抗rsv疫苗的製作方法

2023-05-03 05:32:06

抗rsv疫苗的製作方法【專利摘要】本發明提供一種抗呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，該疫苗包含血清型(26)重組人類腺病毒，該重組人類腺病毒包含編碼RSVF蛋白質或其免疫活性部分的核酸。【專利說明】抗RSV疫苗[0001]本發明是關於醫藥領域。更具體地，本發明是關於抗RSV疫苗。[0002]發明背景[0003]在1950年代發現呼吸道合胞病毒（RSV)之後，該病毒很快即成為公認的與人類下呼吸道感染及上呼吸道感染相關的病原體。據估計，全世界每年出現64,000,000例RSV感染，導致160,000例死亡（WHO急性呼吸道感染，2009年9月更新）。最嚴重的疾病尤其在早產兒、老年人及免疫功能降低的個體中出現。在2歲以下兒童中，RSV為最常見的呼吸道病原體，佔因呼吸道感染而住院治療的約50%，且住院治療的峰值出現在2-4月齡。據報導，幾乎所有兒童至兩歲為止均受到RSV感染。終生反覆感染歸結於無效的自然免疫。老年人中RSV疾病負擔、死亡率及發病率的水平僅次於非泛流行性A型流感感染所引起的那些。[0004]RSV為副黏液病毒，屬於肺病毒亞科。RSV的基因組編碼多種蛋白質，包括稱為RSV糖蛋白（G)及RSV融合（F)蛋白質的膜蛋白，這些膜蛋白為中和抗體的主要抗原標靶。融合蛋白質前體（FO)的蛋白質裂解產生經由二硫橋鍵連接的兩個多肽Fl及F2。抗Fl蛋白質的融合介導部分的抗體可阻止細胞中的病毒吸收且因此具有中和作用。除作為中和抗體的標靶外，RSVF含有細胞毒性T細胞抗原決定基（Pemberton等人，1987,J.Gen.Virol.68:2177-2182)。[0005]RSV感染的治療選項包括抗RSV的F蛋白質的單克隆抗體。與此類單克隆抗體相關的高成本及醫院配置中對投藥的要求排除了其大規模用於危險群體預防的用途。因此，需要一種RSV疫苗，其優選地可用於小兒群體以及老年人。[0006]儘管歷經50年研究，但仍無獲準的抗RSV疫苗。疫苗開發的一個主要障礙為在1960年代使用福馬林不活化（formalin-inactivated，FI)RSV疫苗的臨床試驗中遺留的疫苗增強疾病。FI-RSV接種疫苗的兒童未受到保護以免於自然感染，且受感染兒童遭受比未接種疫苗的兒童更嚴重的疾病，包括兩例死亡。此現象稱為'增強疾病'。[0007]自使用FI-RSV疫苗的試驗以來，已實行多種方法來產生RSV疫苗。嘗試包括RSV的傳統活減毒冷繼代病毒株或溫度敏感性突變病毒株、（嵌合）蛋白亞單位疫苗、肽疫苗及由重組病毒載體表達的RSV蛋白質。雖然此等疫苗中的一些疫苗展示具前途的臨床前數據，但因安全性問題或缺乏功效而尚無疫苗獲準供人類使用。[0008]腺病毒載體用於製備多種疾病的疫苗，包括與RSV感染相關的疾病。以下段落提供已描述的基於腺病毒的RSV候選疫苗的實例。[0009]在一種方法中，已將RSV.F插入4型、5型及7型複製勝任型腺病毒的非必需E3區中。棉鼠鼻內（i.η.)施用IO7Pfu的免疫接種具有適度免疫原性，且保護下呼吸道免受RSV攻擊，但不保護上呼吸道免受RSV攻擊（Connors等人，1992,Vaccine10:475-484;Collins,P.L.,Prince,G.A.,Camargo,E.,Purcell,R.Η.,Chanock,R.M.及Murphy,B.R.Evaluationoftheprotectiveefficacyofrecombinantvacciniavirusesandadenovirusesthatexpressrespiratorysyncytialvirusglycoproteins.Vaccines90:ModernApproachestoNewVaccinesincludingpreventionofAIDS(Brown,F.,Chanock,R.M.,Ginsberg,H.及Lerner,R.A.編）ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，1990,第79-84頁）。黑猩猩的後續經口免疫接種具有不良免疫原性(Hsu等人，1992,JInfectDis.66:769-775)。[0010]在其他研究中（Shao等人，2009,Vaccine27:5460-71;US2011/0014220)，帶有編碼RSV-Bl病毒株的F蛋白質的跨膜截短（rAd-FOATM)或全長（rAd-FO)型式的核酸的兩種重組複製勝任不能型腺病毒5載體經工程改造且經由鼻內途徑給予BALB/c小鼠。動物經鼻內初打IO7Pfu且在28天後鼻內加打相同劑量。雖然抗RSV-Bl抗體中和RSV-Long及RSV-A2病毒株且與其交叉反應，但使用此等載體的免疫接種僅部分防止RSVBl攻擊複製。使用rAd-F0ΛTM的（部分）保護略高於使用rAd-F0。[0011]在另一研究中，觀測到使用表達野生型RSVF(FG-Ad-F)的複製缺陷型（基於Ad5)FG-Ad腺病毒的IO11個病毒粒子對BALB/c小鼠進行鼻內免疫接種與對照組相比肺病毒效價僅減小I.51og10(Fu等人，2009,Biochem.Biophys.Res.Commun.381:528-532)。[0012]在其他研究中，觀測到鼻內施用的表達RSVA2的F蛋白質的密碼子優化可溶性Fl片段（胺基酸155-524)的基於Ad5的複製缺陷型腺病毒載體（IO8PFU)與對照小鼠相比可減少BALB/c小鼠肺中的RSV攻擊複製，但由肌肉內（i.m.)途徑免疫接種的小鼠未展現出抗攻擊的任何保護（Kim等人，2010,Vaccine28:3801-3808)。[0013]在其他研究中，使用基於Ad5且帶有密碼子優化全長RSVF(AdV-F)或可溶性形式的RSFF基因（AdV-Fsol)的腺病毒載體以IX101CI0PU(光學粒子單位：1XIOiciOPU的劑量相當於2X108GTU(基因轉導單位））的劑量對BALB/c小鼠免疫接種兩次。在鼻內免疫接種之後，此等載體大大減少肺內病毒負荷，但在皮下（s.c.)或肌肉內施用後僅部分減少肺內病毒負荷（Kohlmann等人，2009,JVirol83:12601-12610;US2010/0111989)。[0014]在其他研究中，觀測到肌肉內施用的表達RSVA2病毒株的定序F蛋白質cDNA的基於Ad5的複製缺陷型重組腺病毒載體（101°個粒子單位）與對照小鼠相比可僅部分減少BALB/c小鼠肺中的RSV攻擊複製（Krause等人，2011，VirologyJournal8:375-386)。[0015]除了在許多情況下並不完全有效以外，在臨床評估下供小兒使用的RSV疫苗及在臨床前評估下的大多數疫苗為鼻內疫苗。鼻內策略的最重要優勢在於直接刺激局部呼吸道免疫性且不存在相關的疾病增強。實際上，一般用於鼻內投藥的例如基於腺病毒的RSV候選疫苗的功效與肌肉內投藥相比似乎較佳。然而，鼻內接種疫苗亦在不到6個月大的嬰兒中引起安全性問題。在所有年齡層中，鼻內疫苗最常見的不良反應為流鼻涕或鼻充血。新生兒為強制型鼻腔呼吸者且因此必須經鼻呼吸。因此，頭幾個月大的嬰兒鼻充血可幹擾哺乳，且在極少情況下可導致嚴重呼吸問題。[0016]已鑑別超過50種不同人類腺病毒血清型。其中，過去已研究最廣泛地用作基因載運體的血清型5腺病毒（Ad5)。然而，不同血清型的重組腺病毒載體可產生關於誘導免疫反應及保護的不同結果。舉例而言，WO2012/021730描述編碼F蛋白質的血清型7猴腺病毒載體及血清型5人類腺病毒載體與血清型28人類腺病毒載體相比提供較佳抗RSV保護。此外，觀測到基於人類或非人類腺病毒血清型的載體的差異免疫原性（Abbink等人，2007,JVirol81:4654-4663;Colloca等人，2012,SciTranslMed4,115ra2)。Abbink等人得出結論：在不存在抗Ad5免疫性的情況下，所研究的所有稀少血清型人類rAd載體不如rAd5載體有效。另外，近來已描述，雖然具有伊波拉病毒（Ebolavirus，EB0V)糖蛋白（gp)轉基因的rAd5保護100%非人類靈長類動物，但具有EBOVgp轉基因的rAd35及rAd26僅提供部分保護，且此等載體需要異源初打-加打策略來獲得抗伊波拉病毒攻擊的完全保護(Geisbert等人，2011，JVirol85:4222-4233)。因此，事前不可能僅基於另一腺病毒血清型的數據預測重組腺病毒疫苗的功效。[0017]此外，對於RSV疫苗，需要在適當疾病模型（諸如棉鼠）中進行實驗以判定疫苗候選物是否足以有效防止RSV在鼻道及肺中複製且同時為安全的，亦即不導致增強疾病。這些候選疫苗優選地應在這些模型中極其有效，甚至在肌肉內投藥時仍如此。[0018]因此，仍需要不導致增強疾病的有效疫苗及接種抗RSV疫苗的方法。本發明旨在提供此類疫苗及以安全且有效的方式接種抗RSV疫苗的方法。[0019]發明概沭[0020]本發明的發明人驚訝地發現包含編碼RSVF蛋白質的核苷酸序列的血清型26重組腺病毒（Ad26)為明確建立的棉鼠模型中極有效的抗RSV疫苗，且與先前關於編碼RSVF的Ad5所述的數據相比具有改良的功效。據證實，即使單次投與、甚至肌肉內投與編碼RSVF的Ad26仍足以提供抗攻擊性RSV複製的完全保護。[0021]本發明提供一種抗呼吸道合胞病毒（RSV)疫苗，該疫苗包含血清型26重組人類腺病毒，該重組人類腺病毒包含編碼RSVF蛋白質或其片段的核酸。[0022]在某些實施例中，重組腺病毒包含編碼RSVF蛋白質的核酸，該RSVF蛋白質包含SEQIDNO:1的胺基酸序列。[0023]在某些實施例中，編碼RSVF蛋白質的核酸是針對在人類細胞中的表達進行密碼子優化。[0024]在某些實施例中，編碼RSVF蛋白質的核酸包含SEQIDNO:2的核酸序列。[0025]在某些實施例中，重組人類腺病毒的腺病毒基因組的El區中具有缺失、E3區中具有缺失或El區與E3區中均具有缺失。[0026]在某些實施例中，重組腺病毒具有在5'末端包含序列CTATCTAT的基因組。[0027]本發明另外提供一種對受試者接種抗RSV疫苗的方法，該方法包含向該受試者投與本發明的疫苗。[0028]在某些實施例中，疫苗經肌肉內投與。[0029]在某些實施例中，將本發明的疫苗投與受試者一次以上。[0030]在某些實施例中，對受試者接種抗RSV疫苗的方法另外包含向該受試者投與包含血清型35重組人類腺病毒的疫苗，該重組人類腺病毒包含編碼RSVF蛋白質或其片段的核酸。[0031]在某些實施例中，對受試者接種抗RSV疫苗的方法另外包含向該受試者投與RSVF蛋白質（優選地調配成醫藥組合物，因此為蛋白質疫苗）。[0032]在某些實施例中，接種疫苗的方法由向受試者單次投與疫苗組成。[0033]本發明亦提供一種減少例如受試者鼻道及肺中RSV感染和/或複製的方法，其包含通過肌肉內注射向該受試者投與包含血清型26重組人類腺病毒的組合物，該重組人類腺病毒包含編碼RSVF蛋白質或其片段的核酸。在投與疫苗時，此方法將減少由受試者中的RSV感染引起的不良影響，且因此有助於保護受試者免受這些不良影響。在某些實施例中，可基本上預防RSV感染的不良影響，亦即降至使其臨床上不相關的低水平。