症候群、再生障礙性貧血、關節炎、哮喘、特應性過敏、特應性皮炎、自身免疫性艾迪生氏病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性內耳疾病(AIED)、自身免疫性淋巴增生症候群(ALPQ、自身免疫性血小板減少性紫癜(ATP)、巴洛病(Balo disease)、白塞氏病(Behcet' s disease), Berger氏病(IgA腎病)、大皰性類天皰瘡、心肌病、乳糜瀉、口炎性腹瀉皮炎、慢性疲勞免疫缺陷症候群(CFIDS)、慢性疲勞免疫功能障礙症候群(CFIDS)、慢性炎性脫髓鞘性多發性神經病、丘-施症候群(Churg Strauss syndrome)、瘢痕性類天皰瘡、Cogan症候群、冷凝集素病、大腸炎、顱動脈炎、CREST症候群、克羅恩氏病(Crohn' s disease)、庫欣症候群 (Cushing' s syndrome) ,Dego氏病、皮炎、皮肌炎、幼年型皮肌炎、Devic氏病、I型糖尿病、 盤狀紅斑狼瘡、Dowling-Dego氏病、心肌梗塞後症候群(Dressier' s syndrome)、嗜酸性筋膜炎、獲得性大皰性表皮鬆解症、特發性混合型冷沉澱球蛋白血症、伊文症候群(Evan' s syndrome)、纖維肌痛、纖維肌炎、纖維化肺泡炎、胃炎、巨細胞動脈炎、腎小球性腎炎、 Goodpasture氏病、Grave氏病、Guillian-Barre症候群、喬本氏甲狀腺炎、溶血性貧血、過敏性紫癜(Henoch-khonlein purpura)、肝炎、Hughes症候群、特發性腎上腺萎縮、特發性肺纖維化、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA腎病、炎性脫髓鞘性多發性神經病、胰島素依賴性糖尿病(I型)、腸易激症候群、幼年型關節炎、Kawasaki氏病、扁平苔蘚、Lou Gehrig 氏病、狼瘡狀肝炎、萊姆病、梅尼埃爾氏病(Meniere' s disease)、混合性結締組織病、 多發性骨髓瘤、多發性硬化、重症肌無力、肌炎、眼瘢痕性類天皰瘡(ocular cicatricial pemphigoid)、骨質疏鬆症、扁平部睫狀體炎、尋常型天皰瘡、惡性貧血、結節性多動脈炎、多軟骨炎、多腺性症候群、多腺性自身免疫性症候群、風溼性多肌痛(PMR)、多肌炎、多肌炎和皮肌炎、原發性無丙種球蛋白血症、原發性膽汁性肝硬化、原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、牛皮癬、雷諾氏現象、萊特爾症候群(Reiter' s syndrome)、風溼性關節炎、結節病、鞏膜炎、硬皮病、Sjogren症候群、粘血症候群(sticky blood syndrome)、全身肌強直症候群、斯提耳病(Still' s disease)、Sydenham 舞蹈症(Sydenham，s chorea)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、高安氏動脈炎(Takayasu' s arteritis)、顳動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性結腸炎、眼色素層炎、血管炎、白癲風、韋格納肉芽腫病(Wegener' s granulomatosis) 和Wilson氏症候群。 過敏或超敏反應病症可以是任何已知的過敏或超敏反應病症(根據GelI-Coombs 分類包括I型、II型、III型或IV型)以及較少定義的V型超敏反應病症。此類病症包括但不限於特應性、哮喘、胎兒成紅細胞增多症、Goodpasture症候群、自身免疫性溶血性貧血、血清病、阿瑟斯反應(Arthus reaction)、系統性紅斑狼瘡、接觸性皮炎、結核菌素皮膚試驗、慢性移植排斥、格雷夫斯病(Graves disease)、重症肌無力、全身過敏反應、局部過敏反應、過敏性鼻炎、結膜炎、胃腸炎、溼疹、輸血反應、新生兒溶血性疾患、風溼性關節炎、 腎小球性腎炎、接觸性皮炎、特應性皮炎、結核性損傷、藥物引發的溶血性貧血、狼瘡腎炎、 麴黴病、多動脈炎、多肌炎、硬皮病、超敏性肺炎、韋格納肉芽腫病、I型糖尿病、蕁麻疹/血管性水腫或甲狀腺發炎。過敏或超敏反應病症可能與傳染病有關，所述傳染病包括但不限於肺結核、麻風、芽生菌病、組織胞漿菌病、弓形體病、利什曼病或其他感染。可以治療的過敏症包括但不限於對花粉(例如樺樹、豚草、油菜籽)、食物(例如堅果、蛋類或海產食物)、藥物(例如青黴素或水楊酸鹽)、昆蟲產物(例如蜜蜂或胡蜂毒液，或者房塵蟎)或動物毛髮以及諸如膠乳等人造產品的過敏反應。其他可以治療的炎性疾病包括動脈硬化症或其他心血管疾病、阿爾茨海默病、血管炎、肌炎、腦炎、再灌注損傷、II型糖尿病、脂肪肝和傷口癒合，所述傷口癒合包括炎症期、血管生成過程、纖維組織形成及外皮形成、和重建期 (remodeling phase)。在一個實施方式中，對於在治療或診斷程序中由體液或組織與人造或非哺乳動物材料的接觸引起的有害病症，可以在對其進行的治療和預防中使用本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物。此類程序可以是臨時性或永久性的，包括但不限於對包括腎血液滲析或肝血液滲析、腹膜透析、心肺轉流術和血液濾過在內的體外循環迴路的使用，對置於血管、膀胱、鞘內空間或任何其他中空內臟的留置導管的使用，對包括人工關節、心臟瓣膜、血管內支架、腦脊液分流器、人造血管和冠狀動脈血管成形術導管在內的植入型假體的使用。本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物可能具有免疫抑制效果，該效果可用於防止移植排斥。移植物可以是同一個體中的同系移植物、在同一物種不同成員之間的同種異體移植物或者在不同物種間的異種移植物。本發明的分子可用於防止對多種移植物的排斥，所述移植物包括但不限於心臟、肺、心臟及肺、腎臟、肝臟、胰腺、小腸、手、角膜、皮膚移植物(包括臉部再植和臉部移植)、胰島(islets of Langerhans)、骨髓移植物、輸血、血管、心臟瓣膜、骨和皮膚。所述分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物可以用來預防骨髓移植後的移植物抗宿主疾病。雖然本發明人不希望受理論束縛，但仍假定Japanin蛋白可能參與抑制癌症所涉及的信號傳導途徑。在本發明的另外一個實施方式中，可以用本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物來治療癌症。本發明還提供對患有癌症的動物的治療方法，該治療方法包括對所述動物施用上述本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物。這種治療可能涉及再極化(!^polarisation)和對癌症中免疫響應的調節。特別的是，癌症可以是血液病癌症，例如淋巴瘤或白血病或多發性骨髓瘤。可以依照本發明來治療的白血病包括極性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)Vg 性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴母細胞白血病(CLL)和毛細胞白血病。可以依照本發明來治療的淋巴瘤包括霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤。還可以治療的相關病症包括能夠最終發展為ALL的脊髓增生異常症候群(MDS)、骨髓增生性疾病(包括真性紅細胞增多症、原發性血小板增多症或骨髓纖維化症)以及由輕鏈疾病引發的澱粉樣物。在另外的實施方式中，癌症可以是惡性腫瘤、肉瘤或胚細胞瘤。本發明考慮了對任何器官的癌的治療，所述癌包括但不限於乳腺、肺、卵巢、胰腺、精巢、皮膚、結腸、腦、肝或子宮頸的癌以及黑色素瘤。可以治療或預防的癌症是組織細胞瘤且特別是犬皮膚組織細胞瘤。在本發明另一個實施方式中，可以用本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、 抗體或藥物組合物來治療傳染病。特別的是，這種治療可能涉及再極化和對免疫響應的調節，所述免疫響應由諸如病毒、細菌和原生動物(例如HIV致病體、TB和瘧疾)以及其他寄生物等病原體所造成的感染引起。諸如蜱等吸血節肢動物是諸如蜱傳播腦炎病毒、克裡米亞-剛果出血熱病毒、Nairobi羊病毒、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi, Lyme病的媒介物)和泰勒原蟲 (Theileria parva，海岸熱的媒介物)等傳染病因子的來源。據推測Japanin可以起到促進蜱傳疾病傳播的作用。因此Japanin蛋白、同源物、片段及其功能等價物可用於對動物進行疫苗接種來引發免疫響應，從而治療或預防蜱傳疾病。在本發明的另一個實施方式中，由此提供了預防節肢動物攜帶的傳染病傳播的方法或治療節肢動物攜帶的傳染病的方法，所述方法包括對動物施用本發明的分子，例如本發明的蛋白或核酸分子、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物。本發明還提供本發明的分子(例如本發明的蛋白或核酸分子、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物)用來預防節肢動物攜帶的傳染病的傳播和治療節肢動物攜帶的傳染病。所述節肢動物可以是吸血節肢動物。節肢動物攜帶的疾病可以是Lyme病、蜱傳播腦炎、克裡米亞-剛果出血熱、Nairobi羊病毒或海岸熱。還可以將Japanin蛋白、同源物、片段及其功能等價物用作疫苗來抵抗吸血節肢動物本身及其攜帶的疾病。因此，本發明還提供對動物接種疫苗來抵抗吸血節肢動物(可以是蜱)的方法，所述方法包括對動物施用本發明的分子，例如本發明的蛋白或核酸分子、 載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物。本發明還提供用來對動物進行疫苗接種來抵抗吸血節肢動物(可以是蜱)的本發明的分子(例如本發明的蛋白或核酸分子、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物)。如上所討論，可能有益的是，將本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物與一種或多於一種的額外治療劑(例如抗炎劑、免疫調節劑、免疫抑制劑、細胞因子、細胞因子模擬物或細胞因子結合蛋白，或者為治療上述任何病症而開發的其他生物藥物)組合施用。還可能有益的是，將本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物與將其在體內靶向DC的抗體一起施用，從而調節或抑制與不利的免疫響應有關的DC分化和成熟。在此實施方式中，可以將本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物與疾病相關要素組合施用，從而幫助將本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、 抗體或藥物組合物靶向適當的DC。在其中本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、或抗體已經通過與DC特異性結合而靶向DC的實施方式中，可以不需要疾病相關要素。術語「疾病相關要素」旨在涵蓋與患者的疾病相關的任何成分。所述疾病可以包括上述的自身免疫性疾病、過敏及其他超敏反應、移植排斥及移植物抗宿主疾病、傳染病(包括由蜱傳播的傳染病)、癌症(包括血液系統惡性腫瘤)和急性及慢性炎症性疾病。