新型鹼性蛋白酶變體及含有該新型鹼性蛋白酶變體的洗滌劑和清洗劑的製作方法

2023-05-03 04:54:41 4

專利名稱：新型鹼性蛋白酶變體及含有該新型鹼性蛋白酶變體的洗滌劑和清洗劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及源自於天然或改良枯草桿菌蛋白酶的新型鹼性蛋白酶變體。根據遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)枯草桿菌蛋白酶的編號，所述變體與目前已知的枯草桿菌蛋白酶相比，具有兩個胺基酸位置199I和211G，和至少一個有利於分子穩定的改良，優選在點突變後位置3的蘇氨酸和/或位置4的異亮氨酸。特別優選的是變體遲緩芽孢桿菌鹼性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G。該變體與其他的蛋白酶變體相比在洗滌劑和清洗劑中具有更好的洗滌性能。除該酶以外，本發明還涉及其在各種不同技術工藝中的應用，特別涉及含有該新型鹼性蛋白酶變體的洗滌劑和清洗劑。
枯草桿菌蛋白酶型的蛋白酶(Subtilase，枯草桿菌肽酶，EC3.4.21.62)基於催化活性的胺基酸被歸於絲氨酸蛋白酶。其是由微生物，特別是芽孢桿菌天然產生和分泌的。其起著非特異內肽酶的作用，也就是說它可水解任何位於肽或蛋白質內部的醯胺鍵。其最適pH大多處於明顯的鹼性範圍。有關該家族的綜述例如可見R.Bott和C.Betzel主編，New York，1996年出版的「Subtilisin enzymes」第75-95頁由R.Siezen撰寫的文章「Subtilases類枯草桿菌-蛋白酶(Subtilisin-likeProteases)」。枯草桿菌蛋白酶適合於多種可能的技術應用，特別是用作洗滌劑或清洗劑的活性成分。
除例如澱粉酶，脂肪酶或纖維素酶的酶外，蛋白酶在數十年來已被廣泛用作洗滌劑和清洗劑的活性成分。其具有將洗滌物如紡織品或器皿上所含蛋白的汙漬加以分解的能力。水解產物由於其相對高的水溶性而隨洗滌水一起衝走或被其他的洗滌劑或清洗劑的成分作用，溶解，乳化或懸浮。由此使得在酶與洗滌劑和清洗劑的其他成分之間產生協同作用。
枯草桿菌蛋白酶基於其優良的酶解特性如穩定性或最適pH值使得其在洗滌劑和清洗劑蛋白酶中佔據一突出的地位。在下述將列舉目前在洗滌劑中應用的枯草桿菌蛋白酶，其部分是天然的分子，而部分是藉助誘變由野生型酶獲得的變體。
在J.Bacteriol.第159卷，第811-819頁Vasantha等人(1984)和在Nucleic acid Research，第11卷，第7911-7925頁J.A.Wells等人(1983)的研究中已公開了分別來源於解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，以及枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的枯草桿菌蛋白酶BPN』。而在專利公布WO95/07991和WO95/30010中敘述了通過酶在環-區域的點突變所獲得的變體，其與底物結合降低的同時提高了水解速率。例如在專利公布WO95/29979中公開了含有該BPN』-變體的洗滌劑。
在本專利申請中所研究的兩個胺基酸位置，即位置3和4，並不處於環-區域；如上述申請中的敘述，殘基199和211分別與位於BPN』分子的第6環位置205以及217同源。所述環參與底物的結合。對BPN』而言，在位置205處天然地具有一異亮氨酸(I)。在公布WO95/07991中提出了大量可能用於替換天然在位置217上的酪氨酸(Y)的胺基酸，但均與分子的穩定突變無關；即使一217G突變被要求保護，也僅是與其他的在該底物-結合的環中催化補償的點突變有關。唯一真正公開的在位置205和/或217上具有替換的變體(S.14)是，在其中兩個殘基已被空間充滿的通常也是脂族胺基酸所替換。同樣的情況見公布WO95/29979。在公布WO95/30010中的枯草桿菌蛋白酶，當其在第6環中具有一突變時，那末在不同環中至少具有另一個突變。作為217G變體公開的例子有Y217G/S188D或那些甚至帶有多個非第6環的替換，其同源性胺基酸在本發明的變體中無改變。
枯草桿菌蛋白酶BPN』用作枯草桿菌蛋白酶的參照酶，尤其涉及位置編號時。例如在申請EP130756中以BPN』的編號標出了所有枯草桿菌蛋白酶涉及的點突變。這些點突變也包括位置217，其對應於本發明酶的位置211。其他相關位置在該文中並未予以先行描述。
蛋白酶枯草桿菌蛋白酶Carlsberg在J.Biol.Chem.，第243卷，第2184-2191頁E.L.Smith等人(1968)和在Nucl.Acids Res.，第13卷，第8913-8926頁Jacobs等人(1985)的出版物中進行了介紹。其天然來自於地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和可從丹麥Novozymes A/S公司，Bagsvaerd以商品名Alcalase購得。通過點突變所獲得的變體在提高水解率的同時對底物的結合減少，公開在例如公布WO 96/28566中。如同上所述及的BPN』申請，在這些變體的分子的環-區域中進行了一個或多個的替換；一變體204I/216G(Carlsberg編號)在其中未被預先述及。
蛋白酶PB92天然產自於親鹼細菌Bacillus nov.spec 92和以商品名Maxacal從荷蘭的Gist-Brocades公司，Delft獲得。其原始序列已在專利申請EP 283075中述及。通過點突變所獲得的所述酶的變體，適合應用於洗滌劑和清洗劑中的酶，在公布WO94/02618和EP 328229中公開。從這些申請的第一個中僅變體L211G/N212D具有一個與本文要求保護的變體相同的替換；而在第二個申請中沒有相關的變體出現。
枯草桿菌蛋白酶147和309被Novozymes公司分別以商品名Esperase以及Savinase銷售。其來源於Bacillus clausii-菌株，在申請GB 1243784中作了公開。例如在公布WO89/06279，WO95/30011，WO99/27082和WO00/37599中公開了通過點突變開發的在洗滌劑和清洗劑中使用該酶的變體的情況。
公布WO89/06279旨在對該蛋白酶達到較高的氧化穩定性，提高的蛋白水解率和改良的洗滌性能。由其(P.14)得出，只有在一定位置上進行替換才可使枯草桿菌蛋白酶147或309分子的物理或化學性質發生改變；這裡未提及位置3，4或211。公布WO95/30011中描述了枯草桿菌蛋白酶309的變體，其在分子的環-範圍內具有點突變和由此在水解率提高的同時顯現對底物的吸附減少；這裡未提及在位置3或4上的突變；唯一真正與本發明申請變體相對應的點突變是取代L211G，而其無論如何不可能與取代V199I相關聯。在公布WO99/27082中，例如從枯草桿菌蛋白酶309中開發出了變體，並由此提高了其洗滌效果，通過一個以上胺基酸的插入使得該活性環被加大。其取代與本發明的不同。
其他在洗滌劑和清洗劑中被使用的蛋白酶的例子有-得自芽孢桿菌的蛋白酶164-A1，Chemgen Corp.，Gaithersburg，MD，USA和Vista Chemical Company，Austin，TX，USA(WO93/07276)；-得自芽孢桿菌的鹼性蛋白酶PD138 NCIMB 40338，Novozymes(WO93/18140)；-得自芽孢桿菌ferm.BP-3376的蛋白酶K-16，Kao Corp.，Tokyo，Japan(US 53444770)；-由Nedkov等人1985在Biol.Chem.Hoppe-Seyler，第366卷第421-430頁所敘述的枯草桿菌蛋白酶DY，其在公布WO96/28557叔述為特別適合於用作洗滌劑和清洗劑，雖然重新通過在活性環上的特異性點突變，但還是沒有V204I變體(相應於按照本發明酶的位置199)，或單獨或與其他取代組合；和-由普通高溫放線菌(Thermoactinomyces vulgaris)(Meloun等人，FEBS Lett.1983，第195-200頁)產生的和例如在公布WO96/28558中優化的Thermitase。
在大量可能的Thermitase變體中，在最後提及的文獻中也述及到替換L221G的變體(相當於本發明酶的位置211)。由於該酶天然地在位置209(相當於本發明酶的199)上具有異亮氨酸，在相應位置(相當於199I/L211G)對本發明重要的其中兩個胺基酸殘基先前在此已加以描述，但沒有附加的特徵，使得分子在這兩個胺基酸在該位置存在時處於穩定。特別是由於在位置3上的蘇氨酸和/或在位置4上的異亮氨酸(按照遲緩芽孢桿菌-鹼性蛋白酶)使得穩定性喪失，這在先前也已被描述。然而thermitase在位置10和11上具有胺基酸殘基絲氨酸和精氨酸，它們同源於遲緩芽孢桿菌蛋白酶所述的兩個位置(與WO91/00345的順序相比)。
此外，Thermitase為一種分子，其序列與其他枯草桿菌蛋白酶具有顯著的偏差(Meloun等人，第198頁)。因此在成熟蛋白質的Thermitase和遲緩芽孢桿菌-鹼性蛋白酶間同系物具有45％的同一性(62％類似的胺基酸)。類似的也適用於蛋白酶K(WO96/28556)，其與遲緩芽孢桿菌-鹼性蛋白酶的同系物在成熟蛋白質水平上僅具有33％的同一性(46％類似的胺基酸)。
其他的蛋白酶例如在申請EP 199404，EP 251446，WO91/06637和WO95/10591中所述，其被Procter Gamble Comp.公司，Cincinnati，OH，USA分別稱作「蛋白酶A」，「蛋白酶B」， 「蛋白酶C」以及「蛋白酶D」和在洗滌劑和清洗劑中加以應用(比較WO00/47707，第73頁)。申請EP 199404中的蛋白酶為不同的變體，其是基於專利EP130756，但不具有與本申請相關的位置變體(比較EP 199404 A2，第20欄)。在專利EP 251446 B1(第49頁)的實施例10中指出，變體Y217G與野生型酶相比穩定性較低，並由此該替換不再被繼續關注。按照公布WO91/06637，「蛋白酶C」通過在位置123和274的點突變而加以區分。按照WO95/10591，「蛋白酶D」的所有變體均在位置76上發生突變，而在本發明的蛋白酶中卻無變化，並且與BPN』是相同的；同樣適用於本申請以及專利WO95/10615，US 6017871和US6066611。
其他已知的蛋白酶可獲自Novozymes公司的商品名為Durazym，Relase，Everlase，Nafizym，Natalase和Kannase，Genencor公司的商品名為Purafect，Purafect OxP和Properase，Advanced BiochemicalsLtd.公司，Thane，India的商品名為Protosol和Wuxi Snyder BiopruductsLtd.，China的商品名為Wuxi的蛋白酶。
為改善枯草桿菌蛋白酶的洗滌功效，許多申請運用了將其它胺基酸插入在活性環中的對策，例如除已述的申請外還有以下述WO00/37599，WO00/37621至WO00/37627和WO00/71683至WO00/71691所公開的申請。
另一對策為改變分子的表面電荷。例如在公布WO91/00334，WO91/00335，WO91/00345，EP 479870，EP 945502和EP 563103中介紹了大量的胺基酸-替換，由此可使得分子的等電點提高或降低。公布WO00/24924由此得出一識別相應合適變體的方法。對於WO96/34935也同樣適合，按照相同原理也可改變分子的疏水性。
另一改善枯草桿菌蛋白酶洗滌功效的對策為在已知分子中隨機導入點突變和測試所獲得變體對洗滌功效的作用。例如專利US 5700676遵循了該對策，其中作為唯一與本發明有關的位置，除若干其他替換外，在位置217(BPN』編號)上的替換被述及。同樣適合的有專利US5310675，US 5801038，US 5955340和公布WO99/20723和WO99/20727。在專利US 4760025中建議的唯一突變與本發明有關的是在位置217上的突變，因為其與活性中心有關。所有這些文獻並未提示本發明的其他替換可在洗滌功效上起重要作用。
現代的酶發展方向是將已知蛋白的相互有關的元件通過統計方法結合成到新酶中，使其具有乞今未達到的性能。這樣的方法也概括地稱為指導演化法。對此例如有下述的方法StEP-法(Zhao等人(1998)，Nat.Biotechnol.，第16卷第258-261頁)，隨機引發重組法(Shao等人(1998)，Nucleic Acids Res.，第26卷第681-683頁)，DNA-改組法(Stemmer，W.P.C.(1994)，Nature，第370卷第389-391頁)或RACHITT(Coco，W.M.等人(2001)，Nat.Biotechnol.，第19卷第354-359頁)。
另一特別的補充對策為提高所涉及蛋白酶的穩定性和由此提高其作用效能。這種對蛋白酶的穩定法被用於化妝品中，例如在US 5230891中敘述。對洗滌劑和清洗劑而言，與其不同，常用的穩定法是藉助於點突變。因此按照US 6087315和US 6110884，採用其他胺基酸殘基替換特定的酪氨酸殘基可使蛋白酶穩定。其他的可能性例如為-按照EP 583339用脯氨酸替換特定的胺基酸殘基；-按照EP 995801向分子表面引入較極性的或帶電荷的基團；-改變金屬離子的結合，特別是鈣結合的位置，例如按照公布WO88/08028和WO 88/08033的教導；在專利US 5340735，US 5500364，US 5985639和US 6136553中報導了其他使枯草桿菌蛋白酶穩定的可能性，特別是對於得自於遲緩芽孢桿菌的那些枯草桿菌蛋白酶。
遲緩芽孢桿菌(B.lentus)的鹼性蛋白酶為得自於芽孢桿菌種(Bacillus species)的高鹼性蛋白酶。以保藏編號DSM 5483給出了其中一種菌株(WO91/02792以及EP 493398和US 5352604)。在WO92/21760，WO95/23221和WO98/30669中公開了通過點突變所獲得的並在洗滌劑和清洗劑中可應用的酶變體。
野生型酶來源於最初通過篩選鹼性芽孢桿菌菌株而獲得的產品，並且自身表現為一相對高的氧化穩定性和洗滌劑作用。在公布WO91/02792以及EP 493398和US 5352604中，描述了其在宿主地衣芽孢桿菌ATCC 53926中的異源表達。在所述US專利的權利要求中，特徵是指位置208，210，212，213和268，但是在位置61和211無替換變體，後者是遲緩芽孢桿菌鹼性蛋白酶的特徵。
公布WO92/21760也公開了野生型遲緩芽孢桿菌鹼性蛋白酶的胺基酸序列為SEQ ID NO52和其核苷酸序列為SEQ ID NO106。除此之外在該申請中公開了51種不同的變體，這些變體與野生型在眾多位置相區別，其中還有S3T，V4I和V199I。
公布WO95/23221和WO98/30669也表明遲緩芽孢桿菌鹼性蛋白酶變體適合於在洗滌劑和清洗劑中的使用，該變體在3個位置S3T，V4I和V199I與本發明的酶相對應。除此之外，其具有2個或3個其他的相對於得自遲緩芽孢桿菌DSM 5483的野生型酶的點突變。其中一些攜帶另一在位置211，即211D的突變(變體F49，F54和F55)；結果，所述申請要求替換211D和211E的權利。
正如長時間來進行的研究所表明，對於在洗滌劑和清洗劑中使用的替代蛋白酶存在高的需求。最近的公布如WO00/71683至WO00/71691證實，長期以來建立的枯草桿菌蛋白酶蛋白酶家族始終存在對其在洗滌劑和清洗劑中應用的優化要求。其隨之而來進行了大量的工作以使得涉及酶的胺基酸序列發生變化。然而人們不可能輕易地從可能的可計算的酶性能中推斷出所述酶在洗滌劑或清洗劑配方中的行為(對照US 5801039，US 5985639和US 6136553)。其他的因素如對氧化劑的穩定性，由於表面活性劑的變性，摺疊效應或所期望的與其他成分的協同作用也在這裡起著重要的作用。
本發明的目的是找出在技術應用中具有改良效果的枯草桿菌蛋白酶。特別是應找出那些可改善洗滌劑和/或清洗劑的洗滌和清洗性能的枯草桿菌蛋白酶。
部分目的不僅改善蛋白酶的水解活性，而且還應在相應的洗滌劑和清洗劑配方中的穩定性。
本專利申請針對該問題研究了對策，特別相對於在公布WO91/02792，WO92/21760和WO95/23221中公開的用於洗滌劑和清洗劑中的分子，對得自遲緩芽孢桿菌DSM 5483的枯草桿菌蛋白酶進行了進一步的改良。
驚奇地發現，在位置199和211的胺基酸異亮氨酸和甘氨酸可導致洗滌性能提高，所述性能通過在位置3以及4上的胺基酸蘇氨酸和異亮氨酸或許由於穩定性效果而得以增強。
按照本發明，該目的將通過枯草桿菌蛋白酶型的鹼性蛋白酶來解決，其特徵在於，按照得自遲緩芽孢桿菌DSM 5483的枯草桿菌蛋白酶的編號，在位置199具有異亮氨酸和位置211具有甘氨酸和至少一種穩定作用胺基酸，優選由於在位置3上的胺基酸蘇氨酸和在位置4上的異亮氨酸。
其同樣也可藉助枯草桿菌蛋白酶變體來解決，其特徵在於，按照得自遲緩芽孢桿菌DSM 5483的枯草桿菌蛋白酶的編號，在位置199具有異亮氨酸和位置211具有甘氨酸，以及更優選的是另有在位置3上的胺基酸蘇氨酸和在位置4上的異亮氨酸中的一個或兩個。
其同樣也可藉助枯草桿菌蛋白酶變體來解決，其特徵在於，按照得自遲緩芽孢桿菌DSM 5483的枯草桿菌蛋白酶的編號，在位置3具有蘇氨酸，在位置4上有異亮氨酸，在位置199上有異亮氨酸和在位置211上有甘氨酸。
特別是其可通過合適的枯草桿菌蛋白酶型的鹼性蛋白酶來解決，其特徵在於，所述鹼性蛋白酶天然產生於芽孢桿菌或來源於這樣的枯草桿菌蛋白酶，特別是來自於遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶。
很特殊的是，其可由天然產生於遲緩芽孢桿菌DSM 5483的鹼性蛋白酶或來源於這樣的鹼性蛋白酶來解決，以及其中特別是按照SEQID NO.4中所示的胺基酸序列遲緩芽孢桿菌鹼性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G。
遲緩芽孢桿菌鹼性蛋白酶變體M131具有特徵替換S3T/V4I/A188P/V193M/V199I，應看作為WO 92/21760的變體，其與本發明的變體遲緩芽孢桿菌鹼性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G具有最高度的同源性，其在3個位置上與按照本發明的變體相對應。兩個替換A188P和V193M有差異，在該位置上本發明的變體與野生型相同。如自公布WO95/30011所看到的，得自於遲緩芽孢桿菌-枯草桿菌蛋白酶的胺基酸193處於第6環的起始處，而胺基酸188不在任何環中，而是處於其間該蛋白質的緊密範圍內。就這點而言，兩個突變處於結構上不同的分子範圍中。按照本發明驚奇地發現，對野生型胺基酸而言該兩個位置188和193的回覆和另一在位置211的突變，也就是說在第6環的後區域，導致一酶在洗滌和清洗性能方面優於至今已知的酶，特別是先前已知的遲緩芽孢桿菌鹼性蛋白酶。
本發明特別優選的酶與公布WO95/23221和WO98/30669的變體不同在於，多個位置被回復了，也就是說又與野生型相同，以及在於未空間節省的和無電荷的胺基酸甘氨酸處於位置211以替代野生型的亮氨酸或所述變體的天冬氨酸。