重組腺病毒可呈本發明的疫苗形式，包括上文所述的實施例。[0034]本發明亦提供一種包含血清型26重組人類腺病毒的經分離的宿主細胞，該重組人類腺病毒包含編碼RSVF蛋白質或其片段的核酸。[0035]本發明另外提供一種製造抗呼吸道合胞病毒（RSV)疫苗的方法，其包含提供包含編碼RSVF蛋白質或其片段的核酸的血清型26重組人類腺病毒，使所述重組腺病毒在宿主細胞培養物中增殖，分離並純化該重組腺病毒，並將該重組腺病毒調配於醫藥學上可接受的組合物中。這方面的重組人類腺病毒亦可為上述實施例中所述的任何腺病毒。[0036]本發明亦提供一種形成血清型26重組人類腺病毒的基因組的經分離的重組核酸，該重組人類腺病毒包含編碼RSVF蛋白質或其片段的核酸。腺病毒亦可為如上述實施例中所述的任何腺病毒。[0037]附圖簡要說明[0038]圖1展示在使用不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26㈧及rAd35(B)的載體免疫接種時，在免疫接種後2周及8周，小鼠的抗重迭F的胺基酸1-252的F肽及抗重迭F的胺基酸241-574的F肽的細胞免疫反應。[0039]圖2展示在使用不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26及rAd35的載體免疫接種時，在免疫接種後2周及8周，小鼠的抗RSV抗體反應。[0040]圖3展示在使用IOltVp的具有RSVF基因的基於rAd26及rAd35的載體免疫接種時，在免疫接種後8周，小鼠的抗RSVIgG2a抗體反應與抗RSVIgGl抗體反應的比率的結果。[0041]圖4展示在使用不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26(A)及rAd35(B)的載體免疫接種時，在免疫接種後2周及8周，小鼠的抗RSVLong的病毒中和能力。[0042]圖5展示在使用具有RSVF基因的基於rAd26及rAd35的載體進行初打-加打免疫接種時，在初次免疫接種後6周及12周，小鼠的抗（A)重迭F的胺基酸1-252的F肽及抗（B)重迭F的胺基酸241-574的F肽的細胞免疫反應。[0043]圖6展示在使用具有RSVF基因的基於rAd26及rAd35的載體進行初打-加打免疫接種時，在第一次免疫接種後的不同時間點，小鼠的抗RSV抗體反應。[0044]圖7展示在使用不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26及rAd35的載體進行初打-加打免疫接種時，在第一次免疫接種後的不同時間點，小鼠血清中抗RSVLong的病毒中和能力。[0045]圖8展示在使用不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26及rAd35的載體進行初打-加打免疫接種時，在第一次免疫接種後的不同時間點，小鼠的抗RSVBl的病毒中和能力。[0046]圖9展示在使用不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26及rAd35的載體進行初打-加打免疫接種後，在攻擊後5天，棉鼠的A)RSV肺效價及B)RSV鼻效價。[0047]圖10展示在使用不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26及rAd35的載體進行初打-加打免疫接種後，在第一次免疫接種後A)28天及B)49天誘導的病毒中和效價。[0048]圖11展示在使用不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26及rAd35的載體進行初打-加打免疫接種後，在處死當天棉鼠肺部的組織病理學檢查。[0049]圖12展示在經由不同途徑投與不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26及rAd35的載體進行單次劑量免疫接種後，在攻擊後5天，棉鼠的A)RSV肺效價及B)RSV鼻效價。[0050]圖13展示在經由不同途徑投與不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26及rAd35的載體進行單次劑量免疫接種後，在第一次免疫接種後28天及49天誘導的病毒中和效價。[0051]圖14展示在處死當天使用不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26及rAd35的載體進行單次劑量免疫接種（i.m.)後，在處死當天棉鼠肺部的組織病理學檢查。[0052]圖15展示包含具有編碼RSVF的序列的Ad35及Ad26基因組左端的質粒圖譜：[0053]A.pAdApt35BSU.RSV.F(A2)nat，及B.pAdApt26.RSV.F(A2)nat[0054]圖16展示在第0天或第28天使用不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26的載體進行單次劑量免疫接種後，在攻擊後5天，棉鼠的A)RSV肺效價及B)RSV鼻效價。第49天進行攻擊。[0055]圖17展示在使用不同劑量的具有RSVF基因的rAd26進行單次劑量免疫接種後，在如圖16所述的免疫接種後49天誘導的病毒中和效價。[0056]圖18展示在使用不同劑量的具有RSVF基因的rAd26進行單次劑量免疫接種後，在免疫接種後的時間內誘導的病毒中和效價[0057]圖19展示在使用源於經IOkiAcI-RSVF或無轉基因（Ache)免疫接種的棉鼠的血清對抗RSVLong及RSVBwash之後49天的VNA效價。PB:初打-加打。[0058]圖20展示在第0天使用不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26的載體進行單次劑量免疫接種後，在使用RSVA2或RSVB15/97攻擊後5天，棉鼠的RSV肺效價。[0059]圖21展示在第0天使用不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26的載體進行單次劑量免疫接種後，在使用RSVA2或RSVB15/97攻擊後5天，棉鼠的RSV鼻效價。[0060]圖22展示在第0天使用不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26的載體進行單次劑量免疫接種後，在初打後的不同時間點，棉鼠血清中的VNA效價。[0061]圖23展示在第0天使用不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26的載體進行單次劑量免疫接種後，在使用標準劑量（1〇5)或高劑量（5XIO5)RSVA2攻擊後5天，棉鼠的RSV肺效價。[0062]圖24展示在第0天使用不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26的載體進行單次劑量免疫接種後，在使用標準劑量（1〇5)或高劑量（5XIO5)RSVA2攻擊後5天，棉鼠的RSV鼻效價。[0063]圖25展示在第0天及第28天使用不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26的載體的單次免疫接種或初打-加打免疫接種進行免疫接種後，在攻擊後5天，棉鼠的RSV肺效價，其中在免疫接種後210天進行攻擊。[0064]圖26展示在單次劑量免疫接種及初打-加打免疫接種後，在免疫接種後140天，棉鼠的VNA效價[0065]圖27展示在使用不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26的載體進行單次免疫接種或初打-加打免疫接種後，在攻擊後2天，處死的棉鼠肺部的組織病理學檢查。點表示中位數及第25百分位數與第75百分位數的須（whisker)。[0066]圖28展示在使用不同劑量的具有RSVF基因的基於rAd26的載體進行單次免疫接種或初打-加打免疫接種後，在攻擊後6天，處死的棉鼠肺部的組織病理學檢查。點表示中位數及第25百分位數與第75百分位數的須。[0067]圖29展示在使用具有RSVF基因的rAd26(Ad26.RSV.F)免疫接種，繼而使用Ad26.RSV.F或使用輔助型RSVF蛋白質（post-F)加打後誘導的病毒中和效價。[0068]圖30展示在使用Ad26.RSV.F免疫接種，繼而使用Ad26.RSV.F加打或使用輔助型RSVF蛋白質（post-F)加打後，IgG2a及IgGl抗體的誘導及其比率。[0069]圖31展示在使用Ad26.RSV.F免疫接種，繼而使用Ad26.RSV.F或使用輔助型RSVF蛋白質（post-F)加打後，脾細胞產生IFN-g的情況。[0070]本發明的詳細描沭[0071]如本文中所用，關於腺病毒的術語'重組'暗指其已經人工修飾，例如其已改變其中主動克隆的末端和/或其包含異源基因，亦即其並非天然存在的野生型腺病毒。[0072]如本領域中所慣用，本文中的序列自5'至3'方向提供。[0073]"腺病毒衣殼蛋白"是指在測定特定腺病毒的血清型和/或向性時所涉及的腺病毒衣殼上的蛋白質。腺病毒衣殼蛋白通常包括纖維蛋白、五鄰體蛋白和/或六鄰體蛋白。本發明的具有（或'基於'）特定血清型的腺病毒通常包含該特定血清型的纖維蛋白、五鄰體蛋白和/或六鄰體蛋白，且優選地包含該特定血清型的纖維蛋白、五鄰體蛋白及六鄰體蛋白。此等蛋白質通常由重組腺病毒的基因組編碼。具有特定血清型的重組腺病毒可任選地包含和/或編碼來自其他腺病毒血清型的其他蛋白質。因此，作為非限制性實例，包含Ad26的六鄰體、五鄰體及纖維的重組腺病毒視為基於Ad26的重組腺病毒。[0074]重組腺病毒是'基於'如本文中所用的腺病毒，至少在序列上源於野生型。此可通過使用野生型基因組或其部分作為起始物質進行分子克隆來實現。亦可使用野生型腺病毒基因組的已知序列以通過DNA合成重新產生基因組（的部分），DNA合成可由DNA合成和/或分子克隆領域中的商業性服務公司（例如GeneArt、Invitrogen、GenScripts、Eurofins)使用常規程序來進行。[0075]普通技術人員應了解，許多不同聚核苷酸及核酸可由於遺傳密碼的簡併性而編碼相同多肽。亦應了解，普通技術人員可使用常規技術進行不會影響由此處所述的聚核苷酸編碼的多肽序列的核苷酸取代，從而反映欲表達多肽的任何具體宿主生物體的密碼子使用。因此，除非另有規定，否則"編碼胺基酸序列的核苷酸序列"包括彼此呈簡併型式且編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質及RNA的核苷酸序列可包括內含子。[0076]在一個優選的實施例中，編碼RSVF蛋白質或其片段的核酸是針對在哺乳動物細胞（諸如人類細胞）中的表達進行密碼子優化。密碼子優化方法為已知的且先前已有描述（例如WO96/09378)。RSVF蛋白質的特定密碼子優化序列的一個實例描述於EP2102345B1的SEQIDN0:2中。[0077]在一個實施例中，RSVF蛋白質來自RSVA2病毒株且具有SEQIDNO:1的胺基酸序列。