「疾病相關要素」因此可以包括i)與諸如病毒、微生物、寄生物和微生物毒素等傳染原相關的成分； ii)與過敏相關的非自身分子過敏原；iii)與除過敏外的超敏反應相關的非自身成分；iv) 與自身免疫性疾病相關的自身成分；ν)來自同一物種的遺傳差異性成員的移植抗原(同種抗原)或來自不同物種的移植抗原(異種抗原)；和Vi)腫瘤相關抗原和腫瘤特異性抗原。術語「疾病相關要素」還涵蓋這些疾病相關要素的片段和衍生物。此類衍生物可以包括解毒劑、合成模擬表位(mimotope)和抗原，所述抗原在其結構中存在取代、插入或缺失但仍能夠將本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物引導至適合的DC。向動物提供疾病相關要素將改善調節和抑制與所述疾病相關的DC分化和成熟的特異性。以此方式靶向特定的DC是有利的，因為其避免了對整體免疫響應進行抑制的需求，而且因此可以使副作用程度減少。在本發明的一方面中，可以將本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物與疾病相關要素分開施用。在此方面中，可以依次施用本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物和疾病相關要素。在另一實施方式中，本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物可以在疾病相關要素之前施用。在又一實施方式中，本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物可以在疾病相關要素之後施用。在另一實施方式中，可以將本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物與疾病相關要素同時施用。在本發明的此方面中，本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物可以與疾病相關要素結合，例如以融合蛋白的方式結合。因此本發明還提供具有疾病相關要素和本發明的抑制或調節DC分化和成熟的分子的融合蛋白。還提供了編碼此融合蛋白的核酸。本發明還提供包含本發明的分子、蛋白、核酸、載體、宿主細胞、抗體或藥物組合物及疾病相關要素和藥物可接受載劑的藥物組合物。上述方法涉及對動物施用本發明的分子，從而在動物體內調節並優選抑制DC的成熟及分化。所述分子可以單獨施用，或與包括疾病弓I發元素在內的額外試劑組合施用，所述額外試劑會將所述分子靶向DC。上述疾病的替代性治療方法是將本發明的分子用於離體靶向療法。該方法涉及到將本發明的分子在體外遞送至DC來調節所述DC並且將經調節的DC遞送至需要治療的動物。在另一方面，本發明提供DC的調節方法，所述方法包括使DC接觸本發明的分子， 例如上述Japanin蛋白、同源物、片段及其功能等價物。還提供了使用此方法產生的經調節的DC。本發明還提供在有需要的動物中治療或預防的DC相關病症的方法，其中所述方法包括對動物施用由此方法產生的經調節的DC。調節DC分化的分子可以是上述任何調節並優選抑制DC分化和成熟的分子，包括 Japanin蛋白、同源物、片段及其功能等價物。還可以使用編碼這些分子的核酸分子以及含有所述核酸分子的載體。可以直接從需要治療的動物中分離出DC。作為另一選擇，可以從動物中分離出DC 前體，例如骨髓祖細胞的單核細胞，並用來產生DC。在本發明的此方面中，對於在用本發明的分子進行治療後要將經調節的DC導入其中的動物，DC或DC前體可以是與所述動物自體同源的或同種異基因的。DC相關病症可以是上文討論的任何疾病，包括自身免疫性疾病、過敏及其他超敏反應、移植排斥及移植物抗宿主疾病、傳染病(包括由蜱傳播的傳染病)、癌症(包括血液系統惡性腫瘤)和急性及慢性炎症性疾病。所考慮的是，該方法可以用來在進行移植前從移植供體產生經調節的DC來向期望移植受體進行施用，其目的在於誘發對移植物的不應性 (unresponsiveness)並因此減少給予免疫抑制劑的需要。在本發明的此方面中，DC還可以與上述疾病相關要素接觸，從而將調節並優選抑制DC分化和成熟的分子靶定至適合的DC。作為另一選擇，可以將經調節的DC和諸如上文
22所述的哪些疾病相關要素向動物進行組合施用。篩選方法對Japanin的同源受體的鑑定使得在篩選方法中能夠用該受體來鑑定Japanin的潛在激動劑和拮抗劑，從而對任何具有潛在治療用途或其他用途的化合物進行鑑定。可以從例如細胞、無細胞製劑、化學物質庫或天然產物混合物中分離出潛在的激動劑或拮抗劑化合物。對於此類篩選方法的恰當綜述，參見CoIigan等，Current Protocols in Immunology 1(2)第 5 章(1991)。最適合作為優秀拮抗劑的化合物是下述分子所述分子與Japanin的同源受體結合，且並不引發由Japanin所引發的生物效應，並因此競爭性地抑制Japanin的功能。如上所述，認為Japanin的同源受體是二價陽離子依賴型受體，所述受體是C型凝集素受體且在結合Japanin時引發細胞內信號傳導途徑從而抑制樹突狀細胞的分化和成熟。潛在的拮抗劑包括與所述受體結合且不激活信號傳導途徑、或通過激活負信號傳導途徑而與所述受體結合的有機小分子、肽、多肽和抗體。特別的是，適合的潛在拮抗劑包括碳水化合物部分和工程化的Japanin分子所述Japanin分子已經過工程化以在保留其受體親和力的同時減弱了其功能。其他適合的化合物包括Japanin的抗體、Japanin所聯結的碳水化合物部分的抗體、以及能夠經工程化而具有靶標特異性的anticalin。最適合作為優秀激動劑來發揮功能的化合物是下述化合物所述化合物與 Japanin的同源受體結合併引發細胞內信號傳導途徑，所述信號傳導途徑與Japanin所引發的一樣，因此所述化合物以與Janapin相似的方式發揮調節並優選抑制DC分化和成熟的功能。適合的潛在激動劑的實例包括經工程化以提高其受體活化能力和/或受體結合親和力的Japanin分子。用於此篩選技術中的同源受體(二價陽離子依賴型受體，可能為C型凝集素)可以游離於溶液中、附接於固體支持體、攜帶於細胞表面或位於細胞內。一般而言，這些篩選程序可以涉及使用合適的表達所述受體並且與測試化合物接觸的細胞或細胞膜，從而對結合進行觀察或觀察對功能性響應的刺激或抑制。隨後將與測試化合物接觸的細胞的功能性響應與對照細胞比較，所述對照細胞未與測試化合物接觸。這種測試可以使用適當的檢測系統來評估測試化合物是否會產生與經Japanin活化的受體所產生的信號相似的信號。由於確信Japanin通過結合細胞表面二價陽離子依賴型受體(例如C型凝集素受體)並引發細胞內信號傳導途徑來發揮作用，所以如果篩選方法涉及使用細胞表面受體且涉及監視化合物與受體的結合對細胞內信號的誘導，則該篩選方法可能會最有效地發揮功能。在一個實施方式中，Japanin的激動劑化合物和拮抗劑化合物的鑑定方法包括(a)在允許與受體結合的條件下，使待篩選的化合物與細胞接觸，所述細胞在其表面表達有二價陽離子依賴型受體(例如C型凝集素受體)，其中所述受體在響應於與所述化合物的結合時能夠提供可檢測信號；和(b)通過測量由所述化合物與所述受體的相互作用產生的信號的水平，來確定所述化合物是否與所述受體結合併活化或抑制所述受體。在某些實施方式中，待篩選的化合物可以在配體存在時與受體接觸。此類配體可以是脂質，例如膽固醇或膽固醇的代謝產物(例如維他命D3)。在另一實施方式中，Japanin的拮抗劑化合物的鑑定方法包括
(a)在使Japanin結合其同源受體的條件下使Japanin與細胞接觸，所述細胞在其表面表達有二價陽離子依賴型受體(例如C型凝集素受體)，其中所述受體在響應於與所述化合物的結合時能夠提供可檢測信號；(b)測量由Japanin與所述受體的相互作用產生的信號的水平；(c)在允許與受體結合的條件下，添加待篩選的化合物；和(d)通過測量由所述化合物與所述受體的相互作用產生的信號水平變化，來確定所述化合物對Japanin的結合所產生的效果。在某些實施方式中，可以在上述篩選方法中使用任何如上討論的Japanin同源物或功能等價物。在另外一些實施方式中，待篩選化合物和/或Janapin可以在存在配體的情況下與受體接觸。此類配體可以是脂質，例如膽固醇或膽固醇的代謝產物。上文指出的條件可以包括培養基的存在、含生理濃度Ca2+的溶液的存在和/或pH 值為7 8。上述可檢測的信號可以包括細胞內磷酸化、核定位、基因表達和/或細胞因子釋放。在上述方法的某些實施方式中，可以使用簡單的結合檢驗，其中利用與測試化合物直接或間接聯結的標記、或者利用涉及到與經標記的競爭劑競爭的測試，來檢測所述測試化合物對攜帶C型凝集素受體的表面的粘附。在另一實施方式中，可以使用競爭性藥物篩選測試，其中中和性抗體能夠結合二價陽離子依賴型受體(例如C型凝集素受體)，且在結合中特異性地與測試化合物進行競爭。這樣，這些抗體可以用來檢測具有對受體的特異性親和力的任何測試化合物的存在。對於，本領域的技術人員可以設計對作用於Japanin同源受體的化合物進行鑑定的測試。對於具有適合的受體親和力的化合物，其高通量篩選可以使用一種技術來提供 (參見國際專利申請W084/03564)。在該方法中，在固體基體上合成了大量不同的測試小分子，隨後可以使其與受體反應並進行清洗。一種固定肽段的方法是使用非中和性抗體。隨後使用本領域公知的方法可以檢測到已結合的受體。還可以將純化的受體分子直接塗布到平板上，以供前述的藥物篩選技術使用。本發明還包括用上述方法鑑定出的激動劑、拮抗劑和其他化合物。這些激動劑、拮抗劑和其他化合物可以構成上述藥物組合物的一部分，而且可以在上述治療方法中使用。現將通過實施例來詳細描述本發明的各個方面及實施方式。應了解的是，可以在不脫離本發明範圍的情況下對細節做出修改。


圖1顯示了來自經飼養和未經飼養的雄性和雌性具尾扇頭蜱的SGE對人類DC中的⑶86表達上調的影響。F =雌性，M =雄性，0/3/6 =飼養天數。圖2顯示了來自飼養3天的雌性具尾扇頭蜱的SGE對⑶Ia+細胞中的成熟標記物表達的影響。黑色直方圖顯示用SGE和LPS處理過的CDla+細胞中的成熟標記物表達，灰色直方圖顯示用LPS處理過且未經SGE處理的⑶Ia+細胞中的成熟標記物表達。圖3顯示了經Q柱分離的SGE對用LPS處理過的⑶Ia+細胞中的成熟標記物表達以及對未經SGE處理的⑶Ia+細胞中的成熟標記物表達的影響。QFT =在pH值為7時流經 Q柱的材料。QFR =在pH值為7時保留在Q柱上的材料。圖4顯示了在A)LPS+IFNY和B)聚(I: C) +TNFa存在的情況下SGE或QFT對CD86 上調的影響。圖5顯示了蛋白酶K處理對QFT的DC調節效果的影響。圖6顯示了關於DC調節活性的尺寸分級(size fractionation)結果。根據在 LPS存在的情況下對CD86上調的抑制來評估活性。圖7顯示了對使用尺寸排阻色譜獲得的活性最高的片段所進行的聚丙烯醯胺凝膠電泳結果。圖8顯示了 HPLC純化結果A)HPLC柱的洗脫圖，和B)從HPLC洗脫出的各級分 (fraction)的活性圖。圖9顯示了通過Edman降解而測序得到的N端16個胺基酸。圖10和圖11顯示了克隆JapaninDNA 3』區域的PCR的結果。圖12顯示了 Japanin 3』區域的共有序列。圖13a顯示了用於擴增Japanin 5』區域的引物設計。圖13b顯示了 Japanin 5，區域的PCR擴增結果。泳道「PCR」是未經處理的PCR 產物。標記為「清潔的PCR」的兩個500bp泳道是對柱進行清潔後所得的不同體積。圖 14 顯示 Japanin 5，cDNA 序列。圖15顯示全長Japanin cDNA,以及其編碼的具有176個胺基酸的蛋白。圖16顯示位於Japanin全長序列內部的潛在斷裂位點。圖17顯示從含有Japanin表達載體的細胞獲得的昆蟲細胞上清液的DC調節活性。圖18顯示了存在於各硫酸銨沉澱級分中的活性，所述硫酸銨沉澱級分來自從含 Japanin的昆蟲細胞收集的上清液。圖19顯示銀染色的SDS-PAGE凝膠，該凝膠顯示Japanin的存在。