用於減弱結核分枝桿菌複合群的細菌以生產結核病疫苗的方法

2023-05-03 08:36:46 2

用於減弱結核分枝桿菌複合群的細菌以生產結核病疫苗的方法
【專利摘要】本發明涉及結核分枝桿菌複合群的分枝桿菌株在生產用於預防宿主中結核分枝桿菌複合群的細菌感染的疫苗的用途，在結核分枝桿菌複合群的分支桿菌株中插入有能夠表達恥垢分枝桿菌孔蛋白A的mspA基因，所述宿主包含真核細胞優選巨噬細胞，其中如此轉化的所述分枝桿菌株在所述真核細胞中顯示出降低的生長。NCTC 120426012012.04.26
【專利說明】用於減弱結核分枝桿菌複合群的細菌以生產結核病疫苗的 方法

【背景技術】
[0001] 結核病是一種影響人類和動物的傳染性疾病，由於該物種之一的結核分枝 桿菌（Mycobacterium tuberculosis)複合群（complexe)，即特別是結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis)(以及由其衍生 的 BCG 株）、非洲分枝桿菌（Mycobacterium africanum)、卡氏分枝桿菌（Mycobacterium canettii)、山羊分枝桿菌（Mycobacterium caprae)、田鼠分枝桿菌（Mycobacterium microti)和海豹分枝桿菌（Mycobacterium pinnipedii)[19]以及 Mycobacterium mungii (20)。結核病每年在世界各地引起約900萬新發感染病例，並且每年殺死約300萬 人。HIV感染流行與發達國家結核病的重新出現同時出現，並且令人擔憂的是伴有耐受一線 抗結核病抗生素的結核分枝桿菌菌株的出現。結核病是一種傳染性疾病，可以傳染自患有 杆狀肺結核的人，即在吐出物中排出結核分枝桿菌複合群的活分枝桿菌的人。
[0002] 在很長一段時間，預防肺結核是基於接種卡介苗（BCG)，這是一種牛分枝桿菌 (Mycobacterium bovis)的減毒株，一種和結核分枝桿菌非常密切相關的分枝桿菌屬，並且 也在人類與動物中引起結核病，主要是牛結核病。然而，BCG疫苗的功效變化很大，這取決於 臨床情況以及在其中已經測量這種功效的國家。這種功效在〇%的保護直至60%的保護之 間不等。BCG疫苗對肺結核的這種不良保護已導致一些國家的衛生機構放棄這種接種。自 2007年7月以來，法國就是如此，因為除了一些更特殊群體（如醫療保健提供者）外，BCG 接種在法國不再是強制性的。
[0003] -些實驗研究用結核分枝桿菌基因組的不同遺傳工程方法，努力提高BCG疫苗 的保護性，但到現在為止，這些構建體中未能允許開發出BCG的替代疫苗用於保護免受結 核病以及特別是肺結核。一個第一個策略是，開發產生並分泌細胞因子的BCG變體[1]。 第二個策略是，著手構建表達結核分枝桿菌30千道爾頓的抗原蛋白的重組BCG;這種構 建體在動物模型中顯示出保護作用。最後幾項研究對BCG株的基因組進行工程化，使其 分泌細菌單核細胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes)的李斯特菌溶胞素 (listeriolysin)以刺激參與結核病保護的⑶8和⑶4淋巴細胞[2]。最後一個策略轉向 通過使強毒基因（如phoP基因和mce基因）失活產生結核分枝桿菌的減毒株[3、4]。在動 物模型中，這些構建體顯示出比BCG更強的抗結核分枝桿菌感染的保護[3、4]。
[0004] 如已知的，這種負責感染人類或動物的分枝桿菌屬的減毒株能夠被用於生產疫 苗，特別是通過將所述減弱的細菌插入所述疫苗。
[0005] 如已知的，尤其當在真核細胞中進行體內培養時，用作疫苗的分枝桿菌的株尤其 是H37Rv株，具有不超過30天的存活時間。在實踐中，生長的降低伴隨著所述細菌在所述 細胞中壽命的減少，尤其是在體內。
[0006] 在恥垢分枝桿菌（M. smegmatis)的膜提取物中，MspA孔蛋白作為一種20kDa亞基 組成的寡聚蛋白而被發現[5]。它被認為是恥垢分枝桿菌中主要和最豐富的孔蛋白[5、6]。 抑制編碼MspA的mspA基因降低恥垢分枝桿菌外膜對葡萄糖[7]、對磷酸鹽[8]、對金屬離 子和對胺基酸[9]的滲透性，表示此孔蛋白是恥垢分枝桿菌中對不同基質的主要通用擴散 通路，也允許從分枝桿菌外的介質中流入營養物[8、9]。也在其它快速生長的分枝桿菌中檢 測到編碼MspA孔蛋白的基因，比如龜分枝桿菌（Mycobacterium chelonae) [10]以及草分 枝桿菌（Mycobacterium phlei) [11]。已經顯示在結核分枝桿菌和牛分枝桿菌中表達MspA 孔蛋白增加了它們對抗生素敏感性[12]。類似地，恥垢分枝桿菌的MspA孔蛋白增加牛分枝 杆此6菌株在無菌（ &161119116)介質中的生長[14]。在這些先前的研究中[12、14]，作者通 過在無菌Middlebrook 7H10瓊脂介質中的生長，確定了抗生素對於對照株結核分枝桿菌 H37Rv和表達MspA的株的最小抑制濃度。
