用於定向生物標誌物信號放大的螢光方法和材料的製作方法

2023-05-14 17:43:06

專利名稱：用於定向生物標誌物信號放大的螢光方法和材料的製作方法
交叉參考
本申請要求2006年10月6日申請的美國臨時申請No.60/825,615的優先權，該臨時申請在此引入作為參考。
背景技術：
螢光雜交探針已發展成為DNA和RNA的序列特異性檢測的一種重要工具。由附加的螢光標記(或染料)產生的信號可被實時監測且能提供簡單、快速和可靠的檢測生物靶標和事件的方法。從微陣列和實時PCR到螢光原位雜交(FISH)中都可看到其應用的例子。
近期在多發色團研究領域中，尤其關於偶聯的聚合物(CPs)的研究，已經突出顯示了這些材料在顯著改善此類方法的檢測靈敏度方面的潛力(Liu and Bazan，Chem.Mater.，2004)。這些材料的集光結構可以製成水溶性的且適合放大多種探針標記的螢光輸出量(參見2003年6月20日申請的美國專利申請No.10/600,286，以及Gaylord，Heeger，and Bazan，Proc.Natl.Acad.Sci.，2002，以上文件均在此完整引入作為參考)。
陽離子CPs尤其顯示出對帶相反電荷的核酸的強親和性，保證了從光激發的聚合物(集光供體)到螢光標記的探針/靶標對的能量傳遞所需的距離。與直接激發的單獨染料相比，光輸出量可以增加75倍(Liu andBazan，J.Am.Chem.Soc.，2005)。信號放大無論對同源還是異源檢測形式都會增加很多優勢。
這些結果顯示CPs在核酸診斷領域中很有應用前景，在樣品量十分少時尤其如此。但是，已經有擴增(或複製)核酸靶標的方法存在，即PCR。相比之下，在蛋白質識別領域中並不存在擴增靶標物質的這樣的簡單方法。因此，CP應用導致的信號增強在本領域中具有重要意義。
染料標記的抗體在諸如免疫組化、蛋白質陣列、ELISA試驗和流式細胞分析等應用中常規用於檢測蛋白質靶標。將CP材料整合到這些方法學中可使這些試驗的性能具有顯著的提升，可達到原先常規染料無法達到的檢測水平。


發明內容
一般來講，在一個方面，一種測定方法包括提供被懷疑含有靶標生物分子的樣本，提供與信號產生發色團偶聯並且能夠與靶標生物分子互相作用的傳感器，提供偶聯的聚合物，包括但並不局限於
其中該聚合物與傳感器靜電相互作用，並且在激發時能夠將能量傳遞至傳感器信號發色團，在傳感器可結合至靶標生物分子(如果存在)上的條件下將樣本在溶液中與傳感器和多發色團接觸，向該樣本施加能夠激發多發色團的光源，以及檢測是否從信號發色團上發出光來。
在一個實施方式中，R基團是磺酸基團。在另一個實施方式中，傳感器是一種生物分子，例如蛋白質、核酸或抗體。
在另一個實施方式中，傳感器可包括與多個信號發色團偶聯的多個傳感器，其中多個發色團中的至少兩個在從多發色團能量傳遞時能發射不同波長的光。
一般來講，在另一個方面，提供了一種多發色團複合物，其包含偶聯到至少一種生物分子上的多發色團。生物分子可包括但並不局限於傳感器生物分子、生物偶聯物和靶標生物分子。複合物的多發色團更進一步地偶聯至信號發色團上，且包括下述結構
其中CP1、CP2、CP3和CP4是任選地被取代的偶聯的聚合物區段或寡聚結構，它們彼此相同或不同。在一個實施方式中，偶聯的聚合物是陽離子偶聯聚合物。在另一種實施方式中，偶聯的聚合物是陰離子偶聯聚合物。在一個更進一步的實施方式中，偶聯的聚合物是電荷中性的偶聯的聚合物。在一個實施方式中，CP1、CP2、CP3和CP4是芳香族重複單元，選自苯、萘、蒽、芴、噻吩、呋喃、吡啶和噁二唑，每個任選地被取代，並且其中CP3和CP4可含有一個或多個可通過連接體連接的獨特生物偶聯位點。
在一個替代的實施方式中，多發色團包括生物偶聯位點，該生物偶聯位點包括但並不局限於馬來醯亞胺、硫醇、琥珀醯亞胺酯(NHS酯)、胺、疊氮化物化學、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺鹽酸鹽、磺基-SMCC(磺基琥珀醯亞胺基4-[N-馬來醯亞胺基甲基]環己烷-1-羧酸酯)、胺/BMPH(N-[β-馬來醯亞胺基丙酸]醯肼·TFA)、以及磺基-SBED磺基琥珀醯亞胺基[2-6-(生物素醯氨基)-2-(對-疊氮基苯甲醯氨基)-己醯氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯。
複合物的多發色團具有如下結構
其中R1是加溶基，包括但並不局限於乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-烷氧基銨鹽和ω-烷氧基磺酸鹽等。
可替代地，在另一個實施方式中，複合物的多發色團具有如下結構
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。在具體的實施方式中，該1和2可包括具有如下結構的a-g連接基團
*＝用於共價連接至不飽和骨架上的位點 另外，3可以是具有如下結構的h基團
L＝連接體 A＝生物偶聯位點 *＝用於共價連接至不飽和骨架上的位點 在另一個實施方式中，複合物的多發色團可具有如下結構
其中R1是加溶基，包括但並不局限於乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
在另一個實施方式中，複合物的多發色團可具有如下結構
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
在另一個實施方式中，複合物的多發色團具有如下結構
其中R1是加溶基，包括乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基、和ω-磺酸鹽烷氧基。
一般地，在另一個方面，提供了一種用於鑑定靶標生物分子的多發色團複合物，其包含多發色團、共價連接至該多發色團的傳感器生物分子、共價連接至該多發色團的信號產生發色團，其中信號發色團能夠接受在多發色團激發時來自多發色團的能量，並且傳感器生物分子能夠與靶標生物分子相互作用。在一個實施方式中，信號發色團和傳感器生物分子都通過多個連接體共價連接至多發色團上。在一個替代實施方式中，信號發色團和傳感器生物分子都通過三官能化連接體共價連接至多發色團上，該三官能化連接體共價連接多發色團、信號發色團和傳感器生物分子。
在一個實施方式中，連接體具有連接化學部分，包括但並不局限於馬來醯亞胺/硫醇、琥珀醯亞胺酯(NHS酯)/胺、疊氮化物化學部分、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺)鹽酸鹽/胺、胺/磺基-SMCC(磺基琥珀醯亞胺基4-[N-馬來醯亞胺基甲基]環己烷-1-羧酸酯)/硫醇、胺/BMPH(N-[β-馬來醯亞胺基丙酸]醯肼·TFA)/硫醇。在一個特定的實施方式中，該多發色團是偶聯的聚合物，例如聚陽離子偶聯的聚合物。
一般地，在另一個方面，提供了一種測定方法，包括以下步驟提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；提供包含多發色團、共價連接的信號發色團和共價連接的傳感器生物分子的多發色團複合物，其中信號發色團能夠在多發色團激發後接受來自多發色團的能量，並且傳感器生物分子能夠與靶標生物分子相互作用；在傳感器生物分子可結合至靶標生物分子(如果存在)的條件下，將樣本在溶液中與多發色團複合物接觸；向樣本施加能夠激發發色團的光源，以及檢測是否從信號發色團上發出光來。在一個具體的實施方式中，多發色團是偶聯的聚合物，例如聚陽離子偶聯的聚合物。
一般地，在另一個方面，提供了一種測定方法，包括以下步驟提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；提供偶聯至信號發色團並且能夠與靶標生物分子相互作用的第一生物偶聯物；提供與多發色團偶聯的第二生物偶聯物，其中該發色團包含如下結構
其中CP1、CP2、CP3和CP4是任選地被取代的偶聯的聚合物區段或寡聚結構，它們彼此相同或不同，其中第二生物偶聯物可結合至第一生物偶聯物，並且在這種結合後，多發色團的激發能夠將能量傳遞至信號發色團，在第一生物偶聯物可結合至靶標生物分子(如果存在)的條件下將樣本在溶液中與第一生物偶聯物接觸，將該溶液與第二生物偶聯物接觸，向樣本施加能夠激發發色團的光源，以及檢測是否從信號發色團上發出光來。在一個實施方式中，CP1、CP2、CP3和CP4是芳香族重複單元，包括但並不局限於苯、萘、蒽、芴、噻吩、呋喃、吡啶和噁二唑，每個任選地被取代，並且其中CP3和CP4可含有一個或多個通過連接體連接的獨特生物偶聯位點。在一個具體的實施方式中，多發色團是偶聯的聚合物，例如聚陽離子偶聯的聚合物、陰離子偶聯的聚合物和/或電荷中性的偶聯的聚合物。
在一個相關的實施方式中，多發色團具有生物連接位點，包括但並不局限於馬來醯亞胺、硫醇、琥珀醯亞胺酯(NHS酯)、胺、疊氮化物化學部分、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺鹽酸鹽、磺基-SMCC(磺基琥珀醯亞胺基4-[N-馬來醯亞胺基甲基]環己烷-1-羧酸酯)、胺/BMPH(N-[β-馬來醯亞胺基丙酸]醯肼·TFA)、以及磺基-SBED磺基琥珀醯亞胺基[2-6-(生物素醯氨基)-2-(對-疊氮基苯甲醯氨基)-己醯氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯。
在一個具體的實施方式中，多發色團具有如下結構
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
在另一個實施方式中，多發色團具有如下結構
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
在一個更進一步的實施方式中，1和2可包括一個或多個具有如下結構的a-g連接基團
*＝用於共價連接至不飽和骨架的位點 在一個實施方式中，3是具有如下結構的基團h

L＝連接體 A＝生物偶聯位點 *＝用於共價連接至不飽和骨架的位點 在另一個實施方式中，複合物的多發色團具有如下結構
其中R1是加溶基，包括但並不局限於乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
在另一個實施方式中，複合物的多發色團具有如下結構
其中R1是加溶基，包括但並不局限於乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
在另一個實施方式中，複合物的多發色團具有如下結構
其中R1是加溶基，包括但並不局限於乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。在一個具體的實施方式中，該多發色團是偶聯的聚合物，例如聚陽離子偶聯的聚合物、陰離子偶聯的聚合物和/或電荷中性的偶聯的聚合物。
在一個實施方式中，第一和第二生物偶聯物中的至少一個是抗體。在一個特定的實施方式中，第一和第二生物偶聯物都是抗體。
一般地，在另一個方面，提供了一種測定方法，包括以下步驟提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；提供包含共價連接的第一生物偶聯物的多發色團；提供包含能夠與靶標分子相互作用的傳感器生物分子、信號發色團以及能夠與第一生物偶聯物結合的共價連接的第二生物偶聯物的傳感器生物分子複合物，其中在這種結合後，多發色團的激發能夠將能量傳遞給信號發色團；在傳感器生物分子可結合至靶標生物分子(如果存在)的條件下將樣本在溶液中與傳感器生物分子複合物接觸；將溶液與多發色團接觸；向樣本施加能夠激發發色團的光源；以及檢測是否從信號發色團上發出光來。在一個具體的實施方式中，多發色團是偶聯的聚合物，例如聚陽離子偶聯聚合物、陰離子偶聯聚合物和/或電荷中性偶聯聚合物。
在一個實施方式中，第一和第二生物偶聯物包括但並不局限於蛋白質、抗體和核酸、在一個相關的實施方式中，第一生物偶聯物是鏈親和素或生物素，傳感器生物分子是一種抗體，並且在第一生物偶聯物是生物素時，第二生物偶聯物是鏈親和素，或者在第一生物偶聯物是鏈親和素時是生物素。在另一個實施方式中，第一生物偶聯物是鏈親和素或生物素，傳感器生物分子是一種核酸，並且在第一生物偶聯物是鏈親和素時第二生物偶聯物是生物素，或者在第一生物偶聯物是鏈親和素時為生物素。
一般地，在另一個方面，提供一種用於鑑定生物分子的生物識別複合物。該複合物可包含生物偶聯物、共價連接至該生物偶聯物的信號發色團、共價連接至該生物偶聯物的多發色團，其中多發色團的激發能夠將能量傳遞至信號發色團上。
在一個實施方式中，生物偶聯物可包括但並不局限於抗體或鏈親和素。在一個具體的實施方式中，該多發色團是偶聯的聚合物，例如聚陽離子偶聯聚合物、陰離子偶聯聚合物和/或電荷中性偶聯聚合物。
一般地，在一個方面，提供了一種測定方法，包括以下步驟提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；提供包含生物偶聯物、共價連接至生物偶聯物的信號發色團以及共價連接至生物偶聯物的多發色團的生物識別複合物，其中多發色團的激發能夠將能量傳遞給信號發色團；在生物偶聯物可結合至靶標生物分子或靶標相關生物分子(如果存在)的條件下將樣本在溶液中與生物識別複合物接觸；向該溶液施加能夠激發發色團的光源；以及檢測是否從信號發色團上發出光來。在一個具體的實施方式中，多發色團是偶聯的聚合物，例如聚陽離子偶聯聚合物、陰離子偶聯聚合物和/或電荷中性偶聯聚合物。
一般地，在另一個方面，提供了一種用於鑑定靶標生物分子的生物識別複合物，其包含生物偶聯物、共價連接至該生物偶聯物的多發色團、以及共價連接至該多發色團的信號發色團，其中多發色團的激發能夠將能量傳遞給信號發色團。在一個實施方式中，該生物偶聯物是抗體。在另一個實施方式中，該生物偶聯物是鏈親和素。在一個具體的實施方式中，多發色團是偶聯的聚合物，例如聚陽離子偶聯聚合物、陰離子偶聯聚合物和/或電荷中性偶聯聚合物。
一般地，在另一個方面，提供了一種測定方法，包括以下步驟提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；提供包含生物偶聯物複合物的生物識別複合物，該生物偶聯物複合物包含生物偶聯物、共價連接至生物偶聯物的多發色團、以及共價連接至多發色團的信號發色團，其中多發色團的激發能夠將能量傳遞給信號發色團；在生物偶聯物可結合至靶標生物分子或靶標相關生物分子(如果存在)的條件下將樣本在溶液中與生物識別複合物接觸；向該溶液施加能夠激發發色團的光源；以及檢測是否從信號發色團上發出光來。在一個具體的實施方式中，多發色團是偶聯的聚合物，例如聚陽離子偶聯聚合物、陰離子偶聯聚合物和/或電荷中性偶聯聚合物。
在另一個方面，提供的方法是此處公開的一系列方法中的任何方法，其中通過靶標生物分子的檢測來檢測基因的表達。
在另一個方面，提供的方法是此處公開的一系列方法中的任何方法，其中檢測靶標生物分子提供的結果可用於診斷患者的疾病狀態。在一個實施方式中，診斷疾病的方法包括以下步驟檢查或分析關於樣本中是否存在靶標生物分子的數據；以及給患者、醫務人員或醫療衛生管理者提供一個結論；該結論是基於檢查和分析有關疾病診斷的數據而作出的。在一個相關的實施方式中，提供結論包括經由網絡傳輸數據。
一般地，在另一個方面，提供了用於鑑定靶標生物分子的試劑盒。在一個實施方式中，試劑盒包括多發色團、共價連接至該多發色團的傳感器生物分子、共價連接至多發色團的信號發色團，其中信號發色團在多發色團激發時能夠接受來自於多發色團的能量，並且傳感器生物分子能夠與靶標生物分子相互作用。在一個具體的實施方式中，該試劑盒還包括一種基質。
引入參考 在本說明書中提及的所有出版物和專利申請都在此引入作為參考，如同每個單獨的出版物或專利申請被特別地和單獨地在此引入作為參考一樣。