圖20顯示證實用來分離Japanin的多聚組氨酸標籤的存在的蛋白質印跡。圖21顯示Japanin-TEV-his上清液的DC調節效果。圖22顯示了純化的帶His標籤的Japanin的DC調節效果。圖23顯示Japanin對DC的⑶Ia和⑶14表達的影響。圖M顯示了在MLR測試中由Japanin誘發的T細胞增殖的減少。圖25顯示了對Japanin和在安氏革蜱(安氏革蜱E1244)中鑑定出的Japanin同源物的逐對比對結果。圖沈顯示了對Japanin和在微小牛蜱(微小牛蜱RM-CK18M94)中鑑定出的 Japanin同源物的逐對比對結果。圖27顯示了對Japanin和在美洲鈍眼蜱(美洲鈍眼蜱CX766068)中鑑定出的 Japanin同源物的逐對比對結果。圖觀顯示了對Japanin和在具尾扇頭蜱(具尾扇頭蜱⑶796501)中鑑定出的 Japanin同源物的逐對比對結果。圖四顯示了對Japanin和在微小牛蜱(微小牛蜱CV443471)中鑑定出的Japanin同源物的逐對比對。圖30顯示了從GC-MS分析獲得的質譜數據。圖31顯示了 3H-膽固醇與Japanin的結合。圖32顯示了對帶螢光標記的Japanin與下述細胞結合的FACS分析，所述細胞為第5天的源自單核細胞的樹突狀細胞(圖32a)、單核細胞(圖32b)、源自骨髓的樹突狀細胞 (圖32c)、第1天的源自單核細胞的樹突狀細胞(圖32d)、在甘露聚糖(圖32e)和在EDTA (圖32f)存在的情況下源自單核細胞的樹突狀細胞。圖33顯示Japanin的N-糖基化。圖；34 顯示了在 LPS (圖 34a)、IFN γ (圖 34b)、TNF α (圖 34c)、水溶性 CD40L (圖 34d)、IFN α (圖34e)和CD097 (TLR7/8配體)(圖34f)存在的情況下Japanin對源自單核細胞的樹突狀細胞成熟所受的抑制的影響。圖35顯示了 Japanin對樹突狀細胞的TNF α分泌的影響。
實施例材料和方法經在牛津生態學和水文學中心(Centre of Ecology and Hydrology, Oxford)飼養具尾扇頭蜱。在用紗布覆蓋的容納室中，通過將蜱置於豚鼠剃淨的背部上來進行飼養。睡液腺提取物的製備飼養1 6天之後，從豚鼠身上小心地取下蜱並且在顯微鏡下切除其唾液腺。在冷磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，0Xoid Ltd.)中快速衝洗該腺體並將其轉移至1.5ml微量離心管中， 在需用前儲存於_70°C。通過使用Doimce勻漿器使PBS中的腺體勻漿化來製備唾液腺提取物(SGE)。在> IOOOOg將勻漿物離心3分鐘，隨後收集上清液並在需用前儲存於-20°C。細胞培養除非另有說明，細胞培養基和補充劑來自PAA。其中包括胎牛血清(FCS)，且始終使用該FCS的#A04304-0511批次。哺乳動物細胞培養在37°C、5% CO2下進行。昆蟲細胞培養在的Sf900II培養基中進行。除了共轉染培養物，在以100 130rpm進行軌道振蕩的錐形瓶中進行液體培養。樹突狀細胞從分離自健康成年供體的外周血液單核細胞中產生人類樹突狀細胞(DC)。簡言之，將白細胞層(英國國家血液服務中心(National blood service), Bristol)與不含Ca27Mg2+的Hanks緩衝鹽溶液(HBSS)以1 2(體積/體積)混合，小心鋪設至 Lymphoprep (Axis Shield)上並在800g下於22°C離心30分鐘。在HBSS/白細胞層混合物的分界面形成外周血單核細胞(PBMC)層，小心收集Lymphopr印並用HBSS清洗三次以除去血小板。通過短暫粘著或通過用磁珠進行負選擇來從PBMC中分離出單核細胞。對於通過短暫粘著來進行的單核細胞分離，將PBMC沉澱物重懸於RPMI-5中，所述 RPMI-5由補充有5%人類AB+血清(英國國家血液服務中心)、2mM L-穀氨醯胺、100U/ml 青黴素和100 μ g/ml鏈黴素的RPMI 1640組成。以1 X IO7個細胞/ml、IOml/平板的方式將 PBMC平板接種至IOOmrn的用細胞培養基處理過的Petri碟(BDBiosciences)中，並於37°C在5% (X)2下溫育45分鐘。隨後用HBSS衝洗平板三次來除去非粘著性細胞，並且將IOml RPMI-5 加回至平板。培養 1 天后，添加人類 GM-CSF(John Radcliffe Hospital pharmacy) 至濃度為1000U/ml，添加人類IL-4 (P^rotech)至濃度為20ng/ml。在培養3天後和5天後，分別用補充有新鮮製備的GM-CSF+IL-4的RPMI-5對總體積的1/3進行置換。對於通過負選擇來進行的單核細胞分離(換言之，通過除去非單核細胞)，將PBMC 沉澱物重懸於不含Ca2+/Mg2+的HBSS中，隨後根據製造商的操作說明使用Dynal單核細胞負分離試劑盒(Irwitrogen)分離出單核細胞。將純化的單核細胞以5X105/ml的密度重懸於DC-RPMI (即補充有10% FCS、2mM L-穀氨醯胺、100U/ml青黴素、ΙΟΟμ g/ml鏈黴素、 1000U/ml 人類 GM-CSF 和 1000U/ml 人類 IL_4( 二者均來自 Gentaur)的 RPMI1640)中。3 天后，取出1/3的培養基進行離心，將沉澱物重懸於相同體積的含3000U/ml每種細胞因子的新鮮培養基中，隨後將其加回原培養物中。5天後，用HBSS/2%FCS清洗細胞，並將細胞重懸於含 5. 5%羥乙基澱粉(「Voluven，，，John Radcliffe Hospital pharmacy)/4. 8% DMSO (Hybri-max級，Sigma) /3. 8% FCS的等滲鹽水中，隨後置於_80°C的控制型冷凍設備(1 度/分鐘)中將細胞冷凍。篩詵DC調節活件使用上述在含FCS的培養基中產生並冷凍的DC來進行DC調節活性的常規篩選。 將DC解凍，隨後在97孔平底I^rimaria平板(BD Biosciences)中用補充有待篩選樣品的 DC-RPMI來培養細胞。培養24小時後，添加poly (I:C) (25 μ g/ml)或LPS(200ng/ml)來刺激DC，且通過每批DC對不同刺激物的響應性來確定對刺激物的選擇。再培養18 M小時後，通過流式細胞計量來評估CDla+細胞中的CD86表達水平。流式細胞計量使用由CellQuest Pro (Becton Dickinson)控制的 FACSort 流式細胞儀(Becton Dickinson)來進行流式細胞計量。用 CellQuest Pro 和 FloJo (Treestar Software)來進行數據分析。PCR使用DNAEngine溫度循環器(Biorad)來執行PCR。具HPSF品質的引物由MWG Biosciences製造，dNTP來自Bioline。其他試劑依照本文本中的注釋來提供。E. coli 轉化對於化學感受態大腸桿菌的熱休克轉化，在冰上解凍50 μ 1細菌，隨後在冰上與 DNA共溫育5分鐘，於42°C使之熱休克40秒，隨後置回到冰上。隨後添加250 μ 1室溫SOC 培養基，將細胞以200rpm軌道振蕩方式於37°C溫育45分鐘 1小時30分鐘，隨後將50 μ 1 等分試樣鋪塗至含有100 μ g/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板上。實施例1 SGE對LPS所誘發的⑶86上調的抑制作用如上所述，通過短暫粘著來分離單核細胞並用GM-CSF+IL4進行培養來產生DC。培養5天後，將來自雄性或雌性具尾扇頭蜱的SGE添加到培養物中。所述SGE源自未經飼養的蜱或來自已飼養3天或6天的蜱，添加所述SGE直至源自蜱的蛋白的最終濃度為50 μ g/ ml。培養共6天後，用LPS(50ng/ml)處理DC，並且在培養7天後用抗⑶Ia和抗⑶86將其染色，並通過流式細胞計量對其進行分析。圖1將CD86+細胞的數量顯示為CDla+細胞的百分比X這些細胞上的⑶86染色的幾何平均螢光強度(GMFI)。如圖1中所示，發現來自飼
27養3天的雌性具尾扇頭蜱的SGE抑制LPS所誘發的人類DC中協同刺激受體CD86的上調， 而來自未經飼養的雌性蜱、飼養6天的雌性蜱或者來自雄性蜱(經飼養或未經飼養)的SGE 卻無此效果。該實驗進行了兩次，且結果相似。在所添加的SGE在培養物中的最終材料濃度相當於每毫升含有一個腺體時，獲得的結果也相似。實施例2 SGE對LPS所誘發的⑶86和II類MHC上調的抑制作用如上所述，通過短暫粘著來分離單核細胞並用GM-CSF+IL4進行培養來產生DC。培養5天後，將來自飼養3天的雌性具尾扇頭蜱的SGE添加到一些培養物中，直至最終材料濃度相當於每毫升培養基含有一個腺體。培養共6天後，用LPS(50ng/ml)處理DC，並且在培養7天後用抗⑶la、抗⑶80、抗⑶86和抗HLA-DR將其染色，並通過流式細胞計量對其進行分析。圖2顯示了在SGE存在(黑色)和不存在(灰色)的情況下經LPS處理的⑶Ia+細胞中成熟標記物的表達。如圖2中所示，發現來自飼養3天的雌性具尾扇頭蜱的唾液腺提取物不僅抑制對LPS做出響應的⑶86上調，而且還抑制⑶80和II類MHC的上調。該實驗進行了兩次。實施例3 對SGE活性成分的Q柱分級將從飼養3天的雌性具尾扇頭蜱的112個腺體中獲得的SGEWl 10稀釋於50mM 磷酸鈉(PH 7.0)中，隨後將其添加到之前已用同樣緩衝液進行平衡的Hi-Trap Q瓊脂糖離子交換柱(Amersham)上。收集未結合的材料⑴柱流穿部分(f lowthrough) = QFT)，用2 個柱體積的50mM磷酸鈉(pH 7. 0)清洗該柱，隨後通過向該柱添加50mM磷酸鈉、IM NaCl (pH 7. 0)來洗脫已結合的材料⑴柱結合級分=QFR)。用Vivaspin 65kDaMWC0離心濃縮器 (Sartorius)將QFT和QFR濃縮至最終體積為500 μ 1，所述離心濃縮器已經用Y _球蛋白進行了預處理來防止對蛋白的非特異性吸收。如上所述，通過短暫粘著來分離單核細胞並用GM-CSF+IL4進行培養來產生DC。培養5天後，將來自飼養3天的雌性具尾扇頭蜱的SGE或上述產生的QFT或QBF添加到培養物中。每個所提供材料的最終濃度相當於每毫升培養基中含有一個腺體。培養共6天後， 用LPS (50ng/ml)處理DC，並且在培養7天後用抗⑶Ia和抗⑶86將其染色，並通過流式細胞計量對其進行分析。圖3將⑶86+細胞的數量顯示為⑶Ia+細胞的百分比X這些細胞上的CD86染色的幾何平均螢光強度(GMFI)。誤差條表示成對培養物間的變化範圍。圖4顯示出DC調節活性並不限於對LPS所誘發的成熟(大概通過TLR4產生作用)，而且還抑制對25 μ g/ml poly (I: C) (TLR3配體)處理或對50ng/ml IFN- γ處理做出響應的⑶86上調(圖如)。然而，QFT對lOOng/ml TNF- α所誘發的⑶86上調沒有或幾乎沒有影響(圖4b)。其原因目前尚不清楚。實施例4 蛋白酶K對QFT的DC調節活性的影響將上述製備的冷凍的5天期DC解凍，並且與最終濃度為02個腺體等價物/ml的 QFT—起培養。在此實驗中，如下所述，一些QFT用蛋白酶K進行了預處理。一天後，用 poly (I: C) (25 μ g/ml)處理DC，再培養一天後用抗⑶Ia和抗⑶86將其染色，並通過流式細胞計量對其進行分析。對於蛋白酶K處理，在50πιΜΝει2ΗΡ04 (pH 7. 0)中將QFT與150 μ g/ml蛋白酶 K(Sigma)於50°C共溫育2小時。隨後通過加熱至98°C並保持10分鐘來使該酶失活。使用另外進行的不含QFT的相同反應的產物來執行僅含蛋白酶的對照[蛋白酶K+poly(I:C)]，並且以相同的方式處理在無蛋白酶的對照[QFT+poly(I:C)]中使用的QFT，從而說明DC調節活性的消失並不是因為活性成分的熱變性。