[0007] 最後，已經顯示恥垢分枝桿菌中缺失mspA基因增加恥垢分枝桿菌在小鼠巨噬細 胞中的存活（13)。
[0008] 因此，遵循如下文獻：
[0009] 1-不同的生物工程技術已被用來產生突變或缺失來構建結核分枝桿菌複合群的 細菌的減毒株。通過使強毒基因（如phoP基因和mce基因）失活而產生結核分枝桿菌的 減毒株的策略[3、4]，在小鼠和豚鼠動物模型中表現出比BCG對結核分枝桿菌感染更強的 保護[3、4]。然而，出於用作疫苗或生產疫苗的目的，這些生物工程技術沒有有效地用於添 加從結核分枝桿菌複合群的細菌基因組中缺失的基因。
[0010] 2-沒有現有技術的研究表明mspA基因的表達能減弱結核分枝桿菌複合群的細菌 在真核細胞模型和動物模型中的生長，以及更強的原因在於它可以用作疫苗或生產疫苗。
[0011] 本發明的目的是提供結核分枝桿菌複合群的新型株，其具有降低的生長速率，但 同時保持了其免疫原性。
[0012] 疫苗領域中的技術人員不斷尋求多樣化的疫苗生產模式，以提高所述疫苗的功效 和減少副作用，並且還擴展了可受益於接種的哺乳動物譜，特別是家畜如牛。


【發明內容】

[0013] 與需要失活或消除基因以失活分枝桿菌以便可用於疫苗目的的那些策略不同，根 據本發明，發明人驚奇地發現，利用分子工程方法通過基因的增加和表達，有可能減弱結核 分枝桿菌複合群的細菌。
[0014] 為此，通過在所述分枝桿菌中增加和表達編碼恥垢分枝桿菌孔蛋白A的mspA基 因，本發明提供了一種用於降低結核分枝桿菌複合群的分枝桿菌株在真核細胞中生長的方 法，以期使其用作疫苗。
[0015] 在 Georgiana E. Purdy 等人，2009 中（Molecular Microbiology. 73 卷 N。5. 1， 2009年9月，844-857頁），作者使用了結核分枝桿菌⑶C 1551株，其比結核分枝桿菌的大 多數其它株更毒[31]並因此不適合用作疫苗，並且報導由於鼠巨噬細胞感染了鼠白血病 病毒（MuLV)即RAW264. 7細胞[28]而表達mspA孔蛋白的所述轉化株在所述鼠巨噬細胞中 的活力降低。有效地，已知由於病毒幹擾的現象，免疫系統細胞（如巨噬細胞）感染第一病 毒（MuLV)導致感染所述細胞[29]的第二微生物結核分枝桿菌的活力降低。考慮到製備抗 結核病的疫苗，這就是為什麼作者沒有提及可能使用結核分枝桿菌的所述突變體向宿主賦 予增加的免疫力的優勢。
[0016]在Mailaender等人中[12]，與結核分枝桿菌野生型株相比，表達mspA孔蛋白的轉 化株在培養基中生長增加的結果，啟示本領域技術人員，如此轉化的株不允許在宿主真核 細胞中降低所述株的生長。在Mailaender等人，2004中[12]，作者解釋道，出於提供具有 抗結核病活性的新型分子而不考慮提供新型疫苗的目的，他們獲得的實驗數據僅僅符合結 核分枝桿菌株對天然抗生素（源自泛素的肽）更高的敏感性。
[0017] 根據本發明，首先已發現通過使用未感染病毒的巨噬細胞系，更特別地是通過對 健康人類志願者供體的細胞進行分析，能夠獲得改進的結核分枝桿菌株的減毒株，其可方 便地用作疫苗的。如下實施例4所報告，通過在動物中的體內實驗數據證實了這些結果。這 些結果，顯示根據本發明的突變株的無害性，超越了本領域中目前針對BCG所發表的所有 結果[30]，並且為改進抗結核病的疫苗構成了基礎。
[0018] 更具體地，本發明提供了結核分枝桿菌複合群的分枝桿菌株在生產用於預防結核 分枝桿菌複合群的細菌在宿主中感染的疫苗中的用途，在所述結核分枝桿菌複合群的分枝 桿菌株中已插入能夠表達恥垢分枝桿菌孔蛋白A的mspA基因，所述宿主包含真核細胞，優 選巨噬細胞；所述的如此轉化的分枝桿菌株在所述真核細胞中顯示出降低的生長。
[0019] 更具體地，本發明的主題是根據本發明的結核分枝桿菌的轉化株在生產用於預防 哺乳動物或鳥中結核病的疫苗中的用途，所述細胞是巨噬細胞。