所附的權利要求書中詳細地說明了本發明的新特徵。參考以下闡述說明性實施方式的詳細描述和附圖將會更好地理解本發明的特徵和優點，在這些說明性實施方式中應用本發明的原理，在附圖中 圖1.本發明一個實施方式中的多發色團的靜電結合示意圖。
圖2.FITC標記抗體的直接激發圖，闡明放大的染料發射(左)，和本發明一個實施方式的多發色團的結構示意圖(右)。
圖3.Cy3標記抗體的直接激發圖，闡明放大的染料發射(左)，和本發明一個實施方式的多發色團的結構示意圖(右)。
圖4.本發明一個實施方式中生物偶聯的多發色團的示意圖。
圖5.偶聯至抗體(左)或染料(右)的多發色團的示意圖。
圖6.偶聯至染料標記的可與第一抗體結合的第二抗體的多發色團的示意圖。
圖7.與鏈親和素偶聯的多發色團的示意圖，該鏈親和素用於結合染料標記的和生物素標記的第一抗體(左)或染料標記的或生物素標記的核酸(右)。
圖8.偶聯至與染料偶聯的抗體的多發色團(左)和偶聯至與染料偶聯的鏈親和素的多發色團(右)的示意圖。
圖9.本發明一個實施方式中多發色團的結構示意圖。
圖10.本發明一個實施方式中具有生物偶聯位點的單體的示意圖。
圖11.本發明一個實施方式的單體的合成途徑示意圖。
圖12.本發明另一個實施方式的單體的合成途徑示意圖。
圖13.通過連接體(左)或通過三官能化連接體(右)生物偶聯至染料和生物分子上的多發色團的示意圖。
圖14.同時偶聯至染料和抗體上的多發色團(左)以及同時偶聯至染料和蛋白質上的多發色團(右)的示意圖。
圖15.用兩種染料標記的DNA探針的單一和多重檢測圖。
圖16.連接至染料和第二抗體的多發色團的示意圖，該第二抗體對於針對蛋白質的第一抗體是特異性的。
圖17.連接至染料和用於結合第二抗體上生物素的鏈親和素的多發色團的示意圖。顯示第二抗體對於針對蛋白質的第一抗體是特異性的。
圖18.本發明一個實施方式中偶聯的聚合物多發色團的結構示意圖。
圖19.本發明另外的實施方式中偶聯的聚合物多發色團的結構示意圖。
圖20.本發明實施方式中各種芳香族單元的結構的示意圖。
圖21.具有馬來醯亞胺生物偶聯位點的偶聯的聚合物多發色團的結構示意圖。
圖22.顯示一個代表性邏輯裝置實例的流程圖。
圖23.顯示一個代表性試劑盒實例的示意圖。
圖24.本發明一個實施方式的紅外(IR)光譜分析圖。
圖25.本發明一個實施方式的光譜圖。
圖26.本發明一個實施方式的螢光光譜圖。
圖27A.本發明一個實施方式中與生物素化有關的結構的示意圖。
圖27B.本發明的生物素-親和素結合試驗的示意圖。
圖27C.本發明一個實施方式中關於生物素-親和素結合試驗的螢光光譜圖。
圖28.本發明另一個實施方式的紅外(IR)光譜分析圖。
圖29.本發明另一個實施方式的光譜圖。
圖30A.對照聚合物結構的示意圖。
圖30B.涉及本發明一個實施方式的實驗性聚合物結構的示意圖。
圖30C.關於所述對照和實驗性聚合物的螢光光譜圖。
圖31A.關於本發明一個實施方式的對照聚合物和實驗性聚合物結構的示意圖。
圖31B.關於對照和實驗性聚合物的螢光試驗示意圖。
圖32A.本發明聚合物的一個實施方式的螢光光譜圖。
圖32B.顯示本發明一個實施方式的螢光光譜校正值的圖。
圖33A.本發明一個實施方式的聚合物的螢光信號強度圖。
圖33B.涉及本發明一個實施方式的聚合物的信號放大圖。
圖34.本發明另一個實施方式的光譜圖。
圖35A.本發明的生物素-親和素結合試驗的示意圖。
圖35B.本發明一個實施方式的螢光素髮射圖。
圖36A.涉及本發明一個實施方式的聚合物結構的示意圖。
圖36B.涉及本發明一個實施方式的聚合物的螢光試驗的示意圖。
圖36C.本發明聚合物的一個實施方式的螢光光譜圖。
發明詳述 儘管帶電的多發色團結構和基本靜電相互作用能夠有效地放大染料標記的抗體信號，但是更加定向的多發色團結合方法可保證更低的背景和改善信號。多發色團材料可直接偶聯(共價連接)至抗體和/或染料，在試驗中提供增加的控制(多發色團-染料間距)。基本上，信號染料與放大聚合物緊密偶聯。此外，多發色團的偶聯並不局限於染料或抗體；而是多發色團可以偶聯至任何種類的生物分子上，包括蛋白質(諸如親和素/鏈親和素)、核酸、親和性配體、糖類、脂類、肽、以及酶的底物。這些形式可應用於一系列廣泛的應用中，諸如DNA微陣列、FISH試驗、PCR試驗，也包括上述的基於蛋白質的檢測應用。聚合物材料的性質進一步允許使用單一激發波長(雷射、濾光片等)放大一種以上的染料。這就使得同時檢測多個靶標(多重)成為可能。關於多發色團及其應用的詳情公開如下，每個在此引入作為參考美國專利申請序列號No.11/329,495，2006年1月10日申請，以US 2006-0183140 A1公布；美國專利申請序列號No.11/329,861，2006年1月10日申請，以US2006-0216734 A1公布；美國專利申請序列號No.11/344,942，2006年1月31日申請，以US 2006-0204984 A1公布；美國專利申請序列號No.10/648,945，2003年8月26日申請，以US 2004-0142344 A1公布；美國專利申請序列號No.10/600,286，2003年6月20日申請，以US2004-0219556 A1公布；美國專利申請序列號No.10/666,333，2003年9月17日申請，以US 2005-0059168 A1公布；和美國專利申請序列號No.10/779,412，2004年2月13日申請，以US 2005-0003386 A1公布。
在進一步詳細描述本發明之前，應當理解本發明並不局限於描述的特定的方法學、裝置、溶液或器具等，因為這些方法、裝置、溶液或器具當然可發生變化。同樣應當理解此處使用的術語僅用於描述特定實施方式的目的，並非有意限制本發明的範圍。
除非本文清楚指出為其他意思，使用單數形式「一個」和「一種」包括複數形式的所述內容。例如，提及「一個聚集傳感器」包括多個聚集傳感器，提及「一種探針」包括多種探針，以此類推。另外，使用具體的複數形式的內容，諸如「二」、「三」等，除非文本清楚指出其他意思，應當理解是同一主題的較大數目。
諸如「聯結」、「附加」、「偶聯」以及「連接」的術語在此處可互換使用，並且涵蓋直接以及間接的聯結、附加、連接或偶聯，除非文本清楚指出其他意思；在一個實例中，短語「偶聯的聚合物」按照本領域的常規含意來使用，指的是含有一系列不飽和鍵的聚合物，並且文中指出術語「偶聯」應當理解為不僅是單純的或直接的或間接的聯結、附加或連接。
當述及數值範圍時，應當理解在述及的該範圍上限和下限之間的每個介於中間的整數值和每個分數，以及在這些數值之間的每個亞範圍，也被具體公開。任何範圍的上限和下限可獨立地被包括在該範圍內或被排除在該範圍之外，並且當上下限兩者中的任何一個、兩個都被包括在內或都不包括時，每個範圍也被涵蓋在本發明之內。當一個被討論的數值具有內在的限值時，例如當一個組分可以用濃度從0至100％來表示，或當一種水溶液的pH可為1至14時，那些內在的限值就被具體地公開了。當一個數值被明確地述及時，應當理解那些與所述數值大約相同數量或量的數值也處於本發明的範圍之內，基於它們的範圍也處於本發明的範圍之內。當一個組合被公開時，該組合內元素的每個亞組合也同樣被具體地公開且處於本發明範圍之內。相反地，當不同元素或元素組被公開時，其組合也同樣被公開。當一項發明的任何元素被公開為具有多個替代物時，每個替代物單獨地或與其他替代物任意組合地被排除的本發明的實例也同樣在此處公開；一項發明的一個以上的元素可具有此類的排除，並且具有此類排除的元素的所有組合由此被公開。
除非另外定義或文中清楚指出為別的意思，此處使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通技術人員通常所理解的同樣的含意。儘管任何與此處描述的類似或等同的方法和材料可以用於本發明的實踐或測試，現在描述優選的方法和材料。
所有此處提及的出版物在此引入作為參考，目的是公開和描述引用的參考文件的具體材料和方法學。提供此處所述的出版物僅僅因為它們的公開早於本申請的申請日。而不應理解為承認由於在先的發明，本發明不早於此公開內容。
定義 在描述本發明時，將採用下述術語，並且定義如下。
「烷基」指含1至24個碳原子的支鏈的、非支鏈的或環形的飽和烴基，任選地在一個或多個位置被取代，並且包括多環化合物。烷基基團的實例包括任選地被取代的甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正癸基、己基辛基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等，以及環烷基基團，諸如環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基、金剛烷基和降冰片基(norbomyl)等。術語「低級烷基」指含1至6個碳原子，優選1至4個碳原子的烷基基團。取代的烷基基團上的取代基的例子包括羥基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、-NO2、滷素、滷代烷基、雜烷基、羧基烷基、胺、醯胺、硫醚和-SH。
「烷氧基」指「-O烷基」基團，其中烷基如上述定義。「低級烷氧基」基團意指含有一至六個，優選地一至四個碳原子的烷氧基。
「烯基」指2至24個碳原子的支鏈、非支鏈或環形烴基，其含有至少一個碳碳雙鍵，任選地在一或多個位點被取代。烯基的實例包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、1-甲基乙烯基、環丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯基、1，4-丁二烯基、環丁烯基、l-甲基丁-2-烯基、2-甲基丁-2-烯-4-基、異戊二烯基、戊-1-烯基、戊-3-烯基、1，1-二甲基烯丙基、環戊烯基、己-2-烯基、1-甲基-1-乙基烯丙基、環己烯基、庚烯基、環庚烯基、辛烯基、環辛烯基、癸烯基、十四烯基、十六烯基、二十烯基、二十四烯基等。此處優選的烯基含有2至12個碳原子。術語「低級烯基」意指含有2至6個碳原子，優選2至4個碳原子的烯基基團。術語「環烯基」意指有3至8個碳原子，優選5至6個碳原子的環形烯基基團。取代的烯基基團上的取代基的例子包括羥基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、-NO2、滷素、滷代烷基、雜烷基、胺、硫醚和-SH。
「烯氧基」指「-O烯基」基團，其中烯基如上述定義。
「烷基芳基」指與芳基基團共價連接的烷基基團。優選地，該烷基是一種低級烷基。烷基芳基基團的實例包括苯甲基、苯乙基、苯丙基、1-苄基乙基、苯丁基、2-苯甲基丙基等。
「烷基芳氧基」指「-O烷基芳基」基團，其中烷基芳基如上述定義。
「炔基」指2至24個碳原子的支鏈或非支鏈烴基，其含有至少一個-C≡C-三鍵，任選地在一個或多個位點被取代。炔基的實例包括乙炔基、正丙炔基、異丙炔基、炔丙基、丁-2-炔基、3-甲基丁-1-炔基、辛炔基、癸炔基等。此處優選的炔基含有2至12個碳原子。術語「低級炔基」意指含有2至6個，優選2至4個碳原子，以及一個-C＝C-三鍵的炔基基團。取代的炔基基團上的取代基的實例包括羥基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、-NO2、滷素、滷代烷基、雜烷基、胺、硫醚和-SH。
此處提及的「抗體」在最廣泛的意義上使用，具體包括單克隆抗體(包括全長的單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片斷(例如Fab、F(ab′)2和Fv)，只要它們對選定抗原表現出結合活性或親和性即可。
此處使用的「抗原」指任何能夠引發免疫應答的物質。
「醯胺」指-C(O)NR′R″，其中R′和R″獨立地選自氫、烷基、芳基、和烷基芳基。
「胺」指-N(R′)R″基團，其中R′和R″獨立地選自氫、烷基、芳基、和烷基芳基。
「芳基」指具有至少一個環的芳香基團，該環具有偶合的pi電子系統，包括碳環、雜環、橋連和/或多環芳基基團，並可任選地在一個或多個位點處被取代。典型的芳基基團含有1至5個芳香環，這些環可以是稠合和/或連接的。芳基基團的例子包括苯基、呋喃基、唑基(azolyl)、硫代呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、聯苯基、茚基、苯並呋喃基、吲哚基、萘基、喹啉基、異喹啉基、喹唑啉基、吡啶並吡啶基(pyridopyridinyl)、吡咯並吡啶基(pyrrolopyridinyl)、嘌呤基、四氫化萘基(tetralinyl)等。任選取代的芳基基團的例子包括烷基、烷氧基、烷基羧基、烯基、烯氧基、烯羧基、芳基、芳氧基、烷基芳基、烷基芳氧基、稠合的飽和或不飽和的任選取代的環、滷素、滷代烷基、雜烷基、-S(O)R、磺醯基、-SO3R、-SR、-NO2、-NRR′、-OH、-CN、-C(O)R、-OC(O)R、-NHC(O)R、-(CH2)nCO2R或-(CH2)nCONRR′，其中n為0-4，且其中R和R′獨立地是H、烷基、芳基或烷基芳基。
「芳氧基」指″-O芳基″基團，其中芳基如上述定義。
「碳環」指任選取代的含有至少一個環的化合物，且其中所有環原子都是碳，並且可以是飽和的或不飽和的。
「碳環芳基」指任選取代的芳基基團，其中環原子是碳。
「滷代」或「滷素」指氟代、氯代、溴代或碘代。滷化物指滷素的陰離子形式。
「滷代烷基」指在一個或多個位點處被滷素取代的烷基基團，包括僅被一種類型的滷素原子取代的烷基基團以及被混合的不同類型的滷素原子取代的烷基基團。滷代烷基基團的例子包括三滷代甲基基團，例如三氟甲基(trfiluoromemyl)。
「雜烷基」指一種烷基基團，其中一個或多個碳原子和相連接的氫原子被任選取代的雜原子替換，包括僅被一種類型的雜原子取代的烷基以及被混合的不同類型的雜原子取代的烷基基團。雜原子包括氧、硫和氮。如此處所使用的，氮雜原子和硫雜原子包括氮和硫的任何氧化形式，以及具有四個共價鍵的氮的任何形式，包括質子化形式。任選取代的雜原子指用烷基、芳基、烷基芳基或羥基來替換連接在氮原子上的一個或多個氫。
「雜環」指含有至少一個飽和或不飽和的環的化合物，該環具有至少一個雜原子且任選地在一個或多個位點上被取代。典型的雜環基團含有1至5個環，其可以是稠合的和/或連接的，其中每個環含有五個或六個原子。雜環基團的實例包括哌啶基、嗎啉基和吡咯烷基。任選取代的雜環基團的示例性取代基對於烷基或芳基在環碳處，對於雜烷基在雜原子處。
「雜環芳基」指在至少一個芳香環上有至少1個雜原子的芳基基團。雜環芳基基團的例子包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、噠嗪基、吡咯基、N-低級烷基-吡咯並、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、四嗪基、三唑基、四唑基、咪唑基、聯吡啶基、三吡啶基、四吡啶基、吩嗪基、菲羅啉基(phenanthrolinyl)、嘌呤基等。
「烴基」指含有1至大約20個碳原子的烴基取代基，包括支鏈的、非支鏈的和環形的種類以及飽和的和不飽和的種類，例如烷基基團、亞烷基基團、烯基基團、烷基芳基基團、芳基基團等。術語「低級烴基」意指有一個至六個碳原子，優選一至四個碳原子的烴基基團。
「取代基」指用以取代連接在碳或氮上的一個或多個氫的基團。取代物的例子包括烷基、亞烷基、烷基羧基、烷氧基、烯基、烯基羧基、烯氧基、芳基、芳氧基、烷基芳基、烷基芳氧基、-OH、醯胺、甲醯胺、羧基、磺醯基、＝O、＝S、-NO2、滷素、滷代烷基、稠合的飽和的或不飽和的任選取代的環、-S(O)R、-SO3R、-SR、-NRR′、-OH、-CN、-C(O)R、-OC(O)R、-NHC(O)R、-(CH2)nCO2R或-(CH2)nCONRR′，其中n是0-4，並且其中R和R′獨立地是H、烷基、芳基或烷基芳基。取代也包括用任選取代的雜原子代替碳原子和一個或多個連接的氫原子。
「磺醯基」指-S(O)2R，其R是烷基、芳基、-C(CN)＝C-芳基、-CH2CN、烷基芳基或胺。
「硫代醯胺」指-C(S)NR′R″，其R′和R″獨立地選自滷素、烷基、芳基和烷基芳基。
「硫醚」指-SR，其中R是烷基、芳基或烷基芳基。
此處所用的術語「結合對」指以比樣本中其他成分更高的親和力互相特異性結合在一起的第一和第二分子。結合對中成員之間的結合典型地是非共價的。結合對的例子包括免疫結合對(例如任何半抗原或抗原化合物與相應抗體或其結合部分或其片斷組合，例如洋地黃毒苷和抗洋地黃毒苷、螢光素和抗螢光素、二硝基酚和抗二硝基酚、溴脫氧尿苷和抗溴脫氧尿苷、小鼠免疫球蛋白和山羊抗小鼠免疫球蛋白)和非免疫結合對(例如生物素-親和素、生物素-鏈親和素、激素[例如甲狀腺素和氫化可的松]-激素結合蛋白、受體-受體激動劑或拮抗劑(例如乙醯膽鹼受體-乙醯膽鹼或其類似物)IgG-蛋白A、凝集素-碳水化合物、酶-酶輔因子、酶-酶抑制物、和互補的能形成核酸雙鏈的多核苷酸對)等。結合對中的一個或兩個成員可與其他分子偶聯。
術語「多核苷酸」、「寡核苷酸」、「核酸」和「核酸分子」在此處可互換使用，指的是任何長度的核苷酸的聚合形式，並可包含核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、其類似物、或其混合物。這些術語僅指分子的一級結構。由此，這些術語包括三鏈、雙鏈和單鏈的脫氧核糖核酸(「DNA」」)，以及三鏈、雙鏈和單鏈的核糖核酸(「RNA」)。它也包括修飾的(例如通過烷基化和/或通過戴帽反應)和未修飾形式的多核苷酸。這些術語的其他詳情以及鹼基配對形成的詳情可見2006年1月31日申請的美國申請序列號No.11/344,942，該申請在此引入作為完整性的參考。
「互補」或「基本互補」指核苷酸或核酸之間，例如，傳感器肽核酸和靶標多核苷酸之間，雜交或鹼基配對的能力。一般地，互補核苷酸是A和T(或A和U)，或C和G。當一條鏈的鹼基(最佳比對和比較以及具有適當的插入或缺失)與另一條鏈的至少大約80％，通常至少大約90％至95％，以及更優選大約98％至100％的鹼基配對時，兩條單鏈多核苷酸或PNAs就被稱作基本互補。
或者，當一個多核苷酸或PNA將在選擇性雜交條件下與其互補物雜交時就存在基本互補性。典型地，當在至少14至25個鹼基的延伸長度上至少有大約65％，優選地至少大約75％，更優選地至少大約90％互補時，選擇性雜交就會發生。參見M.Kanehisa Nucleic Acids Res.12203(1984)。
「優先結合」或「優先雜交」指與樣本中的非互補聚合物相比，一種多核苷酸或PNA與樣本中其互補物結合的傾向增加。
多核苷酸雜交條件典型地包括小於大約1M的鹽濃度，更常見地小於大約500mM和優選地小於大約200mM。在肽核酸和多核苷酸之間雜交的情況中，雜交可在含有少量鹽或無鹽的溶液中進行。雜交溫度可低至5℃，但典型地高於22℃，更典型地高於大約30℃，優選地超過大約37℃。較長片斷的的特異性雜交可能需要較高的雜交溫度。其他因素可能影響雜交的嚴格性，包括鹼基組成和互補鏈的長度，有機溶劑的存在和鹼基錯配的程度，所用參數的組合比任何單獨一個參數的絕對值更加重要。其他可以控制的雜交條件包括緩衝液類型和濃度，溶液pH，用於降低背景結合的封閉試劑如重複序列或封閉蛋白質溶液的存在和濃度，去汙劑類型和濃度，諸如能夠提高多核苷酸相對濃度的聚合物的分子，金屬離子和它們的濃度，螯合劑和它們的濃度，以及其他本領域已知的條件。
此處的「多重」指多種分析物可以被同時測定的試驗或其他分析方法。
「具有」是類似於「包含」和「包括」的開放式用語，包括其它元素被包括在內的情況和沒有包括在內的情況。
「任選的」或「任選地」意思是後面描述的事件或狀況可能發生或可能不發生，並且該描述包括該事件或狀況發生的情況以及沒有發生的情況。
此處公開的本發明一般地涉及包括多發色團和信號發色團的測定和複合物，信號發色團通過增強的信號放大作用來用於鑑定靶標生物分子或與靶標分子相關聯的生物分子。
一般地，在一個方面，本發明包括多發色團向傳感器上的染料的能量傳遞，該傳感器可以是生物分子，包括生物偶聯物(例如，抗體)。