從酶解的角度來看，令人驚奇的是改良洗滌以及清洗性能的效果通過在一胺基酸上的替換得以實現，其大概是參與了底物結合和/或反應的催化；也就是說用一縮短質子的甘氨酸側鏈替代空間節省的疏水的亮氨酸側鏈。同時相對與野生型，該第6環的第二個突變位置，即199，不由異亮氨酸回復為野生型的纈氨酸。與公布WO95/23221或WO98/30669相比，點突變產生一酸性基團，即L211D或L211E將比其他突變位置上的野生型序列的回覆更明顯。開始引用的不同枯草桿菌蛋白酶活性環變異的文獻，特別是WO95/30011，與位置211的變異一起已提示在另一活性環中可發生其他的變化，或在同樣環內部發生強烈的變化，例如V199S/L211D，P204E/L211G或G196S/L211G，為抵償在催化方面的變化，決不保留V199I的替換。
從工業應用的角度來看，特別是在洗滌劑和清洗劑中，令人驚奇地這導致功效的改善，特別是導致增強這種酶對不同汙物的洗滌和清洗功效的作用。本發明枯草桿菌蛋白酶在相應的洗滌劑和/或清洗劑配方(對比實施例2至5)中的成功應用可以推測相關的變體也具有高的穩定性，以使該酶足夠長時間地保持活性，並因此有助於改善性能。
本發明的主題是枯草桿菌蛋白酶型的鹼性蛋白酶，其特徵在於，根據來自遲緩芽胞桿菌DSM 5483的枯草桿菌蛋白酶的編號具有在位置199的異亮胺基酸和在位置211的甘氨酸以及至少一個穩定作用胺基酸。優選該穩定作用胺基酸是位置3的胺基酸蘇氨酸或位置4的異亮氨酸中的一個。
本發明主題的另一實施方案是枯草桿菌蛋白酶類的鹼性蛋白酶，其特徵在於，根據來自遲緩芽胞桿菌DSM 5483的枯草桿菌蛋白酶的編號具有在位置3的蘇氨酸、在位置4的異亮氨酸、在位置199的異亮氨酸和在位置211的甘氨酸；其自然由枯草桿菌屬，特別是遲緩枯草桿菌形成，或者是由這樣的枯草桿菌屬衍生的枯草桿菌蛋白酶；其是由遲緩枯草桿菌DSM 5483天然形成的或者由它們衍生的枯草桿菌蛋白酶，根據在SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列特別是遲緩枯草桿菌-鹼性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G。
本發明主題的另一實施方案是由相應的枯草桿菌蛋白酶型的鹼性蛋白酶衍生的蛋白質，特別是通過片段化或缺失突變、通過插入突變、通過取代突變或者通過至少一部分與至少另一種蛋白質融合獲得的；這些蛋白質附加的特徵在於，它們可以額外地衍生化，它們具有蛋白酶解活性，優選具有與起始分子或非衍生的分子相比更高的蛋白酶解活性，更特別地具有改善的功效，和/或額外地加以穩定。
本發明的另一主題是用於編碼在本發明的主題中說明的蛋白質的核酸，特別是編碼枯草桿菌蛋白酶的核酸，其核苷酸序列與在SEQ IDNO.3中給出的核苷酸序列一致，特別在編碼位置199異亮氨酸和位置211甘氨酸的區域中，更特別在編碼位置3蘇氨酸、位置4異亮氨酸、位置199異亮氨酸和位置211甘氨酸的區域中。
本發明的又一主題是載體，其含有上述核酸區域，特別是含有編碼在本發明第一主題中描述的任何蛋白質或衍生物的的核酸區域。在優選的實施方案中，涉及克隆載體，其含有上述核酸區域，特別地含有編碼在本發明第一主題中描述的任何蛋白質或衍生物的核酸區域；或者涉及表達載體，其包含上述核酸區域和特別地包含編碼在本發明第一主題中描述的任何蛋白質或衍生物並使生物合成成為可能的核酸區域。
本發明的另一主題是細胞，其包含上述本發明主題的載體；其優選表達在本發明第一主題中描述的任何蛋白質或衍生物或者可以被誘導表達該蛋白質或衍生物，特別是在使用上述表達載體的情況下；優選其特徵在於，它們是細菌，特別是那些將形成的蛋白質分泌在周圍介質中的細菌；優選其特徵在於，它們是芽孢桿菌屬細菌，特別是遲緩芽胞桿菌、地衣形芽胞桿菌、解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)或嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)；或者其特徵在於，它們是真核細胞，特別是那些翻譯後修飾形成的蛋白質的真核細胞。
本發明的另一主題是在使用上述宿主細胞和/或在使用上述載體和/或在使用上述核酸下製備本發明第一主題的蛋白酶或衍生物的方法。
本發明的又一主題是一種組合物，其特徵在於，其包含本發明第一主題的蛋白酶，特別是洗滌劑或清洗劑，特別優選是每克組合物包含2μg至20mg量的蛋白酶；優選那些其特徵在於附加地包含另一種酶，特別是其他蛋白酶、澱粉酶、纖維素酶、半纖維素酶和/或脂肪酶。
本發明的另一主題是用於處理紡織原料或用於織物保養的組合物，其特徵在於，其僅或除其它活性成分外包含本發明第一主題的蛋白酶，特別是用於具有天然成分的纖維或紡織品，更特別是用於那些含羊毛或絲的纖維或紡織品。
本發明的另一主題是機械清洗紡織品或硬表面的方法，其特徵在於，在所述方法的至少一個步驟中使本發明第一主題的蛋白酶活化，優選每次使用量是40μg至4g，特別優選是400μg至400mg。
本發明進一步涉及用於處理紡織原料或用於織物保養的方法，其特徵在於，在所述方法的至少一個步驟中使本發明第一主題的蛋白酶活化，特別是用於含有天然成分的紡織原料或織物，尤其是含有羊毛或絲的那些紡織原料或織物。
本發明進一步涉及本發明第一主題的蛋白酶的應用，其用於清洗織物或硬質表面，優選每次用量為40μg至4g，特別優選400μg至400mg。
本發明的又一主題是本發明第一主題的蛋白酶的應用，其用於活化洗滌劑或清洗劑的成分或使其失活。
本發明的另一主題是本發明第一主題的蛋白酶的應用，其用於生物化學分析或用於合成低分子量的化合物或蛋白質。
本發明的另一主題是本發明第一主題的蛋白酶的應用，其用於製備、純化或合成天然物質或有價值的生物材料。
本發明的另一主題是本發明第一主題的蛋白酶的應用，其用於處理天然原料，特別是用於表面處理，更特別是在處理皮革的方法中應用。
本發明的另一主題是本發明第一主題的蛋白酶的應用，其用於獲得或處理紡織加工中的原料或者中間產品，特別是用於除去織物上的保護層。
本發明的另一主題是本發明第一主題的蛋白酶的應用，其用於處理紡織原料或用於織物保養，特別是用於處理羊毛或絲綢或含羊毛或絲綢的混紡織品。
本發明進一步涉及本發明第一主題的蛋白酶的應用，其用於處理照相膠片，特別是用於處理含明膠或類似的保護層。
本發明的另一主題是本發明第一主題的蛋白酶的應用，其用於製備食品或動物飼料。
本發明的另一主題是含有本發明第一主題的蛋白酶的化妝品或包含本發明第一主題的蛋白酶的化妝方法或本發明第一主題的蛋白酶用於化妝目的的應用，特別是在相應的方法或相應的組合物領域中。
根據本發明，蛋白質表示一種由天然胺基酸組成的聚合物，基本上由直鏈構成，並為了發揮其功能大多數呈現三維結構。表1中列出了19種蛋白質原(proteinogenen)的天然存在的L-胺基酸以及在本申請中採用的它們的縮寫即1個字母的和3個字母的代碼。
表1蛋白酶原的胺基酸
這些名稱代碼中的一種與數字組合表示在各自的位置上具有何種胺基酸殘基的特定蛋白質。所以例如S3表示在位置3(從相關蛋白質的N-末端開始)上的絲氨酸殘基。該位置上的點突變例如被胺基酸蘇氨酸代替根據該命名法可以縮寫為S3T。為了表示具有多個點突變的變體，相互之間的正斜線使這種替換分隔開。因此變體S3T/V4I的特徵在於，先前在所述變體位置3上存在的絲氨酸被蘇氨酸代替，而位置4上的纈氨酸被異亮氨酸代替。
本發明所示的位置，除非另有說明，是指相關蛋白質在每種情況下的成熟形式，即無信號肽(參見下文)。
在本發明的意義中，酶是指一種蛋白質，它起著某種生化功能。蛋白酶或者具有蛋白酶解功能的酶例如，通常理解為那些水解蛋白質的醯胺鍵(特別是那些位於蛋白質內部的鍵)的蛋白酶或酶，因此它們也被叫做內肽酶。枯草桿菌蛋白酶就是這樣的內肽酶，其天然由革蘭氏陽性菌形成的並且大多數是分泌型的，或者是由其例如通過分子生物方法從後者衍生的，並且經部分區域例如形成結構的或者攜帶官能團的區域與天然枯草桿菌蛋白酶成為同系物。其例如描述在R.Siezen的文章「Subtilases類枯草桿菌-蛋白酶」，《枯草桿菌酶》(「Subtilisinenzymes」)第75至95頁，由R.Bott和C.Betzel編輯，New York，1996。
很多蛋白質，作為所謂的蛋白前體(Praproteine)，與一個信號肽一起形成。在這種情況下，信號肽表示這種蛋白的N-末端，其功能通常是保證形成的蛋白質從生產細胞釋放到胞質或者周圍的介質中，和/或保證其正確的摺疊。然後信號肽在自然狀態下被一種信號肽酶從原始蛋白上切下來，從而使蛋白在沒有N末端胺基酸的情況下具有其真正的催化活性。根據WO91/02792中的附圖1，來自遲緩芽孢桿菌DSM5483枯草桿菌蛋白酶的蛋白質前體包含380個胺基酸，對此該成熟的蛋白質僅包含269個胺基酸；以該成熟蛋白質的第一個胺基酸開始編號，在這種情況下也可以從蛋白質前體的序列以序號112丙氨酸開始編號。根據SEQ ID NO.1和2，來自地衣芽孢桿菌ATCC 68614的枯草桿菌蛋白酶的信號肽具有111個胺基酸，並且成熟肽具有269個胺基酸。正如由SEQ ID NO.2得知，在不切分的情況下，完整蛋白質的長度為380個胺基酸。根據SEQ ID NO.3和4，這點同樣適合於特別優選的實施方案。
由於它們的酶活性，成熟的肽即合成後經處理的酶比起蛋白前體來說在工業應用上更受青睞。
前體蛋白(Pro-Proteine)就是沒有活性的蛋白前體。其具有信號序列的前體(Vorlaufer)被稱作前體蛋白的前體(Pra-Pro-Proteine)。
在本發明的意義中，核酸是那些天然由核苷酸組成並被稱作信息載體的分子，其用於編碼蛋白質或酶中的線性胺基酸序列。它們可能是單鏈的，也可能是互補於此單鏈的單鏈，或者是雙鏈。作為天然永久的信息載體，這些核酸DNA更適用於分子生物學工程。相比之下，為了在自然環境中例如在正在表達的細胞中實施本發明，形成RNA，從而對於本發明有很重要作用的RNA分子亦代表本發明的實施方案。
同樣在本發明的意義中，對應於蛋白質的核酸信息單元被稱作基因。在DNA中，所有三個可能讀碼框中的兩條互補鏈都必須考慮到。此外，需要注意的是，不同的密碼三聯體可能編碼同一種胺基酸，因此，某種特定胺基酸序列可以從許多不同的並且也許僅有非常低同一性的核苷酸序列(遺傳密碼子的簡併性)得到。除此以外，不同的生物在應用密碼子上也存在差異。由於這些原因，不管是胺基酸序列還是核苷酸序列都必須列入保護範圍，並且公開的核苷酸序列在每種情況下應只被看作編碼某胺基酸序列的舉例。
在目前常用方法的幫助下，如化學合成或者聚合酶鏈式反應(PCR)，結合分子生物學和/或蛋白質化學的標準方法，專業技術人員已經能夠根據已知DNA和/或胺基酸序列生產完整的基因。對此理想的出發點是由保藏的和/或商業上可獲得的微生物製備DNA。這種方法例如公開在「Lexikon der Biochemie」，Spektrum Akademischer Verlag，Berlin，1999，Vol.1，第267-271頁和Vol.2，第227-229頁上。
核苷酸序列的變化被稱為突變，其可以通過本身已知的分子生物學方法得到。根據變化的類型，突變分為例如缺失突變、插入突變、替代突變，或者不同的基因抑或基因的不同部分被相互融合在一起(「改組」的突變)；這些就是基因突變。與此相關的生物就稱為突變體。從這些突變核酸中得到的蛋白被稱為變體。例如，缺失突變、插入突變、替代突變或者融合導致了基因的缺失突變、插入突變、替代突變或融合，以及在蛋白質水平上，導致對應的缺失變體、插入變體或者替代變體或者融合蛋白。
在本發明的意義中，載體被認為是由核酸組成的元件，這些核酸包括一個目的基因作為特徵核酸區。它們能夠在物種或細胞系中經若干代或細胞分裂作為穩定的遺傳元件建立起來，所述遺傳元件能夠獨立於基因組的其他部分複製。載體是特殊的質粒，即環形的遺傳元件，尤其是它們被用於細菌的時候。在基因工程中，用於儲存進而進行所謂的基因操作(即所謂的克隆載體)的載體與在宿主細胞中生成目的基因即促進特定蛋白表達的載體是有區別的。這些載體都被認為是表達載體。
通過同源化，也就是說與已知酶比較(例如通過比對進行)，由胺基酸或核苷酸序列得出所涉及酶的酶活性成為可能。酶活性能夠被那些不參與實際反應的其他蛋白區域定性或者定量的修飾。這例如涉及酶穩定性、活性、反應條件或底物特異性。
因此，術語蛋白酶被理解為除催化活性中心的少量胺基酸殘基的功能外的所有功能，這些功能是通過整個其餘蛋白質或其餘蛋白質的一部分或大部分對真正的催化活性區域的影響而產生的。在本發明的意義中，這些修飾的功能或部分活性，只要它們有助於蛋白酶解反應，單獨也被認為是蛋白酶解活性。輔助功能或者部分活性包括，例如底物的結合、中間產物或者終產物的結合、激活或抑制或介導對水解活性的控制效果。因此這例如也涉及遠離活性中心的結構單元的形成。對於本發明的蛋白質來說，第二個前提條件當然是通過真正的活性殘基本身的化學行為或者附加地通過修飾部分的作用獲得肽鍵的水解。此外同樣可以通過例如本發明蛋白質的一個或多個部分定性或定量地修飾其它蛋白酶的活性。其它因素的影響也被認為是蛋白酶解活性。活性蛋白酶同樣也是那些其活性在給定的時間例如通過抑制劑而封閉的酶。它們主要適於進行相應的蛋白酶解反應是至關重要的。
片段是指那些比天然蛋白質或那些對應於完全翻譯的基因更短並且例如也可通過合成得到的任何蛋白或者肽。在胺基酸序列的基礎上，它們能被設計成特異的完整蛋白。例如它們可以具有相同的結構，或可發揮蛋白水解活性或者部分活性，例如底物的絡合。片段及初始蛋白的缺失變體基本上是一樣的。然而，片段是相對較小的，缺失變體只是缺失小區域因此僅缺乏個別的部分功能。
在本發明的意義中，嵌合或者雜交蛋白是由那些來自相同或不同生物的不同多肽鏈天然產生的元件組成的蛋白。這個過程也就是改組或融合突變。融合的目的是例如，在融合部分本發明的蛋白的幫助下生成或者修飾某種酶的功能。因此在本發明的意義中，這樣的嵌合蛋白是否由單個的多肽鏈或者多個承擔不同功能的亞基組成是不重要的。為了實現最後提及的這種方案，有可能例如可以翻譯後或者在純化步驟之後馬上通過有針對性的蛋白酶切割將單個的嵌合多肽鏈拆成多個多肽鏈。
通過插入突變得到的蛋白被稱為是變體，這種變體能夠通過本身已知的方法把核酸或蛋白片段插入到起始序列中而得到。因為它們基本是一致的，它們能被置於一個嵌合蛋白中，在這些嵌合蛋白中，區別僅在於蛋白的不變部分與整個蛋白的大小比例不同。在插入突變蛋白中，外源蛋白的比例低於嵌合蛋白。
倒置突變，即部分序列的倒置，被看作一種缺失和插入的特殊形式。同樣適用於分子不同部分的重組，這與原始的胺基酸序列相異。這也可以被看作是一種缺失變體，作為原始蛋白的插入變體或者改組變體。
在本發明的意義中，衍生物是指其純的胺基酸鏈已經化學修飾的蛋白。這種衍生化作用可通過宿主生物以生物方法結合蛋白合成進行。分子生物學的方法可以用於此目的。這些衍生物也可以化學方法來實施，例如根據發明將胺基酸的側鏈化學轉化或者通過共價結合將另一個化合物結合到蛋白上。該化合物可以是如通過雙官能化合物與根據本發明所述的蛋白結合的另一蛋白。當結合的底物是抑制劑時，這種修飾例如可以影響底物的特異性或者與該底物的結合強度，或者導致酶活性的暫時性凍結。例如對於存放的時間也是這樣的。衍生化作用也被認為包括對大分子載體地共價結合。
在本發明的意義中，所有的酶、蛋白、片段及衍生物被集體的冠以蛋白的上位概念，除非它們需要清晰的指稱。
酶的功效在各種情形下被認為是在所屬技術領域裡的效能。這是基於實際的酶解活性，但是也依賴於其他與這個過程相關的因素。這些因素包括穩定性、底物結合、與攜底物的物質相互作用或與其他成分相互作用，尤其是協同作用。
在本發明的意義中，洗滌劑的洗滌或潔淨功效是指所涉及的洗滌劑對汙染的物品例如織物或者具有硬表面的物體所發揮的效果。評價這種洗滌劑中的單個組分例如單個酶對整個洗滌劑的洗滌和潔淨功效的作用。畢竟由一種酶的酶解性能不能不加考慮地推斷出其它酶對洗滌劑的洗滌功效的作用。這裡在除去汙物時，其它的因素例如穩定性、底物結合、洗滌物與洗滌劑的其它成分的結合和相互作用，尤其是協同作用也起重要作用。
依據1977年4月28日布達佩斯條約微生物保藏的國際認可，下面與公布WO91/02792的微生物於1989年8月10日保藏在不倫瑞克(Braunschweig)的德意志微生物保藏中心(the Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)遲緩芽孢桿菌DSM5483。其在這裡的保藏號是DSM 5483(PA5-A0155，菌株2-1)。與這種生物材料的特點相關的重要數據，列於WO91/02792的表1中(第5至7頁)。由該生物獲得的與本申請特別相關的鹼性蛋白酶的DNA和胺基酸序列分別由SEQ ID NO106和SEQ ID NO52獲知。
根據來源於遲緩芽胞桿菌DSM 5483的枯草桿菌蛋白酶的編號(WO92/21760)，該成熟蛋白質的位置3、4、199和211對本發明是特別重要的。根據表2，這些位置與最重要的枯草桿菌蛋白酶的位置是同源的；該同源性也轉錄到所有其它的枯草桿菌蛋白酶上。所以，例如在R.Bott和C.Betzel編輯的「Subtilases類枯草桿菌-蛋白酶」第75至95頁的R.Siezen的文章《枯草桿菌酶》(「Subtilisin enzymes」)(NewYork，1996)中描述了20個以上相關枯草桿菌蛋白酶與枯草桿菌蛋白酶BPN』的已知序列的比對。
表24個對本發明特別重要的位置的同源性
本發明的遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶-變體的胺基酸序列與這些重要的開始描述的枯草桿菌蛋白酶即枯草桿菌蛋白酶309(Savinase)、枯草桿菌蛋白酶PB92、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg和枯草桿菌蛋白酶BPN』的比對同樣列於本申請的附圖1中。
基於各種已知的枯草桿菌蛋白酶之間高度的結構同源性和其發揮的水解內源性醯胺鍵的相同反應機理可以預料到，上述點突變在每種情況下在相關分子的前後顯示出可比的作用。特別地根據本申請的教導可以預料到，在現有技術中已經鑑於其在洗滌劑和清洗劑中的應用而被研製的枯草桿菌蛋白酶是通過採用這種點突變來進一步改善其對洗滌和/或清洗功效的作用。
特別地，在同源位置上採用胺基酸異亮氨酸199和甘氨酸211有助於提高現有技術已知酶對洗滌劑和/或清洗劑中的洗滌和/或清洗功效的作用。然而，根據對來源於遲緩芽胞桿菌的鹼性蛋白酶的經驗，相關分子的至少一個附加的穩定作用胺基酸有益於替換。
具有胺基酸位置199I和211G的本發明蛋白酶的穩定性例如可以通過連接在聚合物上來提高。這樣的一種方法例如描述在US 5230891中。其要求該蛋白質在相應的組合物中使用之前，經化學鍵合步驟結合在這種聚合物上。
優選的穩定作用本身是通過分子的點突變進行的。因為這樣在獲得蛋白質之後就無需其它的加工步驟。對此適合的幾種點突變是現有技術本身已知的。所以，可以根據US 6087315和US 6110884這樣來穩定該蛋白酶，即將一定的酪氨酸殘基與其它殘基交換。本發明的由遲緩芽胞桿菌衍生的蛋白質上的應用將意味著SEQ ID NO.2的位置89、161、165、208和257中的酪氨酸殘基的交換；在遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶的其它兩個這裡描述的位置反正已經被酪氨酸佔據。
其它的可能性例如是—根據EP 583339一定的胺基酸殘基與脯氨酸交換；這對於由遲緩芽胞桿菌衍生的酶來說，意味著替換S55P、A96P、A166P、A188P和/或S253P；—根據EP 995801在分子表面上引入極性的或帶電荷的基團；—例如根據公布WO88/08028和WO88/08033的教導，改變金屬離子的結合，特別是鈣的結合位置。根據這些申請的第一個，一個或多個參與鈣結合的胺基酸殘基被帶負電荷的胺基酸替換。根據這些申請的第二個，同時在這兩個殘基精氨酸/甘氨酸的序列的至少一個序列中進行點突變；例如在來源於遲緩芽胞桿菌的枯草桿菌蛋白酶中，這涉及在位置60/61、115/116和212/213中的NG序列。
