異丙醇生產細菌及使用其的異丙醇生產方法

2023-05-03 03:05:31 1

專利名稱：：異丙醇生產細菌及使用其的異丙醇生產方法
技術領域：
：本發明涉及一種異丙醇生產細菌及使用其的異丙醇生產方法。
背景技術：
：因為由來自植物的原料製備的異丙醇可以經脫水步驟轉化為丙烯，所以有希望作為碳中和的丙烯的原料。目前，根據京都議定書有義務於2008年至2012年間所有發達國家二氧化碳排放量與1990年相比削減5%,碳中和的丙烯由於其廣泛適用性對地球環境極其重要。將來自植物的原料同化生產異丙醇的菌已經存在於自然界中(例如參見中國專利申請公開第CN1043956A及日本特開昭61-67493號公報)。但是，已知異丙醇的生產率低，並且副生出丁醇或乙醇等醇類。由於丁醇及乙醇與水的共沸點和異丙醇與水的共沸點相近，所以難以通過簡單蒸餾等方法容易地將丁醇或乙醇與異丙醇分離。因此，認為為了從丁醇或乙醇與異丙醇共存的現有菌的發酵液中回收異丙醇，必須進行附加有精餾塔等設備的蒸餾，所以推測這一精製過程變得複雜。中國專利申諱-/>開第CN1043956A中記載了下述方法，所述方法將ClostridiumButanoiacetonicusG.V在添力口有玉米和糖蜜的培養液中培養後，對所得的培養液進行蒸餾、再蒸餾、分餾，製備丁醇、乙醇、丙酮、異丙醇。但是，在該文獻記載的實施例中，完全沒有記載培養液中的丁醇、乙醇、丙酮及異丙醇的生成量，也沒有記載最終利用分餾應得到的各成分的量。因此，由該文獻實際上不能確認生產了異丙醇、丁醇、乙醇、丙酮。在曰本特開昭61-67493號公報中，記載了在培養梭狀芽孢杆5菌屬細菌所得的培養液中，同時伴有與異丙醇相比大量的丁醇、和少量的乙醇及丙酮。根據該文獻，作為從所得的培養液得到異丙醇的方法，記載了將培養液過濾，進行數次蒸餾，濃縮，通過鹽析分離得到油分後，將得到的油分用具有分餾塔的裝置進行分餾的方法是通常的分離精製方法。另一方面，已知將來自梭狀芽孢桿菌屬細菌(丙酮丁醇梭菌ClostridiumAcetobutylicum)的乙醯乙酸脫羧酶、CoA4爭移酶及石危解酶的基因導入大腸桿菌中，培養所得的重組大腸桿菌來生產丙酮(例如，LourdesLBermejoetal.:AppliedandEnvironmentalMicrobiology,Vol.64,NO.3,p.1079-1085,(1998)。
發明內容如上所述，由於現有的異丙醇生產菌的異丙醇生產率低，並且培養液中副生大量的丁醇及乙醇等醇類，因此難以從培養液中回收異丙醇，在工業生產異丙醇方面存在問題。本發明是鑑於上述情況而研究得到的，目的在於提供一種細菌，所述細菌副生醇類少、無需用於分離副生醇的特別步驟、能夠生產進一步精製得到的異丙醇；以及使用該細菌的異丙醇生產方法及異丙醇生產裝置。本發明的第一方案提供一種被賦予乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、CoA轉移酶活性及硫解酶活性，可以由來自植物的原料生產異丙醇的異丙醇生產細菌。在本發明的第一方案中，優選上述乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、CoA轉移酶活性及硫解酶活性分別通過導入編碼來自下述細菌的各酶的基因而得到，所述細菌選自梭狀芽孢桿菌屬細菌、芽孢桿菌屬細菌及埃希氏菌屬細菌中的至少一種。本發明的第二方案提供異丙醇生產方法，所述方法包括使用上述異丙醇生產細菌，由來自植物的原料生產異丙醇。在本發明的第二方案中，優選包括邊向含有上述異丙醇生產細菌及來自植物的原料的混合物中供給氣體邊培養該異丙醇生產細菌的培養步驟，和回收通過上述培養生成的異丙醇的回收步驟。本發明的第三方案提供異丙醇生產裝置，所述裝置具有收納含有上述異丙醇生產細菌及來自植物的原料的混合物的培養部，和與上述培養部連接同時在上述培養部中收納的混合物中的位置處開口、向上述混合物中供給氣體的氣體供給部，和收納捕集異丙醇的捕集液的捕集部，和連接上述培養部和上述捕集部、同時可以將在上述培養部內蒸發的異丙醇移動至上述捕集部的連接部。為表示本發明的異丙醇生產裝置的一個實施方案的簡要示意圖。具體實施例方式本發明的異丙醇生產細菌被賦予乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、CoA轉移酶活性及硫解酶活性，可以由來自植物的原料生產異丙醇。本發明的異丙醇的生產方法包括使用上述異丙醇生產細菌，由來自植物的原料生產異丙醇。本發明的異丙醇生產裝置具有收納含有上述異丙醇生產細菌及來自植物的原料的混合物的培養部，和與上述培養部連接同時在上述培養部中收納的混合物中的位置開口，向上述混合物中供給氣體的氣體供給部，和收納捕集異丙醇的捕集液的捕集部，和連接上述培養部和上述捕集部同時可以將在上述培養部內蒸發的異丙醇移動至上述捕集部的連接部。需要說明的是，在本說明書中標記數值範圍時，若無特別說明，則表示以其前後記載的數值分別作為最小值及最大值包含的範圍。另外，在本說明書中所謂"步驟"表示實現本步驟所期望的作用的階段，多個階段在時間上同時進行的情況等不能與其他步驟區分的情況也包括在本說明書中步驟的概念中。在本說明書中所謂"vvm"表示在1分鐘內通入液容量的幾倍的氣體，例如，對10升的培養液進行2vvm的通氣表示每分鐘通入20升的氣體。以下，說明本發明。[異丙醇生產細菌]本發明的異丙醇生產細菌是被賦予了乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氬酶活性、CoA轉移酶活性及石克解酶活性，可以由來自植物的原料生產異丙醇的異丙醇生產細菌。本發明的異丙醇生產細菌被全部賦予了乙醯乙酸脫羧酶、異丙醇脫氫酶、CoA轉移酶及石克解酶四種異丙醇生成酶。本發明人等發現使用該異丙醇生產細菌生產異丙醇時，不副生丁醇或乙醇等醇類。由此，與現有的異丙醇生產微生物相比可以特別簡便地回收異丙醇。本發明中所謂來自植物的原料為由植物獲得的碳源，只要是細菌可以代謝轉化為異丙醇的物質即可，沒有特別限定。在本發明中指根、莖、稈、枝、葉、花、種子等器官、含有它們的植物體、所述植物器官的分解產物，進而在由植物體、植物器官或它們的分解產物得到的碳源中，微生物在培養中可以用作碳源的物質也包含在來自植物的原料中。在包含於所述來自植物的原料中的碳源中，作為通常物質可以舉出澱粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖等糖類、或者含有較多所述成分的草木質分解產物及纖維素水解物等。進而來自植物油的丙三醇及脂肪酸也屬於本發明的碳源。作為本發明中的來自植物的原料，可以優選使用穀物等農作物、玉米、米、小麥、大豆、甘蔗、甜菜、棉花等，作為這些原料的使用形態為未加工品、榨汁、粉碎物等，沒有特別限定。另外，可以為僅是上述碳源的形態。本發明的異丙醇生產細菌只要具有由所述來自植物的原料生成異丙醇的能力即可，例如可以舉出通過培養將來自植物的原料同化，一定時間後在培養液中分泌異丙醇的細菌。本發明中的異丙醇生產細菌被賦予了乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氬酶活性、CoA轉移酶活性及^克解酶活性四種酶活性。本發明中的活性的"賦予"除了包括將編碼酶的基因從宿主細菌的菌體外導入菌體內之外，還包括通過強化宿主細菌在基因組中保有的酶基因的啟動子活性或與其他啟動子置換使酶基因強表達。本發明中的乙醯乙酸脫羧酶是指分類為基於國際生化學聯盟(I.U.B.)酶委員會報告的酶編號4.1.1.4、催化由乙醯乙酸生成丙酮的反應的酶的總稱。作為所述乙醯乙酸脫羧酶，例如可以舉出來自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、f早氏才炎菌(Clostridiumbeijerinckii)等梭狀芽孢桿菌屬細菌、多粘芽孢桿菌(Bacilluspolymyxa)等芽孢桿菌屬細菌的乙醯乙酸脫羧酶。作為本發明的被導入宿主細菌中的乙醯乙酸脫羧酶的基因，可以利用具有編碼從上述各來源生物得到的乙醯乙酸脫羧酶的基因的鹼基序列的DNA或基於其公知的鹼基序列合成得到的合成DNA序列。作為優選基因，可以舉出來自梭狀芽孢桿菌屬細菌或芽孢桿菌屬細菌的DNA,例如可以舉出具有來自丙酮丁醇梭菌、多粘芽孢桿菌的基因的鹼基序列的DNA。特別優選具有來自丙酮丁醇梭菌的基因的;鹹基序列的DNA。本發明中的異丙醇脫氫酶是指分類為基於國際生化學聯盟(I.U.B.)酶委員會報告的酶編號1.1.1.80、催化由丙酮生成異丙醇的反應的酶的總稱。作為所述異丙醇脫氫酶，例如可以舉出拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)等來自梭狀芽孢桿菌屬細菌的異丙醇脫氬酶。作為被導入本發明的宿主細菌中的異丙醇脫氫酶的基因，可以序列的DNA或基於其公知的鹼基序列合成得到的合成DNA序列。作為優選基因，可以舉出來自梭狀芽孢桿菌屬細菌的DNA，例如具有來自拜氏梭菌的基因的鹼基序列的DNA。本發明中的CoA轉移酶是指分類為基於國際生化學聯盟(I.U.B.)酶委員會報告的酶編號2.8.3.8、催化由乙醯乙醯基CoA生成乙醯乙酸的反應的酶的總稱。