在一個實施方式中，用一種方法改變關於核酸傳感器測定的形式，如Gaylord，Heeger，and Bazan，J.Am.Chem.Soc.，2003所述。具體而言，多發色團的信號放大可以基於非特異性靜電結合事件，以顯示雜交事件。任何建立的多發色團可以被選作供體，一種或多種染料，優選地具有高效能量傳遞歷史的染料，例如螢光素和Cy3，可以被選作受體。可以預想染料可直接偶聯至傳感器分子上。如圖1示意性地顯示的，傳感器可以是溶液中或底物上的生物分子(例如，抗體)，在其上可加上多發色團。在圖1顯示的實施方式中，染料可共價連接至(生物偶聯至)一種抗體(Y形結構)，抗體具有淨負電荷。陽離子多發色團(用波狀線顯示)的加入可以導致該多發色團和抗體之間的靜電結合，使多發色團和染料緊密接近。由此可以滿足螢光共振能量傳遞(FRET)所需的距離，並且用光(顯示為hv)激發聚合物導致染料發射放大。可以想像多發色團可在染料不具備顯著吸收的波長下激發。在一個實施方式中，染料可在比多發色團發射更長的波長下發射。在使用中可以想到一種測定方法包括以下步驟提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；提供偶聯至信號發色團且能夠與該靶標生物分子相互作用的傳感器；提供與傳感器靜電作用並且在激發時能夠傳遞能量至傳感器信號發色團的多發色團；在傳感器可結合至靶標生物分子(如果存在)的條件下將樣本在溶液中與傳感器和多發色團接觸；接著，該方法可包括向樣本施加能夠激發多發色團的光源，以及檢測是否從信號發色團上發出光來。
從圖1顯示的實施方式產生的數據的一個實例呈現在圖2中。如圖顯示，FITC標記的小鼠抗人CD22抗體可以被直接激發(下線，標為FITC)，或通過激發靜電結合的多發色團(圖2所示的結構，右側)並且隨後經由FRET能量傳遞而間接激發(上線，標為被聚合物放大的信號)。該實驗的細節包括直接激發FITC標記的小鼠抗人CD22抗體(下線，標為FITC，496nm激發，[FITC標記的小鼠抗人CD22抗體]＝1ng/mL)，和在2mL 1X SSPE中多發色團放大的染料發射(上線，380nm激發，[多發色團]＝1x10-6M，以重複單元計，RU)。供體多發色團的結構顯示於圖的右邊。有利地，與直接激發相比，在存在多發色團的情況下的能量傳遞導致染料信號強度放大5倍。
圖3顯示了圖1顯示的實施方式產生的第二個數據的實例。在這裡，該圖顯示了直接(下線，標為Cy3，540nm激發)和間接(上線，380nm激發)激發Cy3標記的驢抗小鼠第二抗體的光學報告信號的比較。實驗條件類似於先前實驗的條件，但是使用了一半的體積。供體多發色團結構顯示於圖3的右側。多發色團放大的染料強度比直接染料激發的強度大10倍。
如此處所公開的，帶電的多發色團與染料標記的抗體之間的靜電結合是提高檢測靈敏度例如生物分子靶標的靈敏度的一個可行的手段。在更進一步的實施方式中，共價連接多發色團至染料/生物分子(例如，抗體)複合物提供了幾個優勢，包括降低的背景和提高的能量傳遞。在直接連接至生物分子的例子中，生物識別事件，而不是靜電結合事件，應當管理多發色團的存在。在這種方式下，多發色團與生物分子的非特異性結合可以被消除，減少任何由多發色團本身產生的背景發射。上述生物分子包括但並不局限於蛋白質、肽、親和性配體、抗體、抗體片斷、糖、脂類和核酸(如雜交探針和/或適體)。
在直接連接至染料或生物分子/染料複合物的例子中，供體-受體距離可以固定，而非依靠靜電結合的強度，並且能量傳遞效率可被顯著地提高。這對於提高染料信號和減少與供體-受體交叉聯繫(cross-talk)相關的背景螢光具有重要意義。此例中的交叉聯繫是指多發色團(供體)與染料(受體)發射峰之間的重疊。由於距離太遠而無法產生能量傳遞的非特異結合的多發色團對背景螢光(或交叉聯繫)有貢獻。供體和受體之間較短的(固定的)距離不但能夠促進直接染料放大，而且能大大猝滅供體發射。這就導致在受體發射波長上有較少的供體發射，由此減少或甚至消除了對交叉聯繫校正的需要。
一般地，在另一個方面，本發明包括多發色團與親和性配體(親和性配體描述為對另一生物分子具有親和性的生物分子)的生物偶聯。圖4顯示了一類物質，其中多發色團(用波狀線顯示)連接至染料、生物分子、或生物分子/染料複合物(標為X)。與多發色團的連接可經由多發色團上作為生物偶聯位點的第一功能性連接體A連接，該位點能與第二功能性連接體A』共價連接，A』又連接至生物分子和/或染料上(參見X)。這種排列可以固定多發色團和X之間的距離，因此保證了僅多發色團和X之間的特異性相互作用。可以預想該實施方式中的生物分子組分X可以是此處公開的多種生物分子中的任意一種，包括但並不局限於抗體、蛋白質、親和性配體或核酸。
可以預想本文中的X可以是，但並不局限於，染料、螢光蛋白、納米材料(例如Quantum Dot)、染料和產生化學發光的分子之間的偶聯物、螢光蛋白和產生化學發光的分子之間的偶聯物、納米材料(例如Quantum Dot)和產生化學發光的分子之間的偶聯物、鏈親和素、親和素、酶、酶底物、酶底物的類似物、受體、受體的配體、受體的配體類似物、DNA、RNA、修飾的核酸、DNA適體、RNA適體、修飾的核酸適體、肽適體、抗體、抗原、噬菌體、細菌或任何兩種上述成分的偶聯物。
A-A』和B-B』的連接化學包括，但並不局限於，馬來醯亞胺/硫醇、琥珀醯亞胺酯(NHS酯)/胺、疊氮化物化學、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺鹽酸鹽/胺、胺/磺基-SMCC(磺基琥珀醯亞胺基4-[N-馬來醯亞胺基甲基]環己烷-1-羧酸酯)/硫醇、和胺/BMPH(N-[β-馬來醯亞胺基丙酸]醯肼·TFA)/硫醇。
在另一個方面，本發明包括標記的多發色團。圖5顯示了兩個標記的多發色團的實例。在一個實施方式中，在左側，顯示多發色團(以波狀線顯示)與抗體偶聯，該抗體可以是，例如，1°或2°抗體。例如，在一個試驗中，多發色團和抗體的偶聯物可以作為報告物。多發色團用光(未顯示)激發可導致多發色團的發射，顯示出抗體(1°或2°)的存在。在圖5右側顯示的另一個實施方式中，多發色團用染料例如發色團標記。在此例中，在顯示的FRET過程裡，多發色團可起到供體的作用，染料可起到受體的作用。在此處，多發色團可起到集光者的作用，多發色團激發之後是經由FRET過程將激發傳送給染料。這就導致了放大的染料發射(與直接染料激發相比)。在一個實施方式中，供體多發色團的螢光可被猝滅(例如＞90％猝滅)。
一般地，在另一個方面，本發明包括一種測定靶標生物分子或標記的靶標生物分子的方法。如圖6所示，在一個實施方式中，多發色團(以波狀線顯示)可連接至第一生物偶聯物(顯示為一個Y形的物體)，例如針對第二個染料標記的生物偶聯物(例如1°抗體)特異性的2°抗體。在此處，1°和2°抗體之間的識別事件將導致供體多發色團和受體染料之間的距離縮短。經過該識別事件後，用光(顯示為hv)激發供體多發色團將導致向受體染料的FRET(顯示為彎曲的箭頭)，並且觀察到放大的染料發射(與直接激發染料相比)。在使用中，可以預想一種測定方法可包括提供懷疑含有靶標生物分子的樣本，提供偶聯至信號發色團並且能夠與靶標生物分子相互作用的第一生物偶聯物，例如1°抗體。接下來提供偶聯至多發色團的第二生物偶聯物，例如2°抗體，其中第二生物偶聯物可結合至第一生物偶聯物上並且其中在該結合後多發色團的激發能夠將能量傳遞至信號發色團。接下來，該方法包括在第一生物偶聯物能夠結合至靶標生物分子(如果存在)的條件下，在溶液中將樣本和第一生物偶聯物接觸，並且將溶液與第二生物偶聯物接觸。該方法接著包括向至靶標生物分子或標記的靶標生物分子施加光源，其中該光源能夠激發多發色團，隨後檢測是否從信號發色團發射出光來。
一般地，在另一個方面，本發明包括一種使用多發色團和傳感器生物分子複合物測定樣本的方法。如圖7左側所示，多發色團(以波狀線顯示)可偶聯至第一生物偶聯物，例如鏈親和素(SA)，其對生物素有極強的親和性。在圖7左側，傳感器生物分子(例如可以是1°或2°抗體的抗體)同時偶聯至染料和第二生物偶聯物(例如生物素部分)。經過第一和第二生物偶聯物(例如SA和生物素)之間的生物識別事件後，多發色團和染料緊密靠近，並且供體多發色團的激發將導致向受體染料的FRET。染料發射將指示第一生物偶聯物的存在(例如抗體)。與直接染料激發相比，當通過FRET間接激發時將會觀察到染料信號強度的放大。
在如圖7右側顯示的另一個實施方式中，傳感器生物分子，例如核酸，同時偶聯至染料和第一生物偶聯物(例如生物素部分)上。經過第二生物偶聯物(例如SA)和第一生物偶聯物(例如生物素)之間的生物識別事件後，多發色團和染料緊密靠近，並且供體多發色團的激發將導致向受體染料的FRET。與直接染料激發相比，當通過FRET間接激發時將會觀察到染料信號強度的放大。染料發射將指示傳感器生物分子(例如核酸)的存在。
應用圖7所示實施方式的方法可包括以下步驟提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；提供包含共價連接的第一生物偶聯物(例如SA)的多發色團；提供包含能夠與靶標生物分子相互作用的傳感器生物分子、信號發色團、和共價連接的能與第一生物偶聯物結合的第二生物偶聯物的傳感器生物分子複合物，其中在該結合後，多發色團的激發能將能量傳遞至信號發色團。該方法進一步包括以下步驟在傳感器生物分子能結合至靶標生物分子(如果存在)的條件下，在溶液中將樣本和傳感器生物分子複合物接觸；將溶液與多發色團接觸；對樣本施加能夠激發多發色團的光源；以及檢測是否從信號發色團發射出光來。
一般地，在另一個方面，本發明提供一種用於鑑定靶標生物分子的生物識別複合物，其包含生物偶聯物、信號發色團和多發色團。圖8顯示了直接偶聯至染料標記的生物偶聯物如抗體的多發色團(左側)。圖8進一步顯示了一個替代實施方式，其中多發色團偶聯至染料標記的SA(右側)。在左側所示的實施方式中，生物偶聯物(顯示為Y形)與染料和多發色團之間的共價連接確保了供體多發色團和受體染料緊密靠近。在生物偶聯物如抗體和它的靶標如抗原之間的生物識別事件後，供體多發色團的激發將導致向受體染料的FRET。在圖8右側所示的一個替代實施方式中，多發色團和染料仍然保持固定的足夠近的距離。這樣，在如SA和生物素部分之間的結合事件後，供體多發色團的激發將導致向受體染料的FRET。在圖8所示的每個實施方式中，多發色團的激發導致放大的染料發射。
圖9顯示了CP結構的一個非限制實例。骨架可主要由芴-亞苯基重複單元組成並充當FRET過程中的供體。CP由R1和R2基團功能化。二者都可起到使具有親水基團的CP溶解的作用，包括但並不局限於季胺或PEG-型官能團，而R2也可以通過能量水平修飾調節光學性質。以位點A功能化的第三共聚單體苯基基團允許與染料或生物分子生物偶聯。連接體A可以是，但並不局限於馬來醯亞胺、硫醇、琥珀醯亞胺酯(或NHS-酯)、胺、疊氮化物、生物素、親和素/鏈親和素、或可與生物分子或染料上的A』連接體反應的其他配體-受體(例如，參見圖4)。
一種允許合成圖9的示例性聚合物的獨特單體顯示於圖10中。該單體具有兩個適合於Suzuki偶聯的位點(參見Liu and Bazan，J.Am.Chem.Soc.，2005；Liu and Bazan，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，2005；Bazan，Liu，美國臨時申請No.60/666,333，申請於2003年9月17日)，以及重要地，一個允許生物偶聯的位點A。位點A可以是生物偶聯位點本身，或前體，諸如鄰苯二甲醯亞胺(被保護的胺)。
圖11和圖12顯示了幾個適合的單體合成的實例。圖11示意性地顯示了具有鄰苯二甲醯亞胺官能團的單體的合成，鄰苯二甲醯亞胺作為被保護的胺。圖12顯示了具有馬來醯亞胺的單體的合成，馬來醯亞胺可生物偶聯至硫醇。
合成用於聚合作用的兩個單體結構的實例如下。第一步是一步合成用保護的胺(鄰苯二甲醯亞胺的形式)功能化的單體，用於生物偶聯至琥珀醯亞胺酯，第二步是四步合成用馬來醯亞胺功能化的單體，用於生物偶聯至硫醇。
N-4』-(3」，5」-二溴苯氧基)丁基鄰苯二甲醯亞胺或1-(4』-鄰苯二甲醯亞胺基丁氧基)3，5-二溴苯。在己烷中再結晶3，5-二溴苯酚(970mg，3.85mmol)。去除溶劑後，加入N-(4-溴丁基)鄰苯二甲醯亞胺(1.38g，4.89mmol)、K2CO3(1.88g，13.6mmol)、18-冠-6(53mg，0.20mmol)和丙酮(20mL)。回流1小時，然後倒入100mL水中。使用二氯甲烷(4×30mL)萃取水相。合併有機相，用水、飽和NaHCO3和鹽水洗滌，然後用MgSO4乾燥，過濾。溶劑的去除產生白色固體，通過柱層析(4∶1己烷∶CH2Cl2)純化，接著在己烷中再結晶，產生無色針狀物(650mg，87％)。
N-甲氧羰基馬來醯亞胺。馬來醯亞胺(2.00g，20.6mmol)和N-甲基嗎啉(2.08g，20.6mmol)在乙酸乙酯中冷卻至0℃。滴加氯甲酸甲酯(1.4mL，20.7mmol)產生白色沉澱。溶液在0℃攪拌1小時，隨後濾除固體。濃縮濾過液產生粉紅色的油狀物，後用柱層析(洗脫液3∶1己烷∶乙酸乙酯)純化，產生淡黃色晶體。
N-(ω-羥己基)馬來醯亞胺。將6-氨基-1-己醇和飽和NaHCO3(20mL)冷卻至0℃。在攪拌下分批加入N-甲氧羰基馬來醯亞胺。固體不會完全溶解。在0℃攪拌30分鐘(大部分固體在20分鐘後溶解)，然後去除冰浴且再攪拌30分鐘，此時溶液呈淡粉紅色。用水三倍稀釋該液體並用氯仿(3×40mL)洗滌，MgSO4乾燥，過濾，且通過旋轉蒸發去除溶劑。
1-(6』-溴己氧基)-3，5-二溴苯。3，5-二溴苯酚在己烷中再結晶。去除溶劑後，加入1，6-二溴己烷、K2CO3、18-冠-6和丙酮。回流1小時，然後倒入100mL水中。使用二氯甲烷(4×30mL)萃取水相。合併有機相，用水、飽和NaHCO3和鹽水洗滌，然後用MgSO4乾燥，過濾。去除溶劑產生灰白色固體，用柱層析純化，產生白色固體。
1-(6』-(6」馬來醯亞胺基己氧基)己氧基)-3，5-二溴苯。將N-(ω-羥己基)馬來醯亞胺、-(6』-溴己氧基)-3，5-二溴苯、K2CO3、18-冠-6和丙酮回流1小時，然後傾倒入100mL水中。使用二氯甲烷(4×30mL)萃取水相。合併有機相，用水、飽和NaHCO3和鹽水洗滌，然後用MgSO4乾燥，過濾。去除溶劑產生粗物質，用柱層析純化產生純產物。
一般地，在另一個方面，本發明提供一種用於鑑定靶標生物分子的多發色團複合物，其包含多發色團、傳感器生物分子和信號發色團。如圖13所示，在一個實施方式中，多發色團可同時生物偶聯至染料和生物分子例如生物識別分子上。可用的生物分子包括但並不局限於抗體、親和性配體、核酸、蛋白質、納米材料或酶底物。接近多發色團共價連接染料的優點已在上面描述。通過將受體染料和生物識別分子都連接至多發色團上，有兩個優點，通過固定供體-受體距離，保證受體處於供體多發色團的附近(反之亦然)，並且也提高了指示出生物識別事件的多發色團結合的特異性。這些共價複合物可通過此處所述的單體和連接化學製備。
如圖13左側所示，在一個實施方式中，多發色團(波狀線)經過連接體官能團A-A』可生物偶聯至染料X上，經過連接體官能團B-B』可生物偶聯至生物分子Y上。在如圖12右側所示的一個替代實施方式中，多發色團可通過三功能化連接體經過連接體官能團A-A』、B-B』和C-C』生物偶聯至染料X和生物分子Y上。在圖13中所示的實施方式中，該X可以是，但並不局限於，染料、螢光蛋白、納米材料(例如Quantum Dot)、染料和產生化學發光的分子之間的偶聯物、螢光蛋白和產生化學發光的分子之間的偶聯物、或納米材料(例如Quantum Dot)和產生化學發光的分子之間的偶聯物。該Y可以是，但並不局限於，鏈親和素、親和素、酶、酶底物、酶底物類似物、受體、受體的配體、受體的配體類似物、DNA、RNA、修飾的核酸、DNA適體、RNA適體、修飾的核酸適體、肽適體、抗體、抗原、噬菌體、細菌或任何上述兩種成分的偶聯物。
用於A-A』、B-B』和C-C』的連接化學可包括，但並不局限於，馬來醯亞胺/硫醇、琥珀醯亞胺酯(NHS酯)/胺、疊氮化物化學、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺鹽酸鹽/胺、胺/磺基-SMCC(磺基琥珀醯亞胺基4-[N-馬來醯亞胺基甲基]環己烷-1-羧酸酯)/硫醇、和胺/BMPH(N-[β-馬來醯亞胺基丙酸]醯肼·TFA)/硫醇。三功能連接體諸如可商購的磺基-SBED磺基琥珀醯亞胺基[2-6-(生物素醯氨基)-2-(對-疊氮基苯甲醯氨基)-己醯氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯可以在X、Y和多發色團之間的三向連接中發揮很好的功能。
在使用中，圖13顯示的實施方式可以是一種鑑定靶標生物分子的多發色團複合物，其中該複合物包含多發色團、共價連接至該多發色團的信號發色團和共價連接至該多發色團的傳感器生物分子。該複合物中的信號發色團能夠接受多發色團激發時來自多發色團的能量，該傳感器生物分子能夠與靶標生物分子相互作用。可以預想該生物分子可包括但並不局限於抗體、蛋白質、親和性配體、肽或核酸。
一般地，在另一個方面，本發明提供一種用於鑑定生物分子的生物識別複合物，其中該複合物包含生物偶聯物、多發色團和信號發色團。在圖14左側顯示的一個實施方式中，多發色團同時偶聯至生物偶聯物如抗體(1°或2°)和染料上。供體多發色團與受體染料之間的共價連接保證了緊密接近。供體多發色團的激發導致向該受體染料的FRET。當該生物偶聯物是抗體時，如果該抗體結合至它的靶標(例如抗原)上，在供體多發色團激發後就會通過染料發射顯示出來。在圖14右側顯示的一個替代實施方式中，多發色團可同時偶聯至SA和染料上。同樣，供體多發色團與受體染料之間的共價連接保證了緊密接近，供體多發色團的激發導致向該受體染料的FRET。該SA複合物可用於標記或檢測生物素標記的生物分子諸如生物素化的抗體或核酸。多發色團激發後向染料標記的FRET將會大大增強檢測信號(即更高的靈敏度)。
圖16顯示了雙標記的多發色團(以波狀線顯示)的一個實例，它同時生物偶聯至受體染料和2°抗體(Y形結構)上。在一個試驗中，未標記的1°抗體可結合至抗原，例如靶標蛋白質(顯示為黑色三角形)。加入偶聯至多發色團並且進一步偶聯至染料的2°抗體，可特異性地與1°抗體結合。與直接激髮結果相比，多發色團的光學激發可引起向染料的能量傳遞和染料發射放大。
圖17顯示了本發明一個實施方式的夾心型複合物的一個實例。在此，多發色團複合物由生物偶聯至染料和生物分子如鏈親和素(SA)的多發色團(以波狀線顯示)組成。未標記的1°抗體結合到靶標蛋白(顯示為黑色三角形)上後，生物素標記的2°抗體與1°抗體特異性結合。在一個分離的步驟中，多發色團複合物的加入將導致生物素和鏈親和素之間的特異性結合，與直接激發染料相比，多發色團激發將導致放大的染料發射。染料發射產生的信號將指示靶標蛋白的存在。
在一個進一步的方面，本發明提供供體能量向多個受體傳遞的多重化技術。通過在FRET系統中應用多發色團作為供體，也包括能夠多重化的優點。一個供體可將能量傳遞至幾個染料；由此在有一個激發源的情況下，可以監測多個染料的強度。當不同類型的細胞可通過蛋白質-抗體識別事件被監測時，這可用於包括但並不局限於細胞成像(即免疫組化)的應用。
在一個實施方式中，兩種染料標記的抗體可與一種生物材料例如培養的細胞系孵育。抗體可以識別在其表面表達靶標蛋白的細胞並且僅特異性地結合至這些蛋白質上。通過使用不同染料標記這兩種抗體，就有可能同時監測兩種不同蛋白質或不同細胞類型的表達。典型地，這將需要兩次掃描或成像，每次都用正確的激發波長。作為分析前的最後一個步驟，將這兩個圖像互相重疊。通過使用同時偶聯至染料和多發色團的抗體，對兩個染料可使用一種激發波長，並且一張圖像將包括來自於兩種抗體的每一個的數據組。
該實施方式的一個相關實例顯示於圖15中，其顯示了一個供體多發色團將能量傳遞至螢光素標記的DNA探針(點線)、能量傳遞至德克薩斯紅標記的DNA探針(短劃線)、和能量傳遞至兩種探針(實線)的發射光譜。另外，兩種染料直接激發產生的光譜顯示為朝向圖15底部的實線。在這三個例子中均看到顯著的染料放大。另外，每種染料均觀察到強烈的信號，無論是否存在其他染料，顯示出良好的多重化潛力。可以想像蛋白質診斷的平行結果。
考慮到用於多重化分析的潛力，可以想像多發色團可連接至多種染料上，包括，但並不局限於，螢光素、6-FAM、羅丹明、德克薩斯紅、四甲基羅丹明、羧基羅丹明、羧基羅丹明6G、羧基對甲氨基酚、羧基羅丹明110、Cascade Blue、Cascade Yellow、香豆素、