在兩個另外執行的對照中，對熱失活的蛋白酶K[失活的蛋白酶K+poly(I:C)]進行溫育或者將熱失活的蛋白酶K與QFT共溫育[QFT+ 失活的蛋白酶K+poly (I:C)]，從而確認DC調節活性的消失需要蛋白酶K的不耐熱蛋白裂解能力。對於這些步驟，在於50°C進行溫育前，將蛋白酶K於98°C預處理10分鐘。圖5顯示用蛋白酶K進行的處理使QFT的DC調節活性消失，從而確認了其蛋白質性質。結果是成對孔中數據的平均值士2S. E.。實施例5 =QFT的大小分級從飼養3天的雌性具尾扇頭蜱中切除得到350個唾液腺，並如上所述用其來製備 QFT0通過用Superdex 75柱在8個單獨實驗中進行凝膠過濾來對QFT進行大小分級。在每個情況中，從該柱收集到約40個級分，並且如上所述通過與解凍的5天期DC的共培養來篩選其DC調節活性。M小時後通過添加200ng/ml LPS來刺激DC，再過M小時後通過流式細胞計量來評估⑶Ia+細胞的⑶86表達。圖6中顯示了 8個分級中一個代表性分級的結果，其中初始篩選是在1個腺體等價物/ml下進行，而接下來的對所推測的活性級分的篩選是在0. 04個腺體等價物/ml下進行。在所有分級中，經鑑定級分#12或#13的活性最高。將每個分級中活性最高的級分合併，並在低鹽緩衝液[50mM HEPES，pH 8. 3]中進行透析，隨後在還原條件下在4% 12% Bis-Tris聚丙烯醯胺凝膠(Invitrogen)上進行電泳。SGE、QFT和兩個Q柱結合級分與合併的活性級分一起電泳。其結果示於圖7中。SGE 和QFT具有DC調節活性，但Q柱結合級分卻沒有。在QFT和合併的級分中存在位於約20kDa 處的條帶，但是在兩個失活樣品中卻不存在，這表示該條帶是活性蛋白。本發明人將此蛋白命名為 「 Japanin」。將從QFT凝膠過濾色譜獲得的活性最高的級分(見上)合併，並且在低鹽緩衝液中進行透析，隨後用C4柱進行HPLC分級。用乙腈上升梯度進行洗脫，從而從該柱獲得23 個級分，並且如上所述通過與解凍的5天期DC的共培養來篩選其DC調節活性。M小時後通過添加25 μ g/ml LPS來刺激DC，再過M小時後通過流式細胞計量來評估⑶Ia+細胞的 ⑶86表達。實施例6 用HPLC對DC調節活性進行分離以1 200稀釋每個級分後對其進行評估，得到的腺體等價物/ml濃度為2. 6 7.9(取決於級分體積)，其中包括作為對照的輸入材料(合併的活性凝膠過濾級分)和 QFT，其濃度分別為1.8和02個腺體等價物/ml。由於級分把3為約100%的乙腈，在存在或不存在QFT的情況下對其效果進行評估，從而排除了 HPLC溶劑對DC的直接調節效果，或相反所述溶劑掩蓋所述效果的能力。圖8顯示了 HPLC的結果。圖8a顯示了洗脫圖，圖8b 顯示了根據對DC中DC86上調的抑制而評估的每個級分的活性。實施例7 Edman降解在將HPLC的級分#19表徵為具有最強DC調節活性之後，將其用於Edman降解測序，從而產生了 16 個殘基的 N 端序列(Thr)Pro Ser Met Pro Ala lie Asn Thr Gln Thr Leu Tyr Leu Ala(Arg)，其中對括號內殘基的鑑定尚未確定。Edman降解的信息顯示如圖9 中所示。自此將具有該N端序列的蛋白稱為「Japanin」。
實施例8 對JapaninDNA 3，區域的PCR擴增將上述N端序列用來設計外正向引物，將所述正向引物與寡聚dT反向引物的組合一起用於Japanin DNA的PCR擴增。採用一組針對序列「M PAINT Q」的4個簡併引物。 這4個引物非常相似，但卻分開使用來減少簡併度外引物1(SEQ ID NO 13)ATG CCN GCNATC AAYACN CAA外引物2 (SEQ ID NO 14) ATG CCN GCN ATC AAY ACN CAG外引物3 (SEQ ID NO 15) ATG CCN GCN ATff AAY ACN CAA外引物4 (SEQ ID NO 16) ATG CCN GCN ATff AAY ACN CAG從飼養1天的雌性具尾扇頭蜱唾液腺中產生cDNA來提供PCR模板。根據製造商的操作說明使用iTrizol試劑(Invitrogen)從30個唾液腺中分離出RNA，隨後通過添加1/3 體積的8M氯化鋰來從水相中沉澱出RNA。在用冷75 %乙醇清洗後，將所述RNA再溶解於 5μ 1無RNA酶的水中。根據製造商的操作說明，使用ImPromII逆轉錄酶(ftOmega)在40 μ 1反應物中進行逆轉錄。該反應物含有4 μ gRNA,且MgCl2濃度為2. 5mM, dNTP總濃度為0. 5mM。寡聚 (dT) 15用於啟動逆轉錄，其以0. 1 μ g/ml。該反應在42°C進行1小時，並隨後於70°C進行15 分鐘的熱失活。在補充有62. 5 μ M的各種dNTP、250nM簡併引物和3. 25 μ M寡聚(dT)20-V的 IX Thermopol ^745 (New England Biosciences) ψ, M Taq DNA(New England Biosciences)執行使用上述cDNA的PCR。使用以1 40稀釋後的模板cDNA。於94°C進行1分鐘起始變性步驟，而後執行5次如下循環於94°C 30秒[變性]/於45°C 30秒[退火]/於72°C 60秒[延伸]，然後執行30次如下循環於94°C /於50°C 30秒/於72°C 60 秒，最後再於72°C進行5分鐘。在相同條件下使用已知蜱蛋白的正向引物來執行陽性對照 [RH1-PE]。在1.8%瓊脂糖凝膠上對產物進行電泳。其結果示於圖10中。由正向引物2和4擴增的較大產物為約600bp，這表示其編碼約22kDa的蛋白(鑑於胺基酸殘基平均質量為IlODa)。這與在SDS PAGE凝膠上的活性級分中鑑定出的約20kDa 的條帶形成良好對應。在克隆該cDNA之前，通過進行巢式PCR確認了所述cDNA與N端序列相對應。針對序列「Asn Thr Gln Thr Leu Tyr Leu Ala」設計了內引物，所述序列在N端序列內部但位於先前所用引物的結合位點下遊內引物 1(SEQ ID NO 17)GCY ACI CAG ACI YTI TAY CTN GC內引物 2(SEQ ID NO 18)GCY ACI CAG ACI YTI TAY TTR GC非標準碼「 I，，表示作為中性鹼基加入的肌苷。使用正向引物2和4所編碼的引物和寡聚(dT)2Q-V擴增的DNA在以1 20進行稀釋後作為模板。反應條件如上所述，不同之處在於全部35次循環都採用50°C的退火溫度，並且將72°C的延伸步驟從60秒縮短至40秒。在1. 8%瓊脂糖凝膠上對產物進行電泳。如在圖11中所示，這些PCR產生了預期尺寸(即，約600bp)的條帶，從而有力表明編碼N端蛋白序列的cDNA得到特異性的擴增。實施例9 對Japanin cDNA 3，區域的共有序列的鑑定為了獲得Japanin的3』序列，使用外正向引物2和4來擴增DNA，並克隆至pCR2. 1中，隨後進行測序。將外正向引物2和4與作為反向引物的寡聚(dT)2(1-V組合使用，且如上所述在 40 μ 1反應物中進行反應。在瓊脂糖凝膠上對反應物進行電泳，並且將約600bp的DNA條帶切下，隨後根據製造商的操作說明使用QIAquick凝膠提取試劑盒Oiiagen)來將其純化，並且用30 μ 1洗脫緩衝液從柱中洗脫所述DNA。在ΙΟμΙ 反應中將 50ng pCR2. I-TA(Invitrogen)和 T4DNA 連接酶 (NEBBiosciences)與6μ 1每個純化產物於14°C溫育過夜，從而將所述純化產物連接到 PCR2. 1中。用該連接混合物來轉化感受態大腸桿菌TOPlO菌株，並通過組合使用正向引物 2和4及寡聚(dT)2(l-V的PCR篩選來鑑定出包含插入序列的菌落。根據製造商的操作說明使用QIApr印離心試劑盒^jiagen)從5ml陽性菌落的培養物中分離出包含插入序列的 pCR2. IDNA。對四種包含插入序列的質粒的測序使得可以構建示於圖12中的Japanin cDNA 3』區域的共有序列。實施例10 對Japanin 5，區域的測序採用5』 RACE (cDNA末端快速擴增)方案來擴增包含Japanin 5』區域的約500bp 的產物。5，RACE利用已知的3，cDNA序列(在此情況下即最新獲得的Japanin 3，序列) 來為基因特異性引物的設計提供信息。用這些引物來進行基因特異性逆轉錄，並且使用巢式PCR來擴增cDNA的5』區域。在後一種情況下，正向引物對以實驗手段引入的寡聚核苷酸封端區域有特異性，而反向引物則是基因特異性的反向引物。所用的各種Japanin特異性引物的相對位置示於圖13a中。根據製造商的操作說明使用RNAque0us-4PCR試劑盒(Ambion)從飼養2天的雌性具尾扇頭蜱唾液腺中提取出RNA。從柱洗脫液中沉澱出所述RNA並將其再溶解於20 μ 1洗脫緩衝液中。使用GSPlB引物來進行基因特異性逆轉錄。根據製造商的操作說明，在含有 1 μ gRNA的20 μ 1反應物採用ImProm II逆轉錄酶(!Iomega)。在該反應物中，MgCl2濃度為 2. 5mM, dNTP總濃度為0. 5mM，且引物濃度為125nM。逆轉錄反應在48°C進行1小時，之後於 70°C進行15分鐘的熱失活。隨後通過添加1 μ 1 RNA酶混合物(Invitrogen，來自5』 RACE 系統試劑盒)來除去RNA，並且在室溫溫育30分鐘。根據製造商的操作說明，使用SNAP柱(Invitrogen，來自5』RACE系統試劑盒)來清潔生成的cDNA以除去酶、引物及核苷酸。在50 μ 1無核酸酶的水中洗脫出cDNA。根據製造商的操作說明，使用TdT酶和dCTP (Invitrogen，來自5，RACE系統試劑盒)在25 μ 1反應物中將寡聚(dC)連接至15 μ 1 cDNA末尾。在20 μ 1反應物中使用1 μ 1帶寡聚(dC)尾部的cDNA作為巢式PCR的模板。組合使用GSP2A引物與AAP引物(Invitrogen，來自5』 RACE系統試劑盒)來進行第一輪擴增，凝膠純化所得產物並將其用作第二輪擴增的模板，組合使用GSP3引物與AUAP引物 (Invitrogen，來自5』 RACE系統試劑盒)來進行所述第二輪擴增。在含有2mM Mg2+且補充有62. 5 μ M每種dNTP (Bioline)和250nM每種引物的 IXThermopol W^Wi (New England Biosciences) ψ, M Taq DNA WaM (New England