作為所述CoA轉移酶，例如可以舉出來自下述細菌的CoA轉移酶，所述細菌為丙酮丁醇衝炎菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏才炎菌(Clostridiumbeijerinckii)等才炎習犬芽孑包4幹菌屬糹田菌、Roseburiaintestinalis等羅斯氏菌屬糹田菌、Faecalibacteriumprausnitzii等Faecalibacterium屬糹田菌、糞J求菌(Coprococcus)屬細菌、布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)等4偉蟲、大腸才幹菌(Escherichiacoli:大腸4幹菌)等埃希氏菌屬細菌。作為本發明的被導入宿主細菌中的CoA轉移酶的基因，可以利用具有編碼從上述各來源生物得到的CoA轉移酶的基因的鹼基序列的DNA或基於其公知的鹼基序列合成得到的合成DNA序列。作為優選的基因，可以舉出具有來自下述細菌的基因的鹼基序列的DNA,所述細菌為丙酮丁醇梭菌等梭狀芽孢桿菌屬細菌、Roseburiaintestinalis等羅斯氏菌屬糹田菌、Faecalibacteriumprausnitzii等Faecalibacterium屬細菌、糞^求菌屬細菌、布氏錐蟲等錐蟲、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌。作為較優選基因，可以舉出來自梭狀芽孢桿菌屬細菌或埃希氏菌屬細菌的基因，特別優選為具有來自丙酮丁醇梭菌或大腸桿菌的基因的鹼基序列的DNA。本發明中的硫解酶是指分類為基於國際生化學聯盟(I.U.B.)酶委員會報告的酶編號2.3.1.9、催化由乙醯基CoA生成乙醯乙醯基CoA的反應的酶的總稱。作為所述石克解酶，例如可以舉出來自下述物質的石克解酶，所述物質為丙酮丁S事一炎菌(Clostridiumacetobutylicum)、,早氏4炎菌(Clostridiumbeijerinckii)等梭狀芽孢桿菌屬細菌、大腸桿菌(Escherichiacoli)等埃希氏菌屬糹田菌、鹽桿菌種(Halobacteri畫sp.)細菌、生枝動膠菌(zoogloearamigera)等動月交菌屬細菌、根瘤菌種(Rhizobiumsp.)糹田菌、大豆十曼生才艮瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)等慢生根瘤菌屬細菌、新月柄桿菌(Caulobactercrescentus)等柄桿菌屬細菌、山丘鏈黴菌(Streptomycescollinus)等鏈黴菌屬細菌、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)等腸球菌屬細菌、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)等4叚絲酵母菌屬、向日葵(Helianthusannuus)等菊科向日葵屬、紅原雞(Gallusgallus)等雉科原雞屬、褐家鼠(Rattusnorvegicus)等鼠科鼠屬、野豬(Susscrofa)等豬科豬屬、歐洲牛(Bostaums)等牛科牛屬。作為本發明的被導入宿主細菌中的硫解酶的基因，可以利用具有編碼由上述各來源生物得到的硫解酶的基因的鹼基序列的DNA或基於其公知的鹼基序列合成得到的合成DNA序列。作為優選基因，可以舉出具有來自下述物質的基因的鹼基序列的DNA，所述物質為丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌等梭狀芽孢桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、鹽桿菌種的細菌、生枝動膠菌等動膠菌屬細菌、根瘤菌種的細菌、大豆慢生根瘤菌等慢生根瘤菌屬細菌、新月柄桿菌等柄桿菌屬細菌、山丘鏈黴菌等鏈黴菌屬細菌、糞腸球菌等腸球菌屬細菌、熱帶假絲酵母等假絲酵母菌屬、向日葵等菊科向曰葵屬、紅原雞等雉科原雞屬、褐家鼠等鼠科鼠屬、野豬等豬科豬屬、歐洲牛等牛科牛屬。作為較優選基因，可以舉出來自梭狀芽孢桿菌屬細菌或埃希氏菌屬細菌的基因，特別優選為具有來自丙酮丁醇梭菌或大腸桿菌的基因的鹼基序列的DNA。其中，從酶活性的觀點考慮優選上述四種酶分別為來自選自梭狀芽孢桿菌屬細菌、芽孢桿菌屬細菌及埃希氏菌屬細菌中的至少一種的酶，其中，更優選乙醯乙酸脫羧酶及異丙醇脫氫酶來自4炎狀芽孢桿菌屬細菌、CoA轉移酶活性及硫解酶活性來自埃希氏菌屬細菌，和所述四種酶均來自梭狀芽孢桿菌屬細菌。其中從酶活性的觀點考慮優選本發明中的四種酶分別來自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌或大腸桿菌中的任一種；較優選乙醯乙酸脫羧酶為來自丙酮丁醇梭菌的酶，CoA轉移酶及硫解酶分別為來自丙酮ii丁醇梭菌或大腸桿菌的酶，異丙醇脫氫酶為來自拜氏梭菌的酶；上述四種酶從酶活性的觀點考慮，特別優選乙醯乙酸脫羧酶活性來自丙酮丁醇梭菌，上述異丙醇脫氫酶活性來自拜氏梭菌，CoA轉移酶活性及硫解酶活性來自大腸桿菌。本發明中的所述酶的活性可以從菌體外向菌體內導入，或者通過強化宿主細菌在基因組中保有的酶基因的啟動子活性或與其他啟動子置換使酶基因強表達。酶活性的導入可以通過例如使用基因重組技術將編碼所述四種酶的基因從宿主細菌的菌體外導入菌體內而進行。此時，被導入的酶基因與宿主細胞同種或不同種均可。從菌體外向菌體內導入基因時需要的基因組DNA的製備、DNA的切斷及連接、轉化、PCR(PolymeraseChainReaction)、用作引物的寡核苷酸的設計、合成等的方法，可以按照本領域技術人員所公知的通常的方法來進行。所述方法記載於Sambrook,J.,et.al.，"MolecularCloningALaboratoryManual,SecondEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress,(1989)等中。作為用於強化啟動子活性或使酶基因強表達的啟動子，只要為可以在大腸桿菌等宿主中表達的啟動子即可，可以使用任意物質。例如可以使用trp啟動子、lac啟動子、PL啟動子、PR啟動子等來自大腸桿菌或噬菌體的啟動子。可以使用如tac啟動子等那樣被人為設計改變的啟動子。另外也可以如本發明實施例中記載的那樣，使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子、穀氨Si脫羧酶A(gadA)啟動子、絲氨酸羥甲基轉移酶(glyA)啟動子。它們可以根據所使用的酶的來源及種類適當選才奪。例如為了強化來自大腸桿菌的硫解酶或CoA轉移酶的活性，只要為在大腸桿菌等宿主中可以表達的啟動子就可以使用任意的啟動子，可以從下述啟動子組成的組的示例啟動子中適當選擇一種以上，所述啟動子為trp啟動子、lac啟動子、Pi啟動子、PR啟動子、tac啟動子、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子、穀氨酸脫羧酶A12(gadA)啟動子、絲氨酸羥曱基轉移酶(glyA)啟動子等。另外，trp啟動子、lac啟動子、Pi啟動子、Pa啟動子、tac啟動子、甘油醛-3-磷酸脫氬酶(GAPDH)啟動子、穀氨酸脫羧酶A(gadA)啟動子、絲氨酸羥甲基轉移酶(glyA)啟動子等啟動子可以用於與來自大腸桿菌的硫解酶或CoA轉移酶的啟動子置換。只須按照通常的方法將所述啟動子導入宿主細胞，使成為對象的酶基因可以表達即可，例如，可以與成為對象的酶基因連接於同一載體上，與酶基因一起導入宿主細胞。本發明中所謂宿主細菌是指成為用於導入編碼乙醯乙酸脫羧酶、異丙醇脫氫酶、CoA轉移酶及硫解酶四種酶的基因的或強化啟動子活性或置換啟動子的對象的原核生物。作為所述宿主細菌，可以舉出埃希氏菌屬(Escherichia)糹田菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)細菌、棒桿菌(Corynebacterium)屬細菌等，特別優選使用便利性高、工業4吏用的實際成果豐富的大腸桿菌(Escherichiacoli:大腸桿菌)。[異丙醇的生產方法]本發明的異丙醇的生產方法包括使用上述本發明的異丙醇生產細菌由來自植物的原料生產異丙醇。由此，可以不副生其他醇類地以高純度生產異丙醇。因此根據本發明，可以無需用於分離副生醇的複雜的步驟，簡便、效率良好地生產異丙醇。所述生產方法包括下述方法，在含有異丙醇生產細菌和來自植物的原料的混合物中培養異丙醇生產細菌，由此將來自植物的原料同化，一定時間後使用蒸餾、膜分離、提取等公知技術將在培養液中分泌得到的異丙醇進行精製的方法。異丙醇的生產方法中的混合物只要是以在細菌類的培養中通常使用的基本培養基作為主體的混合物即可，只要是對應於異丙醇生產細菌的種類通常使用的培養基即可，可以使用任意物質。所述基本培養基只要是含有碳源、氮源、無機離子及根據需要含有的其他微量成分的培養基即可，沒有特別限定。作為碳源，可以適當使用葡萄糖、果糖、糖蜜等糖類、富馬酸、檸檬酸、琥珀酸等有機酸、曱醇、乙醇、丙三醇等醇類及其他。作為氮源，可以適當使用有機銨鹽、無機銨鹽、硝態氮、氨氣、氨水、蛋白質水解物等無機及有機氮源及其他。作為無機離子，可以根據需要適當使用鎂離子、磷酸離子、鉀離子、鐵離子、錳離子及其他。作為有機微量成分，可以適當使用維生素、胺基酸等及含有它們的酵母提取物、蛋白腖、多聚蛋白腖、玉米浸漬液(CornSteepLiquor)、酪蛋白分解物及其他。多聚蛋白腖是將蛋白質用酶或酸水解得到的產物，其氮源例如有根據由日本製藥(抹)生產的多聚蛋白腖Lot0586A的分析值雖然少但產生氨型氮的例子，但是可以說全部來自蛋白質。