Cy-Chrome、藻紅蛋白、PerCP(多甲藻素葉綠素-a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基螢光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-羅丹明)、HEX、Lucifer Yellow、MarinaBlue、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、AlexaFluor.RTM.350、Alexa

430、Alexa

488、Alexa

532、Alexa

546、Alexa

568、Alexa

594、Alexa

633、Alexa

647、Alexa

660、Alexa

680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BODIPY.RTM.FL、

FL-Br2、

530/550、

558/568、

564/570、

576/589、

581/591、

630/650、

650/665、

R6G、

TMR、

TR、其偶聯物、和其組合。
可以想到此處描述的本發明可用於提高任一種商業化檢測的靈敏度，其包括但並不局限於OraQuick Rapid HIV-1/2抗體檢測，由OraSure Technologies，Inc.(Bethlehem，PA)生產，是FDA批准的用於口腔液體樣本的HIV診斷測試。該檢測在短至20分鐘的時間內可提供超過99％準確性的篩查結果。
多發色團 集光多發色團系統可有效傳遞能量至鄰近的發光物質。能量傳遞機制包括，例如共振能量傳遞(Forster(或螢光)共振能量傳遞，FRET)、量子電荷交換(Dexter能量傳遞)和類似機制。但是典型地，這些能量傳遞機制都處於相對較近的範圍內，並且集光多發色團系統緊密靠近信號發色團對於高效能量傳遞是必需的。當集光多發色團系統的發色團個體數目較大時可產生發射的放大；與螢光團直接被泵浦光激發相比，當入射光(「泵浦光」)處於可被集光多發色團系統吸收並傳遞至螢光團的波長時，來自於螢光團的發射強度更強。
本發明使用的多發色團可以是電荷中性的、陽離子的或陰離子的。在一些實施方式中，多發色團是聚陽離子多發色團。
在多發色團是聚陽離子的實施方式中，它們可以與含有多個陰離子基團的生物分子如多糖、多核苷酸、肽、蛋白質、抗體等相互作用。在一些實施方式中，多發色團可與靶標抗體或多核苷酸靜電作用，並且通過抗體抗原識別或傳感器多核苷酸和靶標多核苷酸之間的雜交，使不帶電的傳感器多核苷酸上的信號發色團接近以便於能量接收。任何能吸收光和優選地發射或傳遞能量的聚陽離子多發色團可在描述的本方法中使用。可使用的多發色團的例子包括偶聯的聚合物(CP)、飽和聚合物或以任意可行方式合併多個發色團的樹狀聚合物、和半導體納米材料(SCNCs)。該CP、飽和聚合物和樹狀聚合物可製備成合併多個陽離子物質或可以衍生化以使它們在合成後為聚陽離子形式；通過在它們表面加入陽離子物質可使半導體納米材料成為聚陽離子形式。在一些實施方式中，聚陽離子多發色團不是按照其在激發時傳遞能量的能力來檢測，因此涉及此類檢測方案的方法不需要多發色團發射或傳遞能量。
在一些實施方式中，多發色團是CP。在一個具體的實施方式中，CP包含一定量的一種類型的「低帶隙重複單元」，使聚合物在大約450nm至大約1000nm的範圍內具有吸收。低帶隙重複單元在聚合前可表現或不表現這種吸收，但在合併入偶聯的聚合物之後確實能引入這種吸收。這種吸收特徵允許聚合物在多種設置下在產生較少背景螢光的波長下被激發，這些設置包括分析生物樣本和成像和/或檢測分子。CP吸收向較低能量和較長波長的轉移因此允許更靈敏和更可靠的方法。另外，許多可商購的儀器中加入了在此波長下工作的成像部件，至少部分原因是為避免此類問題。例如，在擴增反應中進行實時檢測的熱循環儀和微陣列閱讀儀都在此區域內工作。提供在這個區域內吸收的聚合物可使檢測方法適應這些形式，也允許進行全新的方法。
整合入能夠降低帶隙的重複單元可產生具有這些特徵的偶聯的聚合物。產生能在這些波長下吸收光的聚合物的任選取代的種類的例子包括2，1，3-苯並噻二唑、苯並硒二唑(benzoselenadiazole)、苯並碲二唑(benzotellurodiazole)、萘並硒二唑(naphthoselenadiazole)、4，7-二(噻吩-2-基)-2，1，3-苯並噻二唑、方酸染料(squaraine dyes)、喹喔啉、低帶隙商業化染料、石蠟和氰基取代的石蠟和其異構體。關於合適的多發色團的組成、結構、性質和合成方面的詳情可見於2005年1月10日提交的美國臨時申請No.60/642,901和2006年1月10日提交、現以US 2006-0183140 A1公布的美國專利申請序列號No.11/329,495中，兩者均在此引入作為參考。
多發色團可被描述為一組共價結合的發色團單元或發色團的共價集合體。多發色團可包括，但並不局限於，線性結構，諸如偶聯的聚合物(CPs)和樹狀結構(Wang，Gaylord，and Bazan，Adv.Mater.，2004，Wang，Hong，and Bazan，Org.Lett.，2005。
圖18顯示了作為線性多發色團的CP的通常結構。在一個實施方式中，該CP可由Liu和Bazan的美國專利申請序列號No.10/666,333「構象柔性陽離子偶聯聚合物」(Conformationally Flexible CationicConjugated Polymers)的表1和表2或方案1中所述的單元組成，也包括此處圖10所示的含有一個或多個獨特生物偶聯位點的單體。該CP優選地含有至少大約0.01mol％的生物偶聯位點，並且可含有至少大約0.02mol％、至少大約0.05mol％、至少大約0.1mol％、至少大約0.2mol％、至少大約0.5mol％、至少大約1mol％、至少大約2mol％、至少大約5mol％、至少大約10mol％、至少大約20mol％或至少大約30mol％。CCP可含有最多100mol％的生物偶聯位點，可含有大約99mol％或更少、大約90mol％或更少、大約80mol％或更少、大約70mol％或更少、大約60mol％或更少、大約50mol％或更少、或大約40mol％或更少。
在圖18中，單元CP1、CP2、CP3和CP4是任選被取代的偶聯聚合物區段或寡聚結構，並且它們可以彼此相同或不同。CP1、CP2、CP3和CP4可為芳香重複單元並可選自苯、萘、蒽、芴、噻吩、呋喃、吡啶和噁二唑，每個任選地被取代。另外，CP3和CP4可含有一個或多個獨特的生物偶聯位點，由的連接體L連接，如圖3h所示。這些生物偶聯位點可以是，但並不局限於，馬來醯亞胺、硫醇、琥珀醯亞胺酯(NHS酯)、胺、疊氮化物化學、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺鹽酸鹽、磺基-SMCC(磺基琥珀醯亞胺基4-[N-馬來醯亞胺基甲基]環己烷-1-羧酸酯)、胺/BMPH(N-[β-馬來醯亞胺基丙酸]醯肼·TFA)、或磺基-SBED磺基琥珀醯亞胺基[2-6-(生物素醯氨基)-2-(對-疊氮基苯甲醯氨基)-己醯氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯，它們可以在如圖13的X、Y和CP之間作為三向連接體。
典型的芳香族重複單元顯示於Liu和Bazan的美國專利申請序列號No.10/666,333「構象柔性的陽離子偶聯聚合物」的表1中，代表性聚合物區段和寡聚結構顯示於表2中。
圖18含有CP3和CP4，其可以是有角度的連接體(間位形式)，並且可以是具有5至20個原子的單環或多環任選取代的芳基基團。CP3和CP4單元可以均勻地或隨機地沿聚合物主鏈分布。
CP1、CP2、CP3和CP4中的每一個任選地在一個或多個位置處被一個或多個基團取代，這些基團選自--R1--A、--R2-B、--R3--C和-R4--D，這些基團可以經由橋接官能團--E--和--F--連接在一起，前提是整個聚合物必須被多個陽離子、陰離子、或電荷中性的水溶性基團取代。
R1、R2、R3和R4獨立地選自烷基、烯基、烷氧基、炔基、芳基、烷基芳基、芳基烷基和聚環氧烷，每個任選地被取代，其可含有一個或多個雜原子，或可能不存在。R1、R2、R3和R4可獨立地選自C1-22烷基、C1-22烷氧基、C1-22酯、具有1至大約22個碳原子的聚環氧烷、具有1至大約22個碳原子的環狀冠醚，或不存在。優選地，R1、R2、R3和R4可選自具有1至大約12個碳原子的直鏈或支鏈烷基基團，或具有1至大約12個碳原子的烷氧基基團。應當理解，一個以上的官能團可以連接到如通式所示的環的一個或多個位置上。
A、B、C和D獨立地選自H、--SiR′R″R″′、--N+R′R″R″′、胍基、組氨酸、聚胺、吡啶基團和鋶基團。R′、R″和R″′獨立地選自氫、C1-12烷基和C1-12烷氧基和C3-12環烷基。優選地，R′、R″和R″是低級烷基或低級烷氧基基團。
E和F獨立地選自缺無、--O--、--S--、--C(O)--、--C(O)O--、--C(R)(R′)--、--N(R′)--和--Si(R′)(R″)，其中R′和R″如上述定義。
X是O、S、Se、--N(R′)--或--C(R′)(R″)--，並且Y和Z獨立地選自--C(R)＝和--N＝，其中R、R′和R″如上述定義。
圖19顯示了一個由含有芴單元和芳香族單元1、2和3的骨架組成的CP。單元1和2可以是、但並不局限於，顯示於圖20中的結構。單元3含有生物偶聯位點。R1官能團被標為加溶基，可以是，但並不局限於，帶電的烷基官能團(如(CH2)nNMe3Br，或(CH2)nSO3Na)或親水基團(如乙二醇單元，(OCH2CH2)n)。
來自於圖19的π-偶合的單元1、2和3包括Liu和Bazan的美國專利申請序列號No.10/666,333「構象柔性的陽離子偶聯聚合物」的表1和2和方案1中描述的那些物質。圖20顯示了可能存在於如圖19所示的普通CP結構內的π-偶合的單元的幾個具體實例，用星號表示共價結合至CP骨架的位點。這些單元包括以典型的對位形式(a、b和e)或以間位形式(c和d)連接至CP骨架的苯單元，間位形式允許在CP骨架內具有更好的柔性。這些單元可被改變電子結構的部分功能化(b、d和e)，包括供體基團(烷氧基或乙二醇單元)和吸電子基團(氟)或用親水性乙二醇單元或帶電基團如季胺或磺酸酯改善水溶性(e)。也包括諸如噻吩(f)和苯並噻二唑基團(g)的單元，其可以起到改變電子結構的作用。這些單元好可以像上述那樣被功能化。單元h含有特異性生物偶聯位點A，例如馬來醯亞胺，其經由連接體L例如烷氧基共價結合至π-偶合的區段上，並且可以以鄰位、對位或間位的形式被整合至CP骨架上。
特定聚合物結構的幾種變體包括顯示於圖21中的那些，其含有一定百分比的經由醚和烷氧基連接體連接的具有馬來醯亞胺或琥珀醯亞胺酯生物偶聯位點的單元。
本發明有用的偶聯聚合物包括但並不局限於以下所述
抗原-抗體相互作用 抗原和抗體之間的相互作用與其他非共價蛋白質-蛋白質相互作用相同。一般地，抗原和抗體之間存在四種類型的結合相互作用(i)氫鍵，(ii)分散力，(iii)Lewis酸和Lewis鹼之間的靜電力，和(iv)疏水相互作用。某些物理力對抗原抗體結合有貢獻，例如表位形狀與不同抗體結合位點的適配或互補。此外，其他材料和抗原可與抗體交叉反應，由此競爭可以獲得的自由抗體。
抗原抗體之間結合的親和常數和特異性的測定是決定免疫測定效率的一個關鍵因素，不僅可用於評價最好的抗原和抗體製備物以備使用，而且一旦確定基本的免疫測定設計就可用於維持質量控制。
抗體 抗體分子屬於一個稱為免疫球蛋白的血漿蛋白家族，它們的基本組件免疫球蛋白摺疊或域，被以各種形式應用於免疫系統和其他生物識別系統的許多分子中。一個典型的免疫球蛋白具有四個多肽鏈，含有一個稱為可變區的抗原結合區和一個稱為恆定區的非可變區。
天然的抗體和免疫球蛋白通常是大約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩個相同的輕(L)鏈和兩個相同的重(H)鏈組成。每個輕鏈通過一個共價二硫鍵與一個重鏈連接，但不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間二硫鍵的數目不同。每個重鏈和輕鏈也具有規律地隔開的鏈內二硫橋。每個重鏈在一端具有一個可變區(VH)，緊隨著幾個恆定區。每個輕鏈在一端具有一個可變區(VL)，在另一端有一個恆定區。輕鏈的恆定區和重鏈的第一恆定區對齊，並且輕鏈可變區與重鏈的可變區對齊。
按照它們重鏈恆定區的胺基酸序列，免疫球蛋白可分成不同的類別。至少有五(5)個主要的免疫球蛋白類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中幾個可進一步分成亞類(同種型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。不同類別的免疫球蛋白的亞基結構和三維構象眾所周知。有關抗體結構、功能、使用和製備方面更詳盡的信息在2006年2月14日授權的美國專利No.6,998,241中有討論，其完整內容在此引入作為參考。
夾心測定 抗體或多抗體夾心測定是本領域技術人員周知的，包括1984年12月4日授權的美國專利No.4,486,530和其中提及的參考文獻所公開的那些。圖6、7、8和14顯示的結構可直接按照描述的使用或以各種夾心形式使用。夾心形式或夾心測定是指使用連續的識別事件來建立起多種生物分子的層，並且使用報告元件來顯示特定生物分子的存在。一個標準的實例是抗體的連續使用。在這些測定中，第一抗體結合靶標，第二抗體結合第一抗體，第三抗體可結合第二抗體，以此類推。每一個接續的層都可加上額外的報告基團。另一個策略是重複加入兩個(或多個)可互相識別的組分的交替層，或兩個以上的鏈識別關係的組分，其包含一個或兩個多聚結構形式的組分。在這樣的設置中，每個多聚結構中的一個或多個官能團可用報告基團標記且未被佔據的官能團可作為其他組分的識別位點，並且這個系統將隨後提供一個信號放大的平臺。這種方法的一個典型實例是使用鏈親和素-報告分子偶聯物和生物素化的抗鏈親和素抗體。在此類測定中，生物素化的傳感器分子(核酸或抗體)可用於結合靶標生物分子，其隨後被含有鏈親和素-報告分子偶聯物和生物素化抗鏈親和素抗體的檢測系統識別。通過連續幾輪生物素化抗體與標記的鏈親和素複合物的相互作用，就可以建立起這種情況中的夾心結構，以實現信號放大。通過多發色團與生物素化抗體或鏈親和素報告分子複合物額外偶聯，可能進一步增加信號輸出。基本上，這種類型的信號放大系統中多發色團的整合可進一步放大信號至更高的水平。
通過直接整合集光多發色團到常用的識別元件中，圖6、7、8、14、16和17中描述的生物素化聚合物複合物可用於創建光學增強的夾心試驗。多發色團偶聯的結構的優點也可以直接應用於第一靶標識別元件而無需連續的識別元件。例如，如圖14所示，第一抗體可直接偶聯至多發色團-染料複合物上。這種複合物可用於直接探查是否存在靶標生物分子。
多核苷酸 擴增的靶標多核苷酸可進行擴增後處理。例如，在一些例子中，可能需要在雜交之前把靶標多核苷酸片斷化來提供更易接近的區段。核酸的片斷化可通過任何能產生適合所進行試驗的大小的片斷的方法來實現；適當的物理、化學和酶方法在本領域中眾所周知。
擴增反應可以在至少在部分擴增循環中允許傳感器多核苷酸與擴增產物雜交的條件下進行。當以此種模式進行測定時，該雜交事件的實時檢測可以通過監測擴增中的光發射來實現。
實時PCR產物分析(和相關的實時逆轉錄PCR)提供了一種眾所周知的實時PCR監測技術，該技術已應用於許多應用中，其可以修改用於此處描述的方法(參見，Laurendeau et al.(1999)″TaqMan PCR-basedgene dosage assay for predictive testing in individuals from a cancer familywith INK4 locus haploinsufficiency″Clin Chem 45(7)982-6；Laurendeau etal.(1999)″Quantitation of MYC gene expression in sporadic breast tumorswith a real-time reverse transcription-PCR assay″Clin Chem59(12)2759-65；和Kreuzer et al.(1999)″LightCycler technology for thequantitation of bcr/abl fusion transcripts″Cancer Research 59(13)3171-4，以上所有內容均在此引入). 樣本 原則上，樣本可以是任何懷疑含有能夠在聚集傳感器上引發聚集反應的聚集物的材料。在一些實施方式中，樣本可以是任何來源的生物材料，其包含能夠從活的生命體(包括細胞、組織或體液)直接或間接獲得的多核苷酸，以及由該生命體留下的沉積物，包括病毒、支原體和化石。樣本可整體或部分地包含由合成手段製備的聚集物。典型地，獲得的樣本為主要為水性的介質或分散於主要為水性的介質中。樣本的非限制實例包括血液、尿、精液、奶、痰、粘液、口腔拭子、陰道拭子、直腸拭子、抽出液、針吸活檢組織、例如通過手術或屍檢獲得的組織切片、血漿、血清、脊髓液、淋巴液、皮膚外分泌物、呼吸道、消化道、和泌尿生殖道、淚液、唾液、腫瘤、器官、體外細胞培養組分樣本(包括但並不局限於細胞在細胞培養基中生長產生的條件培養液、推斷被病毒感染的細胞、重組細胞、和細胞組分)、和包含多核苷酸序列的重組庫。
樣本可為已知含有聚集物或其替代物的陽性對照樣本。也可使用陰性對照樣本，儘管預期其不含有聚集物，但懷疑其含有聚集物(經由一種或多種試劑的汙染)或另一能夠產生假陽性的組分，並且其檢測是為了確認在特定試驗中使用的試劑沒有被靶標多核苷酸所汙染，以及確定給定的一組試驗條件是否產生假陽性(樣本中即使沒有多核苷酸也產生陽性信號)。
樣本可被稀釋、溶解、懸浮、提取或進行其他處理來溶解和/或純化存在的任何靶標多核苷酸或使之能夠接近擴增方案中使用的試劑或接近檢測試劑。當樣本含有細胞時，細胞可被裂解或通透化來釋放細胞內的多核苷酸。一步通透化緩衝液可用來裂解細胞，在裂解後允許直接進行進一步的步驟，例如聚合酶鏈反應。
信號發色團 在一些實施方式中，可採用信號發色團或螢光團，例如來接收從激發態的光活性單元傳遞的能量，或與標記的探針交換能量，或用於多個能量傳遞方案中。此處描述的本發明可用的螢光團包括任何能吸收適當波長的能量和發射或傳遞能量的物質。對於多重試驗，多種不同的螢光團可用於可檢測地不同的發射光譜。典型的螢光團包括螢光染料、半導體納米晶體、鑭系金屬螯合物和綠色螢光蛋白。
螢光染料的例子包括螢光素、6-FAM、羅丹明、德克薩斯紅、四甲基羅丹明、羧基羅丹明、羧基羅丹明6G、羧基對甲氨基酚、羧基羅丹明110、Cascade Blue、Cascade Yellow、香豆素、