在一個尤其優選的實施例中，編碼RSVF蛋白質的核酸包含SEQIDN0:2的核酸序列。發明人已發現，此實施例產生穩定表達且此實施例的疫苗甚至在肌肉內投與單次劑量之後仍在鼻道及肺中提供抗RSV複製的保護。[0078]如本文中所用的術語"片段"是指具有氨基端和/或羧基端和/或內部缺失，但剩餘胺基酸序列與RSVF蛋白質序列（例如RSVF蛋白質的全長序列）中的相應位置相同的肽。應了解，出於誘導免疫反應及一般出於接種疫苗的目的，蛋白質無須為全長的，亦無須具有所有其野生型功能，且該蛋白質的片段同等適用。實際上，如可溶性Fl或F的RSVF蛋白質片段已顯示如同全長F-般可有效誘導免疫反應（Shao等人，2009,Vaccine27:5460-71;Kohlmann等人，2009,JVirol83:12601-12610)。將對應於胺基酸255-278或412-524的F蛋白質片段併入主動免疫接種中會誘導中和抗體及抗RSV攻擊的某種保護(Sing等人，2007,Virol.Immunol.20,261-275;Sing等人，2007,Vaccine25,6211-6223)。[0079]本發明的片段為免疫活性片段，且通常包含RSVF蛋白質的至少15個胺基酸或至少30個胺基酸。在某些實施例中，其包含RSVF蛋白質的至少50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500或550個胺基酸。[0080]普通技術人員亦應了解，可例如使用常規分子生物學程序，例如通過胺基酸取代、缺失、添加等對蛋白質作出改變。一般而言，可在不損失多肽的功能或免疫原性的情況下應用保守胺基酸取代。此可根據普通技術人員熟知的常規程序而容易地檢查。[0081]術語"疫苗"是指含有有效誘導受試者的抗特定病原體或疾病的治療程度的免疫性的活性組分的試劑或組合物。在本發明中，疫苗包含有效量的編碼RSVF蛋白質的重組腺病毒或其抗原片段，其引起抗RSVF蛋白質的免疫反應。這提供一種為受試者預防因RSV感染及複製而導致住院治療的嚴重下呼吸道疾病且減少因RSV感染及複製而引起的併發症（諸如肺炎及細支氣管炎）的頻率的方法。因此，本發明亦提供一種為受試者預防或減少由RSV引起的嚴重下呼吸道疾病、預防或減少（例如縮短）由RSV引起的住院治療、和/或降低由RSV引起的肺炎或細支氣管炎的頻率和/或嚴重程度的方法，其包含通過肌肉內注射向該受試者投與包含血清型26重組人類腺病毒的組合物，該重組人類腺病毒包含編碼RSVF蛋白質或其片段的核酸。本發明的術語"疫苗"意指其為醫藥組合物，且因此通常包括醫藥學上可接受的稀釋劑、運載劑或賦形劑。其可能包含或可能不包含其他活性成分。在某些實施例中，其可為另外包含誘導免疫反應（例如抗RSV的其他蛋白質和/或抗其他感染物）的其他組分的組合疫苗。[0082]本發明的載體為重組腺病毒，亦稱為重組腺病毒載體。重組腺病毒載體的製備在本領域中為熟知的。[0083]在某些實施例中，本發明的腺病毒載體缺乏病毒複製所需的腺病毒基因組El區(例如Ela區和/或Elb區）的至少一個必需基因功能。在某些實施例中，本發明的腺病毒載體缺乏非必需E3區的至少一部分。在某些實施例中，載體缺乏El區的至少一個必需基因功能及非必需E3區的至少一部分。腺病毒載體可為"多重缺乏"的，意謂腺病毒載體的腺病毒基因組的兩個或兩個以上區中各自缺乏一或多個必需基因功能。舉例而言，前述El缺乏或E1、E3缺乏腺病毒載體可另外缺乏E4區的至少一個必需基因和/或E2區（例如E2A區和/或E2B區）的至少一個必需基因。[0084]腺病毒載體、其構建方法及其增殖方法在本領域中為熟知的且描述於以下文獻中：例如美國專利第5,559,099號、第5,837,511號、第5,846,782號、第5,851，806號、第5,994,106號、第5,994,128號、第5,965,541號、第5,981，225號、第6,040,174號、第6,020,191號及第6,113,913號，及ThomasShenk,"AdenoviridaeandtheirReplication"，M.S.Horwitz，"Adenoviruses"，分別在第67章及第68章，Virology，B.N.Fields等人編，第3版，RavenPress,Ltd.,NewYork(1996)，及本文中所提及的其他參考文獻。腺病毒載體的構建通常涉及使用標準分子生物學技術，諸如以下文獻中所述的技術：例如Sambrook等人，MolecularCloning,aLaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989),Watson等人，RecombinantDNA，第2版，ScientificAmericanBooks(1992),及Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,NY(1995)，及本文中所提及的其他參考文獻。[0085]根據本發明，腺病毒為血清型26人類腺病毒。本發明的基於此血清型的疫苗以及基於Ad35的疫苗令人驚訝地似乎比先前技術中所述的基於Ad5的疫苗更有效，這是因為先前技術中所述的那些疫苗在單次肌肉內投與後無法提供抗RSV攻擊複製的完全保護(Kim等人，2010,Vaccine28:3801-3808;Kohlmann等人，2009,JVirol83:12601-12610;Krause等人，2011，VirologyJournal8:375)。本發明的血清型另外一般在人類群體中具有低血清流行率和/或低原有中和抗體效價。在臨床試驗中評估具有不同轉基因的此血清型的重組腺病毒載體及Ad35重組腺病毒載體，且迄今顯示具有極佳安全型態。rAd26載體的製備描述於例如WO2007/104792及Abbink等人，（2007)Virol81(9):4654-63中。Ad26的例示性基因組序列見於GenBank保藏號EF153474及WO2007/104792的SEQIDNO:1中。rAd35載體的製備描述於例如美國專利第7,270,811號、WO00/70071及Vogels等人，（2003)JVirol77(15):8263-71中。Ad35的例示性基因組序列見於GenBank保藏號AC_000019及WO00/70071的圖6中。[0086]本發明的重組腺病毒可為複製勝任型或複製缺陷型。[0087]在某些實施例中，腺病毒例如由於其在基因組的El區中含有缺失而為複製缺陷型。如普通技術人員所知，在腺病毒基因組缺失必需區的情況下，由此等區編碼的功能必須反式（intrans)提供，優選地由生產細胞提供，亦即當腺病毒缺失部分或整個E1、E2和/或E4區時，此等區必須存在於生產細胞中，例如整合於其基因組中或呈所謂的輔助腺病毒或輔助質粒形式。腺病毒亦可在並非複製所必需的E3區中具有缺失，且因此無須補充此種缺失。[0088]可使用的生產細胞（有時在本領域中及本文中亦稱為'包裝細胞'或'補充細胞'或'宿主細胞'）可為可使所需腺病毒增殖的任何生產細胞。舉例而言，重組腺病毒載體的增殖是在補充腺病毒中的缺陷的生產細胞中進行。這些生產細胞優選地在其基因組中具有至少腺病毒El序列，且由此能夠補充El區缺失的重組腺病毒。可使用任何補充El的生產細胞，諸如由El永生化的人類視網膜細胞，例如911或PER.C6細胞（參見美國專利5,994,128)，El轉化的羊水細胞（參見EP專利1230354)、El轉化的A549細胞（參見例如TO98/39411、美國專利5,891，690)、6!1329:拖1^(63〇等人，2000，！11111^11661161116四口711:213-219)、293及其類似細胞。在某些實施例中，生產細胞為例如HEK293細胞、或PER.C6細胞、或911細胞、或IT293SF細胞及其類似細胞。[0089]對於非亞群CEl缺乏型腺病毒，諸如Ad35(亞群B)或Ad26(亞群D)，優選地將此等非亞群C腺病毒的E4_orf6編碼序列與亞群C腺病毒（諸如Ad5)的E4_orf6交換。這使得這些腺病毒可在表達Ad5的El基因的熟知補充細胞株（諸如293細胞或PER.C6細胞）中增殖（參見例如Havenga等人，2006,J.Gen.Virol.87:2135-2143;TO03/104467,以全文引用的方式併入本文中）。在某些實施例中，可使用的腺病毒為血清型35人類腺病毒，其在已克隆編碼RSVF蛋白質抗原的核酸的El區中具有缺失，且具有Ad5的E4orf6區。在某些實施例中，本發明的疫苗組合物中的腺病毒為血清型26人類腺病毒，其在已克隆編碼RSVF蛋白質抗原的核酸的El區中具有缺失，且具有Ad5的E4orf6區。[0090]在替代性實施例中，無須將（例如Ad5的）異源E4orf6區置於腺病毒載體中，取而代的的是在表達El與兼容E4orf6的細胞株，例如表達Ad5的El與E4orf6的293-0RF6細胞株中使El缺乏型非亞群C載體增殖（參見例如Brough等人，1996,JVirol70:6497-501，其描述293-0RF6細胞的產生；Abrahamsen等人，1997,JVirol71:8946-51及Nan等人，2003,GeneTherapylO:326-36,各自描述使用此種細胞株產生缺失El的非亞群C腺病毒載體）。[0091]可替代地，可使用表達來自欲增殖的血清型的El的補充細胞（參見例如WO00/70071、WO02/40665)。[0092]對於在El區中具有缺失的亞群B腺病毒（諸如Ad35)，優選地保留腺病毒中ElB55K開放閱讀框的3'末端，例如在pIX開放閱讀框上遊緊鄰的166bp或包含其的片段，諸如在PlX起始密碼子上遊緊鄰的243bp片段（在Ad35基因組中在5'末端由Bsu36I限制性位點標記），這是因為此片段由於PlX基因的啟動子部分地存在於此區域中而增加腺病毒的穩定性（參見例如Havenga等人，2006,J.Gen.Virol.87:2135-2143;TO2004/001032,以引入的方式併入本文中）。[0093]本發明的腺病毒中的"異源核酸"（在本文中亦稱為'轉基因'）為非天然存在於腺病毒中的核酸。其是例如通過標準分子生物學技術引入腺病毒中。在本發明中，異源核酸編碼RSVF蛋白質或其片段。可將其例如克隆於腺病毒載體缺失的El或E3區中。轉基因一般可操作地連接於表達控制序列。此可例如通過將編碼這個或這些轉基因的核酸置於啟動子的控制下來完成。可添加其他調控序列。許多啟動子可用於一個或多個轉基因的表達且為普通技術人員所知。適用於在真核細胞中獲得表達的啟動子的非限制性實例為CMV啟動子（US5,385,839)，例如CMV即刻早期啟動子，例如包含來自CMV即刻早期基因增強子/啟動子的核苷酸-735至+95。聚腺苷酸化信號，例如牛生長激素聚A信號（US5,122,458)，可存在於這個或這些轉基因之後。[0094]在某些實施例中，本發明的重組Ad26載體包含以下核苷酸序列作為5'端核苷酸：CTATCTAT。