[0020] 更具體地，本發明的主題是可用於生產預防人類結核病的疫苗的根據本發明的轉 化株的用途。
[0021] 根據本發明，已觀察到：
[0022] a_結核分枝桿菌複合群的如此轉化的分枝桿菌株，在不含真核細胞的培養基中 (無菌介質）顯示出比結核分枝桿菌野生型株更強的生長，其中所述轉化的分枝桿菌株允 許在結核分枝桿菌複合群的所述分枝桿菌中表達Msp孔蛋白--在這方面發明人已經證實 了先前文獻中發表的結果[12、14];
[0023] b_然而，出人意料的是，正如當使用包含尤其是小鼠巨噬細胞和人類巨噬細胞的 三種不同真核細胞培養基所顯示的，相較於原始野生型株的生長，在與真核細胞的共培養 中這種轉化株的生長允許結核分枝桿菌突變體的生長降低。這些巨噬細胞尤其參與結核 病、和免疫原性反應以及因此從用作疫苗方面的保護。巨噬細胞是人類和動物細胞，其吞噬 結核分枝桿菌分枝桿菌以試圖消滅它們並將分枝桿菌的抗原遞呈給免疫系統的其它細胞 [25]。
[0024] 真核細胞共培養中這種細胞內的生長結果完全出乎意料，因為它有悖於發明人所 取得的發現、以及在不含真核細胞的無菌介質中的培養相關的國際文獻中所公布的[12、 14]。
[0025] 此外，小鼠中體內分析允許證明，生長中這種降低在體內得以保持，並且減毒株的 免疫原性特性也得以保持，因此這能被賦予用於生產疫苗以及甚至作為哺乳動物和鳥中結 核病疫苗的有利用途。
[0026] 更具體地，所述mspA基因被插入到所述株中，並置於允許在結核分枝桿菌複合群 的所述分枝桿菌中表達所述mspA基因的啟動子控制下。
[0027] 更具體而言，含有所述mspA基因的質粒被插入到啟動子的控制下，用於在結核分 枝桿菌複合群的所述分枝桿菌中表達所述mspA基因。
[0028] 更進一步地具體而言，所述mspA基因以及控制所述mspA基因在結核分枝桿菌復 合群的所述分枝桿菌中表達的所述元件，被插入到結核分枝桿菌複合群的所述分枝桿菌的 染色體中。
[0029] 本文的"結核分枝桿菌複合群的細菌"是指至少選自如下的細菌物種之一：結核分 枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis)及其克隆、 或BCG亞種、非洲分枝桿菌（Mycobacterium africanum)、卡氏分枝桿菌（Mycobacterium canettii)、山羊分枝桿菌（Mycobacterium caprae)、田鼠分枝桿菌（Mycobacterium microti)、海豹分枝桿菌（Mycobacterium pinnipedii)和Mycobacterium mungii。這些物 種均密切相關，目前測序的這些物種它們的基因組具有高於99%的相似性；它們都引起相 同的臨床疾病並在感染器官中引起相同的組織損傷，特徵在於形成具有巨噬細胞型的巨細 胞的肉芽腫[26]。
[0030] 在本發明一個優選實施方案中，所述結核分枝桿菌複合群的株是物種結核分枝杆 菌的株。
[0031] 更具體地，所述結核分枝桿菌的原始株是H37RV株。
[0032] 更具體地，所述mspA基因包含本說明書所附序列表中的序列SEQIDN°1。
[0033] 更進一步尤其是，所述mspA基因在被稱為"hsp60啟動子"的表達元件控制下，所 述表達元件由本說明書所附序列表中的SEQ ID N° 4組成。有利地，所述真核細胞是哺乳 動物或鳥的細胞，優選所述細胞是人類細胞。更優選，所述細胞是巨噬細胞。
[0034] 本發明還提供了一種疫苗，其包含結核分枝桿菌複合群的分枝桿菌的轉化株，其 中已插入有能夠在所述分枝桿菌中表達恥垢分枝桿菌孔蛋白A的所述mspA基因，以允許實 施本發明的方法。
[0035] 更具體地，其是結核分枝桿菌的轉化株。
[0036] 更具體地，其是下文中被稱為H37RvpVVMspA的株，以編號12042601於2012年4 月26日保藏在NCTC中心（典型培養物國家中心），英國，SP40JG，威爾特郡索爾茲伯裡，波 頓鎮的健康保護局培養物中心（Health Protection Agency Culture Collections)。此保 藏的提交符合布達佩斯條約。
[0037] 更具體地，根據本發明的"轉化株"在每ml的細胞培養物中細菌數目方面，顯示出 所述細菌在真核細胞中降低至少90%、甚至至少99%的生長。換言之，每ml細胞培養物中 細菌數目除以至少10,甚至除以至少100。
[0038] 根據本發明轉化的分枝桿菌株在真核細胞培養物中尤其是在體內，具有不超過60 天，優選不超過50天的存活期。