作為多聚蛋白腖的成分，可以舉出相對於多聚蛋白腖的總質量，總氮量12.5質量％~14.5質量％、氨基氮5.0質量％~6.5質量％、灼燒殘留物4.0質量％~7.0質量％、乾燥損失3.5質量％~5.5質量％的多聚蛋白腖。在培養基中通常在0.02~2%(w/w)的範圍內使用，優選在0.1~1%(w/w)的範圍內使用。玉米浸漬液是將含有在玉米的浸漬步驟中溶出的可溶性成分和在乳酸發酵中生成的成分的浸漬液進行濃縮而得到的產物，根據Microbiol.Mol.Biol.Rev.，Dec1948;Vol.12:pp297—311.,作為成分，可以舉出相對於玉米浸漬液總質量，水分45質量％~55質量％、總氮量2.7質量％~4.5質量％、氨基氮1.0質量％~1.8質量％、揮發性氮0.15質量％~0.40質量％、還原糖分0.1質量％~ll.O質量%、乳酸5質量％~15質量％、灰分9質量％~10質量％、揮發性酸類0.1質量％~0.3質量％、二氧化硫0.009質量％~0.015質量％的物質。根據上述成分，作為揮發性氮，有可能最大含有0.40%(w/w)的在水中能夠生成銨離子的含氮化合物，但即使假設其全部為銨離子，在含有2%玉米浸漬液的培養基中銨離子的含量也只有0.008%。玉米浸漬液在培養基中通常在0.1~20%(w/w)的範圍內進行使用，優選在0.5~7%(w/w)的範圍內進行使用。公開了酵母提取物由胺基酸及其聚合物、核酸、維生素、有機酸、無機鹽構成，根據BD(Becton，DickinsonandCompany)公司的酵母提取物分析數據(Catalog#211929、211931、211930)，作為無機鹽記載了由鈣、鎂、鉀、鈉、氯化物、硫酸、磷酸構成的鹽，沒有記載能夠生成銨離子的化合物。作為成分，可以舉出相對於酵母提取物總質量，總氮量11.4質量％、氨基氮6.9質量％、灰分13.1質量％、乾燥損失1.0質量％、氯化鈉0.2質量％、總無機鹽10.5質量％的物質。混合物中來自植物的原料的量根據其種類及混合物中含有的異丙醇生產細菌的活性及數量而不同，但通常按葡萄糖換算，可以使開始的糖濃度相對於混合物的總質量為20質量％以下，從細菌的耐糖性的觀點考慮優選可以使開始的糖濃度為15質量％以下。其他各成分只要以在微生物的培養基中通常添加的量進行添加即可，沒有特別限定。在含有異丙醇生產細菌及來自植物的原料的混合物中，從提高異丙醇的生產率的觀點考慮，優選進一步添加含有氮的化合物。所謂"進一步添加，，是指以比通常培養基中含有的含量高的含量在混合物中含有在水中能夠生成銨離子的含氮化合物。由此，異丙醇的生產細菌可以在含有比通常的培養條件高的濃度的除胺基酸之外的含氮化合物的培養基中被培養。將除胺基酸之外的含氮化合物加入培養基中的時間可以是開始培養前，也可以是培養過程中。所謂在水中能夠生成銨離子的含氮化合物，可以舉出含有硫酸銨、硝酸銨等銨鹽的無機及有機化合物、氨氣、氨水。在水中能夠生成銨離子的含氮化合物在細菌用的一般的培養基M9中以0.02%(w/w)的含量被含有，在其他一般的培養基MS中以0.02%(w/w)的含量被含有，但在本發明中，為了增加異丙醇的生成量，可以比所述量多地含有在水中能夠生成銨離子的含氮化合物。在本發明中，從提高異丙醇的生產率的觀點考慮，優選在水中能夠生成銨離子的含氮化合物的添加量以氮原子的總質量％計，相對於混合物中培養開始時的培養基的總質量為0.04%~10.6%(w/w)進行添加並培養。更優選為0.04%5.30。/。(w/w)，特別優選為0.04%~4.24%(w/w)。此時，液體lmL換算為lg。另外，可以以通常使用的量含有通常被添加到微生物的培養基中的其他添加成分，例如抗生素等。需要說明的是，優選為了抑制反應時的發泡適當添加消泡劑。作為本發明中使用的培養基，可以舉出以水性介質為基本的液體培養基及以瓊脂等固相為基本的固體培養基，但若從用於工業生產方面考慮優選液體培養基。作為構成液體培養基的水性介質，可以使用蒸餾水、緩沖液等通常使用的介質。在進行本發明的培養時，培養條件沒有特別限定，例如可以在需氧條件下，在pH4~9、優選pH6~8、溫度20°C~50。C、優選25°C~42。C的範圍內邊適當控制pH與溫度邊培養。作為回收在培養液中蓄積的異丙醇的方法，沒有特別限定，但可以採用下述方法，例如通過離心分離等從培養液中除去菌體後，通過蒸餾或膜分離等通常的分離方法分離異丙醇。需要說明的是，本發明的異丙醇的生產方法可以在用於生產異丙醇的培養步驟之前包括前培養步驟，所述前培養步驟用於將使用的異丙醇生產細菌製成適當的菌數或適度的活性狀態。前培養步驟只要為利用對應於異丙醇生產細菌的種類的通常使用的培養條件進行的培養即可。本發明的異丙醇的生產方法優選包括一邊向含有上述異丙醇生產細菌及來自植物的原料的混合物中供給氣體一邊培養該異丙醇生產細菌的培養步驟，和將通過上述培養生成的異丙醇從混合物中分離並回收的回收步驟。根據所述方法，邊向混合物中供給氣體邊培養生產細菌(通氣培養)。通過所述通氣培養，生產得到的異丙醇被釋放到混合物中同時從混合物中蒸發，結果，可以將生成的異丙醇從混合物(培養基)中容易地分離。另外，因為生成的異丙醇從混合物中連續地分離，所以可以抑制混合物中異丙醇的濃度上升。由此，不需要特別考慮異丙醇生產細菌對異丙醇的耐性。作為在培養步驟中供給於混合物中的氣體，只要為含有氧的氣體即可，可以使用氧或空氣、或二者中的一方與惰性氣體的混合氣體。所述氣體優選被除菌。作為上述惰性氣體，可以-使用N2氣或稀有氣體(例如，Ar、He、Ne、Kr或Xe),其中，從操作的觀點考慮，優選N2氣或Ar氣，較優選N2氣。使用混合氣體時，只要不損害成為培養對象的細菌的生理活性即可，可以為任意的混合比，但為了適度抑制異丙醇生產細菌的活性，從而可以進行長時間的處理，優選使惰性氣體的混合比相對於混合氣體總質量為10%~90%。另外，為了確保向混合物中通氣，可以向特定混合物中投入陶瓷體等多孔物體。向上述混合物中的氣體的通氣量沒有特別限定，但作為氣體僅使用空氣時，通常為0.02vvm2.0vvm(vvm;通氣容量[mL]/液容量[mL]/時間[分鐘])，從抑制對細菌的物理損傷的觀點考慮，優選以O.lvvm~1.5vvm進行。需要說明的是，優選邊攪拌全部混合物邊進行培養步驟。由此，可以良好地進行異丙醇生產細菌和來自植物的原料的混合，同時使被供給於混合物中的氣體效率良好地遍布到全部混合物中。可以使培養步驟從培養開始繼續至混合物中的來自植物的原料被消耗，或繼續至異丙醇生產細菌的活性消失。培養步驟的時間根據混合物中異丙醇生產細菌的數量及活性以及來自植物的原料的量而不同，^旦通常可以為1小時以上、4尤選為4小時以上。另一方面，通過進行來自植物的原料或異丙醇生產細菌的再投入，可以使培養時間無限制地連續進行，但從處理效率的觀點考慮，通常可以為5日以下、伊C選為55小時以下。在回收步驟中，回收在培養步驟中生成的、從混合物分離得到的異丙醇。作為所述回收方法，只要可以收集通過通常培養從混合物中蒸發的氣體狀或飛沫狀的異丙醇即可。作為所述方法，可以舉出收納到通常使用的密閉容器等收集構件中等，其中，從可以只將異丙醇高純度地回收的觀點考慮，優選為包括使用於捕集異丙醇的捕集液與從混合物中分離得到的異丙醇接觸的方法。作為用於捕集異丙醇的捕集液，可以舉出水或有機溶劑。作為捕集液的有機溶劑只要為可以容易地溶解異丙醇，並且具有將捕集後的捕集液在含水或非含水狀態下進行蒸餾時可以與異丙醇容易地分離的沸點的溶劑即可，沒有特別限定。作為所述有機溶劑，例如可以舉出曱苯、二曱基曱醯胺、二曱基亞碸等。作為捕集液的有機溶劑可以適當地與水混合使用。作為捕集液，優選水。由於設想的與異丙醇一起生成的揮發性雜質比異丙醇難溶於水，所以可以效率良好地將異丙醇從雜質中分離並回收。可以使異丙醇與捕集液的接觸進行足以使異丙醇溶解於捕集液的時間。異丙醇向捕集液的溶解只要為水或上述有機溶劑則不會進4亍4艮長時間，通常2小時左右即為充分。為了促進異丙醇溶解於捕集液，優選向捕集液中直接注入從混合物中分離得到的氣體狀或飛沫狀的異丙醇。通過所述注入發生起泡，可以促進異丙醇在捕集液中的溶解速度。在本發明的異丙醇的生產方法中，為了進一步提高回收效率，優選包括在與捕集液接觸前將從混合物中分離得到的異丙醇進行液化的液化步驟。異丙醇的液化只要是可以將氣化或飛沫化狀態的異丙醇進行液化的方法即可，例如可以舉出異丙醇的相變化所需要的充分程度的冷卻。作為所述冷卻方法，可以舉出空氣冷卻、或^f吏用冷卻後的水或醇類的方法。另外，可以使用吸附劑回收從混合物中分離得到的異丙醇。作18為所述吸附劑，可以使用為了吸附液體或氣體而通常使用的沸石或矽膠等多孔物體。根據本異丙醇的生產方法，可以以溶解於捕集液或混合物後的狀態回收異丙醇。回收得到的異丙醇可以使用HPLC等通常的檢測方法進行確認。回收得到的異丙醇可以根據需要進一步進行精製。作為所述精製方法，可以舉出蒸餾等。回收得到的異丙醇為水溶液的狀態時，本異丙醇的生產方法除了包括回收步驟之外還可以進一步包括脫水步驟。可以通過常用方法進行異丙醇的脫水。圖1概念地圖示了可以適用本發明的異丙醇的生產方法的生產裝置IO之一例。邊參照圖1邊說明本異丙醇的生產方法。生產裝置10具有培養槽12和捕集槽40，培養槽12與捕集槽40由連接管30連接。培養槽12及捕集槽40可以密閉，使內部的氣氛氣體不會漏到槽外部。在培養槽12的內部收納有含有異丙醇生產細菌B和來自植物的原料M的混合物14。