此等實施例為有利的，因為這些載體與具有原始5'端序列（一般為CATCATCA)的載體相比在產生過程中顯示改良的複製，從而產生具有改良的均質性的腺病毒批次（亦參見專利申請案第PCT/EP2013/054846號及US13/794,318,題為'Batchesofrecombinantadenoviruswithalteredterminalends'，以CrucellHollandΒ·V.的名義於2012年3月12日申請），其以全文引用的方式併入本文中。因此，本發明亦提供編碼RSVF蛋白質或其一部分的重組腺病毒批次，其中該腺病毒為血清型26人類腺病毒，且其中該批次中基本上所有（例如至少90%)腺病毒包含具有末端核苷酸序列CTATCTAT的基因組。[0095]根據本發明，RSV的F蛋白質可源於天然存在的RSV或重組RSV的任何病毒株，優選地源於人類RSV病毒株，諸如A2、Long或B病毒株。在其他實施例中，序列可為基於複數個RSVF蛋白質胺基酸序列的共同序列。在本發明的一個實例中，RSV病毒株為RSV-A2病毒株。[0096]根據本發明，RSV的F蛋白質可為RSV的全長F蛋白質或其片段。在本發明的一個實施例中，編碼RSV的F蛋白質的核苷酸序列編碼RSV的全長F蛋白質（FO)，諸如SEQIDNO:1的胺基酸。在本發明的一個實例中，編碼RSV的F蛋白質的核苷酸序列具有SEQIDN0:2的核苷酸序列。可替代地，編碼RSV的F蛋白質的序列可為與SEQIDN0:2的核苷酸序列至少約80%、優選地超過約90%、更優選地至少約95%-致的任何序列。在其他實施例中，可使用諸如WO2012/021730的SEQIDNO:2、4、5或6中所提供的密碼子優化序列。[0097]在本發明的另一實施例中，核苷酸序列可替代地可編碼RSV的F蛋白質的片段。片段可由氨基端及羧基端中的一或兩者缺失而產生。缺失程度可由普通技術人員確定以例如獲得重組腺病毒的較佳產率。所選擇的片段將包含F蛋白質的免疫活性片段，亦即將引起受試者的免疫反應的部分。此可易於使用計算機仿真（inSilico)、活體外和/或活體內方法來確定，所有方法均為普通技術人員所常用。在本發明的一個實施例中，片段為RSV的跨膜編碼區截短的F蛋白質（Η)ΛΤΜ，參見例如US20110014220)。F蛋白質的片段亦可為F蛋白質的Fl域或F2域。F的片段亦可為含有中和抗原決定基及T細胞抗原決定基的片段(Sing等人，2007,Virol.Immunol.20,261-275;Sing等人，2007,Vaccine25,6211-6223)。[0098]如本發明中所用，關於數值的術語'約'意謂值±10%。[0099]在某些實施例中，本發明提供製造抗呼吸道合胞病毒（RSV)疫苗的方法，其包含提供包含編碼RSVF蛋白質或其片段的核酸的血清型26重組人類腺病毒，使所述重組腺病毒在宿主細胞培養物中增殖，分離並純化該重組腺病毒，並將該重組腺病毒引入醫藥學上可接受的組合物中。[0100]可根據熟知方法製備重組腺病毒且在宿主細胞中增殖，這些方法需要經腺病毒感染的宿主細胞的細胞培養。細胞培養可為任何類型的細胞培養，包括黏附細胞培養，例如細胞附著於培養容器或微載體表面；以及懸浮培養。[0101]大多數大規模懸浮培養以分批製程或補料分批製程操作，因為這些製程最易於操作及擴大規模。如今，基於灌注原理的連續製程變得更常見且亦適合（參見例如WO2010/060719及WO2011/098592,兩者以引入的方式併入本文中，其描述適用於獲得並純化大量重組腺病毒的方法）。[0102]培養生產細胞以增加細胞及病毒數目和/或病毒效價。完成細胞培養以使其能夠代謝和/或生長和/或分裂和/或產生本發明的相關病毒。此可通過如普通技術人員所熟知的方法來實現，且包括（但不限於）例如在適當培養基中為細胞提供營養物。適合培養基為普通技術人員所熟知，且一般可自商業來源大量獲得或根據標準方案定製。可使用分批系統、補料分批系統、連續系統及其類似系統在培養皿、滾瓶或生物反應器中進行培養。適用於培養細胞的條件為已知的（參見例如TissueCulture,AcademicPress,Kruse及Paterson編（1973),及R.I.Freshney,Cultureofanimalcells:Amanualofbasictechnique，第四版（Wiley-LissInc.,2000,ISBN0-471-34889-9))。[0103]腺病毒通常應暴露於培養物中允許吸收病毒的適當生產細胞。通常，最佳攪拌介於約50rpm與300rpm之間，通常為約100-200rpm，例如約150rpm;典型DO為20%-60%，例如40%;最佳？!1值介於6.7與7.7之間；最佳溫度介於301：與391：之間，例如341：-371：;且最佳MOI介於5與1000之間，例如約50-300。腺病毒通常自發感染生產細胞，且生產細胞與rAd粒子的接觸足以感染這些細胞。一般而言，將腺病毒種子儲備物（seedstock)添加至培養物中以起始感染，隨後腺病毒在生產細胞中增殖。此均為普通技術人員所常用。[0104]在感染腺病毒後，病毒在細胞內部複製且由此擴增，該過程在本文中稱為腺病毒增殖。腺病毒感染最終導致經感染的細胞溶解。腺病毒的溶胞特徵因此可允許兩種不同模式的病毒產生。第一模式為在細胞溶解之前收集病毒，採用外部因子溶解細胞。第二模式為在所產生的病毒（幾乎）完全溶解細胞之後收集病毒上清液（參見例如美國專利6,485,958,其描述在未由外部因子溶解宿主細胞的情況下收集腺病毒）。優選地採用外部因子主動溶解細胞以便收集腺病毒。[0105]可用於主動溶解細胞的方法為普通技術人員所知，且已例如在WO98/22588第28-35頁中論述。就此而言適用的方法為例如冷凍-解凍、固體剪切、高滲和/或低滲溶解、液體剪切、音波處理、高壓擠壓、清潔劑溶解、上述方法的組合及其類似方法。在本發明的一個實施例中，使用至少一種清潔劑溶解細胞。使用清潔劑溶解的優勢在於其為一種簡易方法且容易調整規模。[0106]可使用的清潔劑及其使用方式一般為普通技術人員所知。若干實例例如在WO98/22588第29-33頁中論述。清潔劑可包括陰離子型清潔劑、陽離子型清潔劑、兩性離子型清潔劑及非離子型清潔劑。清潔劑的濃度可例如在約0.1%至5%(w/w)範圍內變化。在一個實施例中，所用清潔劑為TritonX-100。[0107]可採用核酸酶移除汙染性（亦即主要來自生產細胞）核酸。適用於本發明的例示性核酸酶包括BenzonaseK、Pulmozymeκ或本領域中常用的任何其他DNase和/或RNase。在優選的實施例中，核酸酶為Benzonaseu，其通過水解特定核苷酸之間的內部磷酸二酯鍵而迅速水解核酸，從而降低細胞溶解產物的黏度。Benzonase?可在商業上獲自MerckKGaA(代碼W214950)。所採用核酸酶的濃度優選地在1至100個單位/毫升的範圍內。可替代地，或除核酸酶處理之外，亦可在腺病毒純化期間使用選擇性沉澱劑（諸如溴化度米芬（domiphenbromide))選擇性地沉澱宿主細胞DNA而與腺病毒製劑分離（參見例如US7,326,555;Goerke等人，2005，Biotechnologyandbioengineering，第91卷：12-21;WO2011/045378；W02011/045381)〇[0108]自生產細胞培養物收集腺病毒的方法已詳盡地描述於WO2005/080556中。[0109]在某些實施例中，進一步純化所收集的腺病毒。可分若干步驟進行腺病毒純化，包含淨化、超濾、透濾或層析分離，如在例如以引入的方式併入本文中的WO05/080556中所述。可通過過濾步驟進行淨化，自細胞溶解產物移除細胞碎片及其他雜質。使用超濾來濃縮病毒溶液。使用超濾器進行透濾或緩衝液交換為移除及交換鹽、糖及其類似物的方式。普通技術人員已知如何發現各純化步驟的最佳條件。以全文引用的方式併入本文中的WO98/22588亦描述產生及純化腺病毒載體的方法。這些方法包含使宿主細胞生長，用腺病毒感染這些宿主細胞，收集並溶解這些宿主細胞，濃縮粗溶解產物，交換該粗溶解產物的緩衝液，用核酸酶處理該溶解產物，及使用層析進一步純化病毒。[0110]純化優選地採用至少一個層析步驟，如在例如WO98/22588第61-70頁中所論述。已描述用於進一步純化腺病毒的許多製程，其中層析步驟包括於製程中。普通技術人員應了解此等製程，且可改變採用層析步驟的確切方式以使製程優化。舉例而言，可由陰離子交換層析步驟純化腺病毒，參見例如WO2005/080556及Konz等人，2005,HumGeneTher16:1346-1353。已描述許多其他腺病毒純化方法且在普通技術人員的可達範圍內。產生及純化腺病毒的其他方法揭示於例如（W000/32754;W004/020971;US5,837,520;US6,261，823;W02006/108707;Konz等人，2008,MethodsMolBiol434:13-23;Altaras等人，2005，AdvBiochemEngBiotechnol99:193-260)中，所有文獻均以引入的方式併入本文中。[0111]為投與人類，本發明可採用包含rAd及醫藥學上可接受的運載劑或賦形劑的醫藥組合物。在本發明情形中，術語"醫藥學上可接受"意謂運載劑或賦形劑在所用劑量及濃度下不會對所投與的受試者產生任何不當或有害影響。這些醫藥學上可接受的運載劑及賦形劑在本領域中為熟知的（參見Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版，A.R.Gennaro編，MackPublishingCompany[1990]!PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins,S.Frokjaer及L.Hovgaard編，Taylor&Francis[2000];及HandbookofPharmaceuticalExcipients,第3版，A.Kibbe編，PharmaceuticalPress[2000])。經純化的rAd優選地以無菌溶液形式調配及投藥，但亦可利用凍幹製劑。無菌溶液是通過無菌過濾或通過本領域中本身已知的其他方法來製備。接著，將溶液凍幹或填充於藥物劑量容器中。溶液的pH值一般在pH3.0至9.5的範圍內，例如pH5.0至7.5。rAd通常呈具有適合醫藥學上可接受的緩衝液的溶液形式，且rAd的溶液亦可含有鹽。任選地可存在穩定劑，諸如白蛋白。在某些實施例中，添加清潔劑。在某些實施例中，可將rAd調配成可注射製劑。此等調配物含有有效量的rAd，呈無菌液體溶液、液體懸浮液或凍幹型式，且任選地含有穩定劑或賦形劑。亦可霧化腺病毒疫苗以供鼻內投藥（參見例如WO2009/117134)。[0112]舉例而言，腺病毒可儲存於亦用於腺病毒世界標準（AdenovirusWorldStandard；Hoganson等人，Developmentofastableadenoviralvectorformulation,Bioprocessing2002年3月，第43-48頁）的緩衝液中：20mMTrispH8、25mMNaCl、2.5%甘油。另一適合投與人類的適用調配緩衝液為20mMTris、2mMMgCl2、25mMNaCl、10%w/v蔗糖、0.02%w/v聚山梨醇酯-80。