[0039] 實踐中，生長的降低伴隨著所述細菌在所述細胞中壽命的減少，特別是在體內，至 少3至10天。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 閱讀如下實施例並參考圖1至圖3,本發明的其它特徵和優點將變得更加明顯，其 中：
[0041]-圖1是SDS-PAGE凝膠照片，其顯示MspA孔蛋白的表達水平。泳道M顯示分子量 標記物。泳道1顯示恥垢分枝桿菌蛋白提取物的分離，泳道2是結核分枝桿菌H37Rv/pVV16 的蛋白提取物，以及泳道3顯示結核分枝桿菌H37Rv/pVVMspA的蛋白提取物的分離，MspA蛋 白20KDa處可見。
[0042]-圖2給出了在MspA孔蛋白存在時，在實施例1的7H9無菌介質上結核分枝桿菌 生長增加的曲線，沿Y軸測量的是600nm處的光密度（0D)，從0到1維持18天（X軸上的 "t"）。
[0043]-圖3A至3C給出了結核分枝桿菌H37Rv/pVV16和結核分枝桿菌H37Rv/MspA在不 同真核細胞中的細胞內生長曲線：實施例2和3中的多噬棘阿米巴（A.polyphaga)(圖3A)、 BMDM (圖3B)以及hMdM(圖3C)，測量為細胞裂解物的CFU/ml數，從0到1000000 (Y軸），培 養0至14天後（X軸上的"t"）。
[0044]-圖4顯示，針對以不同濃度（10,000CFU/100iil和10,000CFU/100iil)的野生型 H37Rv株感染的小鼠以及以不同濃度（10,000CFU/100iil和10,000CFU/100iil)的修飾的 H37Rv/pVVMspA株感染的小鼠，以克（g)計的小鼠重量（w)作為時間⑴的函數的趨勢，其 中時間為從〇到39天數。
[0045]-圖5顯示如實施例4所討論的，接種根據本發明的結核分枝桿菌H37Rv 的 野生型株和結核分枝桿菌株（□)後，在肝臟中（A)、脾臟（B)和肺（C)中的細菌載量（CFU 數目）。

【具體實施方式】
[0046] 實施例1.表達MspA的結核分枝桿菌在無菌介質中的生長
[0047] 首先，發明人從恥垢分枝桿菌基因組中擴增編碼MspA孔蛋白的基因，然後將擴增 產物插入到表達載體PVV16中[16]以獲得質粒pVVMspA，表達載體pVV16特徵在於存在 編碼抗潮黴素和卡那黴素（選擇標記物）的蛋白的兩個基因。發明人隨後通過電穿孔將 pVVMspA質粒併入結核分枝桿菌的株HS7Rv，並使用潮黴素和卡那黴素作為抗生素進行篩 選轉化的克隆。
[0048] 實驗規程
[0049] 1) pVVMspA 質粒的構建：
[0050] 首先，發明人從恥垢分枝桿菌株mcl55(ATCC 700084)中提取基因組DNA，並使用 標準PCR來擴增編碼MspA孔蛋白的基因[5]。
[0051] 所述基因的序列gi_118467340是如下序列SEQ.ID.N° 1 :
[0052] 5，-
[0053] ATGAAGGCAATCAGTCGGGTGCTGATCGCGATGGTTGCAGCCATCGCGGCGCTTTTCACGAGCACAGGC ACCTCTCACGCAGGCCTGGACAACGAGCTGAGCCTCGTTGATGGCCAGGACCGCACCCTCACCGTGCAGCAGTGGGA CACCTTCCTCAATGGTGTGTTCCCCCTGGACCGCAACCGTCTTACCCGTGAGTGGTTCCACTCCGGTCGCGCCAAGT ACATCGTGGCCGGCCCCGGTGCCGACGAGTTCGAGGGCACGCTGGAACTCGGCTACCAGATCGGCTTCCCGTGGTCG CTGGGTGTGGGCATCAACTTCAGCTACACCACCCCGAACATCCTGATCGACGACGGTGACATCACCGCTCCGCCGTT CGGCCTGAACTCGGTCATCACCCCGAACCTGTTCCCCGGTGTGTCGATCTCGGCAGATCTGGGCAACGGCCCCGGCA TCCAGGAAGTCGCAACGTTCTCGGTCGACGTCTCCGGCGCCGAGGGTGGCGTGGCCGTGTCGAACGCCCACGGCACC GTGACCGGTGCGGCCGGCGGTGTGCTGCTGCGTCCGTTCGCCCGCCTGATCGCCTCGACCGGTGACTCGGTCACCAC CTACGGCGAACCCTGGAACATGAACTGA-3'.