混合物14的量只要以為培養槽12的容量的約一半量的量被填充即可，可以根據培養槽12的容量及生產裝置10的規模進行適當調整。培養槽12隻要由為了使用微生物工業生產物質而通常使用的物質構成即可，沒有特別限定。另外，本生產裝置10隻要可以在常溫常壓下處理即可，但也可以為了能夠根據需要進行加熱加壓而具有加熱裝置或加壓裝置。在培養槽12上連接有用於從裝置外部注入氣體的注入管16。注入管16的一端被連接於在生產裝置10的外部具有的沒有圖示的充氣裝置。注入管16的另一端在培養槽12的內部的底部周邊開口。預先調整混合物14的容量，使得收納於培養槽12的混合物14的液面在注入管16的開口部的上方。另外在培養槽12中具有攪拌裝置20,所述攪拌裝置20具有設置於培養槽12的外部的電動機部22和連接於電動機部22的攪拌部24。攪拌部24採用螺旋槳葉等形狀，被配置於培養槽12的底部周19邊。在電動機部22上連接有沒有圖示的驅動控制裝置，控制電動機部22的驅動使攪拌部24以規定的轉速旋轉。攪拌部24的轉速沒有特別限定，但通常為100rpm~l，OOOrpm,優選以200rpm~800rpm進行。在捕集槽40的內部收納有作為捕集液的捕集液42。在捕集槽40的上部安裝有用於將捕集槽40內的氣體排出到捕集槽40外部的排出管44。連接管30的一端在培養槽12的上部開口，使得可以將培養槽12內填充的氣體引導向培養槽12外部。另外連接管30的另一端向捕集槽40的底部周邊延伸並開口，預先調整收納於捕集槽40中的捕集液的液面，使其位於連接管30的開口部的上方。需要說明的是，在連接管30中可以具有積極地冷卻連接管30的內部的冷卻器。由此可以在氣體通過連4妻管30時，積;敗地液化氣體。接下來，說明本生產裝置10的作用。向本生產裝置10的培養槽12中，注入含有異丙醇生產細菌B和來自植物的原料M的混合物14,直至混合物14的液面位於比注入管16的端部充分靠上的位置。開啟攪拌裝置20的電動機部22的電源，使攪拌部24以規定的轉速旋轉。需要說明的是，可以預先在培養槽12中收納規定量的培養基，調整至適宜溫度後，添加混合物14使其達到規定的總和量。將規定量的混合物14收納在培養槽12中，開啟沒有圖示的充氣裝置的電源，向培養槽12中注入氣體。由此，在培養槽12的內部，向混合物中注入氣體，開始通氣培養。開始通氣培養時，在混合物14中，異丙醇生產細菌B邊同化來自植物的原料邊開始生產異丙醇。生產得到的異丙醇被從菌體釋放到混合物中，但其中的一部分溶解於混合物，大部分從混合物中蒸發。由此，異丙醇從混合物中分離。從混合物中分離得到的異丙醇從培養槽12上部作為通氣培養的排氣進入連接管30，向捕集槽40移動。通過連接管30時，排氣中的異丙醇的一部分被冷卻並液化。移動到了捕集槽40的排氣中的異丙醇從在捕集槽40的底部開口的連接管30的另一端進入捕集槽40,被注入捕集液42中。此時在捕集液42中，由於注入排氣發生起泡。此時異丙醇溶解於捕集液42。另一方面，由於與異丙醇一起從培養槽12移動到了捕集槽40的排氣中的揮發性雜質難溶於捕集液42，所以從捕集液42中釋放，通過在捕集槽40上部開口的排出管44,最終作為排氣被排出到捕集槽40的外部。邊利用沒有圖示的採集裝置採集邊確認在培養槽12內產生的異丙醇的量，在可以確認到異丙醇的生產結束或降低時，或經過規定時間後，結束處理。由於在處理結束後的捕集液42中，溶解有高濃度的異丙醇，所以可以作為高濃度異丙醇溶液回收。另外，可以回收該捕集液42，根據需要進一步分離精製異丙醇。另外，由於也有一部分異丙醇溶解於培養槽12的混合物14中，所以根據需要回收混合物14,分離精製異丙醇。由此，通過使用本生產裝置IO，可以在常溫常壓(例如25°C、101，325Pa)下容易地分離回收使用異丙醇生產細菌生產得到的異丙醇。因此，不必設置複雜的分離步驟及精製步驟，可以使生產裝置為簡單的結構。說明圖1中的符號。分別如下所示，IO表示本生產裝置(異丙醇生產裝置)、12表示培養槽(培養部)、14表示混合物、16表示注入管(氣體供給部)、20表示攪拌裝置(攪拌部)、30表示連接管(連接部)、40表示捕集槽(捕集部)、42表示捕集液(捕集液)、44表示排出管。需要說明的是，本實施方案的生產裝置10中設置的培養槽12、捕集槽40、連接管30等各部件、構件的形狀，只要不損害預期的作用就可以適當改變。另外，可以在本實施方案的生產裝置10中設置用於將混合物14或異丙醇生產細菌連續地投入培養槽12中的投入部及排出部。由此，可以連續地生產異丙醇。在本發明中，如上所述，可以副生醇類少、無需副生醇的分離步驟地生產被進一步精製的異丙醇。另外，在本發明的優選實施方案中，可以連續且簡便地生產被進一步精製的異丙醇。實施例以下，記載了本發明的實施例，但本發明不限於所述實施例。需要說明的是，記載中的"％"若沒有特別說明則為質量基準。[實施例1J<來自梭狀芽孢桿菌屬細菌的異丙醇生成酶基因組表達載體及該表達載體轉化體的構築〉已經報導了梭狀芽孢桿菌屬細菌的四種異丙醇生成酶的胺基酸序列和基因的石威基序列。即，裙u解酶被記載於在GenBankaccessionnumberAE001437中記載的基因組序列的互補《連3005963~3007364中。另夕卜CoA轉移酶被記載於GenBankaccessionnumberX72831中，乙醜乙酸脫歡酵被記載於GenBankaccessionnumberM55392中，異丙醇脫氫酶一皮記載於GenBankaccessionnumberAF157307中。進而為了使所述四種基因表達所需的啟動子的鹼基序列，可以使用在上述硫解酶的鹼基序列中存在的硫解酶啟動子的序列。為了取得石克解酶啟動子和石克解酶基因，將ClostridiumacetobutylicumATCC824的基因組DNA用作模板，通過TTTGAATTCCATGATTTTAAGGGGGTTAGCATATGCA(序列號1)、及TTTGGTACCCTAGCACTTTTCTAGCAATATTGCTGTTCC(序列號2)按照PCR法進行擴增，將得到的DNA片段用限制酶EcoRI及Kpnl進行消化，由此得到含有編碼硫解酶啟動子的DNA序列的約1.5kbp的硫解酶片段。另外為了取得CoA轉移酶基因，將ClostridiumacetobutylicumATCC824的基因組DNA用作模板，通過TTTGGTACCCAACCTTAAACCTTCATATTTCAACTACTT(序歹'J號3)、及TTTGGATCCCTAAACAGCCATGGGTCTAAGTTC(序歹'J號4)按照PCR法進行擴增，將得到的DNA片段用限制酶Kpnl及BamHI進行消化，由此得到約1.4kbp的CoA轉移酶片段。為了取得乙醯乙酸脫羧酶基因和終止子序列，將ClostridiumacetobutylicumATCC824的基因組DNA用作模板，通過TTTGGATCCAGCTAAACATTATTAAATTTAGGAAGG丁G(序列號5)、及TTTGTCGACCCAATGAACTTAGACCCATGGCTG(序列號6)按照PCR法進行擴增，將得到的DNA片段用限制酶BamHI及Sail進行消化，由此得到含有編碼終止子的DNA序列的約880bp的乙醯乙酸脫羧酶片段。需要說明的是，ClostridiumacetobutylicumATCC824可以從作為細胞.孩i生物.基因庫的美國標準生物品收藏中心(AmericanTypeCultureCollection)獲得。進而，為了取得異丙醇脫氫酶基因，將ClostridiumbeijerinckiiNRRLB-593的基因組DNA用作模板，通過TTTGGTACCGCGAAATAGCGATGAACAGGCAG(序列號7)、及TTTGGTACCGCAGATTTTGCTACTCTTGGAGC(序列號8)按照PCR法進行擴增，將得到的DNA片段用限制酶Kpnl進行消化，由此得到約1.4kbp的異丙醇脫氫酶片段。需要說明的是，ClostridiumbeijerinckiiNRRLB-593可以從作為細胞.微生物庫的VTT生物品收藏中心(CultureCollection)獲得。將上述四個DNA片段、和用限制酶EcoRl及Sail消化質粒pUC19所得的片段進行混合，使用連接酶連接後，轉化到大腸桿菌DH5a抹感受態細胞(東洋紡織林式會社DNA-903)中，在含有100jig/mL氨苄青黴素的、表面塗布有40mg/mL的X-gal和20%IPTG各40pL的LBBroth,Miller培養液(Difco244620)瓊脂板上繁殖，得到轉化體。將得到的菌落在含有100嗎/mL氨千青黴素的LB液體培養基中，於37。C下培養一夜，從得到的菌體中回收質粒pIPA。將所述質粒pIPA轉化到大腸桿菌B4朱(ATCC11303)感受態細胞中，在含有100)ig/mL氨節青黴素的LBBroth,Miller培養液瓊脂板上，於37。C下培養一夜，由此得到異丙醇生成酶基因組表達載體轉化體pIPA/B才朱。需要說明的是，大腸桿菌B林(ATCC11303)可以從作為細胞.微生物基因庫的美國標準生物品收藏中心獲得。[實施例2]<利用大腸桿菌pIPA/B林、大腸桿菌B野生林生產異丙醇〉作為前培養，在14mL容量的塑料管(FALCON公司制2057)中加入5mL含有0.1g/L氨千青黴素、2g/L葡萄糖的LBBroth，Miller培養液，接種在實施例1中得到的大腸桿菌pIPA/B抹，在培養溫度37°C、120rpm的條件下振蕩培養一夜。另外除不含氨千青黴素之外在相同的培養基組成及培養條件下振蕩培養大腸桿菌B野生抹。