顯然，可使用許多其他緩衝液，且適用於經純化的（腺）病毒製劑的儲存及醫藥投與的調配物的若干實例可例如見於歐洲專利第0853660號、美國專利6,225,289及國際專利申請案WO99/41416、WO99/12568、WO00/29024、WO01/66137、WO03/049763、WO03/078592、WO03/061708中。[0113]在某些實施例中，包含腺病毒的組合物另外包含一或多種佐劑。本領域中已知的佐劑進一步增強對所施用的抗原決定子的免疫反應，且包含腺病毒及適合佐劑的醫藥組合物在例如以引入的方式併入本文中的WO2007/110409中揭示。術語"佐劑"及"免疫刺激齊U"在本文中可互換使用，且定義為刺激免疫系統的一或多種物質。在此情形中，佐劑用於增強對本發明的腺病毒載體的免疫反應。適合佐劑的實例包括鋁鹽，諸如氫氧化鋁和/或磷酸鋁；油-乳液組合物（或水包油組合物），包括角鯊烯-水乳液，諸如MF59(參見例如WO90/14837);皂素調配物，諸如QS21及免疫刺激複合物（ISCOMS)(參見例如US5,057,540;WO90/03184、WO96/11711、WO2004/004762、WO2005/002620);細菌或微生物衍生物，其實例為單磷醯脂A(MPL)、3-0_去醯化MPL(3dMPL)、含CpG基元的寡核苷酸、ADP核糖基化細菌毒素或其突變體，諸如大腸桿菌熱不穩定腸毒素LT、霍亂毒素CT及其類似物。亦可使用載體編碼的佐劑，例如通過使用編碼C4結合蛋白（C4bp)的寡聚域與相關抗原的融合體的異源核酸（例如Solabomi等人，2008,InfectImmun76:3817-23)。在某些實施例中，本發明的組合物包含鋁作為佐劑，例如呈氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鋁鉀或其組合的形式，濃度為每一劑量〇·〇5_5mg(例如(λ075-LOmg)的鋁含量。[0114]在其他實施例中，組合物不包含佐劑。[0115]根據本發明，亦可與本發明的疫苗組合投與其他活性組分。這些其他活性組分可包含例如其他RSV抗原或包含編碼此等抗原的核酸的載體。這些載體可為非腺病毒載體或腺病毒載體，其中腺病毒載體可為任何血清型。其他RSV抗原的一個實例包括RSVG蛋白質或其免疫活性部分。舉例而言，鼻內施用的表達G糖蛋白可溶性核心域（胺基酸130至230)的基於Ad5的重組複製缺陷型腺病毒載體rAd/3xG在鼠類模型中具有保護性（Yu等人，2008,JVirol82:2350-2357)，但當肌肉內施用時其不具保護性，由此等數據顯而易見，RSVG為用於誘導保護性反應的適合抗原。其他活性組分亦可包含非RSV抗原，例如來自其他病原體，諸如病毒、細菌、寄生蟲及其類似物。其他活性組分的投與可例如通過獨立投與或通過投與本發明的疫苗與其他活性組分的組合產品來進行。在某些實施例中，其他非腺病毒抗原（除RSV.F之外）可在本發明的載體中編碼。在某些實施例中，因此可能需要表達來自單一腺病毒的一種以上蛋白質，且在這些情況下，更多編碼序列例如可連接形成來自單一表達盒的單一轉錄物或可存在於在腺病毒基因組的不同部分克隆的兩個獨立表達盒中。[0116]腺病毒組合物可投與受試者，例如人類受試者。在一次投與期間向受試者提供的腺病毒的總劑量可如普通技術人員所知而變化，且一般介於IXIO7個病毒粒子（VP)與IXIO12VP之間，優選地介於IXIO8VP與IXIO11VP之間，例如介於3XIO8VP與5XIOltlVP之間，例如介於IO9Vp與3XIOicVp之間。[0117]可使用標準投藥途徑投與腺病毒組合物。非限制性實施例包括非經腸投藥，諸如通過例如皮內、肌肉內等注射，或皮下、經皮或經黏膜投藥，例如鼻內、經口及其類似途徑。鼻內投藥一般已視為抗RSV疫苗的優選途徑。活的鼻內策略的最重要優勢在於直接刺激局部呼吸道免疫性且不存在相關疾病增強。目前在臨床評估下供小兒使用的唯一疫苗為活鼻內疫苗（Collins及Murphy.Vaccinesagainsthumanrespiratorysyncytialvirus,PerspectivesinMedicalVirology14:RespiratorySyncytialVirus(Cane,P.編），Elsevier，Amsterdam,theNetherlands，第233-277頁）。鼻內投藥亦為本發明的適合優選途徑。然而，根據本發明尤其優選地是肌肉內投與疫苗，因為令人^(訝地發現肌肉內投與本發明的疫苗在棉鼠鼻及肺中產生抗RSV複製的保護，與先前報導的基於其他腺病毒血清型的肌肉內RSV疫苗不同。肌肉內投藥的優勢在於其簡單且完善，且不具有6個月以下的嬰兒鼻內施用的安全性問題。在一個實施例中，通過肌肉內注射將組合物投與例如手臂三角肌或大腿股外側肌中。普通技術人員已知投與組合物（例如疫苗）以誘導對疫苗中的這個或這些抗原的免疫反應的多種可能性。[0118]如本文中所用的受試者優選地為哺乳動物，例如齧齒動物，例如小鼠、棉鼠，或非人類靈長類動物，或人類。受試者優選地為人類受試者。受試者可為任何年齡，例如約1個月大至100歲，例如約2個月大至約80歲，例如約1個月大至約3歲、約3歲至約50歲、約50歲至約75歲等。[0119]亦可提供本發明的一或多種腺病毒疫苗的一或多次加打投藥。若進行加打接種疫苗，則此種加打接種疫苗通常將在組合物第一次投與受試者（在這些情況下稱為'初打接種疫苗'）之後，在一周與一年之間、優選地兩周與四個月之間的時刻投與同一受試者。在替代性加打方案中，亦可在初打接種疫苗之後向受試者投與不同載體，例如不同血清型的一或多種腺病毒，或其他載體，諸如MVA或DNA或蛋白質。舉例而言，可向受試者投與本發明的重組腺病毒載體作為初打，且加打包含RSVF蛋白質的組合物。[0120]在某些實施例中，投藥包含初打及至少一次加打投藥。在其某些實施例中，初打投藥使用包含編碼RSVF蛋白質或其片段的核酸的rAd35('rAd35-RSV.F'），且加打投藥使用本發明的包含編碼RSVF蛋白質的核酸的rAd26('rAd26-RSV.F'）。在其其他實施例中，初打投藥使用rAd26-RSV.F且加打投藥使用rAd35-RSV.F。在其他實施例中，初打與加打投藥均使用rAd26.RSV.F。在某些實施例中，初打投藥使用rAd26-RSV.F且加打投藥使用RSVF蛋白質。在所有此等實施例中，可提供使用相同或其他載體或蛋白質的其他加打投藥。加打RSVF蛋白質可尤其有利的實施例包括例如50歲或50歲以上的危險群體（例如患有COPD或哮喘）的年長受試者，或例如60歲或60歲以上或65歲或65歲以上的健康受試者。[0121]在某些實施例中，投藥包含單次投與本發明的重組腺病毒，而無其他（加打）投藥。這些實施例鑑於單次投藥方案與初打-加打方案相比複雜性及成本降低而為有利的。在本文的實例中，在單次投與本發明的重組腺病毒載體而無加打投藥後，在棉鼠模型中已觀測到完全保護。[0122]在以下實例中進一步說明本發明。這些實例不以任何方式限制本發明。其僅用以闡明本發明。[0123]實例[0124]實例1.製備腺病毒載體[0125]將RSVF基因克隆於Ad35及Ad26的El區中：[0126]通過Geneart使編碼A2病毒株的原生RSV融合（F)蛋白質的RSV.F(A2)nat基因(GenbankAC083301.1)針對人類表達進行基因優化且加以合成。緊鄰ATG起始密碼子之前包括Kozak序列（5'GCCACC3'），且在RSV.F(A2)nat編碼序列末端添加兩個終止密碼子(5'TGATAA3'）。將RSV.F(A2)nat基因經由HindIII及XbaI位點插入pAdApt35BSU質粒及pAdApt26質粒中。所得質粒pAdApt35BSU.RSV.F(A2)nat及pAdApt26.RSV.F(A2)nat描繪於圖15中。F蛋白質的胺基酸序列及編碼該胺基酸序列的密碼子優化序列分別作為SEQ.ID.N0:1及2提供於表1中。[0127]細胞培養：[0128]將PER.C6細胞（Fallaux等人，1998,HumGeneTher9:1909-1917)維持於含10%胎牛血清（FBS)且補充有IOmMMgCl2的達爾伯克改良伊格爾培養基（Dulbecco'smodifiedEagle'smedium，DMEM)中。[0129]腺病毒產生、感染及繼代：[0130]在PER.C6細胞中通過單一同源重組產生所有腺病毒，且如先前所述而產生（關於rAd35:Havenga等人，2006,J.Gen.Virol.87:2135-2143;關於rAd26:Abbink等人，2007，J.Virol.81:4654_4663)。簡言之，根據製造商（LifeTechnologies)所提供的用法說明，使用脂質體（Lipofectamine),以Ad載體質粒轉染PER.C6細胞。為補救帶有RSV.F(A2)nat轉基因表達盒的Ad35載體，使用pAdApt35BSU.RSV.F(A2)nat質粒及pWE/Ad35.ρΙΧ-rITR.dE3.5orf6黏質粒，而對於帶有RSV.F(A2)nat轉基因表達盒的Ad26載體，使用pAdApt26.RSV.F(A2)nat質粒及pWE.Ad26.dE3.5orf6黏質粒。在完整CPE後一天收集細胞，冷凍-解凍，以3,OOOrpm離心5分鐘且在-20°C下儲存。接著，對病毒進行空斑純化且在多孔24組織培養板的單孔上培養的PER.C6中擴增。在使用T25組織培養瓶及T175組織培養瓶培養的PER.C6中進行進一步擴增。使用T175粗溶解產物中的3至5ml接種含有PER.C6細胞的70%匯合層的20XT175三層組織培養瓶。使用兩步CsCl純化方法純化病毒。最後，將病毒以等分試樣儲存於_85°C下。[0131]實例2.使用血清型26及35重組腺病毒活體內誘導抗RSVF免疫性[0132]此為查明血清型重組腺病毒（Ad26)及血清型35重組腺病毒（Ad35)誘導BALB/c小鼠的抗RSV的糖蛋白F抗原的免疫性的實驗。[0133]在此研究中，將動物分配於具有5隻小鼠的實驗組中。用單次劑量的帶有全長RSVF基因的Ad26或Ad35(Ad26-RSV.F或Ad35-RSV.F)或無轉基因的Ad26或Ad35(Ad26e或Ad35e)對動物免疫接種。肌肉內給予在101°至IO8個病毒粒子（vp)範圍內的rAd的三個10倍連續稀釋液。作為對照，一組3隻動物接受空載體Ad26e且一組接受空載體Ad35e。[0134]ELISP0T分析用於測定脾臟中F蛋白質特異性IFNY分泌T細胞的相對數目，且基本上如Rad〇§evi0等人（ClinVaccineImmunol.2010;17(11):1687-94)所述來進行。為在ELISP0T分析中刺激脾細胞，使用由跨越RSVF(A2)蛋白質整個序列的11胺基酸重迭15聚體肽組成的兩個肽庫。計算每IO6個細胞的斑點形成單位（SFU)的數目。[0135]為測定抗體效價，使用ELISA分析。為此，用25μg/mlRSVLong完整不活化抗原(VirionSerion,目錄號BA113VS)塗布ELISA板（ThermoScientific)。將稀釋的血清樣品添加至板中，且使用經生物素標記的抗小鼠IgG(DAK0,目錄號E0413)，由辣根過氧化酶(PO)結合的抗生蛋白鏈菌素（SA)檢測來測定抗RSV的IgG抗體。