[0054] 所用的引物是：
[0055] -MSPA-pVV16F ：5, -cccccccatatgaaggcaatcagtc-3, (SEQ. ID.N。2);以及
[0056] -MSPA-pVV 16ndel :5，-ccccatatgtcagttcatgttccaggg-3, (SEQ. ID.N。3)。
[0057] 確定這些引物用於產生對應整個msp.A基因的PCR產物（636bp)，其中在每側攜帶 限制性酶Ndel (此酶的切割位點在上述引物序列中用下劃線表示）的切割位點，以允許在 表達載體PVV16中進行克隆；隨後是其組成型表達。
[0058]像其它表達載體如pMS3 [15]、pMV261 [16] -樣，pVV16載體在分枝桿菌中具有潮 黴素抗性盒和hsp60表達啟動子（SEQ. ID. N° 4) [16]。pVV16的特異性在於大腸桿菌的表 達啟動子（用於驗證克隆時的質粒構建體）和允許雙重篩選的卡那黴素抗性盒[16]。
[0059] 接下來，將PCR片段克隆在pVV16質粒的Ndel位點，得到pVVMspA質粒。用最簡 單的方法（熱休克）將此後者插入至大腸桿菌DH5 a。通過酶促消化和隨後測序的PCR擴 增來驗證該質粒構建體。
[0060] hsp60 啟動子的 SEQ. ID.N。4 序列是：5' -
[0061] AACGCGTCGGCGGCTGCGCGCACCGAGTCCAGCGAGCACAGATCGAGTTGCTGCAGCGTGACGTGGGCG CCTGGGCGGGCGGCCATGATGCGGGCCCGGGCGGCGTTGCCCTTCTCGAGATTGCGGACGGCCAAACCTACGTGTGC ACCGCGGTCGGCAAACACGGCGGCGGTGTGGTAGCCGATGCCGGTGTTGGCGCCGGTGACCACAACGACGCGCCCGC TTTGATCGGGGACGTCTGCGGCCGACCATTTACGGGTCTTGTTGTCGTTGGCGGTCATGGGCCGAACATACTCACCC GGATCGGAGGGCCGAGGACAAGGTCGAACGAGGGGCATGACCCGGTGCGGGGCTTCTTGCACTCGGCATAGGCGAGT GCTAAGAATAACGTTGGCACTCGCGACCGGTGAGTCGTAGGTCGGGACGGTGAGGCCAGGCCCGTCGTCGCAGCGAG TGGCAGCGAGGACAACTTGAGCCGTCCGTCGCGGGCACTGCGCCCGGCCAGCGTAAGTAGCGGGGTTGCCGTCACCC GGTGACCCCCGGTTTCATCCCCGATCCGGAGGAATCACTTCGCA-3 /
[0062] 在hsp60啟動子控制下的mspA基因表達盒由並置（juxtaposition)的SEQ. 10.獷4和5已〇.10^°1組成。
[0063] 2)電感誇傑結核分枝桿菌的分枝桿菌的制各以及插入dVVMsdA質粒:
[0064] 如Van Kessel和Hatfull先前所述[18]的來製備電感受態（對質粒的插入是可 滲透的）結核分枝桿菌細菌株H37Rv(ATCC 27294)[17]。簡言之，結核分枝桿菌分枝桿菌 收穫自光學密度（D0_)在0. 8-1. 0之間的結核分枝桿菌H37Rv的液體培養物，在10%甘 油中洗滌三次，在相同的緩衝液重新懸浮。質粒pVV16(對照，以保證生長的變化不是由於 表達載體本身，而確實是由於mspA基因的存在）以及pVVMspA (含有目標MspA孔蛋白的基 因的質粒），利用電穿孔儀（參考Multiporator/Electroporator 2510,法國，Le Pecq)以 1000歐米爺2. 5kV和25uF，通過電穿孔分別插入到分枝桿菌中。經電穿孔的分枝桿菌收集 在lmL富集的液體Middelbrook 7H9介質中（Sigma-Aldrich，法國裡昂）於37°C培養12h， 然後塗布在Middelbrook 7H10介質上通過添加卡那黴素加潮黴素進行篩選，於37°C孵育 3至4周。轉化的結核分枝桿菌分枝桿菌中mspA基因的轉錄和翻譯，通過PCR、RT-PCR和 SDS-PAGE 驗證。