將全部量的各前培養液移至300mL容積的錐形瓶中，所述錐形瓶中加入了60mL含有0.1g/L氨千青黴素、20g/L葡萄糖的LBBroth,Miller培養液，進行培養。在攪拌速度120rpm、培養溫度37。C下進行培養。培養開始48小時後對菌體培養液取樣，通過離心操作除去菌體後，通過HPLC按照常用方法測定所得的培養上清液中的異丙醇、丁醇、乙醇、丙酮的蓄積量。結果示於表l。在大腸桿菌pIPA/B抹中，在培養48小時後確認了蓄積有2.1g/L的異丙醇。此時丁醇及乙醇沒有蓄積。表l]HPLC測定結果pIPA/B林野生株異丙醇2.1g/L0.0g/L丁醇0.0g/L0.0g/L乙醇0.0g/L0.0g/L丙酮0.1g/L0.0g/L24[實施例3]<使用1L培養槽由大腸桿菌pIPA/B抹生產異丙醇(1)〉在本實施例中，使用圖1所示的生產裝置IO進行處理。培養槽12使用1升容積的槽，捕集槽40使用500mL容積的槽。培養槽12、捕集槽40、注入管16、連接管30、排出管44均為玻璃制。在捕集槽40中，以400mL的量注入作為捕集液42的水(捕集水)。作為前培養，在試驗管中加入4mL含有0.1g/L氨節青黴素、2g/L葡萄糖的LBBroth,Miller培養液，接種在實施例1中得到的大腸桿菌pIPA/B抹，在培養溫度37°C、120rpm的條件下攪拌培養18小時。將全部量的前培養液接種到1L培養槽中進行培養，所述培養槽中加入了500mL含有0.1g/L氨千青黴素、20g/L葡萄糖、1滴ADEKANOL的LBBroth，Miller培養液。在攪拌速度500rpm、培養溫度37。C下進行培養，使用12.5%氨溶液將培養液的pH控制為7.0。另外，在從培養開始的第25小時添加20mL濃度為0.5g/mL的葡萄糖。從培養開始48小時後對菌體培養液進行取樣，通過離心操作除去菌體後，通過HPLC按照常用方法測定所得的培養上清液中的異丙醇、丁醇、乙醇、丙酮的蓄積量。結果示於表2。在大腸桿菌pIPA/B抹中，在培養48小時後確認了蓄積有3.0g/L的異丙醇。此時丁醇及乙醇沒有蓄積。需要說明的是，表2中的各測定值為培養後的培養液與捕集水(400mL)中的合計值。表2]HPLC測定結果pIPA/B林異丙醇3.0g/L丁醇0.0g/L乙醇0.0g/L丙酮0.9g/L已經報導了大腸桿菌的硫解酶及大腸桿菌的CoA轉移酶的胺基酸序列和基因的鹼基序列。即，編碼硫解酶的基因記載於在GenBankaccessionnumberU00096中記載的大腸桿菌MG1655株基因組序列的2324131~2325315中。另外編碼CoA轉移酶的基因記載於上述大腸桿菌MG1655抹基因組序列的2321469-2322781中。使它們與實施例1記載的來自梭狀芽孢桿菌屬細菌的乙醯乙酸脫羧酶基因、異丙醇脫氫酶基因一同表達，由此可以生產異丙醇。作為使上述基因組表達所必需的啟動子的鹼基序列，可以使用在GenBankaccessionnumberX02662的石鹹基序列信息中，記載於397-440中的來自大腸桿菌的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(以下有時稱為GAPDH)的啟動子序列。為了取得GAPDH啟動子，將大腸桿菌MG1655抹的基因組DNA用作模板，通過CGAGCTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG列號IO)按照PCR法進行擴增，將得到的DNA片段用限制酶NdeI、Sphl進行消化，由此得到約llObp的對應於GAPDH啟動子的DNA片段。將得到的DNA片段、和用限制酶Ndel及Sphl消化質粒pBR322(GenBankaccessionnumberJO1749)而4尋至'J的片l殳進4亍';昆合，4吏用連接酶連接後，轉化到大腸桿菌DH5a林感受態細胞(東洋紡織抹式會社DNA-903)中，在含有50(ig/mL氨苄青黴素的LB瓊脂板上繁殖，得到轉化體。將得到的菌落在含有50嗎/mL氨苄青黴素的LB液體培養基中於37。C下培養一夜，從得到的菌體中回收質粒pBRgapP。為了取得異丙醇脫氫酶基因，將ClostridiumbeijerinckiiNRRLB-593的基因組DNA用作模板，通過AATATGCATGCTGGTGGAACATATGAAAGGTTTTGCAATGCTAGG(序列號11)、及GCGG號12)按照PCR法進行擴增，將得到的DNA片段用限制酶SphI、BamHI進行消化，由此得到約l.lkbp的異丙醇脫氫酶片段。將所得到的DNA片段、與用限制酶Sphl及BamHI消化之前製備的質粒pBRgapP而得到的片段進行混合，使用連接酶連接後，轉化到大腸桿菌DH5a抹感受態細胞(東洋紡織抹式會社DNA-903)中，在含有50嗎/mL氨千青黴素的LB瓊脂板上繁殖，得到轉化體。將得到的菌落在含有50pig/mL氨節青黴素的LB液體培養基中於37。C下培養一夜，從得到的菌體中回收質粒pGAP-IPAdh。為了取得來自大腸桿菌的硫解酶基因，將大腸桿菌MG1655抹的基因糹且DNA用4乍才莫斧反，#4居ATGGATCCGCTGGTGGAACATATGAAAAATTGTGTCATCGTCAG(序列號13)、及GCAGAAGCTTGTCTAGATTAATTCAACCGTTCAATCACCATC(序歹'J號14)按照PCR法進行擴增，將得到的DNA片段用限制酶BamHI、HindIII進行消化，由此得到約1.2kbp的硫解酶片段。將得到的DNA片段、與用限制酶BamHI及HindIII消化之前製備的質粒pGAP-IPAdh而得到的片段進行混合，使用連接酶連接後，轉化到大腸桿菌DH5a抹感受態細胞(東洋紡織株式會社DNA-903)中，在含有50|ig/mL氨苄青黴素的LB瓊脂板上繁殖，得到轉化體。將得到的菌落在含有50pg/mL氨節青黴素的LB液體培養基中於37。C下培養一夜，從得到的菌體中回收質粒pGAP-IPAdh-atoB。為了取得來自大腸桿菌的CoA轉移酶基因，將大腸桿菌MG1655林的基因組DNA用作模板，根據GCTCTAGAGCTGGTGGAACATATGAAAACAAAATTGATGACATTACAAGAC(序列號15)、及列號16)按照PCR法進行擴增，將得到的DNA片段用限制酶Xbal、HindIII進行消化，由此得到約600bp的CoA轉移酶a亞基片段。將得到的DNA片段、與用限制酶XbaI及HindIII消化之前製備的質粒pGAP-IPAdh-atoB而得到的片段進行混合，使用連接酶連接後，轉化到大腸桿菌DH5a林感受態細胞(東洋紡織抹式會社DNA-903)中，在含有50嗎/mL氨節青黴素的LB瓊脂板上繁殖，得到轉化體。將得到的菌落在含有5(Hig/mL氨卡青黴素的LB液體培養基中於37。C下培養一夜，從得到的菌體中回收質粒pGAP-IPAdh-atoB-atoD。進而將大腸桿菌MG1655林的基因組DNA用作模板，通過G(序歹'J號17)、及GGCCAAGCTTCATAAATCACCCCGTTGC(序列號18)按照PCR法進行擴增，將得到的DNA片革殳用限制酶XhoI、HindIII進行消化，由此得到約600bp的CoA轉移酶|3亞基片段。將得到的DNA片段與用限制酶Xhol及HindIII消化之前製備的質粒pGAP_IPAdh-atoB-atoD而得到的片段進行混合，使用連接酶連接後，轉化到大腸桿菌DH5a株感受態細胞(東洋紡織抹式會社DNA-903)中，在含有50嗎/mL氨千青黴素的LB瓊脂板上繁殖，得到轉化體。將得到的菌落在含有50|ag/mL氨千青黴素的LB液體培養基中於37。C下培養一夜，從得到的菌體中回收質粒pGAP-IPAdh-atoB-atoD—atoA。為了取得乙醯乙酸脫羧酶基因，將ClostridiumacetobutylicumATCC824的基因組DNA用作模板，根據CAGGTACCGCTGGTG(序列號20)按照PCR法進行擴增，將得到的DNA片段用限制酶Kpnl、BamHI進行消化，由此得到約700bp的乙醯乙酸脫羧酶片段。將得到的DNA片段、與用限制酶Kpnl及BamHI消化之前製備的質粒pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA而得到的片萃爻進行混合，用連接酶連接後，轉化到大腸桿菌DH5a抹感受態細胞(東洋紡織抹式會社DNA-903)中，在含有50(ig/mL氨千青黴素的LB瓊脂板上繁殖，得到轉化體。將得到的菌落在含有50(ig/mL氨苄青黴素的LB液體培養基中於37。C下培養一夜，從得到的菌體中回收質粒pGAP_Ia亂將所述質粒pGAP-Iaaa轉化到大腸桿菌B抹(ATCC11303)感受態細胞中，在含有50|ag/mL氨千青黴素的LBBroth,Miller瓊脂板上於37。C下培養一夜，由此得到大腸桿菌pGAP-Iaaa/B抹。需要說明的是，大腸桿菌MG1655抹、ClostridiumacetobutylicumATCC824、大腸桿菌B抹可以從作為細胞.微生物'基因庫的美國標準生物品收藏中心獲得。[實施例5]<使用1L培養槽由大腸桿菌pGAP-Iaaa/B抹生產異丙醇(1)〉與實施例3同樣地進行使用1L培養槽的異丙醇生產研究。其中，作為前培養，使用加入到錐形瓶中的25mL含有0.1g/L氨千青黴素的LBBroth，Miller培養液，接種在實施例4中得到的大腸桿菌pGAP-Iaaa/B林，在培養溫度35°C、120rpm下攪拌培養16小時。