31Biosciences)執行全部兩個PCR。GSP2A/AAP PCR包括在94°C進行1分鐘的起始變性步驟， 和隨後的35次如下循環於94°C 30秒/於66°C 30秒/於72°C 40秒，以及最後在72°C再進行5分鐘。在瓊脂糖凝膠上對20 μ 1反應的產物進行電泳，隨後將約650bp的條帶切下， 並根據製造商的操作說明使用QIAquick凝膠純化試劑盒Oiiagen)將其提取出。將純化的產物以1 1000稀釋後用作第二輪擴增的模板。GSP3/AUAP PCR與之類似，不同之處在於所採用的退火溫度是68°C而不是66°C。 為了獲得充足的DNA供測序使用，執行150 μ 1的GSP3/AUAP PCR0在瓊脂糖凝膠上對75 μ 1 產物進行電泳，隨後將約500bp的條帶切下，並根據製造商的操作說明使用QIAquick凝膠純化試劑盒Oiiagen)將其提取出。在30 μ 1的洗脫緩衝液中從柱中洗脫出DNA，並將樣品與未經純化的PCR產物一起在瓊脂糖凝膠上電泳，從而對回收進行確認並將濃度估算為約 lOOng/μ 1，然後對剩餘產物進行測序，如圖1 所示。使用AUAP引物對經凝膠純化的PCR產物進行測序，得到Japanin cDNA的5』序列， 並示於圖14中。GSPlB = GTT ATG GAT AGC ACC TCT CG(SEQ ID NO 29)GSP2A = AGC CTT CAC ACG CAG CAG TGG AGA (SEQ ID NO 30)GSP3 = GCC TGT GTTACC CAAGGT TCT G(SEQ ID NO 31)實施例11 設計用於克隆全長Japanin的引物對5，和3，cDNA序列的成功克隆使得可以對假定Japanin cDNA全長序列進行裝配，所述序列編碼176個胺基酸的肽，並示於圖15中。殘基在Japanin序列中的位置和與其他已知分子的序列相似性表示Japanin是脂質運載蛋白。神經網絡分析表示前M個胺基酸是分泌信號序列。之後是序列Thr Pro Ser Met Pro Ala lie Asn Thr Gln Thr Leu Tyr Leu Ala，其與從 DC 調節性 HPLC 級分獲得的 N 端序列吻合。這確認了已經對正確的cDNA進行了測序。使用巢式PCR策略來克隆全長cDNA。兩輪PCR均使用高保真DNA聚合酶，從而使引入聚合酶所產生的突變的可能性最小化。基於包括信號序列在內的假定全長cDNA序列來設計引物，其中第二輪的引物分別在正向和反向引物的5』端含有BamHi和NotI限制性位點以促進亞克隆。因為據報導限制性酶在直鏈核酸最末端進行切割時效率較低，所以在限制性位點前有5個額外的核苷酸。正向引物5 (SEQ ID NO 19) TGGCATTCT TTGAAGCTCTGTCATCA反向引物3 (SEQ ID NO 20) GCTTTTTATTTTCCGTTATGGATAGCACCTC正向引物6 (SEQ ID NO 21) GCTTTTTATTTTCCGTTATGGATAGCACCTC反向引物4 (SEQ ID NO 22) GTTTAGCGGCCGCCGTTATGGATAGCA兩輪 PCR 均使用 Phusion HotStart DNA 聚合酶(New England Biosciences) 在補充有50 μ M每種dNTP(Bioline)和250nM每種引物的IXHF緩衝液(New England Biosciences)中來執行。使用正向引物5和反向引物3來執行第一輪PCR，如上所述，由產生自飼養1天的雌性具尾扇頭蜱唾液腺的cDNA來為其提供模板。在98°C進行30秒的起始變性步驟，隨後進行35次如下循環於98°C 10秒/於64. 6 °C 30秒/於72°C 30秒，隨後在72°C再進行1 分鐘。將該反應的產物在以1 100000稀釋後用作第二輪擴增的模板。
使用正向引物6和反向引物4執行第二輪PCR。在98°C進行30秒的起始變性步驟，隨後進行2次如下循環於98°C 10秒/於41°C 30秒/於72°C 30秒，最後在72°C再進行5分鐘。實施例12 克隆 Japanin如上所述對附加有5』 BamHI位點和3』 NotI位點的編碼全長Japanin的DNA進行 PCR擴增，用BamHI和NotI進行切割，並連接至以相似方式處理過的pBacPAKS載體中。使用連接後的DNA來轉化TOPlO大腸桿菌，之後取孤立的菌落進行培養並進行Minipr印抽提，並且對其質粒DNA進行測序。如上所述用50 μ 1反應物來擴增編碼全長Japanin的DNA (其含有5』 BamHI位點和3'NotI位點)。為了除去引物和核苷酸，用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)來處理 35 μ 1產物，隨後在30 μ 1洗脫緩衝液中洗脫出所述質粒，所述緩衝液已用水稀釋至0. 33 X 以便減弱其緩衝力並減弱對限制性酶緩衝液PH的後續影響。在補充有BSA的1 XBamHI緩衝液中，於37°C用BamHI和NotI通過1小時的溫育來酶切經擴增的DNA。使用QIAquick PCR純化試劑盒^jiagen)用30 μ 1洗脫緩衝液進行洗脫來清潔所述DNA，從而除去酶。所有酶和緩衝液都來自New England Biosciences.用相似方式酶切pBacPAKS，隨後使用QIAquick凝膠提取試劑盒來純化凝膠，從而確保除去所切下的具多個克隆位點的片段。在含有約60ng切開的pBacPAK8和約5ng切開的Japanin PCR產物的10 μ 1反應物中，用1μ 1在1XT4DNA連接酶緩衝液(New England Biosciences)中的T4DNA連接酶 (New England Biosciences) M Japanin DNApBacPAK8 巾。使用3 μ 1上述連接反應物來轉化50 μ 1化學感受態的Τ0Ρ10大腸桿菌。在補充有氨苄青黴素的LB瓊脂上過夜培養後，將分離出的菌落接種至5ml LB (+氨苄青黴素)過夜培養物中，根據製造商的操作說明使用QIApr印離心試劑盒^jiagen)從中分離出質粒DNA。使用Bac 1和Bac2引物來進行測序。得到的序列確認了所推測的完整cDNA 序列的準確性，並且使得可以對無突變的克隆進行選擇並用來產生重組杆狀病毒 (pBacPAK8-Japanin)。實施例13 在昆蟲細胞培養物中表達Japanin使用f IashBac系統來產生表達Japanin的重組杆狀病毒，從而用Japanin轉移載體和具有缺陷性必需基因的突變病毒來對Sf9昆蟲細胞進行共轉染。在將Japanin序列插入所述病毒的同時，在強啟動子的控制下，所述載體與所述病毒之間的同源重組恢復了所述必需基因的功能。這確保了所有活病毒都包含Japanin DNA0在擴增後，使用重組病毒來感染新鮮Sf9細胞，收集由此得到的培養物上清液並進行DC調節活性篩選。如在圖17中所示，發現所述上清液具有DC調節活性，說明產生了功能性的Japanin並分泌到了培養基中，但為了顯示出上述活性，有必要先使所述上清液通過IOOkDa MWCO過濾器來除去病毒顆粒，這大概是因為病毒顆粒的高度刺激性效果壓制或規避了 Japanin的抑制效果。使對數生長期的Sf9細胞以1. 1 X IO6細胞/孔的密度粘附於6孔板上，隨後使用 Cellfection 轉染試劑(Invitrogen)用 flashBac gold 杆狀病毒 DNA (Oxford Expression Technologies)和pBacPAK8_Japanin的混合物對其進行轉染。將500ng質粒DNA與0. 5 μ 1 flashBac gold DNA和5 μ 1 Cellfectin在Iml Sf900II培養基中混合，在室溫溫育25分鐘來使複合物形成。將培養基從粘附的Sf9細胞上除去並用DNA/Cellfection複合物對其進行置換，過夜溫育細胞，之後再添加Iml Sf900II培養基，再繼續溫育4天。此時收集含有病毒的上清液並於4°C儲存在暗處。隨後使用以此方式獲得的小體積的病毒儲備物接種更大體積的Sf9細胞培養物來擴增該病毒。將0. 5ml包含病毒的上清液添加到250ml對數生長期Sf9細胞的振蕩培養物中(其中細胞密度為約1.5X106/ml)。隨後將所述培養物溫育5天，之後收集上清液並於4°C儲存在暗處。為了促進蛋白表達，使用經擴增的病毒儲備物以高感染複數來感染Sf9細胞。將 25ml病毒儲備物添加到250ml對數生長期Sf9細胞培養物中(細胞密度為8 X 105/ml)。隨後將培養物溫育3天，之後通過離心來收集上清液。為了除去病毒顆粒，使5ml上清液樣品通過IOOkDa MWCO Vivaspin 6離心濃縮器 (Sartorius)。用常見方法對所述樣品和QFT (作為陽性對照)、未過濾的杆狀病毒/Japanin 上清液及來自表達無關蛋白的杆狀病毒-Sf9細胞培養物的上清液一起進行DC調節活性篩選。該結果清楚顯示，在所述上清液中存在DC調節活性，但是在未過濾的上清液中病毒顆粒的存在掩蓋了所述活性，或許這是因為所述顆粒本身向DC傳遞壓倒性的刺激。此結果確認了作為「Japanin」克隆的蛋白確實具有所預期的DC調節性質，並且其活性形式由Sf9細胞產生。實施例14 對分離自含有Japanin的昆蟲細胞上清液中的蛋白的沉澱通過添加聚乙二醇(PEG)或硫酸銨來從杆狀病毒/Japanin上清液中沉澱出蛋白。 用Superdex 75柱通過凝膠過濾來對硫酸銨所沉澱的蛋白進行進一步分級。如在圖18中所示，發現在硫酸銨所沉澱的蛋白中以及合併的Superdex級分#22 #38 (其含有大部分蛋白)中保留了 DC調節活性，但在PEG所沉澱的蛋白中卻沒有保留。接下來對級分#22 #38進行的篩選揭示了合併的級分#23+#24活性最高。在冰上通過持續攪拌將PEG逐漸加到上清液中，直至其最終水平為30% (重量/ 體積)。以相同方式將硫酸銨加至70% (重量/體積)。將PEG所沉澱的蛋白重溶解於50mM HEPES (pH 7. 2)中並用Q柱進行分級。對A28tl 的實時測繪表明級分#4含有明顯的蛋白峰，因此用Superdex 75柱通過凝膠過濾將該級分進一步分級。從該柱洗脫出的大部分蛋白都在級分#22和#23中。將硫酸銨所沉澱的蛋白重溶解於50mM HEPES (pH 7. 2)中並用5kDa MWCOVivaspin 6離心濃縮器(Sartorius)將其濃縮15倍。用Superdex 75柱通過凝膠過濾來對濃縮後的蛋白進行分級。對A28tl的實時測繪表明級分#22 #28含有大部分蛋白。用常見方法對各自以1 100稀釋的所述樣品進行DC調節活性篩選，揭示了活性保留在硫酸銨所沉澱的蛋白中，但在PEG所沉澱的蛋白中卻檢測不到。正如據此可預期到的，選定的PEG沉澱蛋白的Q柱結合級分未顯示出活性，但是與從該Q結合級分得到的 Superdex級分#22+#23共溫育後卻觀察到⑶86表達略有下降該結果並不明確，且未進一步進行探究。相反的是，硫酸銨所沉澱的蛋白在濃縮並進行凝膠過濾色譜後保留了其活性， 並且接下來進行的在凝膠過濾級分間的比較揭示出級分#23+#24活性最高，因此推定其含有的Japanin濃度最高。實施例15 對帶組氨酸標籤的Japanin的克隆
使用三段巢式PCR來再次克隆在C端附加有六殘基寡聚組氨酸融合標籤(組氨酸標籤)的Japanin，其中用pBacPAKS-Japanin來提供模板。用限制性酶對巢式PCR的產物進行酶切，從而便於將其連接至以相似方式進行限制性切割的PBacPAKS質粒。引物被設計來在組氨酸標籤和天然蛋白序列之間引入四個附加殘基(穀氨醯胺-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸)。其目的在於防止因組氨酸標籤鄰近天然序列而引起的立體位阻，並且還可引入TEV 蛋白酶共有斷裂位點，從而潛在地促進對所述標籤進行蛋白水解性去除。正向引物7 (SEQ ID NO 23) CGTTAGGATCCGGCATTCTTTGAAGCTC