—根據US 5453372，可以通過在表面上的一定突變來保護蛋白質免受變性劑例如表面活性劑的影響。在遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶中位置134、155、158、164、188和/或189對應於這裡描述的位置。另一可比的可能性描述在專利US 5340735、US 5500364、US 5985639和US 6136553中。
在優選的實施方案中，胺基酸殘基的穩定作用是按照來源於遲緩芽胞桿菌DSM 5483的枯草桿菌蛋白酶的編號通過在位置3上的蘇氨酸和/或在位置4上的異亮氨酸來進行的。
在本發明的實施例中研究的變體可以推測出，為了在與胺基酸199I和211G的相互配合中賦予它們改善的洗滌功效，其提高的穩定性是決定性的因素，與這種理論無關，所有的其特徵在於根據來源於遲緩芽胞桿菌DSM 5483的編號其在位置199上具有異亮氨酸和在位置211上具有甘氨酸和附加地具有在位置3上的蘇氨酸和在位置4的異亮氨酸這兩個胺基酸中的一個的枯草桿菌蛋白酶類的蛋白酶是解決本發明目的的手段。
此外，優選這種變體，其除具有位置199異亮氨酸和位置211甘氨酸外，不但具有在位置3上的蘇氨酸還具有在位置4上的異亮氨酸。
優選這樣的鹼性蛋白酶(由芽胞桿菌天然形成或者由其衍生)的相應變體。因為芽胞桿菌-蛋白酶一開始對各種不同的工業應用來說就具有有利的性能。對此包括一定的耐溫度、抗氧化或變性劑的穩定性。此外，人們在微生物蛋白酶上獲得許多有關它們的生物技術製備方法方面的經驗，這些技術例如涉及合適克隆載體的構建、宿主細胞和發酵條件的選擇或風險例如變應原活性(Allergenizitat)的評估。
特別地，現有技術中已經確立了來源於遲緩芽胞桿菌的枯草桿菌蛋白酶或者由遲緩芽胞桿菌天然形成的蛋白酶衍生的枯草桿菌蛋白酶例如用於洗滌劑和清洗劑中。對此包括上面提及的蛋白酶枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶309和遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶。根據本發明，人們獲得的製備和使用這些酶的豐富經驗有利於這些酶的進一步開發。對此例如包括其與其它化合物例如洗滌劑或清洗劑的成分的配伍性。
特別優選的實施方案涉及本發明的蛋白酶，其是從由遲緩芽胞桿菌DSM 5483形成的蛋白酶衍生的。其中例如包括那些在公布WO92/21760或95/23221或WO98/30669中描述的。本發明特別優選的實施方案是具有本發明的在第199、211、3和/或位置4中的取代的酶的進一步開發。
在本申請中研究的遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G是來源於遲緩芽胞桿菌DSM 5483的枯草桿菌蛋白酶的進一步開發，其在公布WO92/21760的序列表中以SEQ IDNO52公開了胺基酸序列和以SEQ ID NO106公開了核苷酸序列。
對於這種新的變體來說，可以確定其對洗滌劑或清洗劑的洗滌和清洗功效的作用大於可比的並在現有技術中也用於該目的的遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶F49和Savinase(實施例2至5)。在序列表中，這種變體的胺基酸序列在編號SEQ ID NO.2下給出。在序列表中編碼胺基酸-序列的基因在編號SEQ ID NO.1下給出。此外，由於遺傳密碼的簡併性，可以設想到許多其它的同樣編碼所述變體的核酸，並且它們也是本發明主題中的一種優選的替代實施方式。
形成在序列表中給出的DNA序列和胺基酸序列的遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶變體S3T/V4I/V199I/L211G的細菌，特別是芽胞桿菌菌株，例如是根據本申請的實施例1中描述的方法製備的。
通過現有技術中已知的分子生物方法可以由迄今為止已知的鹼性蛋白酶獲得其它的蛋白質。這些方法例如詳細描述在Fritsch，Sambrook和Maniatis編的「分子克隆實驗室手冊(Molecular cloninga laboratorymanual)」，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York，1989中。
對此例如包括經取代誘變或經其它點突變被賦予其在特殊應用中的附加的性能的變體，例如同WO00/36069中所公開的，由於改變表面電荷，或者同WO99/27082中所公開的，由於改變參與催化或底物結合的環。同樣也可以使該變體的較大的部分區域經歷誘變。所以例如片段形成或缺失誘變的目的是選擇蛋白酶的特定的部分功能或者相反將部分功能排除在外，例如底物結合或經分子的某些區域產生的與其它化合物的相互作用。
通過插入、取代或融合可以使本發明的蛋白酶具有附加的功能。其中例如可以設想到在某些結構域上的連接，例如同公布WO99/57154至WO99/57159中描述的在纖維素-結合-結構域的結合。其中描述的胺基酸接頭可以通過由蛋白酶、接頭-區域和結合結構域形成同一的融合蛋白而實現。這樣的結合結構域也可以由同樣的或其它的蛋白酶產生，以便增強本發明的蛋白酶在蛋白酶底物上的結合。這可以提高局部蛋白酶濃度，而該濃度的提高在單一的應用中是有利的，例如在處理原材料時。
提及的蛋白酶可以進一步被衍生化，特別地以便使其對於各自的應用目的來說最佳化。其中涉及例如描述在申請DE 40 13 142中的化學修飾。其例如可以通過連接低或高分子量的化合物來改性，例如可以通過不同的有機體與蛋白質生物合成相結合自然地進行，如在合成時通過真核宿主細胞在N-末端附近連接脂肪酸自由基或者糖基化作用。因此本發明的實施方案還是被進一步衍生化的蛋白酶或片段。
與本發明的蛋白質在洗滌劑或清洗劑中的應用相關，例如與其它具有洗滌活性的物質或酶的連接是特別有意義的。可比的連接-附著物(Ansatze)例如描述在專利公布WO00/18865和WO00/57155中的纖維素-結合結構域。與此類似，也可以連接在大分子化合物上，例如一些聚乙二醇，以修飾該分子的其它性能例如穩定性或皮膚相容性。這樣的修飾例如描述在專利US 5230891中，以便使所述的蛋白酶更適合於在化妝品中使用。
本發明蛋白質的衍生化在最廣義上是這些酶的製備。根據蛋白質的獲得、加工或製備可以使其中的一種蛋白質與其它不同物質結合，例如來自可生產的微生物的培養物。因為可生產蛋白酶的微生物的培養上清液已經具有蛋白酶解活性，這表明粗的提取物已經具有相應的用途，例如用於使其它蛋白原失去活性。
例如為了增加蛋白質的存儲穩定性，可以將某些其他物質有針對性地加入到其中，因此本發明特有的蛋白質的所有製品也包括在本發明範圍內。這也與蛋白質在某一製品中實際上是否發揮酶活性無關。因為有可能需要蛋白質在儲藏階段沒有或具有很少活性，而僅僅在使用時發揮其蛋白酶解功能。這取決於，例如，蛋白質的摺疊狀態，或可能產生於源自製品中的一種或多種伴隨物質與本發明蛋白質的可逆結合。特別地，蛋白酶與蛋白酶抑制劑的結合製品是現有技術中已知的(WO00/01826)。其中也涉及抑制劑經接頭，特別是胺基酸接頭連接在各自蛋白酶上的融合蛋白質(WO00/01831)。
當本發明的蛋白質進一步產生蛋白酶解活性時，上述本發明蛋白質的進一步開發、衍生化和製備是特別希望的，因為這是其在本發明中應用的前提條件。優選通過所有類型的突變和/或衍生化獲得的蛋白酶與起始分子或未衍生化的分子相比具有提高的蛋白酶解活性，並且特別地在其各自預期的工業應用領域具有改善的功效。對此特別地包括在洗滌劑或清洗劑中應用時其洗滌和/或清洗功效的改善。
這點例如通過本發明的點突變與其它涉及催化反應(例如在活性中心)點突變的組合是可能的。所以例如根據公布WO95/30011的教導，本發明的蛋白酶(其是由遲緩芽胞桿菌-枯草蛋白酶衍生的)在環-區域突變或者導入其他胺基酸是可能的。這種研究例如描述在以下列公開的申請中WO00/37599、WO00/37621至WO00/37627和WO00/71683至WO00/71691中。
在反應介質中與其它活性化合物相互作用並因此例如通過摺疊作用影響整個反應的酶區域的缺失是一種所需的進一步開發。類似地，可以設想與其它活性酶例如與其它蛋白酶的融合來提高水解速率。
例如，在儲存期間，通過抑制劑的結合，蛋白酶解活性的可逆阻斷可以終止自動蛋白酶解，並因此在反應介質中稀釋時產生高的蛋白酶解率。例如在純化過程中，與特定的結合結構域的連接可以相對於在洗液中的蛋白酶濃度來說提高底物附近的蛋白酶濃度，並因此提高蛋白酶對該洗滌劑功效的作用。
由現有技術已知，有許多提高酶，特別是在洗滌劑和清洗劑中使用的酶的穩定性的可能性(參見上文)。其中出於實用性的理由，基於點突變的方法特別是本發明相關的。所有上面已經描述的可能性可以相互組合用於本發明的變體。因為根據WO89/09819可以假設多個起穩定作用的突變具有疊加效果。所以本發明的變體已經通過兩個胺基酸3T或4I中的一個或兩個穩定，可以通過連接在聚合物上進一步來穩定。但是其也可以在該分子的其它位置具有起穩定作用的突變，例如通過一個或多個上述酪氨酸殘基的取代引入特定的脯氨酸殘基，改變表面電荷或者改變鈣的結合部位。
核酸形成了蛋白質以及其生產的幾乎所有常見分子生物學研究和發展的起點。對此特別地包括基因的序列測定和對應胺基酸序列的衍生、誘變的每種方式和蛋白質的表達。例如在Fritsch，Sambrook和Maniatis編的「分子克隆實驗室手冊」，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，New York，1989中描述了這樣的方法。因此用於編碼本發明第一主題的蛋白質或其衍生物的核酸構成本發明的第二主題。
在DNA水平上，本發明的蛋白質通過所有通常概括為術語「蛋白質工程」的方法進一步被優化用作各種用途。特別有可能在蛋白質的水平上獲得下列性能改善衍生蛋白質的抗氧化性、對變性劑或蛋白酶、高溫、酸或強鹼條件的穩定性、對鈣或其它輔因子的敏感性的改變、免疫原性或變應原作用的降低。
本發明突變的基因包括例如那些對個別的有針對性的鹼基替換或隨機點突變、個別鹼基或部分序列缺失，同其他基因或基因片段融合或者倒置負責的基因。這些突變或者修飾可以使由相關的核酸衍生的酶更適合特定的應用。這樣的誘變能夠有目的地進行，或者通過隨機方法，例如利用隨後以活性為目標的對克隆基因識別和/或篩選和選擇方法來進行。
特別地在用於編碼蛋白質片段的核酸的情況下，不但在有義而且在反義定向中考慮所有的三個讀碼框。因為這些寡核苷酸可以通過聚合酶-鏈式反應(PCR)作為出發點來合成相關的核酸。這樣的寡核苷酸，特別地在它們覆蓋對應於四個胺基酸位置3、4、199和/或211的任何區域時，明顯屬於本發明的保護範圍。這同樣適用於那些恰好在這些位置具有可變序列的那些寡核苷酸。所以在許多引物的群體內部同樣存在至少一個用來編碼對這些位置來說相應於SEQ ID NO.3的部分序列的寡核苷酸。這同樣適用於反義寡核苷酸，例如用於調節表達的反義寡核苷酸。
本發明蛋白酶的進一步研究方向特別地可以在公開出版物P.N.Bryan《蛋白質工程》(「Protein engineering」)(2000)，Biochim.Biophys.Acta，第1543卷，第203至222頁中介紹的觀點中獲得。
優選用於編碼枯草桿菌蛋白酶-蛋白酶的核酸，其核苷酸序列與在SEQ ID NO.3中給出的核苷酸序列相符。這特別地適用於編碼位置199異亮氨酸和位置211甘氨酸的區域，更特別地適用於編碼位置3蘇氨酸、位置4異亮氨酸、位置199異亮氨酸和位置211甘氨酸的區域。
這優選適用於那些由遲緩芽胞桿菌-蛋白酶的序列導出的寡核苷酸，並且特別在其是由遲緩芽胞桿菌DSM 5483-蛋白酶的序列衍生的寡核苷酸時。在特別優選的情況下，該核酸編碼本發明的變體遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G和/或與在SEQ ID NO.3中給出的核苷酸序列相符。
用於編碼蛋白酶解活性的插入或融合突變體也屬於本發明的保護範圍。所以對這些活性負責的區域例如可以與纖維素結合的結構域融合或者在催化的非活性區域中具有點突變，以便將產生的蛋白質連接在聚合物上或者以便降低其變應原活性。
為了使用本發明相關的核酸，以適合的方式將它們連接在載體中。這些載體包括例如來自細菌質粒、來自病毒或細菌噬菌體的那些載體或者主要是合成的載體。它們成為有關基因、其表達或者所屬蛋白質的分子生物學和生化研究的起點。因此本發明的主題是包含上述核酸分子特別是那些用於編碼上述蛋白酶的核酸分子的載體。
本發明主題優選的實施方案是克隆載體。除了儲藏、生物擴增和篩選目的基因以外，克隆載體適於特定基因的分子生物學特徵。同時它們是要求保護的核酸的可轉運和可儲存形式，並且它們也是分子生物技術優選的起點，這些分子生物技術不局限於細胞，例如PCR或體外誘變方法。優選的克隆載體含有用於編碼上述蛋白酶的核酸區域。
本發明的表達載體是在生物生產體系中實施本發明第二主題的核酸並因此製備本發明主題的蛋白質的基礎。本發明主題的優選實施方案是表達載體，它們自己攜帶對表達必須的基因元件，例如原先位於基因上遊的天然啟動子或來自其它生物體的啟動子。這些元件例如能以所謂表達盒的形式安裝。優選這些表達載體包含用於編碼上述蛋白酶的核酸區域。
本發明的另一個實施方案是細胞，其包含本發明第三主題的載體。該細胞例如使相應基因的擴增以及突變或者轉錄和翻譯和最後的生物技術的生產成為可能，因此形成了本發明的微生物學範圍。
本發明主題的實施方案是宿主細胞，其表達本發明的任何蛋白質或者能夠被誘導來表達該蛋白質，因此它們使其的生物技術製備成為可能。對此它們必須包含以適合的方式經載體獲得相關的基因，也就是說它們被轉化為相關的基因。這種載體可以在宿主細胞中染色體外作為單獨的遺傳因子存在或者被整合在染色體中，其中優選上述任一種表達載體。
原則上，合適的宿主細胞包括所有生物，即原核生物、真核細胞或藍藻。優選的宿主細胞是那些容易進行遺傳操作的細胞，例如就其表達載體轉化及其穩定建立而言，如單細胞的真菌或者細菌。此外，優選的宿主細胞的特徵在於容易進行微生物和生物技術操作。這包括例如易培養、高生長率、對發酵培養基的要求很低、產量高以及對外源蛋白質的分泌速率。特定個例的最佳表達系統往往需要從現有技術所提供的大量不同的系統中通過試驗確定。通過這種方法，本發明的每個蛋白質可以從大量宿主生物中得到。
優先的實施方案是宿主細胞，它們的活性可以通過基因調節元件進行調節，例如通過受控添加化學物質，通過改變培養條件或者根據細胞密度。這種可控的表達使特別經濟地生產目的蛋白質成為可能。
在本發明的優選實施方案中，宿主細胞是細菌，特別是那些將所形成的蛋白質分泌到周圍介質中的細菌，這是由於細菌的特點在於具有更短的換代時間和對培養條件的要求低。因此可以獲得一種低成本的方法。在革蘭氏陰性細菌例如大腸桿菌(E.coli)的情況下，大量的蛋白質被分泌到周質體空間中。這對於特定的應用是有利的。與此相反，革蘭氏陽性細菌例如芽孢桿菌將分泌的蛋白質立即保存在該細胞周圍的營養介質中，按照本發明的另一實施方案直接從中純化出表達的本發明的蛋白質。在公布WO01/81597中也公開了一種方法，按照該方法可以使革蘭氏陰性細菌分泌出表達的蛋白質。
本發明的一個實施方案使用遲緩芽孢桿菌DSM 5483本身，以同源性表達本發明的蛋白質。然而，與此相反優選異源表達。對於異源表達，優選的細菌包括芽孢桿菌屬，特別是地衣芽孢桿菌、液化芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或者其它的種或者嗜鹼芽孢桿菌菌株。因為這些菌本身形成可比的枯草桿菌蛋白酶，所以通過該方法可以獲得本發明的蛋白質與由宿主菌株內源形成的枯草桿菌蛋白酶的混合物。這樣的一種遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶在地衣芽胞桿菌ATCC 53926中的共表達例如描述在公布WO91/02792(EP 493398 B1)中；這裡存在許多可能的表達載體。可以預料到，在這種載體的幫助下和/或在這種宿主體系中可以製備本發明的新發現的變體，特別是由遲緩芽胞桿菌那些變體，更特別是由遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G。
本發明主題另一優選的實施方案是真核宿主細胞，特別是那些翻譯後修飾形成蛋白質的細胞。適合的真核細胞的實例是真菌例如放線菌(Actinomyceten)或者酶母如糖酵母(Saccharomyces)或克魯伯氏酵母(Kluyveromyces)。這種體系特別地與蛋白質合成一起進行的這種修飾包括例如低分子量化合物的結合，例如膜錨分子或寡糖。這種寡糖修飾例如對於所製備的蛋白質的變應原活性(Allergenizitaet)的降低來說是希望的。
本發明獨特的主題是製備本發明的蛋白酶或衍生物的方法。所以例如藉助於上述DNA和胺基酸序列(它們可以由序列表獲得)按照本身已知的分子生物方法有可能合成相應的寡肽和寡核苷酸直至完整的基因和蛋白質。從已知的生產枯草桿菌蛋白酶的微生物出發可以進一步分離出其它的天然產物，以測定其枯草桿菌蛋白酶序列，以及根據本文所述的指南進一步照它們加以開發。對於相應的製備方法可以培養這種細菌並加以利用。類似地，按照例如在公布WO91/02792中公開的載體的模式，可以開發出一種新的表達載體。本發明的實施方案在所附的核酸序列的基礎上是無細胞的表達體系，其中蛋白質生物合成在體外實施。所有上面已經描述的元件同樣也組合成新的方法，以便製備本發明的蛋白質。因此對於本發明的每個蛋白質來說可以想像出許多可能的方法步驟的組合，所以應該根據經驗確定每個具體個案的最佳的方法。
本發明的獨特的主題是組合物，其特徵在於含有本發明的蛋白酶。
本發明酶的幾乎所有可能的工業應用均取決於在相應介質中使用功能性的酶。所以例如微生物可能的應用渴望一種組合物，其中該酶通常以預先製備的高純度形式與所需的反應組分或助劑結合在一起。用於處理原材料或用於化妝品製品的組合物同樣是以其特殊配方為特徵的。根據本發明，所有的這些配方均應該是具有本發明酶的組合物。
本發明主題的優選實施方案是洗滌劑或清洗劑。因為，如在本發明的實施例中所說明的一樣，令人驚奇地發現，從遲緩芽胞桿菌DSM5483獲得的枯草桿菌蛋白酶-變體199I/211G(根據遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶的編號)和具有替換S3T/V4I/V199I/L211G的遲緩芽胞桿菌-變體對各種汙漬提供了明顯提高的功效(對比實施例2和3)。這在使用相同活性下超過確定的洗滌劑-蛋白酶的水平。這同樣有利於相應的洗碗機用組合物(對比實施例4和5)。這種效果不但在不同的溫度下而且在不同的濃度下均是可再現的。
所有可能類型的洗滌劑，既包括濃縮物也包括不用稀釋加以使用的組合物均屬於本發明的主題；商業規模的使用，用於洗衣機或用於手洗。對此包括例如用於織物、地毯或天然纖維的洗滌劑，按照本發明對此使用術語洗滌劑。它們也包括例如用於洗碗機或手工洗碗的洗滌劑或用於硬表面，例如金屬、玻璃器皿、瓷器、陶器、瓦片、寶石、塗漆面、塑料、木製品或皮革的清洗劑。對於這些來說，根據本發明使用術語清洗劑。任何類型的清洗劑都是本發明的實施方案，只要其中加入本發明的蛋白質。
本發明的實施方案包含所有按照現有技術中確定的和/或所有適當的本發明組合物的提供形式。這些包括例如固體、粉末、液體、膠狀或膏狀組合物，如果需要由若干相組成，擠壓式或非擠壓式。此外提供形式還包括包裝在大容器內和一份中的壓出膠、顆粒、片劑及小袋。
本發明的組合物包含本發明的酶，每克組合物中其用量是2μg至20mg，並且越來越優選的是5μg至17.5mg，20μg至15mg，50μg至10mg，100μg至7.5mg，200μg至5mg，以及500μg至1mg。因此可以推出每次應用的用量是40μg至4g，更優選是50μg至3g，100μg至2g，200μg至1g，以及特別優選是400μg至400mg。