將全部量的前培養液接種到1L培養槽中進行培養，所述培養槽中加入了475mL含有50g/L葡萄糖、1滴ADEKANOL的LBBroth,Miller培養液。在攪拌速度500rpm、培養溫度35°C下進行培養，使用24wt/wt%氫氧化鈉溶液將培養液的pH控制為7.0。從培養開始24小時後對菌體培養液進行取樣，通過離心操作除去菌體後，通過HPLC按照常用方法測定所得的培養上清液中的異丙醇、丁醇、乙醇的蓄積量。在培養24小時後確認了蓄積有5.5g/L的異丙醇。此時丁醇及乙醇沒有蓄積。另外48小時後的異丙醇的蓄積量為5.0g/L。需要說明的是，測定值為培養後的培養液與捕集水(改變為500mL)中的合計值。[實施例6]<使用IL培養槽由大腸桿菌pGAP-Iaaa/B抹生產異丙醇(2)〉與實施例5同樣地進行使用1L培養槽的異丙醇生產研究。但是，在1L培養槽中的培養使用475mL在表3中所示的組成的培養基。此時來自硫酸銨的氮原子的質量％相對於培養開始時的培養基總質量為0.04質量％。另外以10g/L/小時的流速添加50wt/wt%的葡萄糖水溶液。結果，在培養24小時後確認了蓄積有7.4g/L的異丙醇。此時沒有蓄積丁醇及乙醇。另外48小時後的異丙醇的蓄積量為6.2g/L。需要說明的是，測定值為培養後的培養液與捕集水(500mL)中的合計值。培養基組成多聚蛋白腖2g/LFeS04.7H200.09g/LK2HP042g/LKH2P042g/LMgS04'7H202g/L(NH4)2S042g/L(剩餘水)<使用IL培養槽由大腸桿菌pGAP-Iaaa/B抹生產異丙醇(3)〉與實施例6同樣地進行使用1L培養槽的異丙醇生產研究。但是，在1L培養槽中的培養在30小時後追加0.2質量％(2g/L)(NH4)2S04。本實施例中的來自硫酸銨的氮原子的質量％的總和相對於培養開始時的培養基總質量為0.08質量％。結果，在培養24小時後確認了蓄積有7.2g/L的異丙醇。此時沒有蓄積丁醇及乙醇。另外48小時後的異丙醇的蓄積量為13.4g/L。需要說明的是，測定值為培養後的培養液與捕集水(500mL)中的合計值。表明通過加入適量的硫酸銨這樣的氮源而提高了生產率。[實施例8]<使用1L培養槽由大腸桿菌pGAP-Iaaa/B抹生產異丙醇(4)〉與實施例6同樣地進行使用1L培養槽的異丙醇生產研究。但是，在1L培養槽中的培養中的培養基組成內，使(NH4)2S04的量為0.4質量％(4g/L)。本實施例中的來自硫酸銨的氮原子的質量％相對於培養開始時的培養基總質量為0.08質量％。結果，培養24小時後確認了蓄積有11.6g/L的異丙醇。需要說明的是，測定值為培養後的培養液與捕集水(500mL)中的合計值。表明通過加入適量硫酸銨這樣的氮源生產速度提高。[實施例9]<使用1L培養槽由大腸桿菌pGAP-Iaaa/B林生產異丙醇(5)〉30與實施例6同樣地進行使用1L培養槽的異丙醇生產研究。但是，在1L培養槽中的培養中的培養基組成內，使(NH4)2S04的量為0.5質量％(5g/L)。本實施例中的來自硫酸銨的氮原子的質量％相對於培養開始時的培養基總質量為0.11質量％。結果，培養24小時後確認了蓄積有11.2g/L的異丙醇。另外在55小時後確認了蓄積有21.3g/L的異丙醇。需要說明的是，測定值為培養後的培養液與捕集水(500mL)中的合計值。[實施例10]<使用1L培養槽由大腸桿菌pGAP-Iaaa/B株生產異丙醇(6)〉與實施例6同樣地進行使用1L培養槽的異丙醇生產研究。但是，pH調節劑使用12.5質量％的氨水。結果，培養24小時後確認了蓄積有13.3g/L的異丙醇。另外55小時後確認了蓄積有28.4g/L的異丙醇。至培養55小時後添加的12.5質量％氨水的質量為69.0g,本實施例中的來自氨水的氮原子的質量％總和相對於培養開始時的培養基總質量為0.73質量％。需要說明的是，測定值為培養後的培養液與捕集水(500mL)中的合計值。[實施例11]<使用1L培養槽由大腸桿菌pGAP-Iaaa/B抹生產異丙醇(7)〉與實施例6同樣地進行使用1L培養槽的異丙醇生產研究。但是，在1L培養槽中的培養中的培養基組成內，加入20g/L玉米浸漬液(日本食品化工制)代替2g/L多聚蛋白腖，使(NH4)2S04的量為5g/L。結果，培養24小時後確認了蓄積有10.9g/L的異丙醇。另外在55小時後確i/v了蓄積有17.8g/L的異丙醇。本實施例中的來自石克酸銨的氮原子的質量％的總和相對於培養開始時的培養基總質量為0.11質量%。需要說明的是，測定值為培養後的培養液與捕集水(500mL)中的合計值。表明作為培養基營養源可以利用廣泛的成分。[實施例12]<使用1L培養槽由大腸桿菌pIPA/B抹生產異丙醇(2)〉在與實施例3相同的條件下，進行使用1L培養槽的pIPA/B林的異丙醇培養研究。但是，培養開始時添加0.5%(5g/L)的(NH4)2S04。本實施例中的來自硫酸銨的氮原子的質量％相對於培養開始時的培養基總質量為0.11質量％。結果，培養48小時後確認了蓄積有4.5g/L的異丙醇。[實施例13]<利用蒸餾法從培養液中回收異丙醇〉作為供蒸餾的培養液，基於實施例3的方法培養pIPA/B抹，得到180g培養液。將其作為培養液A。將178.6g培養液A放入200mL容量的茄形瓶中，在油浴下邊攪拌邊加熱，按照常用方法進行簡單蒸餾。培養液A的各步驟中的塔頂溫度和液量示於表4。通過HPLC按照常用方法測定蒸餾前的培養液和通過蒸餾分離得到的液體及殘液中含有的異丙醇、丁醇、乙醇的含量。結果示於表5。可以從本實施例中的培養pIPA/B林後的培養液中，在塔頂溫度99.1~99.5。C下回收基本全部量的所含有的異丙醇。此時，從分離得到的溶液中未檢測到丁醇及乙醇。[比壽交例1]模擬在日本特開昭61—67493號公報中記載的Clostridium.sp.172CY-02抹的培養液組成，製備180g培養液，所述培養液在LBBroth,Miller培養液中加入了9.9g/L正丁醇、0.6g/L乙醇、7.2g/L異丙醇，將其作為比較培養液B。將177.9g比4交培養液B加入200mL容量的茄形瓶中，在油浴下邊攪拌邊加熱，按照常用方法進行簡單蒸餾。在比較培養液B的各步驟中的塔頂溫度和液量示於表4。通過HPLC按照常用方法測定在蒸餾前的溶液和通過蒸餾分離得到的液體及殘液中含有的異丙醇、丁醇、乙醇的含量。結果示於表5。在比較培養液B中，三種混合醇成分中特別是異丙醇和丁醇顯示出相同的餾出行為，不能單獨分離並回收異丙醇。從實施例13和比較例1的結果可知，由於本發明中的培養液不含除異丙醇之外的副生醇類所以可以容易地回收異丙醇。因此，可以從本發明的培養液中以簡單蒸餾等簡易的精製過程回收異丙醇。32另一方面，可知在利用現有菌的培養液中，難以分離異丙醇和副生醇類，不能容易地回收異丙醇。認為為了從利用現有菌的培養液中回收異丙醇，需要進行附加有精餾塔等設備的蒸餾，因而推測精製過程變得複雜。由上述內容可以說明本發明的異丙醇生產細菌在來自植物的異丙醇生產的實用化方面顯著優於現有技術。培養液A和比較培養液B的塔頂溫度和液量tableseeoriginaldocumentpage33HPIX觀'J定結果tableseeoriginaldocumentpage33實施例14]<試-驗例〉在本實施例中，使用圖1所示的生產裝置IO進行處理。培養槽12使用1升容積的槽，捕集槽40使用500mL容積的槽。培養槽12、捕集槽40、注入管16、連接管30、排出管44均為玻璃制。向捕集槽40中，以400mL的量注入作為捕集液42的水(捕集水)。將10g/L的異丙醇水溶液作為處理液注入500mL培養槽12中。在攪拌速度500rpm、處理溫度37°C下進行處理。然後，從注入管16以0.5L/min(lvvm)的速度向異丙醇水溶液中注入空氣，開始處理。來自培養槽12的排氣使捕集槽40中的捕集液42起泡。來自捕集槽40的排氣釋放到裝置體系外的空氣中。在處理開始0、2、4、8、24小時後對培養槽12內的處理液和捕集槽40內的捕集液42分別取樣，通過HPLC測定來測定樣品中異丙醇的蓄積量。需要說明的是，使用信和化工公司制、ULTRONPS-80H(8.0mmlD、300mmL),作為洗脫液使用0.1%HClO4,使流速為1.0mL/min、柱溫為50°C，檢測器使用示差折光率檢測器(RI),進行HPLC測定。結果示於表6。[表6]處理時間(小時)異丙醇蓄積量(g/L)處理液捕集水合計量010.10.010.129.81.211.048.52.410.987.13.810.9243.17.010.1如表6所示，培養槽12內的異丙醇的濃度隨時間減少，捕集液42中的異丙醇濃度慢慢增加。可知在經過24小時後的時間點培養槽內的異丙醇的70%由培養槽向水瓶移動。另外，此時的總異丙醇量為10.1g且物料平衡也基本一致。因此，可知通過使培養槽12內的通氣培養的排氣在捕集槽40內的捕集液42中起泡，可以將處理液中的異丙醇從處理液中分離，使其溶解於捕集液42中。34[實施例15]在本實施例中，使用與實施例3中使用的裝置相同的生產裝置IO生產異丙醇。需要說明的是，在捕集槽40中，以400mL的量注入作為捕集液42的水(捕集水)。作為前培養，在019mmx長度175mm的試驗管中，加入4mL含有0.1g/L氨千青黴素和2g/L葡萄糖的LBBroth，Miller培養液，接種在實施例1中得到的pIPA/B抹，在培養溫度37。C、120rpm下振蕩培養18小時。