反向引物 5 (SEQ ID NO 24) ATGAGAGCCTCCTTGTGGATAGCACCTCTCG反向引物6 (SEQ ID NO 25) TTAGTGATGATGATGATGATGAGAGCCTCCTTG反向引物7 (SEQ ID NO 26) AAGTGCGGCCGCTTAGTGATGATGATG使用Phusion DNA 聚合酶(New England Biosciences)在補充有 50 μ M 每種 dNTP (Bioline)、500ηΜ每種引物和各IOpg/μ 1模板質粒的IXHF緩衝液(New England Biosciences)中來執行第一階段PCR。在98°C進行30秒的起始變性步驟，隨後進行15次如下循環於98°C 10秒[變性]/於70°C 30秒[退火]/於72°C 15秒[延伸]，最後在 72°C再進行5分鐘。所用引物是正向引物7和反向引物5。使用QIAquick PCR純化試劑盒對以此方法進行的20 μ 1反應的產物進行清潔，從而除去引物和核苷酸，並且在30 μ 1洗脫緩衝液中將其洗脫出。用完全相同的方法執行第二階段PCR，不同之處在於退火溫度為69°C，由清潔後的第一階段PCR產物(在去離子水中以1 10稀釋)提供模板，並且所用反向引物為反向引物6。使用QIAquickPCR純化試劑盒對以此方法進行的20 μ 1反應物的產物進行清潔，從而除去引物和核苷酸，並且在30 μ 1洗脫緩衝液中將其洗脫出。用與第二階段PCR完全相同的方法執行第三階段PCR，不同之處在於由清潔後的第二階段PCR產物(在去離子水中以1 10稀釋)提供模板，並且所用反向引物為反向引物7。使用QIAquickPCR純化試劑盒對以此方法進行的50 μ 1反應的產物進行清潔，從而除去引物和核苷酸，並且在30 μ 1 0.5Χ洗脫緩衝液中將其洗脫出。在瓊脂糖凝膠上對來自該反應的樣品進行電泳，使得PCR產物的濃度經估算為約20ng/ μ 1。在含有BSA和1 X緩衝液BamHI的50 μ 1反應物中，於37 °C用BamHI和NotI 通過20分鐘的溫育來酶切清潔後的第三階段PCR產物。酶和緩衝液來自New England Biosciences。使用QIAquickPCR純化試劑盒^jiagen)來清潔反應物以除去酶和切下的片段，並且在30 μ 1洗脫緩衝液中進行洗脫。為了達到用於最佳連接的約1 1的摩爾比，將約4. 5ng的限制性切割產物連接至50ng此前經BamHI/NotI限制性切割並經CIP處理的pBacPAK8。在10 μ 1含有T4DNA 連接酶緩衝液(New England Biosciences)的反應物中使用T4DNA連接酶(New England Biosciences)在室溫進行15分鐘的連接。使用連接混合物來轉化感受態的大腸桿菌T0P10 菌株。將離散的菌落接種至5ml液體LB培養基中，並且根據製造商的操作說明使用QIApr印離心試劑盒Oliagen)分離出質粒DNA。使用Bacl和Bac2引物進行的測序確認了存在編碼 Japanin融合蛋白的插入序列。自此將該質粒稱為pBacPAK8-Jap-TEV-his。實施例16 對帶組氨酸標籤的Japanin的分離如此前對產生未標記的重組Japanin所述，使用flashBac Gold系統用pBacPAK8-Jap-TEV-his來產生重組杆狀病毒。再次如前所述，隨後使用這些重組杆狀病毒來感染250ml Sf9細胞的表達培養物。使用氫氧化銨從培養物上清液中沉澱出蛋白，並使用結合多聚組氨酸基序的IMAC柱來進行純化。如在圖19中所示，對SDS-PAGE凝膠的銀染色揭示了在約20kDa處存在重組物特異性蛋白，而且如圖20中所示，通過蛋白質印跡確認了該蛋白確實帶組氨酸標籤。這些結果說明已成功表達了帶組氨酸標籤的Japanin。
如此前對產生未標記的重組Japanin所述，通過添加硫酸銨至70% (重量/體積) 來從250ml pBacPAK8-Jap-TEV-his的3天期表達培養物的上清液中沉澱出蛋白。將所沉澱的蛋白再溶解於60ml pH8的40mM Na2HP04/300mM NaCl/10%甘油(結合緩衝液)中，並加載至預先裝有Iml Talon樹脂(Clontech)的柱上。隨後用20ml結合緩衝液將該柱清洗兩次，並隨後用6ml pH8的40mM Na2HPO4/IOOmM NaCl/300mM咪唑(洗脫緩衝液)進行洗脫。 用5000MWC0 Vivaspin 6 (Sartorius)將洗脫出的蛋白濃縮10倍。在4 % 12 %聚丙烯醯胺Bis-Tris凝膠(NuI^age預製凝膠，Invitrogen) 上對0.5μ1樣品進行電泳，之後根據製造商的操作說明使用SilverXpress試劑盒 (Invitrogen)進行銀染色。在兩種重組蛋白上清液中明顯存在兩條位於約20kDa處的主條帶，但是所述條帶在使用來自受野生型杆狀病毒感染的細胞的上清液而平行進行的陰性對照純化物中卻不存在。對於蛋白質印跡分析，在4% 12%聚丙烯醯胺Bis-Tris凝膠(Nul^age預製凝膠，Invitrogen)上對6. 5 μ 1樣品進行電泳，隨後通過溼法印跡(在補充有10%甲醇的 NuPage轉移緩衝液中施加1小時的30V恆定電壓)將其轉移至具有0. 45 μ m小孔的硝化纖維膜(Biorad)上。一旦完成轉移，用去離子水漂洗該膜，用Tris緩衝鹽水/0. 1% Tween 20 (TBST)清洗5分鐘，隨後在封閉劑(#B6429，Sigma)中於室溫溫育1小時。封閉之後，用 TBST快速漂洗該膜，隨後在封閉劑中用經1 1000稀釋的抗五聚組氨酸抗體Oiiagen)於 4°C溫育過夜。接下來在TBST中進行5次5分鐘的清洗，在10%脫脂奶粉(Marvel) /TBS中用經1 20000稀釋的驢抗小鼠HRP (Jackson Immunoresearch)在室溫溫育1小時，並在TBST 中再進行7次5分鐘的清洗。最後，根據製造商的操作說明，通過用ECL底物(Amersham) 處理該膜來使抗體可視化，並隨後使之與X射線膠片接觸10秒。在從上述柱洗脫出的前四個Iml級分中明顯存在約20kDa的條帶，從而確認了存在具有預期尺寸的帶組氨酸標籤的蛋白。實施例17 源自Japanin-TEV-his上清液的樣品的DC調節活性如前所述對源自Japanin-TEV-his上清液的樣品進行DC調節活性篩選，其中在測試所述樣品時對其進行1 100的稀釋。將源自未標記的重組Japanin的Superdex級分#23+把4作為DC調節活性的陽性對照來進行篩選，而源自受野生型杆狀病毒感染的Sf9 細胞培養物的樣品則作為陰性對照。如在圖21中所示，在使用硫酸銨從Japanin-TEV-his 上清液中沉澱出的蛋白中存在活性，從而表明已經生成了活性重組融合蛋白。在來自 Japanin-TEV-his上清液的經10倍濃縮的Talon柱結合蛋白中也存在活性，從而確認了該活性蛋白的確可結合Talon樹脂。與硫酸銨所沉澱的大量蛋白相比，經10倍濃縮的Talon 洗脫液活性較低，這未必說明活性有所下降，而在另一方面可能反映出Talon洗脫緩衝液的刺激性效果。實施例18 對帶組氨酸標籤的Japanin的純化
通過使Talon柱洗脫液通過Superdex 75 (凝膠過濾)柱來從該洗脫液中進一步將帶多聚組氨酸標籤的Japanin純化。根據在銀染色的SDS-PAGE凝膠上約20kDa條帶的存在來對含有Japanin的級分進行鑑定，並將所述級分合併。根據^Onm處的吸光度和消光係數計算出合併級分中的蛋白濃度，其中所述消光係數用expasy. org的I^otParam工具從成熟Japanin的序列預測出。如前所述通過在M小時後將聚(I:C)加至細胞來對不同濃度(25ng/ml 1.6yg/ml)的純化的蛋白進行DC調節活性測試。圖22顯示了濃度在lOOng/ml以上時活性達到最大，且到目前為止所進行的單一實驗表示在濃度小於25ng/ml時活性可以達到一半。實施例19 Japanin對DC分化的影響如前所述，通過用GM-CSF和IL_4進行培養來從人類單核細胞中產生DC。一些培養物中另外補充有200ng/ml的重組Japanin。從第3天到第6天每天對培養物進行⑶14 和⑶Ia表達分析。可以辯駁Japanin對分化所產生的任何影響都是由於重組Japanin的內毒素汙染，而不是由於Japanin本身的影響，因此使用LAL測試對Japanin的內毒素含量進行了評估，並發現該含量為約0. 540EU/ μ g (近似相當於0. 054ng大腸桿菌LPS/ μ g Japanin)。從圖23可見，200ng/ml的Japanin極大地改變了分化培養物的發育，其中約50% 的單核細胞未能上調CDla並下調CD14(分化為DC的標誌)。對照實驗說明了上述結果並不是Japanin的內毒素汙染的副作用，在所述對照實驗中添加了 9pg/ml或40ng/ml大腸桿菌LPS(分別近似相當於使用200ng/ml重組Japanin時其內毒素含量和大於4000倍該含量的內毒素含量)且這兩種濃度沒有一種對分化有任何顯著影響。實施例20 =T細胞增殖測試——混合白細胞反應(MLR)對於響應於呈遞特定抗原(在此情況下為同種異基因MHC)的moDC的T細胞增殖， 利用混合白細胞反應(MLR)來評估Japanin對其產生的效果。在此系統中顯示Japanin明顯抑制T細胞增殖。將如上所述製備的冷凍的5天期源自單核細胞的DC解凍，並在存在或不存在 200ng/ml重組Japanin的情況下再培養2天。根據製造商的操作說明使用CD3MACS微珠(Miltenyi Biotech)從白細胞層分離出同種異基因T細胞，其中如前所述用Lymphopr印進行PBMC的起始分級。將T細胞以1 X IO5細胞/孔的密度平板接種至圓底96孔板(Corning)，同時添加受輻照的DC的梯度稀釋物。培養基為補充有10%FCS+2mM L-穀氨醯胺、100U/ml青黴素和100 μ g/ml鏈黴素的RPMI 1640，且最終體積為200 μ 1/孔。向含有已與Japanin共溫育 2天的DC的孔中再補充200ng/ml的Japanin。使用包含T細胞但無DC的對照。將MLR培養物溫育4天，之後用0. 5 μ Ci/孔的3H-胸腺嘧啶來使之產生放射脈衝。 隨後再將其溫育16 18小時，而後使用自動細胞收集器將其收集至玻璃纖維濾膜上，接下來用閃爍計數器對與濾膜結合的放射性DNA進行定量測定。進行該實驗三次，發現在每次實驗中用Japanin對DC進行預處理且在MLR培養物中存在Japanin時，都導致T細胞增殖的下降。圖M中顯示了一個示例性結果。實施例21 搜索Japanin同源物(安氏革蜱)
通過對EMBL表達序列標籤(EST)資料庫進行BLAST搜索，從安氏革蜱中鑑定出一種Japanin同源物。目前將該同源物命名為安氏革蜱E1244 (EBIID = EG363153)。用 SignalP來鑑定安氏革蜱E1244可能的信號肽部分(殘基1 17)，從而使得可以將成熟 Japanin序列與所預測的成熟安氏革蜱E1M4(DA-E1244)序列進行比較。如在圖25中所示，使用BL0SUM62矩陣執行的EMBOSS逐對比對結果顯示出在這兩種蛋白間存在30. 5%的一致性和50. 3%的相似性。存在於該資料庫中的核苷酸序列在本文中為kq ID n0:32，而其所編碼的假定蛋白Skq ID n0:4。與Japanin的高度同源性強力表明安氏革蜱E1244具有Japanin樣的生物活性， 因此繼續進行工作來產生重組蛋白。出於此目的，將編碼DA-E1244全胺基酸序列的DNA製成合成基因(Seq ID no 3)，並以克隆載體形式提供，且命名為pCR4T0P0-DA-E1244opt (其由Entelechon GmbH, Regensburg依合同完成)。合成的DNA序列始於ATG起始密碼子，因此並不含與Kozak共有序列(Kozak consensus)吻合的上遊序列，所述Kozak序列是真核生物系統中進行有效翻譯的必需前體。為了補救這一問題，設計了具下述效果的引物所述引物擴增DA-1244並且在產物5』末端增加BamHI識別位點(「GGATCC」)和Kozak-順應序列「TCCAAA」，並在3』 末端增加NotI識別位點(「GCGGCCGC」)。在5』和3』末端都增加「過量」鹼基，從而使得限制性酶的位點不在產物末端，因為已知其會抑制限制性切割。正向引物8 (SEQ ID NO 27) GCAGGCATAGGATCCAAAATGAAACTAAACTTT反向引物8 (SEQ ID NO 28) TATTGCGGCCGCTTATTTCGAACACGT使用在補充有50 μ M每種dNTP(Bioline)和250nM每種引物的IXHF緩衝液(New England Biosciences)中的 Phusion HotStart DNA 聚合酶(New England Biosciences) 在20 μ 1反應物中執行PCR。用pCR4T0P0-DA-E1244_opt質粒作為模板，其以lng/Ι μ 1存在於反應物中。在98°C進行30秒的起始變性步驟，隨後進行15次如下循環於98°C 10秒 /於69°C 30秒/於72°C 15秒，隨後在72°C再進行5分鐘。通過在瓊脂糖凝膠上對5 μ 1已完成反應的反應物進行電泳來確認存在具有預期尺寸(600bp)的產物，根據製造商的操作說明用QIAquick柱^jiagen)來清潔剩餘物，在緩衝液BamHI (NEB)中用BamHI和NotI (均來自NEB)進行酶切，隨後用QIAquick柱再次進行清潔。隨後將經切割並清潔的DA-1M4的PCR產物連接到經BamHI/NotI酶切並經小牛小腸鹼性磷酸酶處理的pBacPAK8(杆狀病毒轉移載體)中，用該連接反應物轉化感受態大腸桿菌T0P10菌株。隨後挑取轉化後的大腸桿菌的孤立菌落並使之在液體培養基中生長，用QIApr印 miniprep試劑盒抽提DNA。使用Bacl和Bac2引物進行測序，從而確認在未引入突變的情況下已成功克隆了 DA-E1244。已鑑定出了適合的克隆體(pBacPAK8-E1244)，並將其用於產生重組杆狀病毒。實施例22 搜索其他Japanin同源物通過對EMBL表達序列標籤(EST)資料庫進行BLAST搜索，從微小牛蜱O種同源物)、美洲鈍眼蜱和具尾扇頭蜱中鑑定出了 Japanin同源物。目前將這些同源物分別命名為微小牛蜱CK18M94、美洲鈍眼蜱CX766068、具尾扇頭蜱CD796501和微小牛蜱CV436349。