這種組合物的蛋白酶活性可以按照在《表面活性劑》(Tenside)第7卷(1970)第125至132頁中描述的方法測定。與此相應，該蛋白酶單位是以PE(蛋白酶-單元)給出的。該組合物的蛋白酶活性總計達每克組合物1,500,000蛋白酶單位。
除了對本發明必需的酶之外，本發明的洗滌劑任選包含其他成分，例如表面活性劑，如非離子、陰離子和/或兩性表面活性劑和/或漂白劑和/或助洗劑以及任選其他常規成分。
優選的非離子表面活性劑為烷氧基化的，有利的是乙氧基化的，特別優選含有8-18個碳原子以及平均每mol醇1-12mol環氧乙烷(EO)的伯醇，其中醇殘基可以是直鏈的，或優選在位置2上被甲基支化的，優選以混合形式含有直鏈和甲基支鏈的殘基，所以其通常以羰基合成醇殘基存在。然而，尤其優選的是包含具有12-18碳原子、天然來源的醇的直鏈殘基以及平均每mol醇2-8 EO的脂肪醇乙氧基化物，例如椰子油醇、棕櫚油醇、牛油醇或油醇。優選的乙氧基化醇包括，例如含有3或4 EO的C12-14醇、含有7EO的C9-11醇、含有3EO、5EO、7 EO或8EO的C13-15醇、含有3EO、5EO或7 EO的C12-18醇及其混合物，例如含有3 EO的C12-14醇和含有5 EO的C12-18醇的混合物。上述乙氧化的程度是統計平均值，對於特殊產品來說，這個平均值可能是整數或分數。優選的醇乙氧基化物具有窄的同系物分布(窄範圍乙氧基化物，NRE)。除了這些非離子表面活性劑之外，也可以使用高於12EO的脂肪醇。這類脂肪醇的例子是包含14 EO、25 EO、30 EO或40 EO的牛油醇。
另一類或作為非離子表面活性劑單用或與其他非離子表面活性劑合用的優選非離子表面活性劑是烷氧基化的、優選乙氧基化的、或乙氧基化和丙氧基化的優選包含1-4個碳原子的烷基鏈的脂肪酸烷酯，特別是脂肪酸甲酯。
另一類優選使用的非離子表面活性劑是烷基多葡糖苷(APG)。合適的烷基多葡糖苷對應於通式RO(G)z，其中R是直鏈或支鏈的，特別是2-甲基支鏈的、飽和或不飽和的、含有8-22個以及優選12-18個碳原子的脂族基，G是含有5或6個碳原子的糖單元，優選是葡萄糖。糖苷化的程度z介於1.0-4.0之間，優選在1.0-2.0之間，以及更優選在1.1-1.4之間。優選使用直鏈烷基多葡糖苷，即烷基多葡糖苷，其中多糖基部分是葡萄糖單元以及烷基部分是正-烷基基團。
氧化胺類的非離子表面活性劑，例如N-椰油烷基-N，N-二甲胺氧化物以及N-牛油烷基-N，N-二羥乙胺氧化物，和脂肪酸鏈烷醇醯胺類也適用。這些非離子表面活性劑的所用量優選不多於乙氧基脂肪醇量，尤其不多於其量的一半。
其它合適的表面活性劑為多羥基脂肪酸醯胺，對應於通式(II) 其中RCO是包含6-22個碳原子的脂族醯基，R1是氫、含有1-4個碳原子的烷基或羥烷基基團，以及[Z]是直鏈或支鏈的、包含3-10個碳原子和3-10個羥基的多羥烷基。多羥基脂肪酸醯胺為已知物質，其通常可通過將還原糖用氨、烷基胺或鏈烷醇胺加以還原性胺化，繼而用脂肪酸、脂肪酸烷酯或脂肪酸氯加以醯化而獲得。
這組多羥基脂肪酸醯胺還包括對應於式(III)的化合物 其中R是含有7-12個碳原子的直鏈或支鏈烷基或者鏈烯基，R1是含有2-8個碳原子的直鏈、支鏈或環化的烷基基團或者芳香基團，以及R2是含有1-8個碳原子的直鏈、支鏈或環化的烷基基團或芳香基團或者是烷氧基基團，但優選C1-4的烷基或者苯基基團，以及[Z]是直鏈的多羥基烷基基團，其烷基鏈至少被2個羥基取代，或者該基團的烷氧基化，優選乙氧基化或丙氧基化的衍生物。優選由還原糖例如葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、甘露糖或木糖的還原性胺化而獲得。然後通過例如以醇鹽作為催化劑與脂肪酸甲酯反應，可將N-烷氧基或N-芳氧基取代的化合物轉化成所需的多羥基脂肪酸醯胺。
合適的陰離子表面活性劑是例如那些磺酸酯和硫酸酯類。合適的磺酸酯類表面活性劑優選是C9-13的烷基苯磺酸酯、烯烴磺酸酯，即烯烴和羥烷基磺酸酯的混合物，以及例如通過氣態三氧化硫的磺酸化接著鹼化或酸化磺酸化產物而從帶有中間或末端雙鍵的C12-18單烯烴中獲得的二磺酸酯。其它合適的磺酸酯類表面活性劑是例如通過氯磺化作用或磺化氧化作用接著水解或中和而從C12-18烷烴中獲得的鏈烷磺酸酯。α-磺基脂肪酸的酯(磺酸酯)，例如氫化椰子油、棕櫚核油或牛油脂肪酸的α-磺酸化甲酯也適用。
其它合適的陰離子表面活性劑有磺基化脂肪酸甘油酯。本發明上下文中的脂肪酸甘油酯指單酯、二酯和三酯及其混合物，其由單甘油與1-3mol的脂肪酸的酯化作用或者在甘油三酯和0.3-2mol的甘油發生酯交換反應進行生產而得來的。優選的磺基化脂肪酸甘油酯是含6-22個碳原子的飽和脂肪酸的磺化產物，例如己酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸或山萮酸。
優選的烷(鏈烯)基硫酸鹽是鹼金屬鹽，以及具體是C12-18的脂肪醇的硫酸半酯的鈉鹽，例如椰油脂肪醇、牛油脂肪醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鯨蠟醇或硬脂醇或C10-20的羰基合成醇以及具有同樣鏈長仲醇的對應的半酯。其它優選的烷(鏈烯)基硫酸鹽是那些具有上述鏈長、含有基於石化產品的合成的、直鏈烷基鏈，並且它們的降解行為類似於基於油化品原料的對應的化合物。C12-16烷基硫酸酯、C12-15烷基硫酸酯以及C14-15烷基硫酸酯從洗滌技術的觀點出發而優選。其它合適的陰離子表面活性劑是2，3-烷基硫酸酯。
用1-6mol的環氧乙烷乙氧基化的直鏈或者支鏈C7-21醇例如含有平均3.5mol環氧乙烷(EO)的2-甲基支鏈的C9-11醇或者是含有1-4 EO的C12-18脂肪醇的硫酸單酯也同樣適用。鑑於他們高的發泡能力，他們僅以相對小的量使用，例如按重量計在清洗劑中的量為1％-5％。
其它合適的陰離子表面活性劑是烷磺基琥珀酸的鹽，其也已知是磺基琥珀酸鹽或磺基琥珀酸酯，以及表示磺基琥珀酸與醇，優選脂肪醇，以及特別是乙氧基化的脂肪醇而形成的單酯或/或二酯。優選的磺基琥珀酸酯含有C8-18脂肪醇殘基或其混合物。特別優選的磺基琥珀酸酯含有衍生自乙氧基化的脂肪醇的脂肪醇部分，其在分離中考慮時，代表非離子的表面活性劑(描述參見上文)。在這些磺基琥珀酸鹽中，那些衍生自窄範圍乙氧基化的脂肪醇的脂肪醇部分尤其優選。在烷(鏈烯)基鏈中優選含有8-18個碳原子的烷(鏈烯)基琥珀酸或其鹽也同樣適用。
其它合適的陰離子表面活性劑尤其是肥皂。合適的肥皂是飽和脂肪酸肥皂，如月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、氫化芥子酸和山萮酸的鹽，以及尤其衍生自天然脂肪酸如椰油、棕櫚核油或牛油脂肪酸的肥皂混合物。
陰離子表面活性劑包括肥皂可以鈉、鉀或銨鹽及作為有機鹼如單-、二-或三乙醇胺的可溶性鹽的形式存在。陰離子表面活性劑優選以鈉或鉀鹽的形式存在，更優選的是鈉鹽形式。
表面活性劑在本發明的洗滌劑中存在的總量優選5-50重量％，特別是8-30重量％，以最終組合物計。
本發明的組合物可包含漂白劑。在那些能在水中產生H2O2而充當漂白劑的化合物中，過碳酸鈉，過硼酸鈉鹽四水合物和過硼酸鈉一水合物是特別的重要。其它有用的漂白劑有例如過氧焦磷酸鹽、檸檬酸的過水合物和產生H2O2的過酸鹽或過酸，如過硫酸鹽或過硫酸。也可使用脲過氧水合物過尿素，其化學式為H2N-CO-NH2·H2O2。如果需要，組合物中也可含有有機類的漂白劑，特別是用於清洗硬表面，例如在洗碗機中，雖然原則上有機漂白劑也可用於洗衣劑。典型的有機漂白劑是二醯基過氧化物，例如二苯甲醯基過氧化物。其它典型的有機漂白劑是過氧酸，其中烷基過氧酸和芳基過氧酸作為例子特別提及。優選的代表是過氧苯甲酸及其環取代的衍生物，例如烷基過氧苯甲酸，還有過氧-α-萘甲酸和單過鄰苯二甲酸鎂鹽，脂族或取代的脂族過氧酸，例如過氧月桂酸、過氧硬脂酸、ε-苯二(甲)醯亞氨基過氧己酸(PAP)、o-羧基苯甲醯氨基過氧己酸、正壬烯氨基過酸性脂肪酸和正壬烯氨基過琥珀酸鹽，以及脂族和芳脂族的過氧二羧酸，例如1，12-二過氧羧酸、1，9-二過氧壬二酸、二過氧癸二酸、二過氧巴西基酸、二過氧苯二甲酸、2-癸基二過氧丁烷-1，4-二酸、N，N-對苯二甲醯-二(6-氨基過氧己酸)。
漂白劑的含量是1-40重量％，特別是10至20重量％，其中有利地使用過硼酸鹽一水合物或者過碳酸鹽如果洗滌溫度等於或者低於60℃，以及特別是對衣物進行預處理，為了提高漂白效果，組合物中可含有漂白活化劑。合適的漂白活化劑是形成脂族過氧羧酸的化合物，所述脂族過氧羧酸優選含有1-10個碳原子，以及更優選含有2-4個碳原子和/或在過水解條件下任選取代的過苯甲酸。攜帶具有上述碳原子數的O-和/或N-醯基和/或任選取代的苯甲醯基的物質是適用的。優選的漂白活化劑是聚醯化的烷撐二胺，特別是四乙醯基乙烯二胺(TAED)、醯化的三嗪衍生物，特別是1，5-二乙醯基-2，4-二氧代六氫-1，3，5-三嗪(DADHT)、醯化的甘脲，特別是1，3，4，6-四乙醯基甘脲(TAGU)、N-醯基亞胺，特別是正壬醯基琥珀醯亞胺(NOSI)、醯化的苯酚磺酸鹽，特別是正壬醯基或者是異壬醯基羥苯磺酸鹽(正-或異-NOBS)、醯化羥羧酸，例如三乙基-O-乙醯基檸檬酸鹽(TEOC)、羧酸酐，特別是鄰苯二甲酸酐、靛紅酸酐和/或琥珀酸酐、羧酸醯胺，例如N-甲基二乙醯胺、乙交酯、醯化多元醇，特別是三醋精、乙二醇二乙酸酯、異丙烯基乙酸酯、2，5-雙乙酸基-2，5-二氫呋喃和烯醇酯，它們從德國專利申請DE 196 16 693和DE 196 16 767中得知，乙醯化的山梨醇和甘露醇及其混合物(SORMAN)，它們在歐洲專利申請EP 0 525 239中描述，醯化糖衍生物，特別是五乙醯基葡萄糖(PAG)、五乙醯基果糖、四乙醯基木糖和八乙醯基乳糖，以及乙醯化的任選N-烷基化葡糖胺和葡糖酸內酯、三唑和三唑衍生物和/或粒狀的己內醯胺和/或己內醯胺衍生物，優選的是N-乙醯化內醯胺，例如N-苯甲醯己內醯胺和N-乙醯己內醯胺，這些是從國際專利公布WO-A-94/27970、WO-A-94/28102、WO-A-94/28103、WO-A-95/00626、WO-A-95/14759和WO-A-95/17498中得來。從德國專利申請DE-A-19616 769中得知的取代的親水性醯基乙縮醛和在德國專利申請DE-A-19616 770以及國際專利公布WO-A-95/14075中描述的醯基內醯胺也優選採用。與從德國專利申請DE-A-44 43 177中得知的常規漂白活化劑組合也可採用。腈衍生物，例如氰基吡啶、四腈(Nitrilquats)，例如N-烷基銨乙腈，和/或氨腈衍生物也可使用。優選的漂白活化劑為4-(辛醯氧基)-苯磺酸鈉、正壬醯或異壬醯氧基苯磺酸酯(正或異-NOBS)、十一醯氧基苯磺酸酯(UDOBS)、十二醯氧基苯磺酸鈉(DOBS)、十一醯氧基苯甲酸(DOBA，OBC 10)和/或十二醯氧基苯磺酸酯(OBS 12)以及N-甲基嗎啉鎓乙腈(MMA)。這類漂白活化劑常用量以整個組合物計為0.01-20重量％，優選0.1-15重量％，以及更優選1-10重量％。
除了或代替上述的常規漂白活化劑，所謂的漂白催化劑也可摻入。漂白催化劑是促進漂白的過渡金屬鹽或者是過渡金屬配合物如錳、鐵、鈷、釕或者鉬-Salen配合物或者羰基配合物。具有含氮的三角配體的錳、鐵、鈷、釕、鉬、鈦、釩和銅的配合物，以及鈷、鐵、銅、釕-氨合物的複合物體也可以用做漂白催化劑，優選使用在DE 19709 284 A1中描述的化合物。依照WO99/63038，乙腈的衍生物以及依照WO99/63041，漂白活化的過渡金屬配合物與澱粉酶組合後也能發生漂白活化的效果。
本發明的組合物通常含有一種或多種助洗劑(Builder)，特別是沸石、矽酸鹽、碳酸鹽、有機共助洗劑以及磷酸鹽，假使根據生態環境對使用這些磷酸鹽沒有反對意見的話。磷在洗碗機洗滌劑中是尤其優選的主要材料。
合適的晶體層狀矽酸鈉對應於通式NaMSixO2x+1·yH2O，其中M是鈉或者氫，x是1.6-4，優選1.9至4.0之間的數，以及y是0-20之間的數，x值優選為2、3或4。這樣的晶體層狀矽酸鹽記載在如歐洲專利申請EP-A-0 164 514中。對應於上述通式的優選的晶體層矽酸鹽是其中M為鈉、x為2或3的那些。β-和δ-二矽酸鈉Na2Si2O5·yH2O均特別優選。這些化合物可從市場上購得，如SKS(Clariant)。因此SKS-6主要是δ-二矽酸鈉，其化學式為Na2Si2O5·yH2O，而SKS-7主要是β-二矽酸鈉。通過與酸(例如檸檬酸或碳酸)反應，δ-二矽酸鈉生成kanemite NaHSi2O5·H2O，其以SKS-9和SKS-10(Clariant)在市場上銷售。對這些層狀矽酸鹽進行化學修飾也有優勢。例如，層狀矽酸鹽的鹼度可受到適度的影響。與δ-二矽酸鈉相比，摻雜磷酸或者碳酸的層狀矽酸鹽已經修飾了晶體形態，他們溶解更快而且顯示出與δ-二矽酸鈉相關的鈣結合能力增加。層狀矽酸鹽具有一般的經驗式xNa2O·y H2O·zP2O5，其中x與y的比例對應於0.35-0.6，x和z的比例對應於1.75-1200，以及y和z的比例對應於4-2,800，它們在專利申請DE 19601063中有記載。層狀矽酸鹽的溶解度還可通過利用特別精細顆粒的層狀矽酸鹽來提高。晶體層狀矽酸鹽和其他成分的化合物也可採用。尤其引人關注的是與纖維素衍生物組成的化合物，其在崩解效果上具有優勢，並尤其用於洗滌劑片劑中，以及與聚羧酸如檸檬酸或聚合的聚羧酸組成的化合物，例如丙烯酸的共聚物。
其他有用的助洗劑是無定形矽酸鈉鹽，其模量(Na2O∶SiO2比率)為1∶2-1∶3.3，優選為1∶2-1∶2.8，以及更優選是1∶2-1∶2.6，其可以延遲崩解並表現多重洗滌循環特性。與常規的無定形矽酸鈉相關的溶解推遲可由多種方法獲得，例如表面處理、混合/壓實或通過過乾燥法。在本發明的上下文中，術語「無定形」同樣可理解為包括「X-射線無定形」。換一種說法，矽酸鹽並不產生任何強烈的X-射線反射，這在X-射線衍射實驗中是晶體物質的特徵，但最多有一個或多個具有幾度衍射角寬的散射X-輻射的最大值。然而，在電子衍射實驗中，當矽酸鹽粒子產生彎曲或者甚至尖銳的衍射最大值時，甚至可獲得特別好助洗劑特性。這個可解釋表示這些產品具有微晶區域，大小介於10至數百nm，優選上限為50nm以及更優選上限達20nm。尤其優選壓實的無定型矽酸鹽、混合的無定型矽酸鹽以及乾燥的X-射線-無定形矽酸鹽。
根據本發明所用的精細晶體、含有結合水的合成沸石優選是沸石A和/或沸石P。沸石MAP(Crosfield公司的銷售產品)是尤其優選的P-型沸石。然而，沸石X和A、X和/或P的混合物也可適用。依照本發明，優選的是使用例如，商業上可得到的沸石X和沸石A的共晶體化物(約80重量％的沸石X)，其由CONDEA Augusta S.p.A.公司以VEGOBOND AX商品名銷售，並可由下式描述nNa2O·(1-n)K2O·Al2O3·(2-2.5)SiO2·(3.5-5.5)H2O。
適合的沸石的平均粒子尺寸小於10μm(體積分布，測量方法Coulter Counter)，並優選含有18-22重量％，以及更優選的20-22重量％的結合水。
眾所周知的磷酸鹽當然也可用作助洗劑，倘若它們的應用對處於生態環境的理由不應避免。在大量市場上可得到的磷酸鹽中，鹼金屬磷酸鹽在洗滌劑工業中最為重要，三磷酸五鈉和三磷酸五鉀(鈉和鉀的三磷酸鹽)尤其優選。
「鹼金屬磷酸鹽」是各種磷酸的鹼金屬(特別是鈉和鉀)鹽的集合術語，包括偏磷酸(HPO3)n和正磷酸(H3PO4)以及更高分子量的代表。磷酸鹽兼有各種優點他們充當鹼性載體，阻止石灰沉積在機器零件上以及在織物上石灰結殼，此外，有助於清潔效果。
磷酸二氫鈉(NaH2PO4)以二水化合物(密度1.91gcm-3，熔點60°)和一水化合物(密度2.04gcm-3)存在。這兩種鹽都是白色非常易溶於水的粉末，加熱後失去結晶水，並在200℃下轉化為弱酸性的二磷酸鹽(二磷酸氫二鈉，Na2H2P2O7)，以及在更高溫度時轉化為三偏磷酸鈉(Na3P3O9)和長鏈高分子量偏磷酸鈉(Maddrell鹽)(參見下文)。NaH2PO4顯示酸性反應。用氫氧化鈉調整磷酸到pH值4.5，然後噴霧乾燥所得「漿」就可形成NaH2PO4。磷酸二氫鉀(原或者一元磷酸鉀、磷酸氫鉀、KDP)KH2PO4是白色鹽，其密度為2.33gcm-3，熔點253°(分解形成多磷酸鉀(KPO3)x)，並且易溶於水。
硫酸氫二鈉(次磷酸鈉)Na2HPO4是無色、易溶於水的晶體鹽。以無水、帶2mol水(密度2.066gcm-3，95℃時失水)、帶7mol水(密度1.68gcm-3，熔點48°時失去5水)以及12mol水(密度1.52gcm-3，熔點35°失去5水)的形式存在，在100°時變成無水，在急劇加熱下，就會轉變成二磷酸鹽Na4P2O7。以酚酞作指示劑，用蘇打水中和磷酸就能製備磷酸氫二鈉。磷酸氫二鉀(次級或者二元磷酸鉀)K2HPO4是無定型的白色鹽、易溶於水。
磷酸三鈉，叔磷酸鈉，Na3PO4，是無色晶體，作為十二水合物，其密度是1.62gcm-3，熔點是73-76℃(分解)，作為十水合物，其熔點為100℃(對應於19-20％ P2O5)，無水形式的密度為2.536gcm-3(對應於39-40％ P2O5)。通過鹼性反應磷酸三鈉易溶於水，其製備方法是通過蒸發濃縮恰好1mol磷酸二鈉和1mol氫氧化鈉的溶液。磷酸三鉀(三級或者三元磷酸鉀)K3PO4是白色易潮解的顆粒粉末，密度2.56gcm-3，熔點1340°，通過鹼性反應易溶於水。例如如果託馬斯(Thomas)礦渣與煤和硫酸鉀一起加熱，就形成磷酸三鉀。儘管價格更高，但由於它們更易溶，所以在洗滌劑工業中，高效磷酸鉀通常比相應的鈉化合物更受歡迎。
二磷酸四鈉(焦磷酸鈉)Na4P2O7以無水形式(密度2.534gcm-3，熔點988°，有時是880°)和十水合物的形式存在(密度1.815-1.836gcm-3，熔點94°時失水)。這兩個物質都是無色晶體，通過鹼性反應溶於水中。當磷酸氫二鈉加熱到200°以上，或通過磷酸與蘇打以化學計量比反應並噴霧乾燥該溶液就形成焦磷酸鈉。十水合物絡合重金屬鹽和硬鹽，由此減少了水的硬度。二磷酸鉀(焦磷酸鉀)K4P2O7以三水合物的形式存在，是一種無色吸溼性粉末，密度2.33gcm-3，溶於水，在25°時，1％溶液pH值為10.4。
相對高分子量的磷酸鈉和磷酸鉀是通過濃縮NaH2PO4或KH2PO4形成的。它們可劃分成環型，即鈉和鉀的偏磷酸鹽，以及鏈型，即鈉和鉀的多磷酸鹽。特別是鏈型有很多不同的名稱熔合或煅燒的磷酸鹽、格雷姆鹽(Graham鹽)、四聚偏磷酸鉀(Kurrol鹽)以及Maddrell鹽。所有更高的鈉和鉀的磷酸鹽都統稱為濃縮的磷酸鹽。
在工業上有重要用途的三磷酸五鈉Na5P3O10(三聚磷酸鈉)是非吸溼性白色水溶性鹽，其不帶水或帶6個水分子結晶，具有通式NaO-[P(O)(ONa)-O]n-Na，其中n＝3。在室溫條件下，大約17克無結晶水的鹽溶於100克的水中，在60°時是約20克，而在100°時大約是32克。將這種溶液加熱2小時到100°，大約8％的正磷酸鹽和15％的二磷酸通過水解形成。在製備三磷酸五鈉時，將磷酸與蘇打水溶液或者氫氧化鈉以化學計量比反應，並將溶液噴霧乾燥。同格雷姆鹽和磷酸氫鈉相似，三磷酸五鈉溶解許多不溶性的金屬化合物(包括石灰肥皂等)。市場上的三磷酸五鈉K5P3O10例如按重量計都是50％溶液(＞23％ P2O5，25％ K2O)的形式。多磷酸鉀廣泛應用於洗滌劑工業中。還存在三磷酸鉀鈉，根據本發明，也可使用。例如當三偏磷酸鈉用氫氧化鉀水解時形成三磷酸鉀鈉
(NaPO3)3+2KOHNa3K2P3O10+H2O根據本發明，它們可以完全相同的方式用作三聚磷酸鈉、三聚磷酸鉀或者它們的混合物。根據本發明，三聚磷酸鈉和三聚磷酸鈉鉀兩者的混合物或者三聚磷酸鉀和三聚磷酸鉀鈉兩者的混合物或者三聚磷酸鈉和三聚磷酸鉀和三聚磷酸鈉鉀三者的混合物也可使用。