在含有500mLLBBroth，Miller培養液的培養槽12中接種4ml前培養液，開始培養，所述LBBroth，Miller培養液含有O.lg/L氨苄青黴素、20g/L葡萄糖和1滴ADEKANOL。在攪拌速度500rpm、培養溫度37。C下進行培養，使用12.5%氨水將培養液的pH調整為7.0。然後，從注入管16以0.5L/min(lvvm)的速度將空氣注入培養液中，開始通氣培養。來自培養槽12的排氣使捕集槽40中的捕集液42起泡。在從開始培養經23小時後的時間點，向培養槽內中添加20mL0.5g/L的葡萄糖溶液。〈樣品中的異丙醇的檢測〉從培養開始0、7、23、30、47及52小時後，對培養槽12中的處理後的培養液和捕集槽40中的處理後的捕集液42進行取樣。對取樣得到的培養液進行離心操作，由此除去培養液中的菌體等固形物。分別通過HPLC測定取樣得到的培養液及水中的、異丙醇的蓄積量。結果示於表7。進而，關於培養開始47小時後的培養液及捕集水，分別將培養液的HPLC測定時檢測得到的峰的數量、Rt時間(Retentiontime;保留時間)及化合物名示於表8，將捕集水的上述項目示於表9。需要說明的是，在表8及表9中"IPA"表示異丙醇。另外，在表tableseeoriginaldocumentpage36如表7~表9所示，確認了使用異丙醇生產細菌生產得到的異丙i於，通過通氣培養被蓄積在培養液和捕集水中。另外，對於從培養開始47小時後的培養液，確認了葡萄糖和乙月月月月厶；久月月\酸，除此之外確認了被推測為雜質的11個峰，但對於此時的捕集水，沒有除對應於異丙醇的峰之外的峰。因此，可知根據本生產方法，通過使來自培養槽12的排氣在捕集液42中起泡，可以容易地分離雜質和異丙醇。由此，從培養開始至異丙醇的回收，可以操作簡便、效率良好地回收異丙醇。進而可知可以在異丙醇的回收中4吏用水，由此得到沒有雜質的異丙醇水溶液。由此，在利用微生物培養的異丙醇生產的實用化中，可以說本發明是可以進行精製步驟負荷少的生產過程構築的劃時代的方法。<硫解酶基因缺失pIPA質粒的構築及該質粒轉化體的構築〉製作了從實施例1中記載的質粒pIPA中除去了硫解酶基因的質粒pIPAAthio。為了從pIPA中分離硫解酶啟動子，將pIPA用作模板，通過TTTGAATTCCATGATTTTAAGGGGGTTAGCATATGCA(序列號21)、及TTTTCTAGATCTAACTAACCTCCTAAATTTTGATACGGG(序列號22)按照PCR法進行擴增，將得到的片段用限制酶EcoRI和Kpnl進行消化，由此得到約240bp的硫解酶啟動子片段。進而為了從pIPA中分離異丙醇脫氫酶基因，將pIPA用作模板23)、及TTTGGTACCGCAGATTTTGCTACTCTTGGAGC(序列號24)按照PCR法進行擴增，將得到的片段用限制酶EcoRI和Xbal進行消化，得到約1.4kbp的異丙醇脫氫酶基因片段。將上述兩個DNA片段、與用限制酶EcoRI及Kpnl消化質粒pIPA而得到的4.9kbp的片段進行混合，使用連接酶連接後，轉化到大腸桿菌DH5a抹感受態細胞(東洋紡織抹式會社DNA-903)中，在含有100嗎/mL氨卡青黴素的LB瓊脂板上繁殖，得到轉化體。將得到的菌落在含有100jig/mL氨苄青黴素的LB液體培養基中於37。C下培養一夜，從得到的菌體中回收質粒pIPAAthio。根據常用方法確定pIPAAthio的鹼基序列，確認石克解酶啟動子和異丙醇脫氫酶基因的DNA序列無誤。將所述質粒pIPAAthio轉化到大腸桿菌B抹(ATCC11303)感受態細胞中，在含有10(Vg/mL氨千青黴素的LBBroth，Miller培養液瓊脂板上於37。C下培養一夜，由此得到轉化體pIPAAthio/B林。<使用1L培養槽由大腸桿菌pIPAAthio/B抹生產異丙醇〉與實施例3同樣地進行使用1L培養槽的異丙醇生產試驗。作為前培養，在試驗管中加入4mL的LBBroth,Miller培養液，所述LBBroth,Miller培養液含有0.1g/L氨千青黴素、2g/L葡萄糖，接種大腸桿菌pIPAAthio/B抹，在培養溫度37°C、120rpm下攪拌培養18小時。將全部量的前培養液接種到1L培養槽中進行培養，所述培養槽加入了500mL含有20g/L葡萄糖、1滴ADEKANOL的LBBroth,Miller培養液。在攪拌速度500rpm、培養溫度37°C下進行培養，使用12.5%氨溶液控制培養液的pH為7.0。另外，從培養開始至第72小時添加20mL濃度為0.5g/mL的葡萄糖。從培養開始經時地對菌體培養液進行取樣，通過離心操作除去菌體後，通過HPLC按照常用方法測定所得的培養上清液中的異丙醇的蓄積量。結果示於表10。需要說明的是，表10中的異丙醇量為培養後的培養液和捕集水中的合計值。由於在大腸桿菌pIPAAthio/B抹中導入了乙醯乙酸脫羧酶、異丙醇脫氬酶及CoA轉移酶的各基因，但沒有導入硫解酶基因，所以所述酶的活性來自其本身。但是，大腸桿菌pIPAAthio/B抹即使在培養72小時後也沒有異丙醇的蓄積。HPLC測定結果培養時間異丙醇—50.0g/L90.0g/L240.0g/L300.0g/L480.0g/L540.0g/L72O.Og/L製作了由實施例1中記載的質粒pIPA中除去了硫解酶基因和CoA轉移酶的質粒pIPAAthioActfAB。將pIPAAthio用限制酶Kpnl及BamHI進行消化，使用DNABluntingKit(TaKaRaBIO抹式會社)使DNA的末端平滑化進行連接後，轉化到大腸桿菌DH5a抹感受態細胞(東洋紡織林式會社DNA-卯3)中，在含有100|ag/mL氨節青黴素的LB瓊脂板上繁殖，得到轉化體。將得到的菌落在含有10(^g/mL氨苄青黴素的LB液體培養基中於37°C下培養一夜，從得到的菌體中回收質粒pIPAAthioActfAB。將所述質粒pIPAAthioActfAB轉化到大腸桿菌B抹(ATCC11303)感受態細胞中，在含有100昭/mL氨苄青黴素的LBBroth,Miller培養液(Difco244620)瓊脂板上於37。C下培養一夜,由此得到轉化體pIPAAthioActfAB/B抹。<使用1L培養槽由大腸桿菌pIPAAthioActfAB/B抹生產異丙醇〉與實施例3同樣地進行使用1L培養槽的異丙醇生產試驗。作為前培養，在試驗管中加入4mL的LBBroth,Miller培養液接種大腸桿菌pIPAAthioActfAB/B株，所述LBBroth,Miller培養液中含有0.1g/L氨苄青黴素、2g/L葡萄糖，在培養溫度37。C、120rpm下培養18小時。將全部量的前培養液接種到1L培養槽中進行培養，所述培養槽加入了500mL含有20g/L葡萄糖、1滴ADEKANOL的LBBroth,Miller培養液。在攪拌速度500rpm、培養溫度37°C下進行培養，使用12.5%氨溶液控制培養液的pH為7.0。另夕卜，從培養開始至第72小時添加20mL濃度為0.5g/mL的葡萄糖。從培養開始經時地對菌體培養液進行取樣，通過離心操作除去菌體後，通過HPLC按照常用方法測定所得的培養上清液中的異丙醇的蓄積量。結果示於表ll。需要說明的是，表ll中的異丙醇量為培養後的培養液和捕集水中的合計值。39由於在大腸桿菌pIPAAthioActfAB/B抹中導入乙醯乙酸脫羧酶及異丙醇脫氫酶的基因，但沒有導入硫解酶基因及CoA轉移酶基因，所以所述酶活性來自其本身。但是，大腸桿菌pIPAAthioActfAB/B抹在培養72小時後沒有異丙醇的蓄積。[表11]HPLC測定結果培養時間異丙醇00.0g/L90.0g/L240,Og/L300.0g/L480.0g/L540.0g/L720.0g/L由實施例1、2、3和比較例2及3的結果可知，根據本發明得到的大腸桿菌不僅要賦予乙醯乙酸脫羧酶及異丙醇脫氫酶活性，還必須賦予由原本在大腸桿菌的基因組中存在的硫解酶基因及CoA轉移酶基因所編碼的所述酶的活性，否則不能生產異丙醇。[實施例16]使用來自大腸桿菌的絲氨酸羥甲基轉移酶基因(glyA)啟動子代替實施例4的GAPDH啟動子。已知報導了大腸桿菌的絲氨酸羥曱基轉移酶的胺基酸序列和基因的石鹹基序列。即，編碼絲氨酸羥甲基轉移酶的基因記載於GenBankaccessionnumberV00283中。使用該啟動子，可以使異丙醇的生產中必需的基因組表達。為了取得glyA啟動子，將大腸桿菌MG1655林的基因組DNA40用作模板，通過TCGACCGGCTCCAGTTCG(序列號25)、及CTGTCGCATGCTGACTCAGCTAACAATAAAATTTTTGG(序列號26)按照PCR法進行擴增，將得到的DNA片段用限制酶Sphl進行消化，由此得到約850bp的對應於glyA啟動子的DNA片段。將得到的DNA片#爻和將質粒pBR322(GenBankaccessionnumberJ01749)用限制酶Ndel處理後通過T4DNA聚合酶處理進行平滑末端化進而用Sphl進行消化而得到的片段進行混合，使用連接酶連接後，轉化到大腸桿菌DH5a抹感受態細胞(東洋紡織抹式會社DNA-903)中，在含有50(ig/mL氨節青黴素的LB瓊脂板上繁殖，得到轉化體。將得到的菌落在含有50叫/mL氨苄青黴素的LB液體培養基中於37°C下培養一夜，從得到的菌體中回收質粒pBRglyP。以下，與實施例4同樣地操作，依次導入分別編碼石克解酶、CoA轉移酶、異丙醇脫氫酶、乙醯乙酸脫羧酶的基因，回收質粒pGly-將所述質粒pGly-Iaaa轉化到大腸桿菌B株(ATCC11303)感受態細胞中，在含有50|ig/mL氨苄青黴素的LBBroth，Miller瓊脂板中於37。