Cy-Chrome、藻紅蛋白、PerCP(多甲藻素葉綠素-a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基螢光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-羅丹明)、HEX、Lucifer Yellow、Marina Blue、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、AlexaFluor.RTM.350、Alexa

430、Alexa

488、Alexa

532、Alexa

546、Alexa

568、Alexa

594、Alexa

633、Alexa

647、Alexa

660、Alexa

680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BODIPY.RTM.FL、

FL-Br2、

530/550、

558/568、

564/570、

576/589、

581/591、

630/650、

650/665、

R6G、

TMR、

TR、其偶聯物、和其組合。鑭系金屬螯合物的例子包括銪螯合物、鋱螯合物和釤螯合物。
多種螢光半導體納米材料(″SCNCs″)在本領域中眾所周知；製造和使用半導體納米材料的方法描述於PCT公開No.WO 99/26299，1999年5月27日公布，發明人為Bawendi等；1999年11月23日授予Weiss等人的USPN 5,990,479；和Bruchez et al.，Science 2812013，1998。半導體納米材料可具有非常窄的發射譜帶和非常明確的峰值發射波長，允許使用大量不同的SCNC在同一試驗中作為信號發色團，任選地與其他非SCNC類型的信號發色團組合使用。
多核苷酸特異性染料的例子包括吖啶橙、吖啶同型二聚體、放線菌素D、7-氨基放線菌素D(7-AAD)、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)、BOBOTM-1碘化物(462/481)、BOBOTM-3碘化物(570/602)、BO-PROTM-1碘化物(462/481)、BO-PROTM-3碘化物(575/599)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二乳酸鹽(DAPI，乳酸鹽)、二氫乙錠(氫乙錠)、二氫乙錠(氫乙錠)、二氫乙錠(氫乙錠)、溴化乙錠、二疊氮氯化乙錠、乙錠同型二聚體-1(EthD-1)、乙錠同型二聚體-2(EthD-2)、一疊氮溴化乙錠(EMA)、碘化己錠(hexidium iodide)、Hoechst 33258、Hoechst33342、Hoechst 34580、Hoechst S769121、羥芪巴脒(hydroxystilbamidine)、甲磺酸酯、JOJOTM-1碘化物(529/545)、JO-PROTM-1碘化物(530/546)、LOLOTM-1碘化物(565/579)、LO-PROTM-1碘化物(567/580)、NeuroTraceTM 435/455、NeuroTraceTM 500/525、NeuroTraceTM 515/535、NeuroTraceTM 530/615、NeuroTraceTM 640/660、OliGreen、

ssDNA、

dsDNA、POPOTM-1碘化物(434/456)、POPOTM-3碘化物(534/570)、PO-PROTM-1碘化物(435/455)、PO-PROTM-3碘化物(539/567)、碘化丙錠、