本發明的洗滌劑/清洗劑中的有機共助洗劑尤其包括多羧酸鹽或多羧酸、聚體多羧酸鹽、多天冬氨酸、聚乙縮醛、任選氧化糊精、其他有機共助洗劑(參見下文)和膦酸酯。下面描述這些類物質。
有用的有機助洗劑例如為以其鈉鹽形式使用的多羧酸，其中多羧酸應理解為攜帶一個以上酸官能團的羧酸。只要對生態是安全的，這些羧酸包括例如檸檬酸、己二酸、丁二酸、戊二酸、蘋果酸、酒石酸、馬來酸、反丁烯二酸、糖酸、氨基羧酸、次氮基三乙酸(NTA)及其混合物。優選的鹽是多羧酸的鹽，如檸檬酸、己二酸、丁二酸、戊二酸、酒石酸、糖酸及其混合物。
這些酸本身就可使用。除了它們助洗效應以外，這些酸也通常具有使成分酸化的性質，因此在洗滌劑或清洗劑中用來建立相對較低和適中的pH值，除非pH值要求通過混合其他成分而得到。在這方面特別提及系統相容性和對環境安全的酸，如檸檬酸、乙酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙醇酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、葡萄酸以及它們的任意混合物。然而，無機酸尤其是硫酸，或鹼尤其是銨或鹼金屬的氫氧化物也可用作pH調節劑。這些調節劑存在於本發明的組合物中，其量優選不高於20重量％，以及特別為1.2-17重量％。
其他合適的助洗劑有聚合的多羧酸鹽，例如是聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸的鹼金屬鹽，例如那些相對分子量為500-700,000g/mol的。
本說明書中提及的聚合多羧酸鹽的分子量是各自酸形式的重均分子量Mw，其主要利用紫外檢測儀通過凝膠滲透色譜法(GPC)測定。測定根據聚丙烯酸的外標進行，所述外標依靠其與所研究聚合物的結構相似性而提供實際的分子量值。這些值完全不同於以聚苯乙烯磺酸為標準測定的分子量值。以聚苯乙烯磺酸為標準測定的分子量一般高於本說明書中提到的分子量。
尤其合適的聚合物是聚丙烯酸酯，其優選具有2,000-20,000g/mol的分子量。由於具有優良的溶解性，該組優選的代表是短鏈聚丙烯酸酯，其分子量為2,000-10,000g/mol，以及特別為3,000-5,000g/mol。
此外，合適的還有共聚合的聚羧酸酯，特別是丙烯酸與甲基丙烯酸的那些共聚合的聚羧酸酯，以及丙烯酸或甲基丙稀酸與馬來酸的那些共聚合的聚羧酸酯。證明含有50-90重量％丙烯酸以及50-10重量％馬來酸的丙烯酸/馬來酸共聚物尤其合適。以游離酸計，它們的相對分子量一般為2,000 to 70,000g/mol，優選在20,000-50,000g/mol，更優選在30,000-40,000g/mol。(共)聚合的聚羧酸酯可以粉末形式或者水溶液的形式利用。(共)聚合的聚羧酸酯在清洗劑中所佔的含量為0.5-20重量％，特別為1-10重量％。
為了改善水中的溶解度，這些聚合體也可包含烯丙基磺酸，如烯丙基羥苯磺酸以及甲代烯丙基磺酸作為單體。
特別優選的聚合物是由2種以上不同單體單元構成的可生物降解的聚合物，如那些含有丙烯酸和馬來酸以及乙烯醇或乙烯醇衍生物作為單體的，或者那些含有以丙烯酸和2-烷基烯丙基磺酸和糖衍生物作為單體的。
其他優選的共聚物是那些優選含有丙烯醛和丙烯酸/丙烯酸鹽或丙烯醛和乙烯基醋酸酯作為單體的共聚物。
其他優選的助洗劑是聚合的氨基二元羧酸、其鹽或其前體。聚天冬氨酸或者鹽及其衍生物是特別優選的。
其他合適的助洗劑是聚縮醛，它們可通過二醛與含有5-7個碳原子和至少3個羥基的多羥基羧酸反應得到。優選的聚縮醛可從二醛如乙二醛、戊二醛、對苯二醛及其混合物得到，以及從多羥基羧酸如葡糖酸和/或葡庚糖酸獲得。
其他合適的有機助洗劑是糊精，如碳水化合物的低聚物或聚合物，它們可由部分水解澱粉獲得。通過常規方法如酸或者酶催化的方法進行水解反應。水解產物優選平均分子量為400-500,000g/mol。優選具有右旋糖當量(DE)0.5-40，特別為2-30的多糖，其中與DE為100的右旋糖比較，該DE是衡量多糖的還原效果的常用尺度。DE為3-20的麥芽糊精和DE為20-37的幹葡萄糖糖漿以及具有相對高的分子量為2,000-30,000g/mol的所謂黃、白糊精都可採用。
這些糊精的氧化衍生物是它們與氧化劑的反應產物，所述氧化劑能將糖環的至少一個醇官能團氧化成羧酸官能團。本發明組合物中尤其優選的有機助洗劑是根據EP 472 042、WO97/25399和EP 755 944的氧化澱粉或其衍生物。
其他合適的共助洗劑是羥二琥珀酸鹽以及其他二琥珀酸的衍生物，優選二琥珀酸化乙二胺。乙二胺-N，N』-二琥珀酸鹽(EDDS)優選以鈉鹽或者鎂鹽形式使用。就此而論，丙三醇二琥珀酸酯和丙三醇三琥珀酸酯也是優選對象。在含沸石、碳酸鹽和/或含矽酸鹽的組合物中使用量為3-15重量％。
其它有用的有機助洗劑是例如乙醯化的羥基羧酸及其鹽，其可任選以內酯形式出現並含有至少4個碳原子、至少一個羥基和最多2個酸性基團。
具有共助洗劑特性的另一類物質是膦酸鹽。對此特別是羥基鏈烷和氨基鏈烷膦酸鹽。在羥基鏈烷膦酸鹽中，1-羥基乙烷-1，1-二膦酸鹽(HEDP)作為共助洗劑尤為重要。優選使用鈉鹽，其中二鈉鹽顯示中性反應，以及四鈉鹽顯示鹼性反應(pH9)。優選的氨基鏈烷膦酸鹽有乙二胺四亞甲基膦酸鹽(EDTMP)、二乙基三胺五亞甲基膦酸鹽(DTPMP)及其更高的同系物。優選使用中性反應的鈉鹽形式，如EDTMP的六鈉鹽或者DTPMP的七-和十鈉鹽。在膦酸鹽中，HEDP優選用作助洗劑。另外，氨基鏈烷膦酸鹽具有顯著的重金屬結合能力。因此，尤其如果洗滌劑裡亦含有漂白劑，有益的是可利用氨基鏈烷膦酸鹽，特別為DTPMP，或者上述膦酸鹽的混合物。
另外，任何能與鹼土金屬離子形成複合物的化合物都可用作共助洗劑。
本發明的洗滌劑中可任選包含其量高達90重量％的助洗劑。其含量優選高達75重量％。本發明的洗滌劑的助洗劑含量尤其為5-50重量％。在本發明的洗滌劑用於硬表面清潔，特別是用於餐具的機械洗滌時，助洗劑的含量尤其為5-88重量％，其中在這種洗滌劑中優選不含水不溶性的助洗劑。在一優選實施方案中，本發明的特別用於洗碗機的洗滌劑包含20-40重量％的水溶性有機助洗劑，特別是鹼金屬檸檬酸鹽，含有5-15重量％的鹼金屬碳酸鹽以及20-40重量％的鹼金屬二矽酸鹽。
在液體至凝膠形式的洗滌劑/清洗劑的組合物中可用的溶劑來源於例如一元醇或者多元醇、烷醇胺或乙二醇醚的基團，條件是在指定的濃度範圍內它們能與水混合。這些溶劑優選選自乙醇，正或異丙醇，丁醇，乙二醇甲醚，乙二醇乙醚，乙二醇丙醚，乙二醇一-正丁醚，二乙二醇甲醚，二乙二醇二乙醚，丙二醇甲基、乙基或丙基醚，二丙二醇單甲基或單乙基醚，二異丙二醇單甲基或單乙基醚，甲氧基、乙氧基或丁氧基三甘醇，1-丁氧基乙氧基-2-丙醇，3-甲基-3-甲氧基丁醇，丙二醇叔-丁醚以及這些溶劑的混合物。
在本發明的液體至凝膠形式的洗滌劑/清洗劑中，溶劑的含量為0.1-20重量％，優選低於15重量％，以及特別低於10重量％。
為了調節粘度，可向本發明組合物中加入一種或者多種增稠劑，例如增稠體系。這些高分子量物質也稱為膨脹劑通常吸收大量液體並且在此過程中膨脹，以便最終變成粘滯的純溶液或膠狀溶液。
合適的增稠劑是無機或者聚合的有機化合物。無機增稠劑包括例如聚矽酸、粘土礦物如蒙脫石、沸石、矽石和膨潤土。有機增稠劑來源於天然聚合物、改性的天然聚合物和完全合成的聚合物。天然存在的聚合物的例子有瓊脂、角叉菜、黃蓍膠、阿拉伯膠、藻酸鹽、果膠、聚糖、瓜耳膠、刺槐豆膠、澱粉、糊精、明膠以及乾酪素。可用作增稠劑的改性天然聚合體主要來源於改性澱粉和纖維素。這裡例如是羧甲基纖維素及其他纖維素醚、羥基乙基和羥基丙基纖維素以及樹膠醚。完全合成的增稠劑包括聚合物，如聚丙烯和聚甲基丙烯化合物、乙烯基聚合物、聚羧酸、聚醚、聚亞胺、聚醯胺和聚氨基甲酸酯。
以製成的組合物計，增稠劑的用量最高達5重量％，優選0.05-2重量％，以及特別在0.1-1.5重量％。
本發明的洗滌劑/清洗劑可任選含有螯合劑、電解液和其他助劑，如螢光增白劑、泛灰抑制劑、銀腐蝕抑制劑、染料轉移抑制劑、泡沫抑制劑、研磨劑、染料和/或香精，以及微生物活性成分和/或紫外吸收劑作為它的補充成分。
本發明的織物洗滌劑可包含二氨基1，2-二苯乙烯二磺酸的衍生物或其鹼金屬鹽作為螢光增白劑。合適的螢光增白劑有例如4，4』-雙-(2-苯胺基-4-嗎啉基-1，3，5-三嗪基-6-氨基)-1，2-二苯乙烯-2，2』-二磺酸的鹽或者相似組成的化合物，所述化合物的嗎啉基可被二乙醇氨基、甲氨基、苯胺基或者2-甲氧基乙氨基替代。也可使用取代的二苯基苯乙烯基型的增白劑，如4，4』-雙-(2-磺苯乙烯基)-二苯基、4，4』-雙-(4-氯-3-磺苯乙烯基)-二苯基或者4-(4-氯苯乙烯基)-4』-(2-磺苯乙烯基)-二苯基的鹼金屬鹽。上述螢光增白劑的混合物也可以使用。
泛灰抑制劑的作用是使從織物纖維上溶解出的汙物保持懸浮於洗滌液中。合適的泛灰抑制劑是大多數的天然有機物的水溶性膠體，如澱粉、動物膠、明膠、澱粉或纖維素的羧酸乙醚或者磺酸乙醚的鹽，也可以是纖維素或澱粉的酸性硫酸酯的鹽。包含酸性基團的水溶性聚醯胺也適用此目的。澱粉衍生物除了上面提及的以外，例如還有乙醛澱粉等也都可使用。纖維素乙醚如羧甲基纖維素(鈉鹽)、甲基纖維素、羥烷基纖維素以及混合醚，如甲基羥乙基纖維素、甲基羥丙基纖維素、甲基羧甲基纖維素及其混合物優選使用，例如以該洗滌劑計，其用量為0.1-5重量％。
為了保護銀器免遭腐蝕，可以在本發明的洗碗洗滌劑中使用銀腐蝕抑制劑。現有技術中，銀腐蝕抑制劑是已知的，並包括例如，苯並三唑、氯化鐵(III)以及硫酸鈷。例如，從歐洲專利EP 0 736 084 B1已知，特別適合與酶一起使用的銀腐蝕抑制劑有錳、鈦、鋯、鉿、釩、鈷或鈰鹽和/或絡合物，在這些絡合物中上述金屬元素以氧化數II、II、IV、V或VI的一種形式存在。這些化合物的例子有MnSO4、V2O5、V2O4、VO2、TiOSO4、K2TiF6、K2ZrF6、Co(NO3)2、Co(NO3)3及其混合物。
汙漬釋放劑或汙漬驅除劑通常是聚合物，當這些聚合物用於洗滌劑中時，它們就給洗滌的纖維提供汙漬排斥特性和/或支持洗滌劑的其他成分懸浮汙漬的能力。在這些聚合物用於硬表面的清洗劑中時，也能觀測到可比的效果。
特別有效並且長期以來已知的汙漬釋放劑是具有二羧酸、烷撐二醇以及聚亞烷基二醇單元的共聚酯。例子為聚對苯二甲酸乙二酯和聚乙二醇的共聚物或混合聚合物(DT 16 17 141或DT 22 00 911)。DE-OS2253063中提到酸性組合物，其中含有由二鹼性羧酸和亞烷基或環亞烷基聚乙二醇組成的共聚物。在DE-PS 28 57 292、DE-PS 33 24 258以及EP 0 253 567中描述了對苯二甲酸亞乙酯和聚環氧乙烷-對苯二甲酸酯的共聚物和它們在洗滌劑中的應用。歐洲專利EP 066 944涉及組合物，其含有由乙二醇、聚乙二醇、芳族二羧酸與磺化芳族二羧酸以一定摩爾比構成的共聚酯。歐洲專利EP 0 185 427描述了甲基-或乙基-末端的聚酯，其含有對苯二甲酸亞乙酯和/或亞丙酯單元和聚環氧乙烷-對苯二甲酸酯單元，以及描述了含有此種汙漬釋放聚合物的洗滌劑。歐洲專利EP 0 241 984涉及聚酯，這種聚酯除了含有氧乙烯基團和對苯二甲酸單元以外，還包含取代的亞乙基單元和甘油單元。歐洲專利EP 0 241 985公開了一種聚酯，其除了含有氧乙烯基團和對苯二甲酸以外，還含有1，2-亞丙基、1，2-亞丁基和/或3-甲氧基-1，2-亞丙基和甘油單元，並且其以C1-4烷基為末端。歐洲專利申請EP 0 272 033描述了包含聚對苯二甲酸亞丙酯和聚對苯二甲酸乙二醇酯單元的至少部分以C1-4烷基或醯基為末端的聚酯。歐洲專利EP 0 274 907描述了包含以磺乙基為末端的對苯二甲酸酯的汙漬釋放聚酯。根據歐洲專利申請EP 0357 280，包含對苯二甲酸、亞烷基二醇和聚-C2-4-乙二醇單元的汙漬釋放聚酯可通過不飽和端基的磺化來製備。國際專利公布WO95/32232涉及酸性芳族汙漬釋放聚酯。國際專利公布WO97/31085描述用於棉織物的未聚合的汙漬驅除劑，其含有若干官能團單元第一單元例如可能是陽離子的，能通過靜電相互作用吸附到棉表面，以及第二單元是疏水的，負責遺留在水/棉界面上的活性物質。
適用於本發明的織物洗滌劑中的染料轉移抑制劑尤其包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯咪唑、聚合的N-氧化物，如聚-(乙烯基吡啶-N-氧化物)和乙烯基吡咯烷酮與乙烯基咪唑的共聚物。
在機器清洗過程中使用時，將泡沫抑制劑加入到洗滌劑中會大有好處。合適的泡沫抑制劑例如是具有較高含量的C18-24脂肪酸的天然或合成來源的皂類。合適的非表面活性劑類的泡沫抑制劑是例如有機聚矽氧烷及其與微細的任選矽烷化的矽酸以及石臘、臘、微晶臘的混合物，以及它們與矽烷化的矽酸或者二-硬脂醯亞乙基二醯胺的混合物。不同泡沫抑制劑的混合物，如矽酮、石蠟和蠟的混合物也可以被有效的利用。泡沫抑制劑，特別是含矽氧烷-和/或含石蠟-的泡沫抑制劑優選固定到粒狀水溶性的或水分散的支持物上。尤其優選石蠟和二-硬脂醯亞乙基二醯胺的混合物。
另外，本發明的硬表面清洗劑可含有研磨劑組分，特別是選自石英粉、鋸末、塑料粉、白堊和玻璃微珠以及它們的混合物的。存在於本發明清洗劑中的研磨劑，其量優選不超過20重量％，特別為5-15重量％。
將染料和香精加入到本發明的洗滌劑/清洗劑中以改善產品的美學印象，並給消費者不僅提供所需要的洗滌和清潔功效而且還提供了視覺和感觀上「特別的和可辨認」的產品。合適的芳香油或香料包括個別的芳香化合物，如酯、醚、醛、酮、醇和烴類的合成產品。酯類的芳香化合物例如是乙酸苄酯、異丁酸苯氧基乙基酯、乙酸p-叔丁基環己酯、乙酸芳樟酯、乙酸二甲基苄基原酯、乙酸苯基乙酯、苯甲酸芳樟酯、甲酸苄基酯、氨基乙酸乙基甲基苯酯、丙酸烯丙基環己酯、丙酸甲基苯基原酯和水楊酸苄酯。醚包括例如苄基乙基醚；醛包括例如含有8-18個碳原子的直鏈鏈烷醛(Alkanale)、檸檬醛、香茅醛、香茅基含氧乙醛、仙客來醛、羥基香茅醛、鈴蘭醛和Bourgeonal；酮包括例如紫羅酮、α-異甲基紫羅酮以及甲基柏木酮；醇包括茴香腦、香茅醇、丁子香酚、香葉醇、沉香醇、苯乙基醇和松油醇；以及烴最主要包括萜烯，如薴烯和蒎烯。然而，優選使用各種香精的混合物一起產生誘人的香味。象這樣的芳香油也可包含天然香精混合物，這些混合物可得自植物源如松樹、柑橘屬植物、茉莉、綠葉刺蕊草、玫瑰或衣蘭衣蘭油。還可適用的有鼠尾草油、春黃菊油、丁香油、蜜蜂花油、薄荷油、肉桂葉油、酸橙花油、杜松子油、巖蘭油、乳香油、楓子香油和巖薔薇油，以及橙花油、苦橙油、桔皮油和檀香油。洗滌劑/清洗劑的染料含量通常低於0.01重量％，而香料卻可佔到整個組合物的2重量％。
香料可直接摻入到洗滌劑/清洗劑中，同樣有利地是將香味塗覆到載體上，所述載體能夠增強香氣在洗滌物上的附著力，並通過緩慢釋放香氣給處理過的織物特別提供持久的芳香。合適的載體物質例如是環糊精，其中環糊精/香料複合物還可附加地用其它助劑塗覆。另一優選的芳料載體是已描述過的沸石X，它也能夠代替表面活性劑或與表面活性劑混合吸收香氣。因此，含有所述沸石X的洗滌劑/清洗劑是優選的，其中所述香料至少部分吸收在沸石上。
專業人員毫無困難地選擇的優選的染料具有高的儲藏穩定性，不受組合物中的其他常規成分和受光的影響，並且對織物纖維不顯示顯著的直接染色性從而不給它們上色。
為了防治微生物，洗滌劑/清洗劑可以含有抗菌活性成分。依賴抗菌譜和作用機理，抗菌劑分為細菌抑制劑和殺菌劑、真菌抑制劑和殺真菌劑等。這些組的重要代表是例如苯扎氯胺、烷芳基磺酸鹽、滷代苯酚和苯酚醋酸汞化物。在本發明教導的範圍中，術語「抗微生物活性」和「抗微生物活性物質」具有本領域的常規意義，如K.H.Wallhuβer在「Praxis der Sterilisation，Desinfektion-KonservierungKeimidentifizierung-Betriebshygiene」(第5版，Stuttgart/New YorkThieme，1995)中所定義，其中所述的任何具有抗微生物活性的物質均可使用。合適的抗微生物活性成分優選選自醇、胺、醛、抗微生物的酸及其鹽、羧酸酯、醯胺、苯酚、苯酚衍生物、聯苯、聯苯基烷、尿素衍生物、氧和氮縮醛和縮甲醛、苄脒、異噻唑啉、鄰苯二甲醯亞胺衍生物、吡啶衍生物、抗微生物的表面活性化合物、胍、抗微生物的兩性化合物、喹啉、1，2-二溴代-2，4-二氰基丁烷、碘代-2-丙基丁基氨基甲酸酯、碘、碘遞體、過氧化合物、滷化合物以及上述的任意混合物。
因此抗微生物活性成分可選自乙醇、正丙醇、異丙醇、1，3-丁二醇、苯氧基乙醇、1，2-丙二醇、甘油、十一烯酸、苯甲酸、水楊酸、Dihydracetsaure、鄰-苯基酚、N-甲基嗎啉乙腈(MMA)、2-苄基-4-氯酚、2，2』-亞甲基-雙-(6-溴代-4-氯酚)、4，4』-二氯-2』-羥基聯苯乙醚(Dichlosan)、2，4，4』-三氯-2』-羥基二苯基醚(Trichlosan)、Chlorhexidin、N-(4-氯苯基)-N-3，4-二氯苯基)-脲、N，N′-(1，10-癸烷二基二-1-嘧啶基-4-亞基)-雙-(1-辛胺)-二氫氯化物、N，N′-雙-(4-氯苯基)-3，12-二亞氨基-2，4，11，13-四氮雜四癸烷二亞氨基醯胺、葡糖魚精蛋白、抗微生物的表面活性季化合物、胍包括二胍和聚胍，如1，6-雙-(2-乙基己基二胍基己烷)-二氫氯化物、1，6-雙-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-苯基-N1，N1-甲基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-鄰-氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-2，6-二氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-[N1N1′-β-(對-甲氧基苯基)-二胍基-N5，N5′]-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1N1′-α-甲基-β-苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-對-硝基苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、ωω-二-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-二-正丙基醚二氫氯化物、ωω′-二-(N1，N1′-對-氯苯基二胍基-N5，N5′)-二-正丙基醚四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-2，4-二氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-對-甲基苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-2，4，5-三氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、1，6-二-[N1，N1′-α-(對-氯苯基)-乙基二胍基-N5，N5′]-己烷二氫氯化物、ωω-二-(N1，N1′-對-氯苯基二胍基-N5，N5′)-間-二甲苯二氫氯化物、1，12-二-(N1，N1′-對-氯苯基二胍基-N5，N5′)-十二烷二氫氯化物、1，10-二-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-癸烷四氫氯化物、1，12-二-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-十二烷四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-鄰-氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-鄰-氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、乙烯-雙-(1-甲苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(對-甲苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(3，5-二甲基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(對-叔戊基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(壬基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(正丁基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(2，5-二乙氧基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(2，4-二甲基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(鄰-聯苯雙縮胍)、乙烯-雙-(混合-戊基萘基雙縮胍)、正丁基乙烯-雙-(苯基雙縮胍)、三亞甲基-雙-(鄰-甲苯基雙縮胍)、正丁基三亞甲基-雙-(苯基雙縮胍)以及相應的鹽，如醋酸鹽、葡糖酸鹽、氫氯化物、氫溴化物、檸檬酸鹽、亞硫酸氫鹽、氟化物、聚馬來酸鹽、正椰油烷基肌氨酸鹽、亞磷酸鹽、次亞磷酸鹽、過氟辛酸鹽、矽酸鹽、山梨酸鹽、水楊酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、亞氨基醋酸鹽、肉桂酸鹽、硫氰酸鹽、精氨酸鹽、苯四酸鹽、四羧基丁酸鹽、安息香酸鹽、戊二酸鹽、單氟磷酸鹽、過氟丙酸鹽和它們的混合物。滷化二甲苯和甲酚衍生物，如對-氯-間-甲酚或對-氯-間-二甲苯，並且植物起源的天然殺菌劑(如香料和香草)以及動物和微生物起源的天然抗菌劑也是合適的。優選的抗菌劑有抗菌性表面活性的四元化合物、植物起源和/或動物起源的天然抗菌劑，以及最優選的是至少一個植物起源的抗菌劑，其來自咖啡因、可可鹼和茶鹼以及香精油如丁子香酚、麝香草酚和香葉醇，和/或至少一個動物起源的抗菌劑，其來自酶如牛奶蛋白、溶菌酶以及乳過氧化物酶和/或至少一個抗菌性表面活性的四元化合物，其包含銨、鋶、鏻、碘鎓或砷鎓基、過氧化合物和氯化合物。微生物起源的物質即所謂的殺菌素也可以使用。