[0065] MspA孔蛋白的特徵在於它對熱變性的穩定性[5]。在圖1中，用結核分枝桿菌 H37Rv/pVV16(泳道2)、結核分枝桿菌H37Rv/pVVMspA (泳道3)和恥垢分枝桿菌（陽性對 照）（泳道1)的蛋白提取物進行SDS-PAGE凝膠電泳。經高溫選擇性提取製備這些提取物 [27]。圖1顯示mspA基因在結核分枝桿菌H37Rv和在對照株恥垢分枝桿菌中的表達。從凝 膠切出所檢測到的蛋白點，並通過MALDI-T0F質譜進行分析。該蛋白點經鑑定具有和20KDa 的恥垢分枝桿菌的MspA蛋白序列21 %至29%的序列覆蓋度以及相似性。
[0066] 3)轉化或未轉化的結核分枝桿菌株在液體介質中的生長：結核分枝桿菌H37Rv/ PVV16 (不表達MspA孔蛋白的對照轉化株）和結核分枝桿菌H37Rv/pVVMspA (表達MspA孔蛋 白的轉化株）置於5mL的Middlebrook 7H9介質（Becton Dickinson, Le Pont de Claix，法 國）的預培養物中保持15天，直至達到D0_值為1。然後，在攪拌下劇烈渦旋混合分枝桿菌 以除去細胞簇，收集並稀釋於l〇ml的新鮮7H9介質中。用BACTEC MGIT 960系統（Becton Dickinson, Le Pont de Claix，法國）通過D0_測量在三個獨立的培養中確定兩菌株的增 長速率。這種全自動的系統是基於對需氧菌氧氣消耗的檢測。
[0067] 4)結果
[0068] 為了研究MspA蛋白對結核分枝桿菌生長的影響，本發明人用株結核分枝桿菌/ PVV16和結核分枝桿菌/pVVMspA在液體7H9無菌介質中以三個獨立的培養進行體外生長實 驗。本發明人採用細胞懸浮液，並在BACTEC MGIT960系統中測量為期17天的細菌生長。 對照株結核分枝桿菌/pVVl和結核分枝桿菌/pVVMspA株的生成時間分別是19小時10分 ±10分以及17小時16分±12分（圖2)。因此，本發明人確定表達MspA孔蛋白的株比對 照株顯示更快的生長（P < 0. 05)。進行了三次的此實驗顯示MspA孔蛋白的表達增加了結 核分枝桿菌的生長速率。
[0069] 實施例2.表達MspA的結核分枝桿菌和變形蟲多噬棘阿米巴的共培養的生長
[0070] 1)實驗規程：
[0071] 10mL變形蟲懸液（?105變形蟲/mL)接種?10 6分枝桿菌/ml (M0I = 10)。作 為對照，多噬棘阿米巴和分枝桿菌分別培養在PAS緩衝液（Page氏改性的Neff氏變形蟲鹽 水）中（21、22、23)。在32°C孵育24h的時間後，用PAS洗滌三次共培養物，在32°C在10ml PAS中孵育10至15分鐘。
[0072] 2)結果：
[0073] 使用變形蟲作為真核細胞，共培養8天後觀察到兩株結核分枝桿菌H37Rv/pVV16 和結核分枝桿菌H37Rv/pVVMspA在實驗中存活，但是表達MspA孔蛋白的結核分枝桿菌 H37Rv/pVVMspA分枝桿菌的數目顯著降低（P彡0. 05 ;Student氏統計檢驗）。在第12天，對 於結核分枝桿菌H37Rv/pVV16的菌落數目為2X 105±6X 104,相對於結核分枝桿菌H37Rv/ pVVMspA 的菌落數目為 8X103±5X103(圖 3A)。
[0074] 圖3A給出了結核分枝桿菌H37Rv/pVV16和結核分枝桿菌H37Rv/MspA在真核細胞 多噬棘阿米巴培養物中的細胞內生長曲線。
[0075] 這些數據表明，相較於結核分枝桿菌H37Rv/pVV16株，結核分枝桿菌H37Rv/ pVVMspA細胞內生長約兩個對數的降低，S卩每ml培養物中細菌數目約99 %的降低。
[0076] 實施例3.表達MspA的結核分枝桿菌和人類巨噬細胞（hMdM)或小鼠巨噬細胞 (BMDM)共培養的生長：
[0077] 1)實驗規程：
[0078]使用 Ficoll 梯度（MSL, Eurobio, Courtaboeuf 法國）從白細胞層（leukopack)(法 國，馬賽，國家血液服務機構（EtablissementFran^ais du Sang))分離 BMDM[24]和 hMdM, 然後使其分化，並分別（1〇5細胞/孔）接種在24孔培養板在含有10% FCS的RPMI 1640 介質中。分別用結核分枝桿菌、結核分枝桿菌H37Rv/pVV16和結核分枝桿菌H37Rv/pWMspA 感染BMDM和hMdM達24小時，然後洗滌巨噬細胞來除去游離的分枝桿菌，之後在含有10% 胎牛血清（FCS)的RPMI1640介質中孵育不同時間段。作為對照，分別培養每種細胞類型和 分枝桿菌。
[0079] 確定定細朐內分枝桿菌的數目（CFU)：