使用來自50倍稀釋的未處理血清的1.5X0D信號作為截止，通過線性內插法計算效價。使用用於定量子類的經PO標記的抗小鼠IgGl及經PO標記的抗小鼠IgG2a(SouthernBiotechnologyAssociates,目錄號1070-05及1080-05)測定小鼠血清中RSV特異性IgGl及IgG2a抗體的效價。[0136]通過微量中和分析來測定抗體的病毒中和活性（VNA)，基本上如Johnson等人（JInfectDis.1999年7月；180(1):35-40)所述來進行。在感染前一天，將RSV易感VERO細胞接種於96孔細胞培養板中。在感染當天，使連續稀釋的血清及對照與1200pfu的RSV(Long或BI)混合且在37°C下培育1小時。隨後，將病毒/抗體混合物轉移至含有VERO細胞單層的96孔板中。三天後，用80%冰冷丙酮固定單層且使用抗F單克隆抗體測定RSV抗原。中和效價表示為使得僅病毒對照孔的0D450減少50%(IC5tl)的血清稀釋度（Iog2)。[0137]在初打後第2周及第8周，處死動物且如上所述監測細胞反應及體液反應。[0138]圖1展示所有劑量的Ad26-RSV.F(圖1A)及Ad35-RSV.F(圖1B)均有效誘導良好細胞免疫反應且反應隨著時間推移而穩定。使用Ad26-RSV.F或Ad35-RSV.F未觀測到載體劑量對於T細胞反應的顯著差異。[0139]圖2展示如上所述的相同實驗中的抗體效價。兩種載體均誘導ELISA效價的極其明顯的時間依賴性及劑量依賴性增加（圖2)。抗F效價自第2周至第8周明顯增加，對於101°劑量為顯著的。第8周，Ad26-RSV.F或Ad35-RSV.F載體之間不存在效價差異。[0140]測定F特異性IgG的子類分布（IgGl相對IgG2a)以評估Thl相對Th2反應的平衡。如使用福馬林不活化RSV所見，偏斜的Th2/Thl反應使動物易顯現疫苗增強的RSV疾病。如圖3所示，Ad26-RSV.F與Ad35-RSV.F的IgG2a/IgGl比率均高於1。此強烈指示腺病毒載體Ad26-RSV.F及Ad35-RSV.F展現Thl類型反應而非Th2類型反應。[0141]圖4展示用於抗體效價的相同血清的病毒中和效價（VNA)。使用Ad26_RSV.F及rAd35-RSV.F免疫接種會誘導中和抗體效價。給予IOltVp的小鼠在初打後兩周與八周之間VNA效價大大增加。第八周，給予IOicVp的小鼠的Ad26-RSV.F載體與Ad35-RSV.F載體之間的效價不存在差異。[0142]由此等免疫接種實驗顯而易見，具有RSV.F轉基因的Ad35載體及Ad26載體誘導強烈的抗RSV.F細胞反應及體液反應。[0143]實例3.使用編碼RSV.F的重組腺病毒載體，在異源初打-加打後抗RSV.F的免疫性[0144]設計此研究以查明基於源於兩種不同血清型的腺病毒載體的初打-加打方案誘導抗RSV.F免疫性的能力。[0145]此研究涉及將BALB/c小鼠分配於具有8隻小鼠的實驗組中。通過肌肉內注射101°個帶有基於/源於RSVA2的RSV.F基因的野生型序列的病毒粒子（Ad-RSV.F或Ad35-RSV.F)或無轉基因的病毒粒子（Ad26e或Ad35e)對動物免疫接種。一組動物首周使用Ad26-RSV.F初打且在第4周使用Ad35-RSV.F或Ad35e加打。另一組動物使用Ad35-RSV.F初打且在第4周使用Ad26-RSV.F或Ad26e加打。小鼠對照組使用Ad35e初打且在第4周使用Ad26e加打。在初打後第6周及第12周，在各時間點處死8隻動物且使用普通技術人員熟知且如上所述的免疫分析來監測細胞反應及體液反應。[0146]圖5展不在弟一次免疫接種後6周及12周的細胞反應。在初打後6周（及加打後2周），量測Ad26-RSV.F與Ad35-RSV.F對於T細胞反應的顯著加強作用，且T細胞反應的量值與初打-加打中使用Ad26-RSV.F或Ad35-RSV.F免疫接種的順序無關。在初打後12周（加打後8周），在僅接受初打的動物及接受初打-加打的動物中，與rAd35-RSV.F初打的動物相比，使用Ad26-RSV.F初打的小鼠已維持較高水平的F特異性T細胞。總之，在使用rAd26-RSV.F或rAd35-RSV.F(初打或初打-加打）免疫接種的所有動物中，F特異性淋巴細胞（SFU)的數目較高且穩定至少12周。[0147]圖6展示在使用腺病毒載體初打-加打接種疫苗後的不同時間點的體液反應。完全同等地初打Ad35.RSV.F及Ad26.RSV.F，且展示由Ad26.RSV.F或rAd35.RSV.F誘導的對於B細胞反應的顯著加強作用。此外，異源初打-加打中B細胞反應的量值與Ad35.RSV.F及Ad26.RSV.F免疫接種的順序無關，且加打後ELISA效價保持穩定12周。[0148]圖7展示在初打-加打免疫接種後的不同時間點的病毒中和抗體效價。完全同等地初打Ad35.RSV.F載體與Ad26.RSV.F載體以獲得明顯VNA效價，如對於ELISA效價所觀測的情況。此外，異源初打-加打後VNA效價的增加與Ad35.RSV.F及Ad26.RSV.F免疫接種的順序無關。Ad26.RSV.F或Ad35.RSV.F對於VNA效價的加強作用在兩個時間點均顯著且在第6周已達到最大。僅使用Ad.RSV.F初打的組在第12周的VNA效價與第6周相比增力口。腺病毒載體構建體中的RSVF序列源於RSVA2分離株。本申請中所述的中和分析是基於屬於RSV亞群A的RSVLong病毒株，證實由F(A2)誘導的抗體能夠交叉中和不同RSVA病毒株亞型。[0149]由於RSVF蛋白質在RSV分離株中完全保守，故測試經Ad-RSV.F載體免疫接種的動物的血清是否能夠交叉中和原型RSVB病毒株分離株RSVB1。如圖8所示，經免疫接種的小鼠的血清亦能夠交叉中和Bl病毒株。交叉中和RSVBl的能力並不依賴於僅初打組中所用的載體或使用Ad26.RSV.F載體及Ad35.RSV.F載體進行初打-加打免疫接種的順序。[0150]總之，此等數據顯示在初打-加打方案中，使用Ad26.RSV.F及Ad35.RSV.F連續免疫接種誘導強體液反應及細胞反應，且體液免疫反應包括中和RSVA亞型與RSVB亞型的分離株的能力。[0151]實例4.在棉鼠模型中使用重組腺病毒載體活體內誘導抗RSV感染的保護[0152]進行此實驗以查明基於源於兩種不同血清型的腺病毒載體的初打-加打方案誘導棉鼠的抗RSV攻擊複製的保護的能力。棉鼠（剛毛棉花鼠，Sigmodonhispidus)易受RSV引起的上呼吸道及下呼吸道感染且發現感染容許度為小鼠品系的至少50倍（Niewiesk等人，2002,Lab.Anim.36(4):357-72)。此外，棉鼠已成為評估RSV候選疫苗、抗病毒劑及抗體的功效及安全性的初級模型。在棉鼠模型中得到的臨床前數據促進開發兩種抗體調配物(RespiGam?.及Synagis?)用於臨床試驗,而無需非人類靈長類動物中的中間研究。[0153]該研究將棉鼠錄入實驗組中，每組8隻棉鼠。通過肌肉內注射IO9個病毒粒子（vp)或IOltlVP的帶有全長RSVF(A2)基因的腺病毒載體（Ad26.RSV.F或Ad35.RSV.F)或無轉基因的腺病毒載體（Ad26e或Ad35e)對動物免疫接種。動物在28天後加打相同vp劑量的相同載體（同源初打-加打）或其他腺病毒血清型（異源初打-加打）；除僅施用1次劑量（101°)之外，據此使用Ad-e載體對對照組免疫接種。對照組由6隻動物組成。經RSVA2(IO4個空斑形成單位（Pfu))鼻內感染的動物用作抗攻擊複製的保護的陽性對照，眾所周知的是，經RSV病毒初次感染會防止二次攻擊複製（Prince.LabInvest1999,79:1385-1392)。此外，福馬林不活化RSV(FI-RSV)充當疫苗增強組織病理學疾病的對照。在第二次（加打）免疫接種後三周，經鼻內使用IXIO5Pfu的空斑純化RSVA2攻擊棉鼠。作為對照，一組棉鼠未經免疫接種但接受攻擊病毒，且另一對照組未經免疫接種且不受攻擊。在感染後5天（RSV攻擊病毒達成峰值效價的時間點）處死棉鼠（Prince.LabInvest1999,79:1385-1392)，且通過病毒空斑滴定來測定肺RSV效價及鼻RSV效價（Prince等人1978,AmJPathology93,711-791)。[0154]圖9展示在未經免疫接種的對照以及接受無轉基因的腺病毒載體的動物中觀測到肺中及鼻中的高RSV病毒效價，分別為5·3+/-0.131og1Qpfu/g及5·4+/-0.351og1Qpfu。相比之下，在接受使用Ad26.RSV.F和/或Ad35.RSV.F載體的初打-加打免疫接種的動物的肺及鼻組織中不可檢測到攻擊病毒，與劑量或方案無關。[0155]此等數據清楚地證實基於Ad35的載體與基於Ad26的載體在棉鼠模型中均產生抗RSV攻擊複製的完全保護。此種情況令人驚訝，因為已知編碼RSVF的基於Ad5的腺病毒載體在肌肉內投與後在動物模型中不能誘導完全保護。[0156]在實驗過程中，在免疫接種之前（第0天）、在加打免疫接種之前（第28天）、在攻擊當天（第49天）及在處死當天（第54天）獲取血液樣品。如Prince(Prince等人1978,AmJPathology93,711-791)所述，在基於空斑分析的病毒中和分析（VNA)中針對全身性RSV特異性中和抗體的誘導來測試血清。中和效價表示為與僅病毒對照孔相比使得空斑減少50%(IC5tl)的血清稀釋度（Iog2)。[0157]圖10展示對照動物在第28天及第49天不具有病毒中和抗體，而在動物使用Ad26.RSV.F或Ad35.RSV.F載體初打後誘導高VNA效價。在加打免疫接種後觀測到VNA效價適度增加。初次感染RSVA2病毒產生相當適度的VNA效價，其隨著時間推移而逐漸增加。[0158]為評估在使用RSVA2攻擊後Ad26.RSV.F或Ad35.RSV.F疫苗是否可能使疾病惡化，在感染後5天進行肺的組織病理學分析。收集肺，用福馬林灌注，切片且用蘇木精(hematoxylin)及伊紅（eosin)染色以供組織學檢查。根據Prince(Prince等人LabInvest1999,79:1385-1392)所公布的準則，以盲法進行組織病理學評分，且對以下參數進行評分：細支氣管周炎、血管周炎、間質性肺炎及肺泡炎。圖11展示此實驗的肺病理學評分。在RSV攻擊後，經FI-RSV免疫接種的動物與基於先前公開的研究所預期的虛擬免疫接種的受攻擊動物相比顯示關於所檢查的所有組織病理學參數的組織病理學評分提高（Prince等人LabInvest1999,79:1385-1392)。經Ad26.RSV.F及Ad35.RSV.F免疫接種的動物與經rAd-e免疫或虛擬免疫接種的動物相比組織病理學得分類似，但經rAd-RSV.F免疫接種的動物的血管周炎似乎略輕。因此，與FI-RSV疫苗不同，Ad26.RSV.F及Ad35.RSV.F疫苗不會導致增強疾病。[0159]所有接種疫苗策略產生抗RSV攻擊複製的完全保護，誘導強病毒中和抗體，且未觀測到增強病變。[0160]實例5.使用不同投藥途徑在單次免疫接種後rAd載體的保護功效[0161]此研究用以查明投藥途徑對於由編碼RSV.F的Ad26或Ad35載體誘導的保護功效的影響。