適合用作抗微生物活性成分的季銨化合物(QAC)具有通式(R1)(R2)(R3)(R4)N+X-，其中R1-R4可以相同或不同，並代表C1-22烷基、C7-28芳烷基或雜環基，其中兩個或在芳香化合物如吡啶的情況下甚至是三個基團與氮原子一起形成雜環基，如吡啶鎓或咪唑鎓化合物，以及X-代表滷離子、硫酸根離子、氫氧根離子或類似的陰離子。為了達到最佳抗微生物活性，這些取代基中至少一個優選具有8-18，更優選12-16個碳原子的鏈長。
QAC可以通過叔胺與烷基化試劑反應得到，所述烷基化試劑如氯代甲烷、苄基氯、硫酸二甲酯、十二烷基溴，以及環氧乙烷。帶有一個長烷基鏈和兩個甲基的叔胺的烷基化尤其簡單，同樣在氯代甲烷的幫助下在溫和條件下可以進行含兩個長鏈基團和一個甲基的叔胺的季銨化。含三個長烷基或者羥基取代的烷基的胺缺乏活性，並優選採用硫酸二甲酯來季銨化。
合適的QAC是例如苄烷銨氯化物(N-烷基-N，N-二甲基苄基氯化銨，CAS No.8001-54-5)、Benzalkon B(m，p-二氯苄基二甲基-C12-烷基氯化銨，CAS No.58390-78-6)、苯佐氯銨(苄基-十二基-雙-(2-羥乙基)-氯化銨)、十六烷三甲基溴化銨(N-十六烷基-N，N-三甲基溴化銨，CASNo.57-09-0)、苯索氯銨(N，N-二甲基-N-[2-[2-[對-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯氧基]-乙氧基]-乙基]-苄基氯化銨，CAS No.121-54-0)、二烷基二甲基氯化銨，如二-正癸基二甲基氯化銨(CAS No.7173-51-5-5)、二癸基二甲基溴化銨(CAS No.2390-68-3)、二辛基二甲基氯化銨、1-十六烷基氯化吡啶鎓(CAS No.123-03-5)和噻唑啉碘化物(CAS No.15764-48-1)以及它們的混合物。尤其優選的QAC是含有C8-18烷基的苄烷氯化銨，特別是C12-14-烷基-苄基-二甲基-氯化銨。
苯扎滷銨和/或取代的苯扎滷銨是商業上可獲得的，如來自Lonza的B arquat、來自Mason的Marquat、來自Witco/Sherex的Variquat以及來自Lonza的Hyamine和來自Lonza的Bardac。其他商業上可獲得的抗微生物活性成分有N-(3-氯烯丙基)-hexaminium氯化物，如來自Dow的Dowicide和Dowicil，苄索氯銨，如來自Rohm Haas的Hyamine1622，甲基苯索氯銨，如來自RohmHaas的Hyamine10X，十六烷基吡啶鎓氯化物，如來自Merrell Labs的氯化十六烷基吡啶。
該抗微生物活性成分的用量在0.0001-1重量％的範圍內，優選在0.001-0.8重量％的範圍內，更優選在0.005-0.3重量％的範圍內，以及最優選在0.01-0.2重量％的範圍內。
另外，該洗滌劑可任選含有紫外吸收劑，所述吸收劑可吸附到經處理的織物上，並增強纖維和/或其他組合物成分的光穩定性。紫外吸收劑是有機物質(濾光劑)，它們能吸收紫外線並以長波輻射如熱的形式釋放吸收的能量。
具有這些所需特性的化合物是例如通過無輻射鈍化而具有作用的化合物以及具有位置2和/或位置4取代基的二苯甲酮的衍生物。此外其他合適的紫外吸收劑是取代的苯並三唑、3-苯基-取代的丙烯酸鹽(位置2上任選用氰基取代的肉桂酸衍生物)、水楊酸鹽、有機Ni複合物和天然物質，如傘形酮和內生的尿刊酸。聯苯基以及主要是1，2-二苯乙烯衍生物具有特別的意義，例如在EP 0728749 A中所述的商業上以TinosorbFD和TinosorbFR ex Ciba可得到的。合適的UV-B吸收劑包括3-苯亞甲基樟腦或3-苯亞甲基降樟腦和它的衍生物，如在EP-B1 0693471中所述的3-(4-甲基苯亞甲基)-樟腦；4-氨基苯甲酸衍生物，優選4-(二甲基氨基)-苯甲酸-2-乙基己基酯、4-(二甲基氨基)-苯甲酸-2-辛基酯和4-(二甲基氨基)-苯甲酸戊基酯；肉桂酸的酯，優選4-甲氧基肉桂酸-2-乙基己基酯、4-甲氧基肉桂酸丙基酯、4-甲氧基肉桂酸異戊基酯、2-氰基-3，3-苯基肉桂酸-2-乙基己基酯(氰雙苯丙烯酸辛酯)；水楊酸的酯，優選水楊酸-2-乙基己基酯、水楊酸-4-異丙基苄基酯、水楊酸高薄荷基酯；二苯甲酮的衍生物，優選2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基-4′-甲基二苯甲酮、2，2′-二羥基-4-甲氧基二苯甲酮；亞苄基丙二酸的酯，優選4-甲氧基亞苄基丙二酸二-2-乙基己基酯；三嗪衍生物，如2，4，6-三苯胺-(對-羰基-2′-乙基-1′-己氧基)-1，3，5-三嗪和EP0818450 A1中所述的辛基三嗪酮或者二辛基丁氨基三嗪酮(UvasorbHEB)；丙烷-1，3-二酮如1-(4-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-丙烷-1，3-二酮；如EP 0694521 B1中所述的酮三環(5.2.1.0)癸烷衍生物。其他合適的UV-B吸收劑有2-苯基苯並咪唑-5-磺酸和鹼金屬、鹼土金屬、銨、烷基銨、烷醇銨及其葡糖銨鹽；二苯甲酮的磺酸衍生物，優選2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸及其鹽；3-苯亞甲基樟腦的磺酸衍生物，如4-(2-氧代-3-亞龍腦基甲基)-苯磺酸和2-甲基-5-(2-氧代-3-亞龍腦基)-磺酸及其鹽。
典型的UV-A過濾劑具體有苯甲醯甲烷的衍生物，如1-(4′-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-丙烷-1，3-二酮、4-叔丁基-4′-甲氧基聯苯甲醯甲烷(Parsol 1789)、1-苯基-3-(4′-異丙基苯基)-丙烷-1，3-二酮和DE19712033 A1(BASF)中所述的烯胺化合物。UV-A和UV-B過濾劑當然可以混合物的形式利用。除了上面提到的可溶性物質外，不溶的光封閉色素，也就是細分散的優選「毫微化的」金屬氧化物或鹽也可以用於這種目的。適合的金屬氧化物的例子具體有氧化鋅、二氧化鈦以及鐵、鋯、矽、鎂、鋁和鈰的氧化物以及它們的混合物。矽酸鹽(滑石)、硫酸鋇和硬脂酸鋅也可作為鹽使用。氧化物和鹽以色素的形式應用在護膚的乳劑和裝飾性化妝品上。顆粒直徑平均小於100nm，優選在5-50nm之間，以及更優選在15-30nm之間。它們一般為球形，儘管橢圓或其他非球形顆粒也能用。這些色素也可經表面處理，也就是說親水性的或疏水性的。典型的例子是包覆的二氧化鈦，如Titandioxid T805(Degussa)和EusolexT2000(Merck)。合適的疏水型包覆材料首要是矽氧烷，以及其中尤其是三烷氧基辛矽烷或者二甲矽油。微粉化的氧化鋅優選使用。其他合適的UV過濾劑可以在P.Finkel，SFW-Journal 122，第543頁(1996)的綜述中找到。
UV吸收劑的常用量在0.01-5重量％的範圍內，以及優選在0.03-1重量％的範圍內。
通常用於洗滌劑和清洗劑的成分還包括清潔和清洗活性的酶。同時，以除本發明蛋白質之外的其它酶為特徵的洗滌劑/清洗劑是本發明優選的實施方案。對此例如是其它的蛋白酶以及氧化還原酶、角質酶、酯酶和/或半纖維素酶，特別優選是脂肪酶、澱粉酶、纖維素酶和/或β-葡聚糖酶。
數十年來，將酶例如蛋白酶、澱粉酶、脂肪酶或纖維素酶作為洗滌劑和清潔劑中的活性組分使用。它們各自對相關組合物的洗滌或清潔功效的作用是在蛋白酶的情況下降解含蛋白質汙物的能力，在澱粉酶的情況下降解含澱粉的汙物，在脂肪酶的情況下裂解脂肪的活性。纖維素酶除其去汙即基本洗滌和清潔功效外，特別由於其對洗滌劑的二次洗滌功效的作用和由於其對織物的纖維作用優選在洗滌劑中使用。特定的水解產物被洗滌劑和清潔劑中的常規組分損壞、溶解、乳化或懸浮或者由於其高的溶解度被洗液衝洗出，因此獲得酶和其他組分之間的協同作用效果。
蛋白酶在天然纖維，特別是棉或絲上具有與纖維素酶對組合物的二次洗滌功效可比的效果。由於它們對織物表面結構的影響，可以對該材料產生柔順的影響，並因此防止糾結。
其它酶通過它們特殊的酶功效增加相應組合物的清洗功效。這些酶包括例如β-葡聚糖酶(WO 99/06515和WO 99/06516)、蟲漆酶(WO00/39306)或者果膠溶解酶(WO 00/42145)，這些具體用於特殊的清洗劑中。
在本發明的組合物中首先考慮使用從微生物例如細菌或真菌獲得的酶。他們以本身已知的方法從合適的微生物中通過發酵方法而獲得，這些微生物例如在德國公開申請DE 1940488和DE 2121397，在美國專利US 3,623,957和US 4,264,738，在歐洲專利申請EP 006 638和在國際專利公布WO 91/02792中有所描述。
本發明的蛋白質和/或其他蛋白質特別在儲存期間應用穩定劑來保護，例如避免通過物理作用、氧化或蛋白酶解而造成其變性、分解或失活。
一組穩定劑是可逆的蛋白酶抑制劑，它能在洗滌劑稀釋之後在洗液中解離。苄脒氫氯化物和亮抑酶肽就為此目的而確立。硼砂、硼酸或它們的鹽或酯也經常用於這種目的，它們首先包括例如在WO95/12655中由芳香基鄰位取代的苯基硼酸、在WO 92/19707中由芳香基間位取代的苯基硼酸和在US 5,972,873中由芳香基對位取代的苯基硼酸或它們的鹽或酯。在WO 98/13460和EP 583 534中公開了肽醛，也就是具有還原C末端的寡肽，特別是那些含有2-50個單體的，用於可逆性抑制洗滌劑蛋白酶。肽的可逆性蛋白酶抑制劑尤其包括卵類粘蛋白(WO 93/00418)。例如，WO 00/01826公開了針對蛋白酶枯草桿菌素的特異性可逆的肽抑制劑，用於含蛋白酶的組合物中，而WO00/01831公開了相應的蛋白酶和抑制劑的融合蛋白質。
其他酶的穩定劑有氨基醇，如單-、二-、三-乙醇-和-丙醇胺和它們的混合物、例如從EP 0 378 261和WO 97/05227中得知的最多達C12的脂族羧酸，如琥珀酸，其他羧酸或上述酸的鹽。德國專利申請DE19650537中為此目的公開了封端的脂肪酸醯胺烷氧酸鹽。如WO97/18287中所公開，某些用作助洗劑的有機酸額外能夠穩定存在的酶。
除了上面所有多羥基化合物如甘油、乙二醇、丙二醇或山梨醇以外，低級脂族醇也是其他常用的酶穩定劑。同樣可以使用鈣鹽，例如醋酸鈣和在EP 0 028 865中為此目的公開的甲酸鈣，以及例如根據歐洲專利申請EP 0 378 262的鎂鹽也可使用。
聚醯胺寡聚物(WO 99/43780)或者聚合物，例如木質素(WO97/00932)，水溶性乙烯基共聚物(EP 828 762)或者如EP 702 712中所公開的纖維素乙醚、丙烯酸聚合物和/或聚醯胺可對酶製劑產生穩定作用，以克服物理影響或者pH值的變化。包含了聚胺-N-氧化物的聚合物(EP 587 550和EP 581 751)同時擔當酶穩定劑和染料轉移抑制劑。其它聚合物穩定劑是除了在WO97/05227所公開的其他成分以外的直鏈C8-18聚氧化烯。如WO97/43377和WO98/45396所公開，烷基聚糖苷可穩定本發明組合物中的酶成分，甚至提高它們的功效。如WO98/17764所公開，交聯的含氮化合物擔當著汙漬釋放劑和酶穩定劑的雙重作用。根據WO97/32958，疏水性非離子聚合物與其它穩定劑的混合物對纖維素酶有穩定的作用，因此這些或者相似的組成也同樣適合本發明中所必需的酶。
如EP 780 466所公開，還原劑和抗氧化劑將增加酶對氧化分解的穩定性。含硫的還原劑例如從EP 0 080 748和EP 0 080 223中得知。其它的例子是亞硫酸鈉(EP 533 239)和還原糖類(EP 656 058)。
在很多情況下，還採用穩定劑的組合，例如在WO 96/31589中多羥基化合物、硼酸和/或硼砂的組合，在EP 126 505中硼酸或硼酸鹽、還原鹽與丁二酸或其它二羧酸的組合，或者硼酸或硼酸鹽與多羥基或多氨基化合物的組合以及與如EP 080 223中所披露的還原鹽的組合。根據WO98/13462，肽/乙醛穩定劑的效果可通過與硼酸和/或硼酸衍生物和多羥基化合物的組合來增強，根據WO98/13459，其還可通過添加鈣離子而進一步增強。
具有穩定的酶活性的組合物代是本發明的優選實施方案。特別優選的是含有以上面提到的幾種方法而加以穩定的酶的組合物。
因為本發明的組合物可以任何可想到的形式提供，所以在任何適合於加入特定組合物的配方中的本發明酶，均是本發明的實施方案。對此例如是液體組合物、固體顆粒或膠囊。
以膠囊化形式提供來保護酶或其它成分不受其它組分例如漂白劑的影響，或者使緩釋成為可能。膠囊按照大小可以劃分為毫膠囊、微膠囊或者納膠囊，其中對於酶來說微膠囊特別優選。例如，這樣的膠囊在專利公布WO 97/24177和DE 19918267中公開。另一可能的膠囊化方法在於從蛋白質溶液與澱粉或澱粉衍生物的溶液或懸浮液混合開始，將蛋白質包封在這些物質中。一個如此膠囊化的方法在德國申請DE 19956382「微膠囊酶的生產方法(A process for the production ofmicroencapsulated enzymes)」中公開。
在固體組合物的情況下，該蛋白質例如以乾燥的、造粒的和/或膠囊化的形式使用。它們可以單獨即作為單相添加，或者與其它組分一起在同相中以壓實或未壓實形式添加。如果微膠囊化的酶以固態形式生產，則可按照現有技術已知的方法從加工獲得的水溶液中除去水，例如噴霧乾燥、離心或者再溶解。以這種方式獲得的顆粒大小通常為50-200μm。
可以從按照現有技術進行的蛋白質分離和製備開始將酶和本發明必需的蛋白質以濃縮的水或非水溶液、懸浮液或乳液加入本發明的液體、凝膠狀或糊狀組合物中，同樣也可以凝膠狀或膠囊化或作為乾燥粉末加入。本發明的這種洗滌劑或者清洗劑一般通過簡單混合成分來製備，所述成分以固體物質本身或作為溶液加入自動攪拌器中。
除基本洗滌功效外，在洗滌劑中包含的蛋白酶還可以滿足通過蛋白酶解裂解活化其它酶組分或者在相應的作用時間之後使其失活的功用，例如在公布WO94/29426或EP 747 471中所公開的。通過本發明的酶也可以獲得可比的調節功能。此外，本發明的另一實施方案涉及那些具有由蛋白酶敏感材料製成的膠囊的組合物，其例如在預期的時間點被本發明蛋白質水解並釋放出其內容物。在其它多相組合物的情況下也可以獲得可比的效果。
本發明特有的主題是處理紡織原料或者織物保養的組合物，其特徵在於，其僅含有或者除其它成分外還包含本發明的蛋白酶。因為特別是天然纖維例如羊毛和絲的區分在於其獨特的微觀表面結構特徵。正如在R.Breier的文章「Melliand Textilberichte」1.4.2000(第263頁)中用許多羊毛的實例所說明的，所述表面結構能長期能導致所不希望的效果，例如一些糾結。為了避免這種效果，使用本發明的組合物處理這些天然原材料，這些組合物例如有助於在蛋白質結構的基礎上使魚鱗狀的表面結構光滑並因此防止糾結。特別優選的實施方案是這種用於纖維或具有天然組分和特別是具有羊毛或絲的織物的組合物。
在本發明的實施方案中，含有本發明蛋白酶的組合物被這樣配製，即其一般可以作為保養劑使用，例如通過在洗滌過程中加入，在洗滌之後使用或者其應用不依賴於洗滌。所需的效果在於，獲得光滑的織物表面結構和/或預防和/或減少織物損壞。
本發明特有的主題是機械清潔織物或硬表面的方法，其特徵在於，在洗滌過程的至少一個步驟中使本發明的蛋白酶活化。
機械清洗織物的方法的特徵在於若干個方法步驟，所述步驟包括將不同的具有清潔活性的物質施用到待清洗物上，並且在作用時間之後漂洗，或者以其它的方式將該待清洗物用清潔劑或該清潔劑的溶液處理。這同樣適合於機械清洗其他所有的非織物的材料，這些材料被概括為術語硬表面。這種方法可以在至少一個洗滌步驟中加入本發明的蛋白質，並且是本發明的實施方案。
優選的方法是其中本發明酶每次應用的用量是40μg至4g，逐步優選地是50μg至3g，100μg至2g，200μg至1g，特別優選是400μg至400mg。
因為本發明的酶已經自然具有溶解蛋白質的活性，並且它們也可以在本來不具有清洗力的介質(例如單純的緩衝液)中顯示所述活性，所以這種機械清洗織物的方法的單個分步驟可由在所需的情況下除穩定的化合物、鹽或緩衝物質外加入本發明的酶作為唯一的具有清洗活性的組分所組成。這是本發明特別優選的實施方案。
本發明特有的主題是處理紡織原料或用於紡織品保養的方法，其特徵在於，在至少一個洗滌步驟中使本發明的蛋白酶具有活性。因此涉及一種方法，其中製備的材料以用於紡織品中，例如為了抗氈精加工，或者例如涉及一種方法，該方法在穿舊的紡織品的清洗中增加了保養成分。儘管蛋白酶對某些織物產生上述作用，但是在優選的實施方案中涉及紡織原料或含有天然成分特別是含有羊毛和絲的紡織品。
本發明特有的主題是本發明蛋白酶的應用，其用於洗滌紡織品，或者是硬表面。因為本發明的酶，特別地按照上述方法，可以用來清除紡織品或硬表面的類蛋白質的汙物。機械方法之外的應用，例如手洗或者人工除去紡織品或硬表面的汙漬是優選的實施方式。
優選在本發明酶的應用中，每次使用的用量是是40μg至4g，逐步優選地是50μg至3g，100μg至2g，200μg至1g，特別優選是400μg至400mg。