C下培養一夜，由此得到大腸桿菌pGly-Iaaa/B株。[實施例17]<使用gadA啟動子構築來自大腸桿菌的硫解酶基因、來自大腸桿菌的CoA轉移酵基因、來自梭狀芽孢桿菌屬細菌的乙醯乙酸脫羧酶基因、來自梭狀芽孢桿菌屬細菌的異丙醇脫氫酶基因表達載體及該表達載體轉化體〉使用來自大腸桿菌的穀氨酸脫羧酶A基因(gadA)啟動子代替實施例4的GAPDH啟動子。已知報導了大腸桿菌的穀氨酸脫羧酶A的胺基酸序列和基因的石鹹基序列。即，編碼穀氨酸脫羧酶A的基因記載於GenBankaccessionnumberM84024中。可以使用所述啟動子，使異丙醇的生產中必需的基因組表達。為了取得gadA啟動子，將大腸桿菌MG1655抹的基因組DNA號27)、及CAGTCGCATGCTTCGAACTCCTTAAATTTATTTGAAGGC(序列號28)，按照PCR法進行擴增，將得到的DNA片段用限制酶Ndel、Sphl進行消化，由此得到約130bp的對應於gadA啟動子的DNA片段。將得到的DNA片段、和用限制酶Ndel及Sphl消化質粒pBR322(GenBankaccessionnumberJ01749)而得到的片段進行混合，使用連接酶連接後，轉化到大腸桿菌DH5ot抹感受態細胞(東洋紡織抹式會社DNA-903)中，在含有50嗎/mL氨苄青黴素的LB瓊脂板上繁殖，得到轉化體。將得到的菌落在含有5(Vg/mL氨苄青黴素的LB液體培養基中於37。C下培養一夜，從得到的菌體中回收質粒pBRgadP。以下，與實施例4同樣地操作，依次導入分別編碼硫解酶、CoA轉移酶、異丙醇脫氫酶、乙醯乙酸脫羧酶的基因，回收質粒pGad-將所述質粒pGad-Iaaa轉化到大腸桿菌B抹(ATCC11303)感受態細胞中，在含有50|ig/mL氨苄青黴素的LBBroth,Miller瓊脂板上於37。C下培養一夜，由此得到大腸桿菌pGad-laaa/B才朱。[實施例18]<使用1L培養槽由大腸桿菌pGly-Iaaa/B抹及pGad-Iaaa/B林生產異丙醇〉與實施例5同樣地進行使用1L培養槽利用大腸桿菌pGly-Iaaa/B抹及pGad-Iaaa的異丙醇生產研究。結果，培養24小時後確認了pGly-Iaaa/B抹蓄積有3.1g/L異丙醇，pGad_Iaaa/B抹蓄積有2.6g/L異丙醇。需要說明的是，測定值為培養後的培養液和捕集水(500mL)中的合計值。[實施例19]<在通氣量lvvm或2vvm下培養pGAP-Iaaa/B抹時的異丙醇的生產率〉在本實施例中，使用2臺除捕集槽的容量之外與在實施例5中使用的裝置相同的生產裝置10,生產異丙醇。需要說明的是，各捕集槽40的容量為2000mL,以2000mL的量注入作為捕集液42的水(捕集水)。作為前培養，使用加入到錐形瓶中的含有0.1g/L氨千青黴素的LBBroth,Miller培養液25mL，接種在實施例4中得到的大腸桿菌pGAP-Iaaa/B抹，在培養溫度35。C、120rpm下攪拌培養16小時。將全部量的前培養液接種到1L培養槽中進行培養，所述培養槽中加入了475mL含有50g/L葡萄糖、1滴ADEKANOL的LBBroth,Miller培養液。在攪拌速度500rpm、培養溫度35。C下進行培養，使用NaOH將培養液的pH調整為7.0。然後，在第一臺生產裝置中，從注入管16向培養液中注入空氣，使空氣為lwm,開始通氣培養。在第二臺生產裝置中，使用2根注入管16，向培養液中注入空氣和氮氣各lvvm、總通氣量為2vvm,開始通氣培養。來自培養槽12的排氣使捕集槽40中的捕集液42起泡。結果，培養24小時後，確認了通氣量為lwm時蓄積有5.5g/L的異丙醇，通氣量為2vvm時蓄積有3.3g/L的異丙醇。需要說明的是，測定值為培養後的培養液和捕集水中的合計值。捕集水中的異丙醇量是使水中的異丙醇濃度乘以4，換算為相當於培養液量而算出的。〈在通氣量lvvm或0.75vvm下培養pIPA/B^^時的異丙醇的生產率〉與實施例3同樣地進行pIPA/B林的培養研究。但是，使葡萄糖為40g/L,pH調節劑使用氨水。需要說明的是，各捕集槽40的容量為500mL,以500mL的量注入作為捕集液42的水(捕集水)。氣體使用空氣，使通氣量為lvvm或0.75vvm。結果，培養54小時後，確認了通氣量為lvvm時蓄積有2.8g/L的異丙醇，通氣量為0.75vvm時蓄積有2.8g/L的異丙醇。需說明的是，測定值為培養後的培養液和捕集水中的合計值。由實施例19和實施例20的結果，本申請發明人等發現存在適於異丙醇的生產的通氣量。發現注入培養槽中的總通氣量與2vvm相比為0.75~lvvm時更適於異丙醇的生產。綜上所述，根據本發明的實施方案，可以通過副生醇類少、無需副生醇的分離步驟僅進行簡單的精製、即可簡便且效率良好地生產進一步精製得到的異丙醇。由本發明得到的異丙醇可以用於各種用途，例如可以優選用作丙烯的製備原料。曰本申請號2007-181571公開的全部內容通過參照被引入本說明書中。對於本說明書中記載的全部的文獻、專利申請及4支術標準來說，各文獻、專利申請及技術標準通過參照被引入本說明書中與具體且分別記載的情況同等程度地通過參照被引入本說明書中。權利要求1、一種異丙醇生成細菌，所述異丙醇生成細菌被賦予乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、CoA轉移酶活性及硫解酶活性，可以由來自植物的原料生成異丙醇。2、如權利要求l所述的細菌，所述乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、CoA轉移酶活性及硫解酶活性是分別通過導入編碼來自下述細菌的各酶的基因而得到的，所述細菌是選自梭狀芽孢桿菌屬細菌、芽孢桿菌屬細菌及埃希氏菌屬細菌中的至少一種。3、如權利要求l所述的細菌，所述乙醯乙酸脫羧酶活性及異丙醇脫氫酶活性是通過導入編碼來自梭狀芽孢桿菌屬細菌的酶的基因而得到的，所述CoA轉移酶活性及硫解酶活性是通過導入編碼來自埃希氏菌屬細菌的酶的基因而得到的。4、如權利要求l所述的細菌，所述乙醯乙酸脫羧酶活性是通過導入編碼來自丙酮丁醇梭菌的酶的基因而得到的，所述異丙醇脫氫酶活性是通過導入編碼來自拜氏梭菌的酶的基因而得到的，所述CoA轉移酶活性及硫解酶活性是通過導入編碼來自大腸桿菌的酶的基因而得到的。5、如權利要求l所述的細菌，所述乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、CoA轉移酶活性及硫解酶活性是分別通過導入編碼來自梭狀芽孢桿菌屬細菌的各酶的基因而得到的。6、如權利要求l,所述的細菌，所述細菌為大腸桿菌，即Escherichiacoli。7、一種異丙醇生產方法，所述方法包括使用權利要求1~6中所述的異丙醇生成細菌，由來自植物的原料生產異丙醇。8、如權利要求7所述的異丙醇生產方法，其中，在含有所述異丙醇生產細菌及來自植物的原料的混合物中，進一步添加含有氮的化合物。9、如權利要求7所述的異丙醇生產方法，其中，在含有所述異丙醇生產細菌及來自植物的原料的混合物中添加在水中能夠生成銨離子的含氮化合物，含氮化合物的添加量以氮原子的總質量％計，相對於混合物中培養開始時的培養基的總質量為0.04%~10.6%10、如權利要求7所述的異丙醇的生產方法，所述方法包括一邊向含有所述異丙醇生產細菌及來自植物的原料的混合物中供給氣體一邊培養所述異丙醇生產細菌的培養步驟，和回收通過所述培養生成的異丙醇的回收步驟。11、如權利要求10所述的異丙醇的生產方法，所述氣體為含氧的氣體。12、如權利要求10所述的異丙醇的生產方法，其中，所述氣體的供給量為0.02v糧~2.0v糧。13、如權利要求10所述的異丙醇的生產方法，所述氣體的供給量為0.1vvm1.5vvm。14、如權利要求10所述的異丙醇的生產方法，所述回收步驟包括使從在所述培養步驟中得到的培養物中蒸發的異丙醇與用於捕集異丙醇的捕集液接觸。15、如權利要求10所述的異丙醇的生產方法，所述回收步驟包括使所述蒸發的異丙醇液化，然後與所述捕集液接觸。16、一種異丙醇生產裝置，所述裝置具有培養部，所述培養部收納含有權利要求1~6中所述的異丙醇生產細菌及來自植物的原料的混合物，和培養部中收納的混合物中的位置處開口，向所述混合物中供給氣體，和捕集部，所述捕集部收納捕集異丙醇的捕集液，和連接部，所述連接部連接所述培養部和所述捕集部，同時可以將在所述培養部內蒸發的異丙醇移動至所述捕集部。17、如權利要求16所述的異丙醇生產裝置，所述連接部為將在所述培養部內蒸發的異丙醇液化並供給於所述捕集部的液化部。18、如權利要求16所述的異丙醇生產裝置，所述裝置進一步具有攪拌在所述培養部內收納的所述混合物的攪拌部。全文摘要本發明提供一種異丙醇生成細菌，所述細菌被賦予乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、CoA轉移酶活性及硫解酶活性，可以由來自植物的原料生成異丙醇。本發明還提供一種包括使用所述異丙醇生產細菌由來自植物的原料生產異丙醇的異丙醇生產方法及用於該方法的裝置。文檔編號C12N15/09GK101688202SQ20088002390公開日2010年3月31日申請日期2008年7月4日優先權日2007年7月11日發明者吉見文伸,和田光史,望月大資,森重敬,渡邊清一,竹林望,高橋均申請人:三井化學株式會社