Light、

Green I、

Green II、

Gold、

101、

102、

103、

DX、TO-

-1、TO-

-3、TO-

-5、

-1、

-3、YO-

-1(噁唑黃)、YO-

-3、

-1、

-3、TO、

Blue、

Green、

Orange、

9、

BC、

40、

41、

42、

43、

44、

45、

Blue、

11、

12、

13、

14、

15、

16、

20、

21、

22、

23、

24、

25、

Green、

80、

81、

82、

83、

84、

85、

Orange、

17、

59、

60、

61、

62、

63、

64、

Red、紡錘菌素、遠黴素、吖啶橙、3，4-苯並芘、噻唑橙、TOMEHE、柔紅黴素、吖啶、戊基-TOTAB、和丁基-TOTIN。不對稱花青染料可作為多核苷酸特異性染料使用。其他感興趣的染料包括那些描述於下述文獻中染料Geierstanger，B.H.and Wemmer，D.E.，Annu.Rev.Vioshys.Biomol.Struct.1995，24，463-493，by Larson，C.J.and Verdine，G.L.，Bioorganic ChemistryNucleic Acids，Hecht，S.M.，Ed.，OxfordUniversity PressNew York，1996；pp 324-346，和Glumoff，T.andGoldman，A.Nucleic Acids in Chemistry and Biology，2nd ed.，Blackburn，G.M.and Gait，M.J.，Eds.，Oxford University PressOxford，1996，pp375-441。多核苷酸特異性染料可為嵌入式染料，且可以是對雙鏈多核苷酸特異性的。其他染料和螢光團在www.probes.com(MolecularProbes，Inc.)中有描述。
術語「綠色螢光蛋白」指天然的多管水母(Aequorea)綠色螢光蛋白和突變形式，二者均被鑑定能呈現改變的螢光特徵，包括改變的激發和發射最大值，以及不同形狀的激發和發射光譜(Delagrave，S.et al.(1995)Bio/Technology 13151-154；Heim，R.et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9112501-12504；Heim，R.et al.(1995)Nature 373663-664)。Delgrave等人分離了克隆的維多利亞多管水母(Aequorea victoria)GFP突變體，其具有紅移激發光譜。Bio/Technology 13151-154(1995)。Heim，R.等人報導了一個突變體(Tyr66突變為His)，其具有藍色螢光(Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)USA 9112501-12504)。
基質 在一些實施方式中，試驗組分可置於基質上。基質可包括多種材料，不論是生物學的、非生物學的、有機的、無機的，或上述任一種的組合。例如，基質可為聚合的Langmuir Blodgett膜、功能化的玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4，、改性矽、或多種凝膠或聚合物中的任一種，諸如(聚)四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、交聯的聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚乳酸、聚乙醇酸、丙交酯乙交酯共聚物、聚酐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚矽氧烷、聚二氧化矽、乳膠、葡聚糖聚合物、環氧樹脂(epoxies)、聚碳酸酯、或其組合。可使用導電聚合物和光導材料。
基質可為平面結晶的基質，諸如基於二氧化矽的基質(例如玻璃、石英，或類似物)，或例如用於半導體和微處理器工業的結晶基質，諸如矽、砷化鎵、摻雜銦的GaN和類似物，並且包括半導體納米晶體。
基質可採用光電二極體、光電傳感器諸如光電半導體晶片或光電薄膜半導體、或生物晶片的形式。基質上探針的定位可以尋址；這可以通過高度密集的形式完成，且位置可以微米尋址或納米尋址。
二氧化矽氣凝膠也可被用作基質，且可通過本領域已知的方法製備。氣凝膠基質可用作自由直立基質或作為另一種基質材料的表面塗層。
基質可採用任何形式，並且典型地是板、薄片、珠、小球、盤、顆粒、微粒、納米顆粒、鏈、沉澱、任選多孔的凝膠、薄層、管、球、容器、毛細管、墊、片、膜、小片、多孔板或皿、光纖等等。基質可為剛性或半剛性的任意形式。基質可含有凸起或凹陷的區域，試驗組分定位於此。基質表面可使用眾所周知的技術蝕刻，以提供理想的表面特徵，例如溝槽、V-溝、階式(mesa)結構等等。
基質表面可由與基質相同的材料構成或可由不同材料製成，並且可通過化學或物理方法偶聯至基質表面。這些偶聯的表面可由任何材料構成，例如聚合物、塑料、樹脂、多糖、二氧化矽或基於二氧化矽的材料、碳、金屬、無機玻璃、膜、或上述列出的任何基質材料。表面可以任選地為透明的並可具有Si-OH官能性，諸如二氧化矽表面上存在的那些。
可以選擇基質和/或其任選的表面，來為所用的合成方法和/或檢測方法提供適當的特性。基質和/或表面可以是透明的，以允許基質暴露於來自多個方向的光。基質和/或表面可以具有反射「鏡」結構，以增加光的回收。
基質和/或其表面一般地對它在使用中暴露的條件有抗性，或被處理為具有抗性，並且能任選地被處理，以在暴露於這些條件後去除任何抗性材料。
可以使用任何適當的方法，將多核苷酸探針製造在基質上或附著在基質上，例如美國專利No.5,143,854，PCT公開No.WO 92/10092，1990年12月6日提交的美國專利申請No.07/624,120(現已放棄)，Fodoret al.，Science，251767-777(1991)，和PCT公開No.WO 90/15070)中描述的方法。使用機械合成策略合成這些陣列的技術在例如PCT公開No.WO 93/09668和美國專利No.5,384,261中均有描述。
另外的技術包括諸如那些在PCT公開No.PCT/US93/04145中描述的基於珠子的技術，和諸如那些在美國專利No.5,288,514中描述的基於針的方法。
適合將傳感器多核苷酸附著在基質上的其它流動槽和點樣方法在1992年11月20日提交的美國專利申請No.07/980,523和美國專利No.5,384,261中描述。試劑通過以下方法被傳送至基質(1)在預定區域上設定的槽內流動，或(2)在預定區域上「點樣」。在將要保護的基質的部分上可使用諸如親水性或疏水性塗層的保護性塗層(取決於溶劑的性質)，有時與在其他區域有利於反應劑溶液溼潤的其他材料組合。以此種方式，進一步防止了流動的溶液流出指定的流動路徑之外。
典型的分配器包括任選機器控制的微量移液器、噴墨印表機、一套試管、多歧管、一套移液器，等等，以便於將多種試劑先後或同時被傳送至反應區域。
基質或其區域可被編碼，以便可以確定所查詢的位於基質或區域中的傳感器的身份。任何適當的編碼方案都可採用，例如光學碼、RFID標籤、磁性碼、物理碼、螢光碼、和組合碼。
激發和檢測 任何儀器，如果它能夠提供能激發聚集傳感器同時短於待檢測發射波長的波長，都能用於激發。可商購的裝置可提供適當的激發波長以及適當的檢測元件。
激發源的例子包括寬帶UV光源，諸如帶有合適濾光片的氘燈，白光源輸出，諸如經過單色光鏡來提取出所需波長的氙燈或氘燈，連續波長(cw)氣體雷射器，固態二極體雷射器，或任何脈衝雷射器。發射光可通過任何適當裝置或技術來檢測；許多適當的方法在本領域內眾所周知。例如，螢光計或分光光度計可被用於檢測待測樣本在多發色團被激發時是否發出信號發色團所特有的波長的光來。
物質的組合物 還提供了此處描述的任何分子的任何形式的物質組合物。此處描述的多發色團和包含多發色團的複合物可以以純化和/或分離的形式提供。多發色團和包含多發色團的複合物可以以晶體形式提供。
多發色團和包含多發色團的複合物可以在溶液中提供，該溶液可以是主要為水的溶液，其可包含一種或多種此處描述的額外溶液組分，包括但不限於額外的溶劑、緩衝液、生物分子、多核苷酸、螢光團等。多發色團和包含多發色團的複合物在溶液中以一定濃度存在，在該濃度下來自於第一光活性單元的第一發射在不存在生物分子靶標或與其相關的生物分子的情況下可被檢測到。溶液可包含如此處所述的額外的組分，包括標記的探針，諸如螢光標記的抗體或多核苷酸，它們對於一類生物分子靶標或其相關生物分子是特異性的，用於多發色團和包含多發色團的複合物。
多發色團和包含多發色團的複合物可以以膜的形式提供。物質的組合物可通過任何此處描述的性質來要求保護，包括根據提出的結構、通過合成方法、通過吸收和/或發射光譜、通過元素分析、通過NMR光譜、或通過任何其他性質或特徵。
在一些實施方式中，可在樣本中檢測基因的表達。在一個進一步的實施方式中，檢測生物分子靶標或與其相關的生物分子的測量結果可用於診斷患者的疾病狀態。在另一個實施方式中，本發明的檢測方法可進一步包括診斷疾病狀態的方法。在一個相關的實施方式中，診斷疾病的方法可包括檢查和分析關於生物分子靶標或與其相關的生物分子是否存在的數據，並對患者、醫務人員或醫療衛生管理者提出結論，該結論是基於檢查和分析關於疾病診斷的數據而作出的。檢查和分析此類數據可通過使用此處描述的計算機或其他數字裝置和網絡來得到協助。可以預想關於此類數據的信息可通過網絡來傳遞。
在實踐本發明的方法的過程中，任選地使用許多分子生物學的常規技術。這些技術眾所周知且在例如下述的出版物中闡述Ausubel et al.(Eds.)Current Protocols in Molecular Biology，Volumes I，II，and III，(1997)，Ausubel et al.(Eds.)，Short Protocols in Molecular BiologyA Compendiumof Methods from Current Protocols in Molecular Biology，5th Ed.，JohnWiley & Sons，Inc.(2002)，Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，3rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2000)，and Innis et al.(Eds.)PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications，Elsevier Science & Technology Books(1990)，以上所有出版物均在此引入作為參考。
圖22是一個流程圖，顯示了一個代表性邏輯裝置實例，通過該裝置可實現檢查和分析關於本發明的數據。此類數據可與受試者的疾病、紊亂或狀況相關。圖22顯示了一個連接至儀器820的計算機系統(或數字裝置)800，它們與多發色團和多發色團複合物824一起使用，例如用來產生結果。可以把計算機系統800理解為一個可以讀取來自介質811和/或網絡接口805的指令的邏輯裝置，網絡接口805可以任選地連接至具有固定介質812的伺服器809。圖22顯示的系統包括CPU801、磁碟驅動器803、光輸出裝置如鍵盤815和/或滑鼠816和任選的監視器807。可通過示出的通訊介質與當地或遠程的伺服器809實現數據通訊。通訊介質可包括任何傳輸和/或接收數據的手段。例如通訊介質可以是網絡連接、無線連接或網際網路連接。可以預想關於本發明的數據可通過此類網絡或連接來傳輸。
在一個實施方式中，計算機可讀介質包括適合傳輸生物學樣本分析結果的介質。該介質可包括關於患者的疾病狀況或狀態的結果，其中此結果是使用此處描述的方法獲得的。
試劑盒 還提供了包含用於實施所述方法的試劑的試劑盒。
在一些實施方式中，試劑盒包含多種試劑，該試劑包括多發色團或多發色團複合物，生物偶聯物，例如抗體，和其他此處描述的組分。
試劑盒可以任選地含有一種或多種下述物質一種或多種標記物，其可整合到多發色團或多發色團複合物中；和一個或多個基質，其可以含有或不含有陣列，等等。
試劑盒的組分可容納在外包裝中。關於使用試劑盒進行所述方法的說明可與外包裝一起提供，並且可以任何固定介質來提供。說明可放在外包裝內或外包裝以外，並且可印在構成外包裝的任何表面的內部或外部，使得說明清晰可見。試劑盒可以是多重形式，用於檢測一種或多種不同靶標生物分子或與其相關的生物分子。
如此處所述並且如圖23中所示，在一些實施方式中，試劑盒903可包括容器或外包裝902用來容納各種組分。如圖23所示和此處所述，在一個實施方式中，試劑盒903包含一種或多種多發色團或多發色團複合物試劑905，並且任選地提供基質900。如圖23所示和此處所述，試劑盒903可以任選地包括說明901。可以想到試劑盒903的其他實施方式，其中組分包括多種額外的此處描述的物質。
實施例 實施例1. 使用聚合物-染料偶聯的抗體的夾心ELISA方法的總體方案 1.向96孔聚氯乙烯(PVC)微孔板的每孔中加入大約50μL抗體溶液(20μg/mL，在PBS中)，以此使未標記的抗體結合至每孔的底部。PVC將結合大約100ng/孔(300ng/cm2)。使用的抗體量取決於各個試驗。
2.在4℃下過夜孵育微孔板來確保完全結合。
3.用PBS漂洗微孔兩次。
4.微孔板上剩餘的蛋白質結合位點必須通過用封閉緩衝液孵育而達到飽和。向孔中添加含0.02％疊氮化鈉的3％BSA/PBS至頂部。在室溫潮溼氣氛下孵育2小時至過夜。
5.用PBS漂洗微孔兩次。
6.向孔中加入50μL抗原(或樣本)溶液(抗原溶液必須滴定)。所有稀釋須在封閉緩衝液(3％BSA/PBS)中進行。在室溫潮溼氣氛下孵育至少2小時。
7.用PBS洗板四次。
8.加入過量的聚合物-染料-第二抗體偶聯物(實例A或C)或生物素標記的抗體。
9.在室溫潮溼氣氛下孵育2小時或更長時間。
10.更換幾次PBS漂洗。
11.當在步驟8中使用生物素標記的抗體時，加入鏈親和素-聚合物-染料偶聯物(實例B或D，在含有1M NaCl的PBS中)，並且在室溫潮溼氣氛下孵育2小時或更長時間。
12.用ELISA讀板儀在目標波長下測量光密度。
對於定量結果，將未知樣本的信號與標準曲線比較。每次試驗都必須運行標準品以確保準確性。
在該ELISA試驗中，第一抗體分子可結合於微孔板孔的側面和底部。當含有靶標分子的樣本加入到孔中時，固定的第一抗體將僅捕獲這些靶標，而樣本中其餘的組分將被洗去。與常用的螢光標記抗體相比，由於它們更高的集光能力和它們能獲得更好能量傳遞效率的同一分子內設計，所述的聚合物-染料-第二抗體偶聯物可發出比常規方案更強的信號(10-100倍)。這些優點也可以轉化為具有更高靈敏度的測定。當進一步把聚合物-染料-第二抗體偶聯物與其他具有信號放大功能部分的第二抗體(例如辣根過氧化物酶標記的抗體)相比，聚合物-染料-第二抗體偶聯物可提供一步過程(無需額外的酶底物)來達到信號放大的目的。也可以預期所述偶聯物的成本效率(無論是時間還是材料)具有更好的市場接受性。
實施例2. 用聚合物-染料偶聯的抗體標記的微陣列的總體方案 1.製備總RNA或mRNA。
2.使用T7-oligo(dT)引物來實現一步循環或兩步循環cDNA合成。
3.清洗雙鏈cDNA。
4.使用IVT(體外轉錄)擴增試劑盒將生物素標記的核糖核苷酸整合到cRNA中。
5.將cRNA片斷化。
6.在晶片上雜交cRNA片斷。
7.洗掉殘餘的cRNA，並且用鏈親和素-聚合物-染料偶聯物(實例B或D)對晶片染色。
8.洗掉晶片上殘餘的試劑。
9.掃描微陣列。
在微陣列方法學的常規實踐中，將生物素標記的核苷酸整合至cRNA序列中是隔離鏈親和素藻紅蛋白偶聯物和生物素化抗鏈親和素抗體用於放大的信號報告的手段。由於鏈親和素藻紅蛋白偶聯物生產的複雜性，批間差異是顯著的。因此，鏈親和素-聚合物-染料偶聯物可為鏈親和素藻紅蛋白偶聯物的一個非常好的替代物。況且，此前的出版物已經證明，通過它的集光和能量傳遞功能部分，多發色團可將螢光信號放大高達75倍。有理由預期，鏈親和素-聚合物-染料偶聯物可具有等同於或優於藻紅蛋白的表現。
本發明優選的實施方式已經在此顯示並描述，但是本領域技術人員應當明了這些實施方式只是作為例子提供。在不背離本發明的前提下本領域技術人員將會想到許多變動、變化和替代。應當理解在實施本發明中可採用此處描述的本發明實施方式的多種替代方案。可以預期下面的權利要求限定了本發明的範圍，因此涵蓋這些權利要求的範圍內的方法和結構以及它們的等同物。
實施例3. 具有胺官能團的陽離子偶聯聚合物CA001的合成
1-(4』-鄰苯二甲醯亞氨基丁氧基)-3，5-二溴苯在己烷中再結晶3，5-二溴苯酚(970mg，3.85mmol)。去除溶劑後，加入N-(4-溴丁基)鄰苯二甲醯亞胺(1.38g，4.89mmol)、K2CO3(1.88g，13.6mmol)、18-冠-6(53mg，0.20mmol)和丙酮(20mL)。回流1小時，然後倒入100mL水中。使用二氯甲烷(4×30mL)萃取水相。合併有機相，用水、飽和NaHCO3和鹽水洗滌，然後用MgSO4乾燥，過濾。溶劑的去除產生白色固體，通過柱層析(4∶1己烷∶CH2Cl2)純化，接著在己烷中再結晶，產生無色針狀物(650mg，87％)。1H NMR(CDCl3)7.860(m，2H)；7.733(m，2H)；7.220(t，J＝1.6Hz，1H)；6.964(d，J＝2.0Hz，2H)；3.962(t，J＝6.0Hz，2H)；3.770(t，J＝6.6Hz，2H)；1.846(m，4H)。