本發明特有的主題是本發明的蛋白酶使洗滌劑或清洗劑的成分活化或失活的應用。因為，同已知的一樣，洗滌劑或清洗劑的蛋白質組分通過蛋白酶的作用而失去活性。本發明具體涉及使用這種本來所不希望的作用。同樣通過蛋白酶解可以僅使其它的組分活化，例如當所述組分是一種由真正的酶和其相應的抑制劑組成的雜合蛋白質時，如在公布WO00/01831中所公開的。這種調節的另一實例是其中的活性組分已包封在一種易受酶攻擊的材料中來保護或控制其活性。因此本發明的蛋白質可用於失活、活化或釋放反應中。
本發明特有的主題是本發明蛋白酶的應用，其用於生物化學或分子生物分析，特別是在酶分析方法中。根據本發明和Rmpp，「LexikonChemie」(Version 2.0，Stuttgart/New YorkGeorg Thieme Verlag，1999)，術語酶分析是指每一種利用特定的酶或底物來一方面測定底物本身或其濃度或者另一方面測定酶本身或活性的任何生物化學分析。應用領域是所有與生物化學相關的領域。本發明主題的優選實施方案是在序列分析領域中用於測定端基。
本發明特有的主題是本發明蛋白酶的應用，其用於製備、純化或合成天然物質或生物原料。所以例如在天然物質或生物原料的純化過程中需要從所述物質中清除蛋白質汙物。對此例如涉及低分子量化合物、所有的細胞組分和儲存物質或者蛋白質。這不但在實驗室規模中而且在大工業規模中例如可按照生產原料的生物技術方法來進行。
本發明的蛋白酶用於合成蛋白質或其它低分子量化合物出現在由其天然催化的反應的逆向中，例如當蛋白質片段相互結合或者將胺基酸連接到不是主要由蛋白質組成的化合物上時。這種應用例如描述在申請EP 380362中。
本發明特有的主題是本發明蛋白酶的應用，其用於處理從中應該除去蛋白質汙物的天然原料，其中主要是非生物方法獲得的原料，例如那些來自農業的原料。
優選的實施方案是用於表面處理，特別是在處理經濟上有意義的原料皮革的工藝中的應用。鞣革工藝，特別是在鹼性柔化步驟中(Rmpp，「Lexikon Chemie」，Version 2.0，Stuttgart/New YorkGeorg ThiemeVerlag，1999)藉助於蛋白酶從皮革材料中除去水溶性蛋白質。本發明的蛋白質，尤其在鹼性條件下和採用變性劑時，對此是特別適合的。
本發明特有的主題是本發明蛋白酶的應用，其用於獲得或者處理紡織品加工中的原材料或中間產品。對此的實例是加工棉花，其在被稱作製漿的步驟中必須除莢；另一實例是處理羊毛；類似地也可用於加工粗絲。酶方法，特別是在其環境相容性方面，優於可比的化學方法。
在優選的實施方案中，本發明的蛋白質用於除去紡織品，特別是中間產品或原材料的保護層或者使其表面光滑，之後它們在隨後的工藝步驟中被進一步處理。
在本發明特有的主題中，本發明的蛋白質用於處理紡織原料或用於紡織品的保養，特別是用於羊毛或絲綢或含羊毛或絲綢的混合紡織品的表面處理。這不但適用於這種紡織品的製備而且適用於使用期間的保養，例如在該紡織品清洗時(參見上文)。
本發明特有的主題是本發明蛋白酶的應用，其用於處理照相膠片，特別是除去含明膠或類似的保護層。因為膠片例如X線膠片被這樣的保護層特別是由含銀鹽的明膠乳液塗覆，它們在載體材料曝光之後必須去除。對此，特別是在鹼性或略微變性的反應條件下可以使用本發明的蛋白酶。
本發明特有的主題是本發明蛋白酶的應用，其用於製備食品或動物飼料。所以自古以來蛋白酶已經被用於產品生產。對此的實例是凝乳酶用於奶酪或其它奶製品的製備過程中。可以加入本發明的蛋白質或者完全採用本發明的蛋白質進行該過程。同樣用於非營養目的富含碳水化合物的食品或食品原料，例如麵粉或糊精，可以用合適的蛋白酶處理，以便從其中除去伴隨的蛋白質。本發明的蛋白酶也適合於這種應用，尤其當其在鹼性或略微變性的條件下進行時。
相應地也適用於動物飼料的生產。這裡除完全除去蛋白質外還感興趣的是用蛋白酶僅短時間地處理類蛋白質原料或原料混合物，以便使其對於家禽來說更易消化。
本發明特有的主題是具有本發明蛋白酶的化妝用組合物或者使用本發明蛋白酶的化妝方法，或者本發明的蛋白酶用於化妝目的，特別是在相應的方法或相應的組合物的範圍內。
因為蛋白酶在人類皮膚的細胞再生過程(脫皮)中扮演重要的角色(T.Egelrud等，Acta Derm.Venerol.，第71卷(1991)，第471至474頁)。因此蛋白酶也作為生物活性組分被用於皮膚保養產品中以便促進乾性皮膚中增多的橋粒結構的退化，例如根據公布WO95/07688或WO99/18219。例如在WO97/07770中描述了枯草桿菌蛋白酶，特別是上述的遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶-變體用於化妝目的。本發明的蛋白酶，特別是那些例如在突變或通過添加合適的與其相互作用的物質來控制其活性的蛋白酶同樣適合在皮膚或頭髮洗滌或氧護組合物中作為活性組分。特別優選這些酶的製品，其如上所述例如通過連接在大分子載體上而被穩定(對照US 5230891)和/或通過在高變應原位置的點突變而被衍生化，所以它們與人皮膚的相容性增加。
因此，這種蛋白酶用於化妝目的應用也屬於本發明的主題，特別是在相應組合物中的應用，例如香波、皂或洗滌液，或者在以霜的形式提供的護理組合物中的應用。同樣在脫皮藥物中的應用也包括在本發明的權利要求中。
實施例實施例1本發明蛋白酶的製備所有的分子生物學操作方法均按照標準方法，例如在Fritsch、Sambrool和Maniatis編輯的「分子克隆實驗室手冊」，Cold SpringHarbour Laboratory Press，New York，1989年或者國際專利公布WO92/21760中說明的。
突變載體的構建突變從蛋白酶變體遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶M 131開始進行。這個變體描述在WO92/21760中，並且形成它的菌株根據該申請以名稱地衣形芽胞桿菌ATCC 68614保藏在美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)，Rockville，MD，USA。該菌株在表達盒中含有在芽胞桿菌中複製的質粒pCB56M131上的基因，所述表達盒包含啟動子、核糖體結合位點以及ATG-起始密碼子，及與前體蛋白質融合的來自地衣形芽胞桿菌ATCC 53926的鹼性蛋白酶的22氨基末端的胺基酸，以及遲緩芽胞桿菌DSM 5483-鹼性蛋白酶的突變序列。變體遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶M131與天然的序列相比具有下列的突變S3T、V4I、A188P、V193M、V199I。
為了突變，整個表達盒藉助於限制酶Bam HI和Sac I切割，並克隆到同樣用Bam HI和Sac I切割的載體pUC18(Amersham PharmaciaBiotech，Freiburg，德國)中。然後這樣獲得的載體pUC18M131進行下列的突變步驟。載體pUC18M131描述在附圖2中。在SEQ ID NO.1中記錄了包含遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶M131的表達盒的DNA片段；SEQ ID NO.2表示由其導出的胺基酸序列。在SEQ ID NO.1中描述的Bam HI-Sac I-片段在附圖2描述的載體pUC18M131中從位置1延伸至位置177 1；其餘的載體區域與起始質粒pUC18的相同。
突變首先在位置188和193中恢復遲緩芽胞桿菌DSM 5483的鹼性蛋白酶的原始序列。對此按照製造商的說明書採用Stratagene的QuikChange方法(La Jolla，CA，USA)。按照該體系，在使用兩個互補的包含各種突變的引物下，在聚合酶反應中製備突變的質粒。在藉助於Dpnl消化起始質粒之後，將反應物轉化至大腸桿菌(E.coli)XL-1 blue中。該獲得的克隆，如果合適，可以藉助於通過突變導入的限制酶切位點而輕易地識別，在每種情況下按照鏈終止方法，藉助於常規的試劑盒通過DNA測序進行檢查。
為了將編碼位置188的胺基酸的三聯體CAA(脯氨酸)轉換成GCC(丙氨酸)，使用下列兩個引物5』-TCA CAG TAT GGC GCC GGGCTT GAC ATT-3』以及5-AAT GTC AAG CCC GGC GCC ATA CTGTGA-3』。它們在直接鄰近突變之處包含未改變胺基酸序列的Nar 1-限制酶切位點。
為了將編碼位置193的胺基酸的三聯體ATG(甲硫氨酸)轉化為ATT(異亮氨酸)，採用下列兩個引物5』-GGG CTT GAC ATT GTG GCACCC GGG GTA AAC-3』以及5』-GTT TAC CCC GGG TGC CAC AATGTC AAG CCC-3』。它們在直接鄰近突變之處包含未改變胺基酸序列的Xma Cl-限制酶切位點。
包含雙向突變的質粒的克隆為隨後在位置211的三聯體TTA(亮氨酸)突變為GGA(甘氨酸)提供了模板。對此使用下列兩個互補序列5』-ACG TAT GCT AGC GGA AAC GGT ACA TCG-3』以及5』-CGA TGTACC GTT TCC GCT AGC ATA CGT-3』的引物。它們在直接鄰近突變之處包含未改變胺基酸序列的Nhe 1-限制酶切位點。然後通過DNA測序核查用Nhe 1產生的所需片段的克隆。
編碼整個蛋白酶的BLAP-S3T、V4I、V199I、L211G突變基因的DNA-序列在序列表中以SEQ ID NO.3給出。由此可以導出在序列表中SEQ ID NO.4下給出的胺基酸序列。該遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶-變體由於與來自遲緩芽胞桿菌DSM 5483的野生型酶有不同的位置，故被稱作遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G。
突變體的表達和蛋白酶製備具有突變序列的表達盒作為Bam HI-Sac I-片段再被克隆在載體pCB56M131中，代替在SEQ ID NO.1中描述的片段，並且轉化到枯草芽胞桿菌DB 104中。菌株枯草芽胞桿菌DB 104具有基因型his、nprR2、nprE18、aprA3(Kamamura，F.和Doi，R.H.1984，J.Bacteriol.，第160卷，第442至444頁)。DNA轉化到芽胞桿菌中，按照在WO91/02792中描述的最初由Chang和Cohen開發的原生質體方法(1979；Molec.Gen.Genet.，第168卷，第111至115頁)的變體方案進行。
因此獲得的蛋白酶-陽性克隆在鑑定之後在2000毫升搖瓶的500毫升MLBSP-培養基(10g/l酪腖；10g/l色氨酸，10g/l酵母抽提物均來自Becton Dickinson，Cockeysville；5g/l NaCl；27g/l琥珀酸鈉；100mg/lMgSO4·7H2O；75mg/l CaCl2·2H2O；0.5μM MnC12；0.5μM FeSO4；2％(w/v)葡萄糖；50mM PIPES-緩衝液(由pH為7.2的1M儲液製成)；75mM KPO4(由pH為7.0的1.5M儲液製成)；pH＝7.0，用KOH調節，以及10μg/ml四環素)中在37℃和每分鐘200轉下溫育72小時。將細胞離心分離之後獲得的上清液在確定蛋白酶活性(按照在《表面活性劑》(Tenside)第7卷(1970)，第125至132頁描述的方法)之後用於下面的試驗中。
實施例2在下面的兩個實施例中使用以標準方式汙染的紡織品，該紡織品由材料檢驗機構，St.Galler，Schweiz，Switzerland(EMPA)或者Waschereiforschungsanstalt，Krefeld，德國購得。在實施例2中試驗下列的汙漬/紡織品A(在棉織物上的血跡/牛奶/菸灰)、B(在棉織物上的血跡/牛奶/墨汁)、C(在聚酯-棉-混合織物上的血跡/牛奶/墨汁)以及D(在棉織物上的雞蛋/菸灰)。利用耐洗牢度試驗儀(launderometer)，將這些試驗材料檢測各種洗滌劑組合物的清洗功效。為此目的，調整固液比為1∶12，並將織物在40℃下清洗30分鐘。劑量為每升清洗液中特定洗滌劑為5.88g。水硬度為16°德國制硬度。
具有下列組成的洗滌劑基本配方作為對照洗滌劑(用重量百分比表示)4％直鏈烷基苯磺酸鹽(鈉鹽)、4％ C12-18脂肪醇硫酸鹽(鈉鹽)、5.5％C12-18脂肪醇x7 EO、1％皂鈉、11％碳酸鈉、2.5％無定型二矽酸鈉(Sadium disilicate)、20％過硼酸鈉四水合物、5.5％ TAED、25％沸石A、4.5％聚羧酸酯、0.5％膦酸鹽、2.5％粒狀泡沫抑制劑、5％硫酸鈉，其餘為水、螢光增白劑和鹽。對於各種測試系列，將下列的蛋白酶加入到對照洗滌劑中，以使在每種情況下的最終濃度為每升清洗液中蛋白酶解活性為2.250PE遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶F49(WO95/23221；製造商Biozym，Kundl，Australia)、Savinase(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)以及本發明的蛋白酶遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G。
清洗後，以硫酸鋇的白度作為標準100％，與之對比測出洗過織物的白度。測量用的是Datacolor SF500-2分光光度計，測試條件為460nm(紫外阻擋濾光片3)、孔徑30mm、無光澤面、光源類型D65、10°、d/8°。下表3中給出了測試結果，以反射率％表示，即和硫酸鋇比較的百分數，表3還列出每種情況下的起始值。所示值是4次測量的平均值。它們是所包含的酶對所用洗滌劑的清洗功效的作用的直接指標。
表3
從表中可以看出，本發明的蛋白酶與常規的蛋白酶遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶F49和Savinase相比在所有汙漬上均表現對具體組合物的洗滌功效具有更大的作用。
實施例3除實施例2中給出的汙漬/紡織品外這裡還使用了試樣E(在棉花上的血跡)。將這些紡織品與實施例2中相同的方式並用相同的洗滌液在Launderometer中進行測定。與實施例2相比唯一的不同在於現在在60℃的溫度下洗滌。同樣如在上述實施例中所描述的一樣進行該試驗系列的評價；結果列於下面的表4中。
表4
如這些結果所示，在60℃的洗滌溫度下，本發明的鹼性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G在對每種情況下的組合物的洗滌功效方面同樣超過其它用於洗滌劑的蛋白酶遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶F49和Savinase或者在誤差範圍內至少不相上下。
實施例4在標準化條件下將具有硬的光滑表面的容器與下列汙漬接觸(A)半熟蛋、(B)蛋/奶、(C)混合澱粉和(D)肉末，並45℃下用家用洗碗機(MieleG 676)的正常操作程序清洗。洗滌劑的用量為每一清洗循環為20g；水的硬度為16°德國制硬度。
下列基本配方用於洗碗劑(所有值按重量百分比計)55％三磷酸鈉(以無水計算)、4％無定型二矽酸鈉(以無水計算)、22％碳酸鈉、9％過硼酸鈉、2％TAED、2％非離子表面活性劑，其餘為水、染料和香精。對於各種測試，將各種蛋白酶酶，即遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶F49、Savinase以及本發明的蛋白酶-變體遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G以每清洗循環活性為10000PE相同活性的方式加入到基本配方中。這相當於每克洗滌劑濃縮物有約0.1毫克的蛋白酶-蛋白質。
清洗後，汙漬A至C的除去按重量差測定，以％表示。對此，受汙染後清洗的容器的重量與容器的初始重量之間的差異和未清洗的容器與其初始重量之間的差異有關。這種關係可看成是去除百分率。對汙漬D在清洗之後按照0(＝不變，即十分顯著的汙漬)到10(＝無可辨別的汙漬)等級進行目測評估。下表5列出了所獲得的結果。這裡給出的是9次測量的平均值。它們是所包含的酶對所用洗滌劑的清洗功效的作用的直接指標。
表5
這些結果表明，在洗碗機洗滌劑中，本發明的鹼性蛋白酶S3T/V41I/V199I/L211G對洗滌功效的作用優於試驗的蛋白酶，或者至少不相上下；並且在相對低的使用活性下也是這樣的。
實施例5
同前述實施例，將容器與相同的汙漬接觸，並以相同的方式用每種情況下相同的清洗劑配方清洗。唯一的區別在於，在每種情況下蛋白酶的用量是20000PE。這相當於在每種情況下洗滌劑濃縮物中含有約0.2毫克的蛋白酶。以與實施例4中相同的方式獲得的測量結果列於下表6中。
表6
。



序列表110漢高兩合股份公司(Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien)120新型鹼性蛋白酶變體及含有該新型鹼性蛋白酶變體的洗滌劑和清洗劑(Neue Alkalische Protease-Varianten und Wasch-undReinigungsmittel enthaltend diese neuen AlkalischenProtease-Varianten)130 SCT033039-47140
141
150 DE 10121463.4-411512001-05-021604170PatentIn Ver.2.121012111773212DNA213地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)ATCC 68614220
221CDS222(233)..(1375)220
221mat_肽222(566)..(1375)4001ggatcctcgg gacctctttc cctgccaggc tgaagcggtc tattcatact ttcgaactga 60acatttttct aaaacagtta ttaataacca aaaaatttta aattggtcct ccaaaaaaat 120aggcctacca tataattcat tttttttcta taataaatta acagaataat tggaatagat 180tatattatcc ttctatttaa attattctga ataaagagga ggagagtgag ta atg atg 238Met Met-110