[0080] 在給定的時間，用0. 1 %十二烷基硫酸鈉（SDS)裂解被感染的細胞30min，然後穿 過26號規格的針以保證完全裂解。用PBS將裂解物（500 ii L)洗滌三次，塗布在固體7H10 介質上（Becton Dickinson, Le Pont de Claix，法國）並在37°C孵育15天以確定細胞內 分枝桿菌的菌落數（CFU)。所有的實驗均以一式三份進行。
[0081] 2)結果：
[0082] 通過使用BMDM巨噬細胞作為真核細胞，本發明人觀察到兩株結核分枝桿菌 H37Rv/pVV16和結核分枝桿菌H37Rv/pVVMspA在整個實驗時間（14天）均得以存活。本 發明人觀察到第4和第14天之間，對照株H37Rv/pVV16顯示出比表達MspA的株顯著更 強的生長（P < 0. 05)(圖3B)。在第14天，對於結核分枝桿菌H37Rv/pVV16的菌落數為 IX 106±7X 105,相對於結核分枝桿菌 H37Rv/pVVMspA 的菌落數 4X 105±1105(P 彡 0. 05)。
[0083] 轉化的或未轉化的結核分枝桿菌與人類巨噬細朐的共培養
[0084] 使用hMdM巨噬細胞作為真核細胞，本發明人觀察到在第4天及其以後直到 實驗結束時，對照株結核分枝桿菌H37Rv/pVV16比表達MspA的株顯示出顯著更強的 生長（P < 0.05)(圖3C)。在第14天，對於結核分枝桿菌H37Rv/pVV16的菌落數為 2X 104±2X 103,相對於結核分枝桿菌H37Rv/pVVMspA的菌落數為5X 103±7102。
[0085] 總之，這些結果表明，與對照株相比，在結核分枝桿菌中MspA孔蛋白的表達導致 細菌在3種測試類型的真核細胞中難以增殖。
[0086] 圖3B和3C給出結核分枝桿菌H37Rv/pVV16和結核分枝桿菌H37Rv/MspA在不同 巨噬細胞培養物中的細胞內生長曲線：BMDM(圖3B)和hMdM(圖3C)。
[0087] 這些數據表明，相較於結核分枝桿菌H37Rv/pVV16株，結核分枝桿菌H37Rv/ pVVMspA的細胞內生長約一個對數的降低，S卩每ml培養物的細菌數目約90%的降低。
[0088]實施例4.表達MspA的結核分枝桿菌在動物模型中的生長和對結核病的保護
[0089] 1)實驗規程：
[0090] 在得到當地動物實驗倫理委員會辦公室批准後3天，在NSB實驗室進行在動物中 的研究。通過腹膜內途徑用100 y L細菌培養物感染6至8周齡的Balb/c小鼠（每組10 只）。採用上述各株（野生型H37RvATCC 27294株和突變的結核分枝桿菌H37Rv/pVVMspA 株）的Tw不同的接種物：1 X 107CFU/mL和1 X 105CFU/mL。作為對照，一組小鼠被感染有 100 U L的無菌PBS。持續一個月監測小鼠的重量、表現和存活。
[0091] 根據其它研究者發表的規程進行感染小鼠的檢查[3]。此外，在第一階段處死一些 存活的小鼠，通過病理解剖分析脾、肝和肺，並確定每培養物、每組織的細菌載量，並以CFU 表示。在第二階段，兩組中存活的小鼠重新接種10 7CFU/mL的結核分枝桿菌h37Rv，並進行 相同的觀察規程。
[0092] 2)結果：
[0093]目前的數據顯示，相較於感染結核分枝桿菌野生型株的小鼠，感染有本發明的改 變株的小鼠存在更少的行為問題，並具有更快的增重（圖4和圖5)。
[0094] 根據其它研究者發表的規程進行感染小鼠的檢查[3]。感染後10周，接種有突 變結核分枝桿菌H37Rv/pVVMspA株的所有小鼠活了下來，然而接種野生型株的那些表現出 50%的死亡率。這種存活與結核分枝桿菌H37Rv/pVVMspA在肺中非常低的菌落形成單位 (CFU)數目相關。接種有突變結核分枝桿菌H37Rv/pVVMspA株的小鼠發展出較少的組織損 傷，包括小肉芽腫。一隻接種有野生型結核分枝桿菌H37Rv株的小鼠表現出腹部瘻。宏觀分 析表明，接種有野生型結核分枝桿菌H37Rv株的小鼠中脾的重量顯著大於接種有突變株的 小鼠。此外，肝臟中肉芽腫的數目分別為24±21相對於0 ;以及脾中61±27相對於8±7， 這些差異是顯著的（P〈〇.05)。在脾中，相較於野生型結核分枝桿菌H37Rv株，對於突變結核 分枝桿菌H37Rv/pVVMspA株而言，分枝桿菌的計數顯示出CFU數目的顯著降低。細胞分析 中測試的免疫原性被保留下來。
[0095] 第一次接種後90天，本發明人用野生型結核分枝桿菌H37RV株以每ml 107CFU的 接種物再次接種兩組小鼠。再次監測小鼠90天；除了在初次接種時接種有野生型株的每4 只小鼠中的1隻以外，所有小鼠均存活。