[(2，7-{9，9-二(4』-(磺酸鈉)丁基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亞苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(4』-(磺酸鈉)丁基)}芴-交替共聚-3，5-1-{4』-鄰苯二甲醯亞胺基丁氧基)亞苯基)]共聚物在一個100mL的裝備有水套回流冷凝器的圓底燒瓶中，2，7-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)-9，9-二(6′-溴己基)芴(1.001g，1.34mmol)、1，4-二溴-2，5-二氟苯(346.6mg，1.274mmol)、1-(4』-鄰苯二甲醯亞胺基丁氧基)-3，5-二溴苯(30.8mg，0.068mmol)、碳酸鉀(2.15g，15.5mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(37.2mg，0.032mmol)在THF(45mL)和水(15mL)中的溶液經由四個冷凍-抽氣-融解循環脫氣，在第三和第四輪脫氣後引入氬。然後將溶液在氬氣氛下加熱回流48小時。冷卻後，將溶液滴加至40mL攪拌的甲醇中，以沉澱聚合物，離心收集。然後用甲醇潷析和洗滌(兩次)以去除低分子量組分，產生淺黃色蓬鬆粉末(500mg，62％)。1H NMR(CD2Cl2)7.912-7.419(m，8H)；3.322(t，J＝7.4Hz，4H)；2.120(br s，4H)；1.693(t，J＝7.0Hz，4H)；1.237(br s，4H)；1.153(br s，4H)；0.788(br s，4H).Mn 17K，PDI 2.1。
[(2，7-{9，9-二(6』-(N，N，N-三甲基溴化銨)己基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亞苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(6』-(N，N，N-三甲基溴化銨)己基)}芴-共聚-alt-3，5-1-{4』-鄰苯二甲醯亞胺基丁氧基)亞苯基)]共聚物將三甲胺(1mL)減壓濃縮至[(2，7-{9，9-二(6』-溴己基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亞苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(6』-溴己基)}芴-共聚-alt-3，5-1-{4』-鄰苯二甲醯亞胺基丁氧基)亞苯基)]共聚物(130mg，0.215mmol)在THF(10mL)中的溶液中。將溶液攪拌24h，此時聚合物從溶液中沉澱出來。加入甲醇(50mL)溶解聚合物，然後另外1mL的三甲胺減壓濃縮至反應瓶中。再攪拌24小時，然後在減壓狀態下去除所有溶劑和多餘的三甲胺，產生淡黃色膜(140mg，90％)。1H NMR(D2O)7.871-7.423(m，8H)；3.148(m，4H)；2.970(br s，18H)；2.116(br s，4H)；1.525(br s，4H)；1.119(br s，8H)；0.681(br s，4H)。
CA001，[(2，7-{9，9-二(6』-(N，N，N-三甲基溴化銨)己基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亞苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(6』-(N，N，N-三甲基溴化銨)己基)}芴-交替共聚-3，5-1-{4』-氨基丁氧基)亞苯基)]共聚物將肼一水合物(73.1mg，1.46mmol)、[(2，7-{9，9-二(6』-(N，N，N-三甲基溴化銨)己基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亞苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(6』-(N，N，N-三甲基溴化銨)己基)}芴-交替共聚-3，5-1-{4』-鄰苯二甲醯亞胺基丁氧基)亞苯基)]共聚物(100mg，0.137mmol)在甲醇(10mL)中的溶液回流5小時。冷卻至室溫後，向溶液中加入0.9mL 1M HCl，然後再回流2小時。產生的溶液在50％甲醇水溶液中透析，然後蒸發至幹。
確定了一種評估功能化單體整合至最終聚合物結構中的方法。在聚合反應過程中胺官能團作為鄰苯二甲醯亞胺被保護以防止催化劑汙染。該保護基在紅外(IR)光譜中具有獨特的特徵，在圖24中顯示為實線。顯示的峰對應於僅有鄰苯二甲醯亞胺保護基才呈現的獨特的C＝O峰。鄰苯二甲醯亞胺基後續的脫保護(產生自由的胺)產生CA001 IR特徵，缺少鄰苯二甲醯亞胺的特徵C＝O峰(虛線，圖24)，顯示可用於偶聯的活性胺。
CA001的光譜顯示於圖25中，其中實線表示吸光度，虛線表示發射光譜。
實施例4. 陽離子偶聯聚合物-FAM偶聯物CA001-FAM的合成 脫保護的聚合物CA001(具有自由胺)與琥珀醯亞胺酯FAM，5(6)FAM-SE(Invitrogen，#C1311)反應，該反應採用www.invitrogen.com(最後一次瀏覽日期10/04/07)的方案的修改方案。作為陰性對照，相同聚合物與螢光素(無反應基團)在相同反應條件下孵育。這個步驟的方案如下。
NHS-FAM與CA001的偶聯 目的 用NHS-FAM將CA001生物素化，並證明向共價偶聯的染料的FRET。
材料 螢光計，具有UV可穿透的比色杯 UV-可見光儀器 純化的CA001 NHS-FAM(Invitrogen#C-1311) 0.5M NEt3(母液(7.2M)NEt3的1∶14稀釋液) MC30過濾器 步驟 1.用10倍XS的NH-FAM至胺-聚合物中建立反應。每10uL反應液使用50ug聚合物和8.0ug NHS-FAM 2.當除染料外的所有試劑都混合後，在DMSO中以130uL無水DMSO/mg染料溶解1-2毫克染料。溶解後立即使用NHS-試劑。
3.在熱模塊上25℃孵育30min。
4.在90M1T中稀釋(10uL於400ul中) 5.用MC30脫鹽兩次 6.用UV/可見光分析濃度 產生的每個反應產物的螢光光譜顯示於圖26中。陽性對照產生的螢光顯示為實線。當聚合物被激發時，發生向受體染料(現在已共價結合至聚合物)的FRET，導致強烈的螢光發射。陰性對照產生的螢光顯示為虛線。因為陰性對照的螢光素無法結合聚合物，當聚合物被激發時，不發生FRET，只觀測到聚合物發射。這些數據表明CA001上的胺可用於偶聯。
實施例5. 生物素化偶聯聚合物生物素基-CA001的合成
使用來自於Pierce的NHS-生物素連接體(#20217)，將CA001上的胺官能團轉換為生物素官能團。這個步驟的方案根據可見於Pierce網站www.piercenet.com(最後一次訪問日期09/23/2007)的Pierce方案改良。這個步驟的方案類似地沿用實施例12中所述的方案。
實施例6. 通過生物素基-CA001、親和素DN和生物素基-螢光素放大信號的步驟 目的 使用生物素基-CA001、親和素DN和生物素基-螢光素，證明經由FRET的螢光素信號放大。
材料 NanoDrop螢光計 Perkin-Elmer螢光計，型號PE-LS55 UV-可穿透的1-ml塑料比色杯 移液器+吸頭 生物素基-CA001(BCA) CA001(CA) 生物素基-螢光素(BFL) 親和素DN(ADN) TBS 步驟 1.在一個Eppendorf試管中，混合下表中列出的試劑。確保最後添加AND並且在添加DNA之前混勻其他試劑。在螢光計測量之前將混合物稀釋100倍，對於Nanodrop是將1uL加至100uL，對於臺式螢光計是將10uL加至1mL。
2.在488nm直接激發螢光以及通過在380nm激發聚合物經由FRET間接激發。
3.在相關波長下採集關於峰高度的數據。從峰高度中減除背景，包括這些來源。
3a)僅有緩衝液的對照。
3b)從FRET至螢光素峰的聚合物峰尾(～5％)。
實施例7. 對生物素基-CA001、親和素DN和生物素基-螢光素放大信號的分析 圖27A顯示了CA001的生物素化。胺聚合物CA001(生物素基聚合物的前體)不結合親和素，並且作為陰性對照聚合物。圖27B示意性地描述了該試驗。生物素化染料和聚合物通過生物素-親和素結合被特異性地結合在一起。陰性對照聚合物(胺聚合物CA001，標註為CA)不結合親和素。圖27C顯示了沿用上述方案(實施例6)進行的試驗產生的螢光光譜。虛線顯示了在含有親和素DN(AvDN)和生物素化螢光素(B-F1)的溶液中非特異性聚合物(CA)在380nm激發時的螢光光譜。僅觀測到聚合物的發射，以420nm為中心。實線顯示的是在含有親和素DN(AvDN)和生物素化螢光素(B-F1)的溶液中生物素化聚合物(BCA)在380nm激發時的螢光光譜。觀測到強烈的能量傳遞，引起來自於螢光素的額外發射，以530nm為中心。僅生物素基-CA001發生FRET，意味著供體生物素基-CA 001和受體螢光素通過生物素-親和素結合被拉近至較近的距離。這就證實了沿用Pierce步驟(實施例5)的CA001的生物素化。染料在488nm的直接激發顯示為虛線。比較虛線和實線揭示出間接激發(經由FRET)比直接激發，染料信號放大了19倍。
實施例8. 具有羧酸酯官能團的陽離子偶聯聚合物前體CC001的合成
[(2，7-{9，9-二(6』-溴己基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亞苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(6』-溴己基)}芴-共聚-alt-3，5-1-{7』-乙酯庚氧基)亞苯基)]共聚物在一個裝備有水套回流冷凝器的50mL圓底燒瓶中，2，7-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)-9，9-二(6′-溴己基)芴(500mg，0.670mmol)、1，4-二溴-2，5-二氟苯(173.2mg，0.637mmol)、1-(7』-乙酯庚氧基)-3，5-二溴苯(13.6mg，0.033mmol)、碳酸鉀(1.12g，8.12mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(21mg，0.018mmol)在THF(15mL)和水(5mL)中的溶液經由四個冷凍-抽氣-融解循環脫氣，在第三和第四輪脫氣後引入氬。然後將溶液在氬氣氛下加熱回流48小時。冷卻後，將溶液滴加到40mL攪拌的甲醇中以沉澱聚合物，離心收集。然後用甲醇潷析和洗滌(兩次)來去除低分子量組分，產生淺黃色、蓬鬆粉末。1H NMR(CD2Cl2)7.887-7.406(m，8H)；3.322(t，J＝6.6Hz，4H)；2.080(br s，4H)；1.710(t，J＝7.0Hz，4H)；1.269(br s，4H)；1.158(br s，4H)；0.799(br s，4H).Mn 39.5K，PDI 2.1。
IR光譜用於評估功能化單體向最終聚合物結構中的整合。在聚合反應過程中羧酸官能團作為酯被保護以防止催化劑汙染。該保護基在紅外(IR)光譜中具有獨特的特徵，如圖28所示。顯示的峰對應於僅有羧酸酯保護基才呈現的獨特的C＝O峰。圖28中的虛線對應於單體的IR光譜，而實線對應於聚合物的IR光譜。在兩種情況中，都觀測到羧酸酯的峰，表明功能性單體的整合。
實施例9. 具有胺官能團的陰離子偶聯聚合物AA003的合成
[(2，7-{9，9-二(4』-(磺酸鈉)丁基)}芴-共聚-alt-1，4-{2，5-二氟}亞苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(4』-(磺酸鈉)丁基)}芴-共聚-alt-3，5-1-{4』-鄰苯二甲醯亞胺基丁氧基)亞苯基)]共聚物在一個100mL的裝備有水套回流冷凝器的圓底燒瓶中，2，7-二溴-9，9-二(4′-(磺酸鈉)丁基)芴(129.5mg，0.202mmol)、1，4-二硼酸(37.4mg，0.225mmol)、1-(4』-鄰苯二甲醯亞胺基丁氧基)-3，5-二溴苯(10.4mg，0.023mmol)、碳酸鉀(366mg，2.65mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(8.8mg，0.008mmol)在DMF(20mL)和水(20mL)中的溶液經由四個冷凍-抽氣-融解循環脫氣，在第三或第四輪脫氣後引入氬。然後將溶液在氬氣氛下加熱回流48小時。在反應進程中，形成黑色沉澱。冷卻後，去除溶液並用丙酮洗滌沉澱，產生棕色粉末。1H NMR(DMSO)7.910-7.597(m，10H)；2.206(br s，8H)；1.400(br s，4H)；0.668(brs，4H).IR1696cm-1，表明為被保護的胺(鄰苯二甲醯亞胺)。
AA003，[(2，7-{9，9-二(4』-(磺酸鈉)丁基)}芴-共聚-alt-1，4-{2，5-二氟}亞苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(4』-(磺酸鈉)丁基)}芴-共聚-alt-3，5-1-{4』-氨基丁氧基)亞苯基)]共聚物將肼一水合物(29.9mg，0.598mmol)和[(2，7-{9，9-二(4』-(磺酸鈉)丁基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亞苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(4』-(磺酸鈉)丁基)}芴-交替共聚-3，5-1-{4』-氨基丁氧基)亞苯基)]共聚物(45mg，0.081mmol)在50％甲醇/水(5mL)中的溶液回流5小時。冷卻至室溫後，用1M HCl調節溶液的pH至3，然後回流另外2小時。冷卻並轉移至15mL Falcon管中後，用下述方案純化AA003。
純化脫保護的AA003 目的 富集胺活化的陰離子聚合物 材料 UV-可穿透的1-mL塑料比色杯 離心機 UV-可見光分光光度計 移液器+吸頭 NaOH，1.0M，0.1mL NaOH，10M 10uL H2O90uL 粗AA003 90％MeOH，1％T20(90M1T，50mL) MC30過濾器 步驟 1.分選組分 1a)如果有一層膜襯在試管內部(沉澱的聚合物)，把上清液倒入一個新試管中。用移液器吸頭徹底去除所有上清液，置於一邊。
1b)處理襯在試管內的膜(ppt) i.加入0.5mL水並用石蕊檢測pH。如果需要，通過添加NaOH(開始用1-5uL 0.1M NaOH，然後更實際地，用1.0M NaOH)、混合、沉澱(pellet)、石蕊檢測，中和至pH～7-8。重複幾個添加-混合-沉澱-檢測pH試驗循環，直至pH保持於8。
ii.去除水萃取物，並放置在一個1.5mL離心管中。
iii.在14krcf下離心2』。保留上清和沉澱物。
iv.將沉澱物凍幹。
1c)處理來自於步驟1a)的上清液 i.取0.5mL上清液(通常是懸浮液)並放在一個1.5mL離心管中。
ii.用石蕊測pH並記錄pH。
iii.如上述步驟1b1一樣中和至pH～7-8。
iv.在14krcf下離心2』。
v.從沉澱物中分離上清液，保留兩者。
vi.將沉澱物凍幹。
vii.在最小量的無水DMSO中重新懸浮沉澱物。
viii.在水中進行UV/可見光光譜測量，並記錄吸光度，使用有效的消光係數計算所有組分的濃度。
2.用MC30脫鹽。
AA003的光學光譜顯示於圖29中，其中實線表示吸光度，虛線表示發射光譜。脫保護的聚合物AA003(有一個自由胺)與一個琥珀醯亞胺酯FAM，5(6)FAM-SE(Invitrogen，#C1311)反應，反應方案由來自www.invitrogen.com(最後一次瀏覽日期10/04/07)的方案修改。作為陰性對照，相同聚合物與螢光素(無反應基團)在相同反應條件下孵育。這個步驟的方案類似地沿用實施例4的方案。
實施例10. 具有馬來醯亞胺官能團的陰離子偶聯聚合物AA003-M01的合成
多發色團上的胺官能團可使用雙功能連接體如GMBS轉化成其他官能團。採用此策略來將AA003轉化成AA003-M01。這個步驟的方案是對可見於Pierce網站www.piercenet.com(最後一次訪問日期09/23/2007)的Pierce方案的改良。使用的方案如下。
將GMBS偶聯至AA003 目的 用GMBS將AA003功能化來產生馬來醯亞胺部分 材料 離心機 UV-可見光分光光度計 UV-可穿透的1-mL比色杯 移液器+吸頭 AA003 GMBS(Pierce#22309) 90％MeOH，1％T20(90M1T，50mL) DMSO NEt3 MC30過濾器 步驟 1.用馬來醯亞胺使AA003功能化，下面是使用的量 1a)對於40X XS，使用0.3mM聚合物和12mM GMBS。這意味著3.0nmol聚合物/10uL反應液如下 2.當除連接體以外所有試劑都混合後 2a)在DMSO中溶解GMBS(在溶解後不要立刻使用GMBS) i.120mM GMBS＝3.4mg/0.1mL DMSO，或30uL/mg 2b)在熱模塊上25℃孵育30min。檢查澄清度。
3.用MC30去除XS GMBS 3a)在加至MC杯之前，稀釋DMSO到＜5％ 3b)分別合併每個反應w/400uL 90M1T 3c)加至杯中 3d)以14k rcf離心10min 3e)通過估計滯留物體積來確定是否需要離心更長的時間 3f)棄掉濾液 3g)再加入400uL 90M1T並且重複離心 3h)如果滯留物看上去近乎乾燥，加入20uL 90M1T並在杯中稍許振蕩 3i)顛倒並離心收集滯留物 3j)測量最終滯留物體積＝______uL 3k)通過UV-可見光來確定濃度，然後在0.5X 90M1T中調整最終濃度至25uM。
實施例11. 陰離子偶聯聚合物-螢光素偶聯物AA003-M01-F1的合成 採用來自www.invitrogen.com(最後一次訪問日期10/04/07)的修改方案，通過與SAMSA-螢光素(Invitrogen)反應，來檢測AA003-M01上的馬來醯亞胺官能團的硫醇反應性。AA003用作陰性對照。修改的方案如下。
對馬來醯亞胺的SAMSA試驗 目的應用10X XS SAMSA-螢光素至AA003-M01，來確定AA003-M01具有活性馬來醯亞胺部分 材料 離心機 UV-可穿透的1-mL比色杯 螢光計，型號PE-LS55 移液器+吸頭 磷酸鉀，0.5M，pH 7.0，0.2mL K2HPO4，1M62uL KH2PO4，1M39uL H2O 100uL HCl，6M，0.2mL H2O 0.1mL HCl，12M 0.1mL NaOH，0.1M，1mL NaOH，10M 10uL H2O990uL AA003 AA003-M01 SAMSA-螢光素(Invitrogen，產品A685) MC30過濾器 步驟 1.製備1.0mM脫保護的SAMSA 1a)溶解1.0mg SAMSA於95uL 0.1M NaOH中(20mM SAMSA) 1b)室溫孵育15min來去除乙醯基保護基 1c)用6M HCl1.4uL/mg SAMSA中和(20mM SAMSA) 1d)用20uL 0.5M磷酸鈉，pH 7/mg SAMSA緩衝(16mMSAMSA) 1e)用水稀釋16倍至1.0mM SAMSA 2.加入以下物質建立反應 2a)對於AA003-M01添加10uL 1.0mM脫保護的SAMSA至10uL 25uM AA003+GMBS(3.k+G來自於實施例10中的方案)中 2b)對於AA003添加10uL 1.0mM脫保護的SAMSA至10uL25uM AA003-GMBS(3.k-G來自於實施例10中的方案)中 3.在熱模塊上25℃孵育30min 4.用MC30去除XS SAMSA 4a)在加至MC杯之前，稀釋DMSO到＜5％ 4b)分別合併每個反應w/400uL 90M1T 4c)加至杯中 4d)以14k rcf離心10min 4e)通過估計滯留物體積來確定是否需要離心更長的時間 4f)棄掉濾液 4g)再加入400uL 90M1T並且重複離心 4h)如果滯留物看上去近乎乾燥，加入20uL 90M1 T並在杯中稍許振蕩 4i)顛倒並離心收集滯留物 5.在488和380下激發來自步驟4.i的AA003-M01和AA003，分析螢光。
圖30C顯示了該試驗的結果。AA003-M01(圖30B，標註為馬來醯亞胺功能化聚合物)和陰性對照聚合物(無馬來醯亞胺，AA003，圖30A，標註為陰性對照聚合物)與硫醇化的螢光素(SAMSA-螢光素)按照上述步驟反應。馬來醯亞胺功能化的聚合物AA003-M01與硫醇化螢光素反應，並且變成與該螢光素共價結合，確保了在供體聚合物和受體染料之間固定的距離。由此，聚合物的激發導致了向受體染料的FRET，並且觀測到強烈的染料發射(圖30C，實線)。陰性對照不與螢光素共價結合，並且當聚合物被激發時，僅觀測到聚合物的發射(圖30C，虛線)。
實施例12. 生物素化陰離子偶聯聚合物生物素基-AA003的合成
使用可獲自Pierce(#20217)的NHS-生物素連接體，將AA003上的胺官能團轉換成生物素。該步驟的方案是對可見於Pierce網站www.piercenet.com(最後訪問日期09/23/2007)的Pierce方案的改良。使用的方案如下。
將NHS-生物素偶聯至AA003的步驟 目的 用NHS-生物素將AA003生物素化 材料 螢光計，具有UV可穿透的比色杯 UV-可見光分光光度計 純化的AA003(AA3) NHS-生物素(Pierce#20217) 0.5M NEt3(母液(7.2M)NEt3的1∶14稀釋液) DMSO MC30過濾器 步驟 1.建立反應，0.5mM聚合物和20mM NHS-生物素 2.當除生物素以外的所有組分都混合後，在DMSO中以15uL無水DMSO/mg NHS-生物素的量(或1.7mg/0.025mL；200mM)溶解1-2mg NHS-生物素。溶解後立即使用NHS-試劑。
3.在熱模塊上25℃孵育30min。
4.於90M1T中1∶100稀釋(1uL加至100uL，或4uL加至400uL) 5.用MC30脫鹽，兩次 6.用UV/可見光分析濃度 實施例13. 由生物素基-AA003和親和素D-螢光素放大信號的步驟 目的 證明使用生物素基-AA003和親和素D-螢光素經由FRET產生的特異性螢光信號。