agg aaa aag agt ttt tgg ctt ggg atg ctg acg gcc ttc atg ctc gtg 286Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met Leu Val-105-100 -95ttc acg atg gca tcg atc gca tcg gct gct gag gaa gca aaa gaa aaa 334Phe Thr Met Ala Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys Glu Lys-90 -85 -80tat tta att ggc ttt aat gag cag gaa gct gtc agt gag ttt gta gaa 382Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe Val Glu-75 -70 -65caa gta gag gca aat gac gag gtc gcc att ctc tct gag gaa gag gaa 430Gln Val Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala Ile Leu Ser Glu Glu Glu Glu-60 -55 -50gtc gaa att gaa ctg ctt cat gag ttt gaa acg att cct gtt tta tcc 478Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val Leu Ser-45 -40 -35 -30gtt gag tta agc cca gaa gat gtg gac gcg ctt gaa ctt gat cca gcg 526Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Ala Leu Glu Leu Asp Pro Ala-25 -20 -15att tct tat att gaa gag gat gca gaa gta acg aca atg gcg caa aca 574Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Ala Gln Thr-10 -5 -1 1atc cca tgg gga att agc cgt gtg caa gcc ccg gct gcc cat aac cgt 622Ile Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His Asn Arg5 10 15gga ttg aca ggt tct ggt gta aaa gtt gct gtc ctc gat aca ggt att 674Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile20 25 30 35tcc act cat cca gac tta aat att cgt ggt ggc gct agc ttt gta cca 718Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro40 45 50ggg gaa cca tcc act caa gat ggg aat ggg cat ggc acg cat gtg gcc 766Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala55 60 65
ggg acg att gct gct tta aac aat tcg att ggc gtt ctt ggc gta gcg 814Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala70 75 80cct agt gcg gaa cta tac gct gtt aaa gtt tta gga gcc gac ggt aga 862Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Arg85 90 95ggt gca atc agc tcg att gcc caa ggg ttg gaa tgg gca ggg aac aat 910Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly Asn Asn100 105 110 115ggc atg cac gtt gct aat ttg agt tta gga agc cct tcg cca agt gcc 958Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro Ser Ala120 125 130aca ctt gag caa gct gtt aat agc gcg act tct aga ggc gtt ctt gtt 1006Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val Leu Val135 140 145gta gcg gca tct ggg aat tca ggt gca agc tca atc agc tat ccg gcc 1054Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser Tyr Pro Ala150 155 160cgt tat gcg aac gca atg gca gtc gga gct act gac caa aac aac aac 1102Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn Asn Asn165 170 175cgc gcc agc ttt tca cag tat ggc cca ggg ctt gac att atg gca cca 1150Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Pro Gly Leu Asp Ile Met Ala Pro180 185 190 195ggg gta aac att cag agc aca tac cca ggt tca acg tat gcc agc tta 1198Gly Val Asn Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Ser Leu200 205 210aac ggt aca tcg atg gct act cct cat gtt gca ggt gca gca gcc ctt 1246Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu215 220 225gtt aaa caa aag aac cca tct tgg tcc aat gta caa atc cgc aac cat 1294Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg Asn His230 235 240
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Gln Thr Ile Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His115 120 125Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr130 135 140Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe145 150 155 160Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His165 170 175Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly180 185 190Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp195 200 205Gly Arg Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly210 215 220Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro225 230 235 240Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val245 250 255Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser Tyr260 265 270Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn275 280 285Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Pro Gly Leu Asp Ile Met290 295 300Ala Pro Gly Val Asn Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala305 310 315 320Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala325 330 335Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg340 345 350Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr355 360 365Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg370 375 38021032111143212DNA213人工序列(Künstliche sequenz)220
223遲緩芽孢桿菌鹼性蛋白酶(Bacillus lentus Alkalische Protease)
S3T/V4I/V199I/L211G220
221CDS222(1)..(1143)220
221mat_肽222(334)..(1143)4003atg atg agg aaa aag agt ttt tgg ctt ggg atg ctg acg gcc ttc atg48Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met-110-105-100ctc gtg ttc acg atg gca tcg atc gca tcg gct gct gag gaa gca aaa96Leu Val Phe Thr Met Ala Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys-95 -90 -85 -80gaa aaa tat tta att ggc ttt aat gag cag gaa gct gtc agt gag ttt144Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe-75 -70 -65gta gaa caa gta gag gca aat gac gag gtc gcc att ctc tct gag gaa192Val Glu Gln Val Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala Ile Leu Ser Glu Glu-60 -55 -50gag gaa gtc gaa att gaa ctg ctt cat gag ttt gaa acg att cct gtt240Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val-45 -40 -35tta tcc gtt gag tta agc cca gaa gat gtg gac gcg ctt gaa ctt gat288Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Ala Leu Glu Leu Asp-30 -25 -20cca gcg att tct tat att gaa gag gat gca gaa gta acg aca atg gcg336Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Ala-15 -10 -5 -1 1caa aca atc cca tgg gga att agc cgt gtg caa gcc ccg gct gcc cat384Gln Thr Ile Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His5 10 15aac cgt gga ttg aca ggt tct ggt gta aaa gtt gct gtc ctc gat aca432
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權利要求
1.一種枯草桿菌蛋白酶型的鹼性蛋白酶，其特徵在於，根據遲緩芽胞桿菌(Bacillus lentus)DSM 5483枯草桿菌蛋白酶的編號，其具有在位置199的異亮胺基酸和在位置211的甘氨酸以及至少一個穩定作用胺基酸。
2.一種枯草桿菌蛋白酶型的鹼性蛋白酶，其特徵在於，根據遲緩芽胞桿菌DSM 5483枯草桿菌蛋白酶的編號，其具有在位置199的異亮胺基酸和在位置211的甘氨酸並附加地具有位置3的蘇氨酸和位置4的異亮氨酸中的任一胺基酸。
3.一種枯草桿菌蛋白酶型的鹼性蛋白酶，其特徵在於，根據遲緩芽胞桿菌DSM 5483枯草桿菌蛋白酶的編號，其具有在位置3的蘇氨酸、在位置4的異亮氨酸、在位置199的異亮氨酸和在位置211的甘氨酸。
4.權利要求1至3中任一項所述的鹼性蛋白酶，其特徵在於，其是由芽胞桿菌，特別是遲緩芽胞桿菌自然形成或者是由這樣的芽胞桿菌衍生的枯草桿菌蛋白酶。
5.權利要求4所述的鹼性蛋白酶，其特徵在於，其是由遲緩芽胞桿菌DSM 5483天然形成或者由其衍生的枯草桿菌蛋白酶，特別是根據SEQ ID NO.4所示胺基酸序列的遲緩芽胞桿菌-鹼性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G。
6.從權利要求1至5中任一項所述的蛋白酶衍生的蛋白質，特別是通過斷裂或缺失突變、插入突變、取代突變或是通過至少一部分與至少另一種蛋白質融合獲得的蛋白質。
7.權利要求1至6中任一項所述的蛋白質，其特徵在於，其進一步被衍生化。
8.權利要求6或7所述的蛋白質，其特徵在於，其具有蛋白酶解活性，與起始分子或非衍生化的分子相比優選具有更高的蛋白酶解活性，更特別地具有改善的功效。
9.權利要求6至8中任一項所述的蛋白質，其特徵在於，其附加地被穩定化。
10.一種用於編碼在權利要求1至9中任一項所述的蛋白質的核酸。
11.一種編碼枯草桿菌蛋白酶的核酸，其核苷酸序列與SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列相對應，特別是在編碼位置199的異亮氨酸和位置211的甘氨酸的區域中，更特別是在編碼位置3的蘇氨酸、位置4的異亮氨酸、位置199的異亮氨酸和位置211的甘氨酸的區域中。
12.一種載體，其含有權利要求10或11所述的核酸區域，特別是含有編碼在權利要求1至9中任一項所述的蛋白質或衍生物的核酸區域。
13.一種克隆載體，其含有權利要求10或11所述的核酸區域，特別是含有編碼在權利要求1至9中任一項所述的蛋白質或衍生物的核酸區域。
14.一種表達載體，其包含權利要求10或11所述的核酸區域，特別是含有編碼在權利要求1至9中任一項所述的蛋白質或衍生物並使其生物合成成為可能的核酸區域。
15.一種細胞，其包含權利要求12至14中任一項所述的載體。
16.一種宿主細胞，其表達或可被誘導表達在權利要求1至9中任一項所述的蛋白質或衍生物，特別是通過使用權利要求14所述的表達載體。
17.權利要求16所述的宿主細胞，其特徵在於，其是細菌，特別是一種將形成的蛋白質分泌在周圍介質中的細菌。
18.權利要求17所述的宿主細胞，其特徵在於，其是枯草桿菌屬細菌，特別是遲緩芽胞桿菌(Bacillus lentus)、地衣形芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)、解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)或嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)。
19.權利要求15或16所述的宿主細胞，其特徵在於，其是真核細胞，特別是一種翻譯後修飾形成的蛋白質的細胞。
20.一種使用權利要求15至19中任一項所述的宿主細胞和/或使用權利要求12至14中任一項所述的載體和/或使用權利要求10或11所述的核酸來製備權利要求1至9中任一項所述的蛋白酶或衍生物的方法。
21.一種組合物，其特徵在於，其包含權利要求1至9中任一項所述的蛋白酶，特別是一種洗滌劑或清洗劑，更優選是每克所述組合物包含2μg至20mg的酶量。
22.權利要求21所述的組合物，其特徵在於，其進一步包含另一種酶，特別是其他蛋白酶、澱粉酶、纖維素酶、半纖維素酶和/或脂肪酶。
23.一種用於處理紡織原料或用於織物保養的組合物，其特徵在於，其僅包含或除其它活性成分以外還包含權利要求1至9中任一項所述的蛋白酶，特別是用於纖維或具有天然成分的紡織品，更特別是用於那些含羊毛或絲的紡織品的組合物。
24.一種機械清洗紡織品或硬表面的方法，其特徵在於，在清洗過程的至少一個步驟中使權利要求1至9中任一項所述的蛋白酶活化，優選每次使用的用量是40μg至4g，特別優選是400μg至400mg。
25.一種用於處理紡織原料或用於織物保養的方法，其特徵在於，在清洗過程的至少一個步驟中使權利要求1至9中任一項所述的蛋白酶活化，特別是用於紡織原料或含有天然成分的紡織品，更特別是用於那些含羊毛或絲的紡織品的方法。
26.權利要求1至9中任一項所述的蛋白酶的應用，其用於清洗紡織品或硬表面，優選每次使用的用量是40μg至4g，特別優選是400μg至400mg。
27.權利要求1至9中任一項所述的蛋白酶的應用，其用於活化洗滌劑或清洗劑的成分或使其失活。
28.權利要求1至9中任一項所述的蛋白酶的應用，其用於生物化學分析或用於合成低分子量的化合物或蛋白質。
29.權利要求1至9中任一項所述的蛋白酶的應用，其用於製備、純化或合成天然物質或生物材料。
30.權利要求1至9中任一項所述的蛋白酶的應用，其用於處理天然原料，特別是用於表面處理，更特別是在處理皮革的方法中的應用。
31.權利要求1至9中任一項所述的蛋白酶的應用，其用於獲得或處理紡織品生產中的原料或者中間產品，特別是用於除去織物上的保護層。
32.權利要求1至9中任一項所述的蛋白酶的應用，其用於處理紡織原料或用於織物保養，特別是用於處理羊毛或絲綢或含羊毛或絲綢的混紡織品。
33.權利要求1至9中任一項所述的蛋白酶的應用，其用於處理照相膠片，特別是用於除去含明膠或類似物的保護層。
34.權利要求1至9中任一項所述的蛋白酶的應用，其用於製備食品或動物飼料。
35.一種包含權利要求1至9中任一項所述的蛋白酶的化妝品，或一種包含權利要求1至9中任一項所述的蛋白酶的化妝方法，或權利要求1至9中任一項所述的蛋白酶用於化妝目的的應用，特別是在相應方法或相應組合物的範圍內。
全文摘要
本發明涉及新型鹼性蛋白酶變體，其源自天然或改良的枯草桿菌蛋白酶。與目前已知的枯草桿菌蛋白酶相比，該得自遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)枯草桿菌蛋白酶的變體具有兩個胺基酸位置199I和211G，和至少一個有利於分子穩定的改良，特別是點突變後在位置3具有蘇氨酸和/或在位置4具有異亮氨酸。作為例子，對變體遲緩芽孢桿菌－鹼性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G進行了研究。該變體與其他的蛋白酶－變體相比對洗滌劑和清洗劑的洗滌性能具有更大的作用。除該酶以外，本發明還涉及其在各種不同技術工藝中應用，特別是涉及含有該新型鹼性蛋白變體的洗滌劑和清洗劑。
文檔編號A61K8/96GK1505679SQ02809246
公開日2004年6月16日 申請日期2002年4月24日 優先權日2001年5月2日
發明者貝婭特麗克絲·克特維茨, 卡爾-海因茨·毛雷爾, 羅蘭·布雷韋斯, Ｒ虼摹っ 錐, 布雷韋斯, 貝婭特麗克絲 克特維茨 申請人:漢高兩合股份公司