[0096]此外，正如在接種第38天及其後所觀察到的，相較於最初接種有野生型株的小 鼠，最初接種有根據本發明疫苗株的小鼠的組中增重顯著更高（P〈〇. 05) (p = Student統計 檢驗，表示當聲稱兩個系列的兩個平均值不相等時錯誤的概率的（此處〈5% ))。
[0097] 第二次接種後90天使小鼠安樂死；組織的組織病理學分析顯示，相較於最初接種 有本發明疫苗株的小鼠（21±25結節），最初接種有野生型結核的組中顯著更高的肺肉芽 腫的結節數（33±37結節）（P〈0. 05)。
[0098] 最後，相較於最初接種有本發明疫苗株的小鼠的組，最初接種有野生型結核的小 鼠的組中，結核分枝桿菌H37RV的細菌載量（CFU的數目）顯著更高（p〈0. 05)(圖5)。[0099] 因此，發明人得到三種類型的證據要素：臨床證據要素（死亡率）；組織學證據要 素（每個器官肉芽腫數）；以及微生物證據要素（接種後的細菌載量），這允許得到這樣的 結論：結核分枝桿菌H37RV/PVVMSPA突變株在這種動物模型中賦予了抗野生型結核的保護 作用。
[0100] 這些結果顯示了本發明突變體株的無害性、以及本發明的結核分枝桿菌突變株對 抗結核分枝桿菌感染的保護性，這超越了本領域中目前針對BCG所發表的所有結果[30]， 並且為改進抗結核病的疫苗構成了基礎。
[0101] 在Brandt L.等人2002中[30]，接種結核分枝桿菌後6周沒有顯出對結核病所導 致死亡率的保護作用，儘管在人類當中其感染前景非常重要。此外，在脾和肺中結核分枝杆 菌的細菌載量被非常溫和地降低。
[0102] 參考文獻
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【權利要求】
1. 結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis)複合群的分枝桿菌株在生產用於預 防宿主中結核分枝桿菌複合群的細菌感染的疫苗中的用途，在所述結核分枝桿菌複合群的 分枝桿菌株中插入有能夠表達恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis)孔蛋白A的mspA 基因，所述宿主包含真核細胞，優選巨噬細胞，所述的如此轉化的分枝桿菌株在所述真核細 胞中具有降低的生長。
2. 根據權利要求1所述的結核分枝桿菌的轉化株在生產用於預防哺乳動物或鳥中結 核病的疫苗中的用途，所述真核細胞是巨噬細胞。
3. 根據權利要求2所述的株在生產用於預防人類中結核病的疫苗中的用途。
4. 根據權利要求1至3中的一項所述的用途，特徵在於插入在所述株中的mspA基因 被置於啟動子的控制下，從而允許在所述結核分枝桿菌複合群的分枝桿菌中表達所述mspA 基因。
5. 根據權利要求4所述的用途，特徵在於所述基因和所述啟動子插入在質粒中。
6. 根據權利要求1至5中的一項所述的用途，特徵在於分枝桿菌複合群的所述分枝杆 菌的所述株是物種結核分枝桿菌的株。
7. 根據權利要求6所述的用途，特徵在於所述結核分枝桿菌的原始株是H37Rv株。
8. 根據權利要求1至7中的一項所述的用途，特徵在於所述mspA基因包含序列SEQ ID N° 1。
9. 根據權利要求4至8中的一項所述的用途，特徵在於所述mspA基因在由SEQ ID N° 4組成的hsp60啟動子的表達元件的控制下。
10. 根據權利要求1至9中的一項所述的用途，特徵在於所述株是經轉化的，並且以編 號12042601於2012年4月26日保藏在NCTC中心（UK)。
11. 一種根據權利要求1至10中的一項所述的用途所獲得的疫苗，特徵在於其包含結 核分枝桿菌複合群的分枝桿菌的所述轉化株，其中插入有能夠在所述分枝桿菌中表達恥垢 分枝桿菌MspA孔蛋白的mspA基因。
12. 根據權利要求11所述的疫苗，特徵在於所述株是結核分枝桿菌的轉化株。
13. 根據權利要求12所述的疫苗，特徵在於所述株是以編號12042601於2012年4月 26日保藏在NCTC中心（UK)的株。
【文檔編號】C12N1/20GK104271732SQ201380024171
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2013年5月16日 優先權日:2012年5月21日
【發明者】M·德朗古, O·拉姆貝特, D·拉烏爾 申請人:地中海傳染基金會