材料 螢光計(NanoDrop或Perkin-Elmer PE-LS55) UV-可穿透的塑料1-mL比色杯 移液器+吸頭 生物素基-AA003(BAA) AA003(AA) 親和素D-螢光素(A-F1) TBS 步驟 1.在一個eppendorf管中，混合列於下表中的試劑。孵育五分鐘，然後在螢光計測量之前將該混合物稀釋100倍，對於NanoDrop是將1uL加至100uL，對於臺式螢光計是將10uL加至1mL。
2.在488nm處直接激發A-F1以及通過在380nm處激發聚合物經由FRET間接激發。
3.在相關波長下採集關於峰高度的數據。從峰高度中減除背景，包括這些來源。
3a)僅緩衝液的對照 3b)從FRET到螢光素峰的聚合物峰尾(～5％)。
實施例14. 由生物素基-AA003和螢光素標記的親和素D引起的信號放大的分析 該試驗的步驟在實施例13中描述。該試驗的示意圖顯示於圖31B中。生物素基-AA003(參見圖31A，標註為生物素基聚合物)與螢光素標記的親和素D孵育。作為陰性對照，胺聚合物AA003(參見圖31A，標註為陰性對照聚合物)以同樣方式與螢光素標記的親和素D孵育。在每種情況下，聚合物被激發，並且觀測到螢光素髮射。對於陰性對照AA003，僅觀測到聚合物的發射(以420nm為中心)，而對於生物素基-AA003，觀測到強烈的染料發射。
該試驗的結果顯示於圖32A-B中。用每個親和素含4個染料的親和素D檢測生物素基-AA003。也記錄來自於對照聚合物和單獨的染料的信號，並且顯示於圖32A-B中。圖32A顯示了產生的螢光光譜。來自於該數據集的在523nm處的染料信號總結於圖32B中。
這些數據表明，該螢光素信號(在523nm處)在聚合物存在的情況下被放大了(圖32A，左側，實線對比虛線光譜，和右側，生物素基-AA003對比單獨的染料)，並且觀測到的信號是由於特異性的聚合物-親和素D複合物(圖32A，左側，實線對比虛線光譜，和右側，生物素基-聚合物對比對照)。胺聚合物對照(無生物素)不能結合親和素，並且由此觀測到最小的能量傳遞(88％特異性)。特異性定義為1-(對照信號/特異性染料信號)。右圖顯示了在有或無聚合物條件下以及陽性和陰性對照樣本之間染料信號的不同。圖32B顯示的數據是對緩衝液和聚合物尾產生的信號校正後的。聚合物尾在523nm處的貢獻是聚合物在419nm處峰高的5％。
實施例15. 不同染料親和素D比的放大效果 測試了聚合物與染料的不同比例。這是用來自於VectorLaboratories的、每個親和素平均含有0.8、1.5和4個螢光素染料的親和素D偶聯物來評估的。當染料數目增加時，聚合物和染料之間的消光係數(吸光度)比就減少。因此對於這套螢光素標記的親和素D，預測在含有最少數目染料的親和素偶聯物上觀測到最佳放大值。在每個親和素D兩當量聚合物時聚合物濃度保持恆定。
圖33A-B顯示的數據表明預計依賴於聚合物與染料的比例。在恆定的聚合物和親和素濃度下，通過增加每親和素D上染料的數目，該比例會發生變化。數據表明當染料親和素比從0.8增加至4時，染料信號強度增加(圖33A)，而觀測到的放大作用下降(圖33B)。當染料數目增加時，由於較高吸光度以及較高的螢光引起的直接染料信號也增加(灰色條，圖33A)。
實施例16. 能在405nm激發的具有胺官能團的陰離子偶聯聚合物AA002的合成
[2，7-{9，9-二(1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)))}-交替共聚-(2，7-{9，9-二(4』-(磺酸鈉)丁基)}芴-共聚-2，7-{9，9-二(1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)))}-交替共聚-3，5-1-{4』-鄰苯二甲醯亞胺基丁氧基)亞苯基)]共聚物在48mL Schlenck試管中，2，7-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)-9，9-二(1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)))氟(120.1mg，0.150mmol)、2，7-二溴{9，9-二(4』-(磺酸鈉)丁基)}芴(91.3mg，0.143mmol)、1-(4』-鄰苯二甲醯亞氨基丁氧基)-3，5-二溴苯(3.7mg，0.0082mmol)、碳酸鉀(234mg，1.7mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(6.2mg，0.0054mmol)在DMF(3.8mL)、THF(2.5mL)和水(2.5mL)中的溶液通過用氬噴射20分鐘脫氣。該溶液然後在氬氣氛下加熱至85℃，3天。將溶液滴加至攪拌的丙酮中，產生深褐色固體。該固體然後與甲醇一起攪拌，過濾收集，並且去除溶劑，產生亮黃色固體。1H NMR(DMSO)8.055-7.828(m，12H)；3.558-3.293(m，24H)；3.188(m，12H)；2.217-2.161(m，8H)；1.417(br s，4H)；0.664(br s，4H)。Bimodal，Mn 7.3K，PDI 1.02，和Mn 49K，PDI 1.2。
然後使用與實施例9所述類似的步驟，將該聚合物去保護並且純化產生AA002。AA002的光學光譜顯示於圖34，其中實線表示吸收，虛線表示發射光譜。
實施例17. 生物素化偶聯聚合物-生物素基-AA002的合成
生物素基-AA002 使用來自於Pierce(#20217)的NHS-生物素連接體，將AA002上的胺官能團轉換成生物素官能團。這個步驟的方案由Pierce方案改進而成，可見於Pierce網站www.piercenet.com(最後一次訪問日期09/23/2007)。這個步驟的方案類似地遵循實施例12所述。
實施例18. 不同聚合物親和素D比的放大效果 螢光素標記的親和素D，或親和素D-F1(每個親和素0.8個染料)，維持在一個恆定濃度，與一系列濃度增加的從0至8當量的生物素基-AA002孵育。圖35A中示意性地顯示了生物素基-AA002的頭兩個當量。對於每個比例，記錄直接和間接激發(經由FRET)的染料螢光。當聚合物與染料的比例增加時，由直接激發產生的信號維持相當恆定，而由間接激發產生的信號增加，如圖35B所示，該圖是作為AA002與親和素D-F1之比的函數的螢光素髮射圖。此種信號增加大致在生物素基-AA002的四個當量時達到平臺期，這與親和素D上所有生物素結合位點被佔據相一致。
這些數據與生物素基-AA002與螢光素標記的親和素D之間的特異性結合相一致。觀測到了較高的信號放大，其平臺期在聚合物的四個當量時，表示所有可用的生物素結合位點都被佔據。
實施例19. 染料信號的靜電放大 如圖36B示意性顯示，染料標記的蛋白質(Cy3-標記的IgG和螢光素標記的BSA)各自獨立地與陽離子聚合物PFP-2F孵育(參見圖36A)。在聚合物和每個染料標記的蛋白質之間發生了非特異性靜電結合。每個溶液都在380nm處激發，並且收集發射光譜。將這些光譜與直接激發染料收集的發射光譜進行比較，如圖36C所示，顯示出Cy3標記的IgG有30倍的放大，螢光素標記的BSA有25倍的放大。使用的Cy3標記的IgG是一種抗洋地黃毒苷抗體，其用來靶向洋地黃毒苷標記的抗體。
本發明優選的實施方式已經在此顯示並描述，但是本領域技術人員應當明白這些實施方式僅以實施例的方式提供。本領域技術人員將會想到在不偏離本發明的情況下進行多種變化、改變和替換。應當理解在實踐本發明中可以採用此處描述的本發明實施方式的多種替代形式。可以預期下述的權利要求書限定了本發明的範圍，並且因此涵蓋這些權利要求範圍內的方法和結構和它們的等同物。
權利要求
1.一種測定方法，包括
提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；
提供與信號發色團偶聯並且能夠與靶標生物分子相互作用的傳感器；
提供偶聯的聚合物，該聚合物選自
其中該聚合物與該傳感器靜電相互作用並且在激發後能夠傳遞能量至該傳感器信號發色團；
在傳感器能夠與可能存在的靶標生物分子結合的條件下，在溶液中將樣本與所述傳感器和所述多發色團接觸；
向樣本施加能夠激所述發多發色團的光源；和
檢測是否從信號發色團發出光。
2.權利要求1的方法，其中所述R基團是磺酸基團。
3.權利要求1的方法，其中所述傳感器是一種生物分子。
4.權利要求3的方法，其中所述生物分子是抗體。
5.權利要求1的方法，其中所述傳感器包含與多個信號發色團偶聯的多個傳感器，其中在從多發色團能量傳遞後，所述多個發色團中的至少兩個發射不同波長的光。
6.一種多發色團複合物，包含
偶聯至至少一個生物分子上的多發色團，該生物分子選自傳感器生物分子、生物偶聯物和靶標生物分子，其中該多發色團進一步偶聯至信號發色團上，並且其中該多發色團包含結構
其中CP1、CP2、CP3和CP4是任選取代的偶聯的聚合物區段或寡聚結構，它們彼此相同或不同。
7.權利要求6的多發色團，其中偶聯的聚合物是一種陽離子偶聯聚合物。
8.權利要求6的多發色團，其中偶聯的聚合物是一種陰離子偶聯聚合物。
9.權利要求6的多發色團，其中偶聯的聚合物是一種電荷中性的偶聯聚合物。
10.權利要求6的多發色團，其中CP1、CP2、CP3和CP4是芳香族重複單元，選自苯、萘、蒽、芴、噻吩、呋喃、吡啶和噁二唑，每個任選地被取代，並且其中CP3和CP4可含有一個或多個通過連接體連接的獨特生物偶聯位點。
11.權利要求6的多發色團，進一步包含選自馬來醯亞胺、硫醇、琥珀醯亞胺酯(NHS酯)、胺、疊氮化物化學、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺鹽酸鹽、磺基-SMCC(磺基琥珀醯亞胺基4-[N-馬來醯亞胺甲基]環己烷-1-羧酸酯)、胺/BMPH(N-[β-馬來醯亞胺丙酸]醯肼·TFA)、以及磺基-SBED磺基琥珀醯亞胺基[2-6-(生物素醯氨基)-2-(對-疊氮基苯甲醯氨基)-己醯氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯的生物偶聯物位點。
12.權利要求6的多發色團，其中該多發色團包含結構
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
13.權利要求6的多發色團，其中該多發色團包含結構
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
14.權利要求12或13的多發色團，其中1和2選自具有下述結構的a-g連接基團
*＝用於共價連接至不飽和骨架的位點
3為具有如下結構的基團h
L＝連接體
A＝生物偶聯位點
*＝用於共價連接至不飽和骨架的位點。
15.權利要求12或13的多發色團，進一步包含如下結構
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
16.權利要求12或13的多發色團，進一步包含如下結構
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
17.權利要求12或13的多發色團，進一步包含如下結構
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
18.一種用於鑑定靶標生物分子的多發色團複合物，包含
多發色團，
共價連接至該多發色團的傳感器生物分子，
共價連接至該多發色團的信號發色團，其中該信號發色團能夠接收在多發色團激發時來自多發色團的能量，並且該傳感器生物分子能夠與靶標生物分子相互作用。
19.權利要求18的多發色團複合物，其中所述信號發色團和所述傳感器生物分子均通過多個連接體共價連接至該多發色團。
20.權利要求18的多發色團複合物，其中所述信號發色團和所述傳感器生物分子均通過一個三官能化連接體共價連接至該多發色團，該三官能化連接體共價結合該多發色團、該信號發色團和該傳感器生物分子。
21.權利要求18的多發色團複合物，其中所述連接體包含選自馬來醯亞胺/硫醇、琥珀醯亞胺酯(NHS酯)/胺、疊氮化物化學、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺鹽酸鹽)/胺、胺/磺基-SMCC(磺基琥珀醯亞胺基4-[N-馬來醯亞胺甲基]環己烷-1-羧酸酯)/硫醇、和胺/BMPH(N-[β-馬來醯亞胺基丙酸]醯肼·TFA)/硫醇的連接化學。
22.權利要求18的多發色團複合物，其中該多發色團是偶聯的聚合物。
23.權利要求18的多發色團複合物，其中所述偶聯的聚合物是聚陽離子偶聯的聚合物。
24.一種測定方法，包括
提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；
提供包含多發色團、共價連接的信號發色團和共價連接的傳感器生物分子的多發色團複合物，其中信號發色團能夠接收在多發色團激發時來自於多發色團的能量，並且傳感器生物分子能夠與靶標生物分子相互作用；
在傳感器生物分子能夠結合至可能存在的靶標生物分子的條件下，在溶液中將樣本與多發色團複合物接觸；
向樣本施加能夠激發多發色團的光源；和
檢測是否從信號發色團發出光。
25.權利要求24的方法，其中所述多發色團是偶聯的聚合物。
26.權利要求25的方法，其中所述偶聯的聚合物是聚陽離子偶聯聚合物。
27.一種測定方法，包括
提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；
提供偶聯至信號發色團並能夠與靶標生物分子相互作用的第一生物偶聯物；
提供偶聯至多發色團的第二生物偶聯物，其中該發色團包含結構
其中CP1、CP2、CP3和CP4是任選地取代的偶聯的聚合物區段或寡聚結構，它們彼此相同或不同，其中該第二生物偶聯物能結合該第一生物偶聯物，並且在這種結合後，多發色團的激發能夠傳遞能量至該信號發色團；
在第一生物偶聯物能結合可能存在的靶標生物分子的條件下，在溶液中將樣本與第一生物偶聯物接觸；
將溶液與第二生物偶聯物接觸；
向樣本施加能夠激發多發色團的光源；和
檢測是否從信號發色團發出光。
28.權利要求27的多發色團，其中所述偶聯的聚合物是陽離子偶聯聚合物。
29.權利要求27的多發色團，其中所述偶聯的聚合物是陰離子偶聯聚合物。
30.權利要求27的多發色團，其中所述偶聯的聚合物是電荷中性偶聯聚合物。
31.權利要求27的多發色團，其中CP1、CP2、CP3和CP4是芳香族重複單元，選自苯、萘、蒽、芴、噻吩、呋喃、吡啶和噁二唑，每個任選地被取代，並且其中CP3和CP4可含有一個或多個獨特生物偶聯位點，由一個連接體連接。
32.權利要求27的多發色團，進一步包含選自馬來醯亞胺、硫醇、琥珀醯亞胺酯(NHS酯)、胺、疊氮化物化學、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺鹽酸鹽、磺基-SMCC(磺基琥珀醯亞胺基4-[N-馬來醯亞胺基甲基]環己烷-1-羧酸酯)、胺/BMPH(N-[β-馬來醯亞胺基丙酸]醯肼·TFA)、以及磺基-SBED磺基琥珀醯亞胺基[2-6-(生物素醯氨基)-2-(對-疊氮苯甲醯氨基)-己醯氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯的生物偶聯位點。
33.權利要求27的多發色團，其中該多發色團包含結構
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
34.權利要求27的多發色團，其中該發色團包含結構
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
35.權利要求33或34的多發色團，其中1和2選自具有下述結構的a-g連接基團
*＝用於共價連接至不飽和骨架的位點
3為具有如下結構的基團h
L＝連接體
A＝生物偶聯位點
*＝用於共價連接至不飽和骨架的位點。
36.權利要求33或34的多發色團，進一步包含結構
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
37.權利要求33或34的多發色團，進一步包含結構
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
38.權利要求33或34的多發色團，進一步包含結構
其中R1是加溶基，選自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-銨鹽烷氧基和ω-磺酸鹽烷氧基。
39.權利要求27的方法，其中所述偶聯的聚合物是聚陽離子偶聯聚合物。
40.權利要求27的方法，其中所述偶聯的聚合物是陰離子偶聯聚合物。
41.權利要求27的方法，其中所述偶聯的聚合物是電荷中性結合偶聯聚合物。
42.權利要求27的方法，其中第一和第二生物偶聯物中的至少一個是抗體。
43.權利要求27的方法，其中第一和第二生物偶聯物均為抗體。
44.一種測定方法，包括
提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；
提供包含共價連接的第一生物偶聯物的多發色團；
提供包含能夠與靶標生物分子相互作用的傳感器生物分子、信號發色團和能夠與第一生物偶聯物結合的共價連接的第二生物偶聯物的傳感器生物分子複合物，其中在這種結合後，多發色團的激發能夠將能量傳遞至該信號發色團；
在傳感器生物分子能結合可能存在的靶標生物分子的條件下，在溶液中將樣本與傳感器生物分子複合物接觸；
將溶液與多發色團接觸；
向樣本施加能夠激發多發色團的光源；和
檢測是否從信號發色團發出光。
45.權利要求44的方法，其中所述多發色團是偶聯的聚合物。
46.權利要求44的方法，其中所述偶聯的聚合物是聚陽離子偶聯聚合物。
47.權利要求44的方法，其中第一和第二生物偶聯物選自蛋白質、抗體和核酸。
48.權利要求44的方法，其中所述第一生物偶聯物是鏈親和素或生物素，其中所述傳感器生物分子是抗體，以及其中當第一生物偶聯物是鏈親和素時，所述第二生物偶聯物是生物素，或當第一生物偶聯物是鏈親和素時，該第二生物偶聯物為生物素。
49.權利要求44的方法，其中所述第一生物偶聯物是鏈親和素或生物素，其中所述傳感器生物分子是核酸，以及其中當第一生物偶聯物是鏈親和素時，所述第二生物偶聯物是生物素，或當第一生物偶聯物是鏈親和素時，該第二生物偶聯物為生物素。
50.一種用於鑑定生物分子的生物識別複合物，包含
生物偶聯物；
共價連接至該生物偶聯物的信號發色團；
共價連接至該生物結合物的多發色團，其中該多發色團的激發能夠將能量傳遞至該信號發色團。
51.權利要求50的生物識別複合物，其中所述生物偶聯物是抗體。
52.權利要求50的生物識別複合物，其中所述生物偶聯物是鏈親和素。
53.權利要求50的方法，其中所述多發色團是偶聯的聚合物。
54.權利要求53的方法，其中所述偶聯的聚合物是聚陽離子偶聯聚合物。
55.一種測定方法，包括
提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；
提供包含生物偶聯物、共價連接至該生物偶聯物的信號發色團和共價連接至該生物偶聯物的多發色團的生物識別複合物，其中多發色團的激發能夠將能量傳遞至該信號發色團；
在生物偶聯物能結合可能存在的靶標生物分子或靶標相關生物分子的條件下，在溶液中將樣本與生物識別複合物接觸；
向該溶液施加能夠激發多發色團的光源；和
檢測是否從信號發色團發出光。
56.權利要求55的方法，其中所述多發色團是偶聯的聚合物。
57.權利要求56的方法，其中所述偶聯的聚合物是聚陽離子偶聯的聚合物。
58.一種用於鑑定靶標生物分子的生物識別複合物，包含
生物偶聯物；
共價連接至該生物偶聯物的多發色團；和
共價連接至該多發色團的信號發色團，其中多發色團的激發能夠將能量傳遞至該信號發色團。
59.權利要求58的生物識別複合物，其中所述生物偶聯物是抗體。
60.權利要求58的生物識別複合物，其中所述生物偶聯物是鏈親和素。
61.權利要求58的方法，其中所述多發色團是偶聯的聚合物。
62.權利要求61的方法，其中所述偶聯的聚合物是聚陽離子偶聯的聚合物。
63.一種測定方法，包括
提供懷疑含有靶標生物分子的樣本；
提供包含生物偶聯物複合物的生物識別複合物，該生物偶聯物複合物包含生物偶聯物、共價連接至該生物偶聯物的多發色團、和共價連接至該多發色團的信號發色團，其中該多發色團的激發能夠將能量傳遞至該信號發色團；
在生物偶聯物能結合可能存在的靶標生物分子或靶標相關生物分子的條件下，在溶液中將樣本與該生物識別複合物接觸；
向該溶液施加能夠激發多發色團的光源；和
檢測是否從信號發色團發出光。
64.權利要求63的方法，其中所述多發色團是偶聯的聚合物。
65.權利要求64的方法，其中所述偶聯的聚合物是聚陽離子偶聯的聚合物。
66.權利要求1、24、27、44、54和62中任一項的方法，其中基因的表達通過檢測靶標生物分子來檢測。
67.權利要求1、24、27、44、54和62中任一項的方法，其中靶標生物分子的檢測提供可以用於診斷患者疾病狀態的結果。
68.權利要求67的方法，其中診斷疾病的方法包括
檢查或分析關於樣本中是否存在靶標生物分子的數據；和
對患者、醫務人員或醫療衛生管理者提供結論，該結論是基於檢查或分析關於疾病診斷的數據而作出的。
69.權利要求68的方法，其中提供結論包括在網絡上傳輸數據。
70.一種用於鑑定靶標生物分子的試劑盒，包括
多發色團，
共價連接至該多發色團的傳感器生物分子，
共價連接至該多發色團的信號發色團，其中該信號發色團能夠接收在多發色團激發時來自於該多發色團的能量，並且該傳感器生物分子能夠與靶標生物分子相互作用。
71.權利要求70的試劑盒，其中該試劑盒進一步包含一種基質。
全文摘要
提供了包括用於鑑定靶標生物分子的多發色團和/或多發色團複合物的方法和組合物。傳感器生物分子，例如抗體，可與該多發色團共價連接。此外，信號發色團可與該多發色團共價連接。這種排列使得該信號發色團能夠接收在多發色團激發時來自於該多發色團的能量。因為該傳感器生物分子能夠與靶標生物分子相互作用，該多發色團和/或多發色團複合物能夠提供針對靶標生物分子的增強的檢測信號。
文檔編號C12Q1/68GK101553579SQ200780041763
公開日2009年10月7日 申請日期2007年10月8日 優先權日2006年10月6日
發明者B·S·蓋洛德, J·W·霍格, T-j·付, 孫成軍 申請人:賽裡根有限公司