疫苗經肌肉內或經鼻內投與。[0162]在第0天已接受IXIO9或IX101°個病毒粒子（vp)的帶有轉基因RSVF的Ad26或Ad35(Ad26.RSV.F或Ad35.RSV.F)或無轉基因的Ad26或Ad35(Ad26-e或Ad35-e)的棉鼠在第49天經IO5RSVpfu攻擊且在第54天處死。[0163]圖12展示測定肺攻擊病毒及鼻攻擊病毒的實驗結果。在未經免疫接種或經無轉基因的腺病毒載體免疫接種的大鼠的肺及鼻中檢測到高RSV病毒效價，分別為4·9+/-0.221og1(lpfu/g及5·4+/-0.161og1(lpfu。相比之下，接受Ad35-RSV.F或Ad26-RSV.F的動物的肺及鼻中不存在攻擊病毒的複製，與投藥途徑及劑量無關。[0164]此等數據令人驚訝地證實編碼RSVF蛋白質的基於Ad26及基於Ad35的載體各自在棉鼠攻擊實驗中提供完全保護，與載體的投藥途徑無關。此種情況出乎意料，因為所公開的基於腺病毒的RSV疫苗（其基於其他血清型）中無一者已證實在肌肉內接種疫苗後具有完全保護。[0165]在實驗期間，在免疫接種之前（第0天）、免疫接種後4周（第28天）及攻擊當天（第49天）獲取血液樣品。在中和測試中針對RSV特異性抗體的誘導來測試血清（圖13)。在免疫接種之前，在任何棉鼠中均未檢測到病毒中和抗體。所有腺病毒載體免疫接種策略與投藥途徑無關，明顯誘導高VNA效價，其隨著時間推移而保持穩定。此等數據令人驚訝地證實編碼RSVF蛋白質的基於Ad26及基於Ad35的載體各自在棉鼠免疫接種實驗中提供病毒中和抗體的高效價，與載體的投藥途徑無關。[0166]為評估在經RSVA2攻擊後Ad26.RSV.F或Ad35.RSV.F疫苗的單次免疫接種是否可能導致疫苗增強疾病，在感染後5天進行肺的組織病理學分析（圖14)。與經rAd-e免疫接種或虛擬免疫接種的動物相比，使用rAd26.RSV.F或rAd35.RSV.F的單次免疫接種在經rAd26.RSV.F或rAd35.RSV.F免疫接種的動物中產生類似的免疫病理學評分，如上述初打-加打免疫接種實驗中所觀測。顯然，未觀測到疾病惡化，與使用FI-RSV初打的動物形成對比。經rAd載體免疫接種的動物的組織病理學評分與虛擬感染的動物相當。[0167]總之，所有單次劑量接種疫苗策略均產生抗RSV攻擊複製的完全保護，誘導強病毒中和抗體，且不展示增強病變。[0168]實例6.具有變體（諸如RSVF的片段）或具有替代性啟動子的載體顯示類似免疫原性[0169]已使用表達野生型RSVF的載體進行上述實例。已在rAd35中構建F的其他截短或修飾形式，從而提供腺病毒載體中RSVF片段的實施例。F的此等截短或修飾形式包括缺少細胞質域及跨膜區（亦即僅保留胞外域片段）的RSV-F截短形式，及細胞質域及跨膜區截短且胞外域中具有另一內部缺失且添加三聚化域的RSV-F片段形式。此等載體與具有全長F蛋白質的rAd35.RSV.F相比未改良反應。[0170]另外，已構建具有驅使野生型RSVF表達的不同替代性啟動子的其他rAd35載體。[0171]已在小鼠模型中比較RSV.F的修飾形式及啟動子變體的免疫原性且與表達野生型F的Ad35.RSV.F相比。具有此等F變體或啟動子變體的所有Ad35載體均顯示與Ad35.RSV.F相同數量級的反應。[0172]實例7.在棉鼠模型中在重組腺病毒載體活體內免疫接種後抗RSV感染的短期保護[0173]此實驗確定在棉鼠模型中由表達RSV-F蛋白質的腺病毒載體迅速發起保護的潛力。為此目的，在第〇天或第21天，通過單次肌肉內注射107、IO8或IO9個病毒粒子（vp)的帶有全長RSVF(A2)基因的腺病毒載體（Ad26.RSV.F)或無轉基因的腺病毒載體（Ad26e)對棉鼠免疫接種。經RSVA2(104個空斑形成單位（pfu))鼻內感染的動物用作抗攻擊複製的保護的陽性對照，眾所周知的是，經RSV病毒初次感染防止二次攻擊複製（Prince.LabInvest1999,79:1385-1392)。在免疫接種後七周（第49天）或四周，使用IXIO5Pfu的空斑純化RSVA2經鼻內攻擊棉鼠。在感染後5天（RSV攻擊病毒達成峰值效價的時間點）處死棉鼠（Prince.LabInvestl999,79:1385-1392)，且通過病毒空斑滴定來測定肺RSV效價及鼻RSV效價（Prince等人1978，AmJPathology93,711-791)。圖16A及圖16B展示在接受無轉基因的腺病毒載體的動物中觀測到肺中及鼻中的高RSV病毒效價，分別為4.8+/-0.lll〇g1Qpfu/g及5.l+/-0.321og1Qpfu/g。相比之下，接受Ad26.RSV.F載體免疫接種的動物的肺及鼻組織中不可檢測到攻擊病毒，與免疫接種與攻擊之間的時間無關。此實驗清楚指示表達RSV-F的Ad26迅速發起抗攻擊病毒複製的保護。第0天、第28天及攻擊當天（第49天），自經免疫接種的棉鼠獲取血液樣品。在中和測試中針對RSV特異性抗體的誘導來測試血清（圖17)。使用腺病毒載體免疫接種誘導劑量依賴性VNA效價。圖18展示對照動物在第28天及第49天不具有病毒中和抗體，但在使用IO7至IO9VpAd26.RSV.F免疫接種後28天或49天在動物中誘導高VNA效價。初次感染RSVA2病毒產生相當適度的VNA效價，其隨著時間推移而逐漸增加。此實驗清楚指示表達RSV-F的Ad26迅速發起抗攻擊病毒複製的保護。[0174]實例8.在棉鼠模型中在重組腺病毒載體活體內免疫接種後抗RSV亞群A及亞群B感染的保護[0175]RSV病毒株可分成兩個亞群：亞群A及亞群B。此亞型分類是基於高變G糖蛋白抗原性的差異。F蛋白質的序列高度保守，但亦可歸入上述亞群A及亞群B中。實例3描述經Ad-RSV.F載體免疫接種的小鼠的血清亦能夠活體外交叉中和Bl病毒株。圖19清楚展示源於經Ad26.RSV-Fa2S疫接種的棉鼠的棉鼠血清在免疫接種後第49天展示抗RSV-ALong(亞群A)及Bwash(亞群B，ATCC編號1540)的高VNA效價。接著，使用在IO6至IO8Vp範圍內的低腺病毒載體劑量在棉鼠中測定抗亞群A或B攻擊的活體內保護。為此目的，將棉鼠分配於實驗組中，每組8隻棉鼠。第0天，通過肌肉內注射IO6UO7或IO8個病毒粒子（vp)的帶有全長RSVF(A2)基因的腺病毒載體（Ad26.RSV.F)或無轉基因的腺病毒載體（Ad26e)對動物免疫接種。第49天，使用IO5PfuRSV-A2(RSV-A病毒株）或RSV-B15/97(RSV-B病毒株）鼻內攻擊動物。圖20展示在接受無轉基因的腺病毒載體的動物中觀測到肺中及鼻中的高RSV病毒效價。相比之下，在接受Ad26.RSV.F免疫接種的動物的肺及鼻組織中不可檢測到攻擊病毒或檢測到有限攻擊病毒。當使用RSV-A2或RSV-B15/97攻擊時，對於保護僅觀測到較小差異。Ad26.RSV.Fa2當使用IO8及IO7Vp劑量時展示抗肺攻擊複製的完全保護，且在IOfVpAd26.RSV.Fa2時展示格外有限的失效（breakthrough)。關於抗鼻攻擊病毒複製的保護可見類似趨勢，不過所有動物在IO6及IO7VPAd26.RSV.Fa2時觀測到部分失效，但低於對照組（圖21)。在實驗期間，在攻擊當天（第49天）獲取血液樣品。在中和測試中針對RSV特異性抗體的誘導來測試血清（圖22)。此實例證實IO6至IO8VpAd26.RSV的低劑量腺病毒載體顯示抗RSVA2的VNA效價的劑量反應。在免疫接種之前，在任何棉鼠中均未檢測到病毒中和抗體。[0176]Ad26.RSV.F被證實比Ad35.RSV.F略佳，因為後者在IO8Vp劑量下在鼻攻擊實驗中顯不一些失效。[0177]實例9.在棉鼠模型中在重組腺病毒載體活體內免疫接種後抗高攻擊劑量的RSV-A2的保護[0178]此實例確定與IXIO5PfuRSV-A2的標準劑量相比，抗5XIO5Pfu的高攻擊劑量的保護。該研究將棉鼠錄入實驗組中，每組8隻棉鼠。第0天，通過單次肌肉內注射IO7或IO8個病毒粒子（vp)的帶有全長RSVF(A2)基因的腺病毒載體（Ad26.RSV.F)或無轉基因的腺病毒載體（Ad26e)對動物免疫接種。經RSVA2(IO4個空斑形成單位（pfu))鼻內感染的動物用作抗攻擊複製的保護的陽性對照。在感染後5天處死棉鼠，且通過病毒空斑滴定來測定肺RSV效價及鼻RSV效價。圖23展示在接受無轉基因的腺病毒載體的動物中，較高攻擊劑量比標準攻擊劑量誘導較高肺病毒負荷。接受IO7或IO8VpAd26.RSV.F載體免疫接種的動物在肺中受到抗較高及標準RSV攻擊效價的完全保護。圖24展示接受IO8VpAd26.RSV.F載體免疫接種的動物在鼻中受到抗較高及標準RSV攻擊效價的完全保護，而接受IO7VpAd26.RSV.F載體免疫接種的動物受到抗較高及標準RSV攻擊效價的部分保護。[0179]實例10.在棉鼠模型中在重組腺病毒載體活體內免疫接種後抗RSV-A2及RSV-B15/97的長期保護[0180]此實例確定在棉鼠模型中在重組腺病毒載體活體內免疫接種後抗RSV-A2及RSV-B15/97的保護的持久性。該研究將棉鼠錄入實驗組中，每組6隻棉鼠。通過肌肉內注射IO8個病毒粒子（vp)或IOltVp的帶有全長RSVF(A2)基因的腺病毒載體（Ad26.RSV.F)或無轉基因的腺病毒載體（Ad26e或Ad35e)對動物免疫接種。動物在28天後加打相同vp劑量的相同載體（Ad26.RSV.F)(同源初打-加打）或Ad35.RSV.F腺病毒（異源初打-加打）；除僅施用1次劑量（101°)之外，據此使用Ache載體對對照組免疫接種。一些組未接受加打免疫接種。對照組由6隻動物組成。經RSVA2及B15/97(IO4個空斑形成單位（pfu))鼻內感染的動物用作抗攻擊複製的保護的陽性對照。在第一次免疫接種後210天進行攻擊。[0181]圖25展示在接受無轉基因的腺病毒載體的動物中觀測到肺中及鼻中的高RSV病毒效價。相比之下，在接受Ad26.RSV.F和/或Ad35.RSV.F免疫接種的動物的肺組織中不可檢測到攻擊病毒。在接受Ad26.RSV.F和/或Ad35.RSV.F免疫接種的動物的鼻組織中不可檢測到RSV-A2攻擊病毒。使用RSV-B15/97攻擊在接受Ad26.RSV.F和/或Ad35.RSV.F免疫接種的動物（接受Ad26.RSV.F初打，繼而加打IOicVpAd35.RSV.F的動物除外）的鼻組織中誘導有限病毒複製。圖26展示在免疫接種後140天的病毒中和抗體效價。僅初打IO8及IOltVp劑量的腺病毒載體或使用IO8及IOltVp劑量進行初打-加打免疫接種顯示在免疫接種後VNA效價的劑量反應可持續至少4.5個月。此外，所觀測的效價高於通過初次鼻內免疫接種產生的中和效價。觀測到Ad26.RSV.F或Ad35.RSV.F對於VNA效價的明顯加強作用。[0182]總之，此實例在使用單次劑量或兩次劑量的Ad26.RSV.F或Ad35.RSV.F免疫接種後展示持久VNA效價，且肺及鼻中抗同源病毒攻擊的長期完全保護與肺中抗異源病毒攻擊的長期完全保護及鼻中抗異源病毒攻擊的部分保護組合。[0183]實例11.在棉鼠模型中在重組腺病毒載體活體內免疫接種後不存在疫苗增強免疫病變[0184]為評估在使用RSVA2攻擊後Ad26.RSV.F疫苗是否可能使疾病惡化，在感染後2天及6天進行肺的組織病理學分析。