38在圖沈 圖四中顯示了這些序列的序列比對結果圖和一致性百分比圖。在這些鑑定出的同源序列中，僅有微小牛蜱CV436349具有信號肽。對於在其他三個鑑定出的同源物中信號肽的缺失，存在三種可能的解釋i)其並非分泌蛋白；ii)部分序列丟失，或iii)涉及到非標準分泌。微小牛蜱CK18M94和美洲鈍眼蜱CX766068均為與Japanin基本同源的脂質運載蛋白。然而，這兩個序列均不含有信號肽，如上所述，這表示其不是分泌蛋白或者部分序列丟失。雖然這些Japanin同源物與Japanin的序列一致性低於從安氏革蜱中鑑定出的同源物，但是其功能據預期與Japanin相似。實施例23 膽固醇作為Japanin配體的鑑定已將Japanin描述為脂質運載蛋白，這表示了其可以結合脂質配體的可能性。根據OmCI ( 一種結合脂肪酸的蜱脂質運載蛋白)的晶體結構，構建了 Japanin的假想結構模型，從而為上述觀點提供了額外的支持，因為其表示了在Japanin中存在疏水性的開放結合口袋(未示出)。為了對此進行進一步的研究，如在實施例13中所述，在昆蟲細胞培養物中產生了重組Japanin，並如前所述使用連續金屬親和色譜和凝膠過濾來將其純化。在如下所述使用Bligh和Dyer法進行脂質提取之後，將400 μ g純化的重組蛋白用於氣相色譜-質譜 (GC-MS)分析。Bligh和Dyer法脂質提取將3. 75ml氯仿甲醇(1 2)加至0. 5ml蛋白樣品(或加至0. 5ml緩衝液對照) 中。將此混合物振蕩10 15分鐘，隨後添加另一份1. 25ml氯仿，並通過渦旋振蕩1分鐘進行混合。隨後添加1.25ml超淨水，並再進行1分鐘的渦旋振蕩。對所得樣品進行離心， 棄去上部的相，保留下部含脂質的相。在氮氣下對其進行乾燥，並重懸於500 μ 1 二氯甲烷中。 氣相色譜/電子衝擊-質譜(GC/EI-MS)將1 μ 1從重組蛋白或從緩衝液空白對照中提取出的樣品注射至配備有毛細管氣相色譜的Perkin Elmer Turbomass四級杆質譜儀中。使用下述條件氣相色譜柱=DB-5。注射=柱上(On-column)。注射溫度=40°C。溫度梯度= 在40°C保持1分鐘，隨後8°C /分鐘直至325°C (並保持10分鐘)。載氣=氦。質譜電離電壓=70eV。電離模式=掃描。質譜分辨=單位。從質譜獲得的數據顯示在Japanin樣品中在33. 1分鐘處存在一個峰，而在緩衝液空白對照中卻不存在該峰(圖30a)。通過將來自該峰的平均譜(圖30b)與NIST庫中的譜進行比較，可以將其鑑定為膽固醇。在相同條件下對膽固醇參照標準物進行同樣處理，得到與平均譜吻合的33. 1分鐘處的峰，從而確認了上述結果(圖30c)。實施例M 重組Japanin結合游離膽固醇在含有Ni-NTA 磁珠的 500 μ 1 緩衝液 A(120mM NaCl、0. 02% Tween、5%甘油、40mM Na2HPO4)中將0. 5 μ g重組的帶寡聚組氨酸標籤的Japanin於室溫溫育2小時，從而將該蛋白固定於所述珠上。對照樣品中不加蛋白。用500 μ 1緩衝液A將蛋白塗覆的珠清洗三次， 隨後添加含有0. 2 μ 1 3H-膽固醇的50 μ 1緩衝液Β(6Μ胍、120mM NaCl,0. 02% Tween,5%甘油、40mM Na2HPO4)(該變性緩衝液用來促進在帶放射性標記的膽固醇和與蛋白結合的源自細胞培養物的冷配體之間可能發生的交換)。5分鐘後，除去緩衝液B並添加含有另外 0. 2 μ I3H-膽固醇的500 μ 1緩衝液Α。隨後在室溫進行3小時的溫育。用500 μ 1冰冷緩衝液A將珠清洗1次，再用50 μ 1冰冷緩衝液A將珠清洗2次，從而除去未結合的膽固醇。隨後通過將珠重懸於含有咪唑(0. 5Μ)的100 μ 1緩衝液A中來從珠上洗脫出蛋白。圖31中的清洗物1和清洗物2指50 μ 1清洗物，每個樣品的右側柱形顯示了與珠/蛋白結合的放射量。在圖31中能夠見到，這些結果清楚顯示了 3H-膽固醇與Japanin結合。還不清楚蛋白結合是否需要變性/再摺疊，而且對結合強度和結合特異性還必須進行確定。實施例25 Japanin與DC上的C型凝集素細胞表面受體結合Japanin抑制DC成熟的能力意味著其具有結合DC表面受體的能力。這看似最可能通過與Japanin的膜受體特異性相互作用而發生，但是亦可能構想到一種作用機制，通過該機制Japanin以非特異性的方式結合併進入細胞(這可能涉及所結合的膽固醇與質膜的相互作用)並隨後以細胞類型特異性的方式作用於細胞內信號傳導途徑。 為了研究Japanin是否以特異性方式與DC表面結合，並為了可以對任何相互作用的性質進行研究，使用商用試劑盒用螢光染料Alexa 488標記Japanin。用500ng/ml的帶螢光標記的Japanin於4°C與細胞共溫育30 60分鐘，隨後進行充分清洗，使Japanin的結合可以通過流式細胞計量來顯現。圖3 展示了 Japanin特異性地結合源自單核細胞的DC，其顯示 Japanin-AleXa488(圖3 32f中的填充的直方圖)與5天期源自單核細胞的DC(如前所述而產生)結合，然而作為對照脂質運載蛋白使用的moubatin-Alexa 488並不結合DC (圖32a 32f中的虛線直方圖)。此外，Japanin既不與單核細胞結合(圖32b)，也不與源自小鼠骨髓的DC結合(圖32c)。鑑於之前所展示的Japanin阻礙單核細胞分化為DC的能力，Japanin不與單核細胞結合令人驚奇。問題就此產生=Japanin如何能夠對其明顯不會結合的細胞類型產生作用。為了解決這個問題，將Japanin-Alexa 488(圖32a 32f中的填充的直方圖)或 moubatin-Alexa 488 (圖3 32f中的虛線直方圖)與1天期源自單核細胞的DC (圖32d) 共溫育。發現Japanin與1天期源自單核細胞的DC結合，儘管其程度與5天期源自單核細胞的DC相比較低。這表示Japanin結合受體的上調始於DC分化極早期，因此Japanin可能在此早期階段作用於細胞來使其分化停滯。為了研究Japanin-DC相互作用的性質，對甘露聚糖和EDTA的效果進行了考察。 lmg/ml甘露聚糖的存在極大地減弱了 Japanin-Alexa 488與源自單核細胞的DC的結合 (圖32e，填充的直方圖顯示在無甘露聚糖時Japanin-Alexa 488的結合，未填充的直方圖顯示在甘露聚糖存在時的結合，而虛線直方圖顯示對照蛋白的結合)，然而0.5mM EDTA的存在則將此結合完全破壞(圖32f，如圖32d，不同之處在於未填充的直方圖顯示在EDTA存在時的結合)。綜上考慮，這些發現強烈表示Japanin與源自單核細胞的DC上的C型凝集素細胞表面受體結合。實施例洸Japanin發生N-糖基化使用 NetNGlyc 1. 0 (生物序列分析中心，Technical University of Denmark)表
40明，Japanin含有一個很可能的N-糖基化位點和另一個可能的N-糖基化位點(圖33a)。 如前所述，Japanin與C型凝集素受體的相互作用也表明存在一定程度的糖基化。為了確認N-糖基化的存在，用PNGase F (—種除去多數N-糖基化形式的酶)於 37°C對純化的重組Japanin(如前所述製備)進行16小時的處理。在SDS-PAGE凝膠上將經PNGase F處理的Japanin與模擬處理的和未處理的Japanin —起電泳，並通過抗組氨酸標籤蛋白質印跡來進行可視化。如在圖3 中所示，用PNGase F進行的處理導致在經模擬物處理和未處理的Japanin的兩條條帶之外還出現了一條額外的較小條帶。這表明較大的兩條條帶中的至少一條、可能有兩條代表N-糖基化的Japanin。實施例27 重組Japanin抑制響應於多種不同的刺激物的樹突狀細胞成熟如前所述，重組Japanin抑制響應於聚(I :C) (TLR3刺激物)的樹突狀細胞成熟， 所述樹突狀細胞源自單核細胞，而來自飼養3天的雌性具尾扇頭蜱的包含Japanin的Q柱流穿部分抑制響應於LPS (TLR4刺激物)和IFNy (其通過、幹擾素受體而發揮作用)而非水溶性TNF α (其通過TNFRl發揮作用)的樹突狀細胞成熟，所述樹突狀細胞源自單核細胞。通過重複進行這些使用純化的重組Japanin (如前所述而產生)和用LPS(圖34a)、 IFN γ (圖:34b)、TNF α (圖:34c)、水溶性 CD40L (圖!Md)、IFN α (圖;34e)或 CL097 (TLR7/8 配體)(圖34f)進行刺激的實驗(根據前述同樣的方法)，使上述這些發現得到了擴展。由除TNF α外的所有這些刺激物觸發的樹突狀細胞成熟都受到Japanin的抑制，而未觀察到對TNFa驅動的成熟有顯著影響，儘管可能出現微小的抑制。這些發現確認了 Japanin能夠抑制對大範圍的刺激物做出響應的樹突狀細胞成熟，其通過多個不同的受體和下遊信號傳導途徑來起作用。實施例28 重組Japanin抑制響應於刺激物的樹突狀細胞TNF α分泌除了上調協同刺激分子和II類MHC以外，樹突狀細胞還通過產生多種細胞因子來對炎性刺激物做出響應。為了評估Japanin是否能夠抑制或改變樹突狀細胞成熟的這一方面，已經評估了 Japanin對樹突狀細胞在響應於兩種刺激物(LPS和IFNy)的混合物時產生促炎性細胞因子TNF α的影響，所述樹突狀細胞源自單核細胞。如前所述產生源自人類單核細胞的樹突狀細胞。在第5天將其收集並以5Χ IO5 細胞/ml的密度重懸於含有FCS、GCSF和IL4(如前所述)的新鮮培養基中。隨後在經組織培養基處理的M孔板中，在存在或不存在純化的重組Japanin (500ng/ml)的情況下對所述細胞進行培養，M小時後將含有重組人類IFNy (Peprotech)和超純大腸桿菌011 B4LPS (Alexis Biochemicals)的刺激物混合物加到一些孔中，至最終濃度為20ng/ml IFN y +200ng/ml LPS。再過48小時，收集培養物上清液並將其離心以除去細胞和碎片。隨後根據製造商的操作說明使用ELISA試劑盒ansight Biotechnology)來確定TNF α的濃度。如圖35中所示，發現Japanin使響應於刺激物混合物的樹突狀細胞TNF α分泌下降。參考文獻Anguita, J. , Ramamoorthi, N. , Hovius, J. , Das, S. , Thomas, V. , Persinski, R., Conze, D. , Askenase, P. , Rincon, Μ. , Kantor, F. , Fikrig, Ε. (2002)Salpl5, an Ixodes scapularis salivary protein inhibits CD4+T cell activation Immunityl6,849-859.