在攻擊後兩天，即刻反應（包括肺部嗜中性白血球浸潤）達到峰值，而諸如淋巴細胞浸潤的亞急性變化在感染後第6天達到峰值（Prince等人，JVirol，1986,57:721-728)。該研究將棉鼠錄入實驗組中，每組12隻棉鼠。通過肌肉內注射IO8個病毒粒子（vp)或IOltVp的帶有全長RSVF(A2)基因的腺病毒載體（Ad26.RSV.F)或無轉基因的腺病毒載體（Ad26e)對動物免疫接種。動物在28天後加打相同vp劑量的相同載體（Ad26.RSV.F)(同源初打-加打）；除僅施用1次劑量（101°)之外，據此使用Ad-e載體對對照組免疫接種。對照組由12隻動物組成。經RSVA2(104個空斑形成單位（pfu))鼻內感染的動物用作抗攻擊複製的保護的陽性對照。經FI-RSV免疫接種的動物用作增強疾病的對照。收集肺，用福馬林灌注，切片且用蘇木精及伊紅染色以供組織學檢查。根據Prince(Prince等人LabInvest1999,79:1385-1392)所公布的準則，以盲法進行組織病理學評分，且對以下參數進行評分：細支氣管周炎、血管周炎、間質性肺炎及肺泡炎。此實驗第2天的肺病理學評分描繪於圖27中且第6天的肺病理學評分描繪於圖28中。在RSV攻擊後，經FI-RSV免疫接種的動物與基於先前公開的研究所預期的虛擬免疫接種及攻擊的動物相比顯示在第2天及第6天所檢查的所有組織病理學參數的組織病理學評分提高。第2天經Ad26.RSV.F載體免疫接種的所有組中的組織病理學得分與虛擬免疫接種的動物相當，且在攻擊後第6天得分始終低於虛擬免疫接種及攻擊（Ad26.e)的動物。因此，與FI-RSV疫苗不同，Ad26.RSV.F疫苗不會導致增強疾病。[0185]實例12.初打Ad26.RSV.F且加打重組F蛋白質在小鼠模型中產生向Thl偏斜的反應[0186]在此實例中，查明在初打Ad26.RSV.F後的免疫反應是否可通過加打輔助型重組RSVF蛋白質來增強。為此目的，將小鼠分配於實驗組中，每組7隻小鼠。第0天，通過肌肉內注射101°個病毒粒子（vp)的帶有全長RSVF(A2)基因的腺病毒載體（Ad26.RSV.F)或PBS對動物免疫接種。第28天，動物肌肉內加打相同劑量的相同載體或輔助型RSVF蛋白質（全長；融合後構形：post-F)(以2種劑量：5μg及0·5μg)。圖29清楚展示源於經Ad26.RSV-Fa2免疫接種且加打輔助型RSVF的小鼠的血清在免疫接種後12周展示抗RSV-ALong(亞群A)的高VNA效價。圖30展示經Ad26.RSV-Fa2免疫接種且加打輔助型RSVF蛋白質的小鼠的血清中的IgG2a/IgGl比率。高比率指示Thl平衡的反應，而低比率指示向Th2偏斜的反應。顯然，經Ad26.RSV.F免疫接種且加打Ad26.RSV.F或RSVF蛋白質的動物產生高IgG2a/IgGl比率，而經FI-RSV或RSVF蛋白質免疫接種的對照小鼠（無腺病毒載體的情形）誘導低比率。由於RSV疫苗強烈需要向Thl偏斜的反應以避免在攻擊後增強疾病及誘導強T細胞記憶，故當施用Ad26.RSV.F初打時，可將蛋白質免疫接種的Th2偏斜反應向Thl反應引導。圖31展示源於經Ad26.RSV-Fa2免疫接種且加打輔助型RSVF蛋白質的小鼠的脾臟中的細胞反應。可清楚觀測到加打輔助型RSVF蛋白質亦將大大增強細胞反應。[0187]表1.序列[0188]SEQIDNO:1:RSV融合蛋白質（GenbankAC083301.1)胺基酸序列：MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN[0189]SEQIDNO:2:編碼RSV融合蛋白質的密碼子優化RSV.F(A2)nat基因ATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCACCATCCTGACCGCCGTGACCTTCTGCTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAATTCTACCAGAGCACCTGTAGCGCCGTGTCCAAGGGCTACCTGAGCGCCCTGCGGACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAAAAGAACAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAAATCAAGCTGATCAAGCAGGAACTGGACAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGAGCACCCCCGCCACCAACAACCGGGCCAGACGGGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAAAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGCGGAAGCGGCGGTTCCTGGGCTTCCTGCTGGGCGTGGGCAGCGCCATTGCTAGCGGAGTGGCTGTGTCTAAGGTGCTGCACCTGGAAGGCGAAGTGAACAAGATCAAGTCCGCCCTGCTGAGCACCAACAAGGCCGTGGTGTCCCTGAGCAACGGCGTGTCCGTGCTGACCAGCAAGGTGCTGGATCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCAGCAACATCGAGACAGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAAATCACCCGCGAGTTCAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACCCCCGTGTCCACCTACATGCTGACCAACAGCGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAAAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACTCCATCATGTCCATCATCAAAGAAGAGGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCCCTGTACGGCGTGATCGACACCCCCTGCTGGAAGCTGCACACCAGCCCCCTGTGCACCACCAACACCAAAGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCCGGACCGACCGGGGCTGGTACTGCGATAATGCCGGCAGCGTGTCATTCTTTCCACAAGCCGAGACATGCAAGGTGCAGAGCAACCGGGTGTTCTGCGACACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCAGCGAGGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCTAAGTACGACTGCAAGATCATGACCTCCAAGACCGACGTGTCCAGCTCCGTGATCACCTCCCTGGGCGCCATCGTGTCCTGCTACGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTACGTGTCCAACAAGGGCGTGGACACCGTGTCCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAACAGGAAGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCCCTGGTGTTCCCCAGCGACGAGTTCGACGCCAGCATCAGCCAGGTCAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATCAGAAAGAGCGACGAGCTGCTGCACAATGTGAATGCCGTGAAGTCCACCACCAATATCATGATCACCACAATCATCATCGTGATCATCGTCATCCTGCTGTCCCTGATCGCCGTGGGCCTGCTGCTGTACTGCAAGGCCCGGTCCACCCCTGTGACCCTGTCCAAGGACCAGCTGAGCGGCATCAACAATATCGCCTTCTCCAAC【權利要求】1.一種抗呼吸道合胞病毒（RSV)疫苗，其包含血清型26重組人類腺病毒，該重組人類腺病毒包含編碼RSVF蛋白質或其片段的核酸。2.如權利要求1所述的疫苗，其中該重組腺病毒包含編碼RSVF蛋白質的核酸，該RSVF蛋白質包含SEQIDNO:1的胺基酸序列。3.如前述權利要求中任一項所述的疫苗，其中該編碼RSVF蛋白質的核酸是針對在人類細胞中的表達進行密碼子優化。4.如前述權利要求中任一項所述的疫苗，其中該編碼RSVF蛋白質的核酸包含SEQIDNO:2的核酸序列。5.如前述權利要求中任一項所述的疫苗，其中該重組人類腺病毒的腺病毒基因組的E1區中具有缺失、E3區中具有缺失或E1區與E3區中均具有缺失。6.如前述權利要求中任一項所述的疫苗，其中該重組腺病毒的基因組在5'末端包含序列CTATCTAT。7.-種對受試者接種抗RSV疫苗的方法，該方法包含向該受試者投與如前述權利要求中任一項所述的疫苗。8.如權利要求7所述的方法，其中該疫苗是經肌肉內投與。9.如權利要求7或8所述的方法，其中如權利要求1至6中任一項所述的疫苗是投與該受試者一次以上。10.如權利要求7至9中任一項所述的方法，其另外包含向該受試者投與包含血清型35重組人類腺病毒的疫苗，該重組人類腺病毒包含編碼RSVF蛋白質或其片段的核酸。11.如權利要求7或8所述的方法，其是由向該受試者單次投與該疫苗組成。12.如權利要求7至11中任一項所述的方法，其另外包含向該受試者投與RSVF蛋白質。13.-種減少受試者的RSV感染和/或複製的方法，其包含通過肌肉內注射向該受試者投與包含血清型26重組人類腺病毒的組合物，該重組人類腺病毒包含編碼RSVF蛋白質或其片段的核酸。14.一種經分離的宿主細胞，其包含血清型26重組人類腺病毒，該重組人類腺病毒包含編碼RSVF蛋白質或其片段的核酸。15.-種製造抗呼吸道合胞病毒（RSV)疫苗的方法，其包含提供包含編碼RSVF蛋白質或其片段的核酸的血清型26重組人類腺病毒，使所述重組腺病毒在宿主細胞培養物中增殖，分離並純化該重組腺病毒，並將該重組腺病毒調配於醫藥學上可接受的組合物中。16.-種經分離的重組核酸，其形成血清型26重組人類腺病毒的基因組，該重組人類腺病毒包含編碼RSVF蛋白質或其片段的核酸。【文檔編號】A61K39/155GK104334188SQ201380012141【公開日】2015年2月4日申請日期:2013年3月21日優先權日:2012年3月22日【發明者】K·拉多塞維奇,J·H·H·V·屈斯泰,J·維林加,M·N·維佐約阿特莫佐申請人:克魯塞爾荷蘭公司