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W084/03564.
權利要求
1.一種樹突狀細胞(DC)調節分子，其中所述分子調節哺乳動物DC的分化和成熟。
2.如權利要求1所述的樹突狀細胞(DC)調節分子，其中所述分子抑制哺乳動物DC的分化和成熟。
3.如權利要求1或2所述的DC調節分子，其中所述分子調節或抑制人類DC的分化和成熟。
4.如權利要求1 3中任一項所述的DC調節分子，所述分子分離自吸血節肢動物。
5.如權利要求1 4中任一項所述的DC調節分子，其中所述分子是蛋白質。
6.如權利要求1 5中任一項所述的DC調節分子，其中所述分子抑制T淋巴細胞的活化。
7.如權利要求1 6中任一項所述的DC調節分子，其中所述分子調節T淋巴細胞的極化。
8.如權利要求1 7中任一項所述的DC調節分子，其中所述分子是免疫抑制劑。
9.如權利要求5 8中任一項所述的DC調節分子，其中所述分子被糖基化。
10.如權利要求4 9中任一項所述的DC調節分子，其中所述分子分離自蜱。
11.如權利要求10所述的DC調節分子，其中所述蜱選自下述群體硬蜱屬、凹溝蜱亞科、花蜱亞科、血蜱亞科、扇頭蜱亞科(包括璃眼蜱亞科)、納蜱科、軟蜱亞科、殘喙蜱亞科、 匙喙蜱亞科、Nothhoaspinae和鈍緣蜱亞科。
12.如上述權利要求中任一項所述的DC調節分子，所述分子是脂質運載蛋白。
13.如權利要求12所述的DC調節分子，其中所述分子與脂質複合。
14.如權利要求13所述的DC調節分子，其中所述脂質是類固醇或甾醇。
15.如權利要求14所述的DC調節分子，其中所述脂質是膽固醇或膽固醇的代謝產物， 例如維他命D3。
16.如上述權利要求中任一項所述的DC調節分子，所述分子與存在於DC外膜上的受體結合。
17.如權利要求16所述的DC調節分子，所述分子與C型凝集素受體結合。
18.如上述權利要求中任一項所述的DC調節分子，其中所述分子包括i)包含胺基酸序列SEQID NO 2的蛋白；ii)i)中所定義蛋白的同源物，所述同源物與所述蛋白的一致性至少為60%；iii)上文i)中所定義蛋白的活性片段，或上文ii)中所定義同源物的活性片段；或iv)i)、ii)或iii)的功能等價物。
19.如上述權利要求中任一項所述的DC調節分子，其中所述分子包括i)包含SEQID NO :4、6、8、10或12中任何一個胺基酸序列的蛋白；ii)i)中所定義蛋白的同源物，所述同源物與所述蛋白的一致性至少為60%；iii)上文i)中所定義蛋白的活性片段，或上文ii)中所定義同源物的活性片段；或iv)i)、ii)或iii)的功能等價物。
20.一種核酸分子，所述核酸分子含有編碼上述權利要求中任一項所述的DC調節分子的核酸序列。
21.如權利要求20所述的核酸分子，所述核酸分子含有SEQID NO :1、3、5、7、9或11中的任何一個。
22.一種核酸分子，所述核酸分子在高度嚴格雜交條件下與權利要求20或21所述的核酸分子雜交。
23.—種載體，所述載體包含權利要求20 22中任一項所述的核酸序列。
24.一種宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求23所述的載體或權利要求20 22中任一項所述的核酸分子。
25.製備權利要求1 19中任一項所述的DC調節分子的方法，所述方法包括在表達所述蛋白的條件下培養權利要求M所述的宿主細胞並回收由此製得的所述蛋白。
26.一種抗體，所述抗體與權利要求1 19中任一項所述的DC調節分子結合。
27.一種調節DC的方法，所述方法包括使所述DC與下述物質接觸權利要求1 19中任一項所述的DC調節分子、權利要求20 22中任一項所述的核酸、權利要求23所述的載體、權利要求M所述的宿主細胞或權利要求26所述的抗體。
28.—種經調節的DC，所述DC通過權利要求27所述的方法製得。
29.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權利要求1 19中任一項所述的DC調節分子、權利要求20 22中任一項所述的核酸、權利要求23所述的載體、權利要求M所述的宿主細胞、權利要求26所述的抗體或權利要求觀所述的DC，以及藥物可接受載劑。
30.如權利要求四所述的藥物組合物，所述藥物組合物還包含一種或多於一種的附加治療劑。
31.如權利要求30所述的藥物組合物，其中所述一種或多於一種的附加治療劑包括抗炎劑、免疫調節劑、免疫抑制劑、細胞因子、細胞因子模擬物或細胞因子結合蛋白。
32.如權利要求四或30所述的藥物組合物，其中所述一種或多於一種的治療劑包括疾病相關要素。
33.用於治療用途的以下物質權利要求1 19中任一項所述的DC調節分子、權利要求20 22中任一項所述的核酸、權利要求23所述的載體、權利要求M所述的宿主細胞、 權利要求26所述的抗體、權利要求28所述的DC或權利要求四 32中任一項所述的藥物組合物。
34.用於治療或預防自身免疫性疾病、移植排斥、急性及慢性炎症性疾病、過敏或超敏反應的用途的以下物質權利要求1 19中任一項所述的DC調節分子、權利要求20 22 中任一項所述的核酸、權利要求23所述的載體、權利要求M所述的宿主細胞、權利要求沈所述的抗體、權利要求28所述的DC或權利要求四 32中任一項所述的藥物組合物。
35.用於治療或預防包括節肢動物傳播的疾病在內的傳染病的用途的以下物質權利要求1 19中任一項所述的DC調節分子、權利要求20 22中任一項所述的核酸、權利要求23所述的載體、權利要求M所述的宿主細胞、權利要求沈所述的抗體、權利要求觀所述的DC或權利要求四 32中任一項所述的藥物組合物。
36.用於治療和預防癌症的用途的以下物質權利要求1 19中任一項所述的DC調節分子、權利要求20 22中任一項所述的核酸、權利要求^所述的載體、權利要求M所述的宿主細胞、權利要求26所述的抗體、權利要求28所述的DC或權利要求四 30中任一項所述的藥物組合物。
37.一種對患有自身免疫性疾病、移植排斥、急性及慢性炎症性疾病、過敏或超敏反應的動物進行治療的方法，所述方法包括對所述動物施用權利要求1 19中任一項所述的DC調節分子、權利要求20 22中任一項所述的核酸、權利要求23所述的載體、權利要求 24所述的宿主細胞、權利要求沈所述的抗體、權利要求觀所述的DC或權利要求四 32 中任一項所述的藥物組合物。
38.一種對患有包括節肢動物傳播的疾病在內的傳染病的動物進行治療的方法，所述方法包括對所述動物施用權利要求1 19中任一項所述的DC調節分子、權利要求20 22中任一項所述的核酸、權利要求23所述的載體、權利要求M所述的宿主細胞、權利要求 26所述的抗體、權利要求28所述的DC或權利要求四 32中任一項所述的藥物組合物。
39.一種對患有癌症的動物進行治療的方法，所述方法包括對所述動物施用權利要求1 19中任一項所述的DC調節分子、權利要求20 22中任一項所述的核酸、權利要求 23所述的載體、權利要求M所述的宿主細胞、權利要求沈所述的抗體、權利要求觀所述的 DC或權利要求四 30中任一項所述的藥物組合物。
40.如權利要求37 39中任一項所述的方法或如權利要求31 34中任一項所述的 DC調節分子、核酸、載體、宿主細胞、抗體、DC或藥物組合物，其中將所述DC調節分子、核酸、 載體、宿主細胞、抗體、DC或藥物組合物與疾病相關要素組合施用。
41.如權利要求38所述的方法或如權利要求38所述的DC調節分子、核酸、載體、宿主細胞、抗體、DC或藥物組合物，其中所述疾病相關要素選自與傳染原相關的成分；過敏原；與除過敏外的超敏反應相關的非自身成分；與自身免疫性疾病相關的自身成分；移植抗原；和腫瘤抗原。
42.一種如權利要求1 19中任一項所述的調節分子的激動劑或拮抗劑的鑑定方法， 所述鑑定方法包括(a)在允許與受體結合的條件下，使待篩選的化合物與細胞接觸，所述細胞在其表面表達有所述受體，其中所述受體在響應於與所述化合物的結合時能夠提供可檢測的信號；和(b)通過測量由所述化合物與所述受體的相互作用產生的信號的水平，來確定所述化合物是否與所述受體結合併活化或抑制所述受體。
全文摘要
本發明提供樹突狀細胞調節分子，該分子調節並優選抑制哺乳動物樹突狀細胞的分化和成熟。本發明還提供包含所述樹突狀細胞調節分子和同源物及其活性片段以及它們的抗體的藥物組合物，以及利用此類分子的治療方法和篩選方法。
文檔編號A61P37/02GK102215873SQ200980141871
公開日2011年10月12日 申請日期2009年9月16日 優先權日2008年9月16日
發明者吉多·裴森, 容·奧斯蒂恩, 帕特麗夏·納託爾, 史蒂芬·普雷斯頓 申請人:自然環境研究會